سير عمل حوسبي لتحديد أولويات جينات المضيف المرتبطة بالمستقلبات الميكروبية في متلازمة القولون المتهيج ذات الغلبة الإمساكية

ملخص

يدمج هذا البروتوكول بين التنبؤ بالأهداف الخاصة بالنواتج الأيضية الميكروبية، والتحليل النسخي للمخاطية المستقيمة، وتفاعلات البروتين-بروتين وإثراء المسارات، والرسو الجزيئي، ومحاكاة الديناميكيات الجزيئية، وتقدير الطاقة الحرة للارتباط باستخدام ميكانيكا الجزيئات/مساحة سطح بويسون-بولتزمان (MM-PBSA)، وذلك لإنشاء قائمة قصيرة مرتبة ومولدة للفرضيات من الجينات المضيفة المرتبطة بالنواتج الأيضية المرشحة، ومعقدات البروتين-الربيطة ذات الأولوية البنيوية للمتابعة التجريبية.

الملخص

لا يوجد مسار حوسبي موحد لتحديد أولويات الجينات المضيفة المرتبطة بمستقلبات ميكروبية ومعقدات البروتين-الربيطة بشكل منهجي من قواعد البيانات الكيميائية والجينية والتركيبية المتاحة للعموم. يصف هذا المقال سير عمل مكونًا من ثماني مراحل يستقبل مجموعة محددة من قبل المستخدم من المستقلبات المشتقة من ميكروبات الأمعاء، وينتج قائمة قصيرة مرتبة من الجينات المضيفة المرشحة المرتبطة بالمستقلبات، والمسارات البيولوجية المثرية، ومعقدات البروتين-الربيطة ذات الأولوية التركيبية للمتابعة التجريبية. يدمج هذا المسار ما يلي: (i) التنميط الكيميائي المعلوماتي للمستقلبات؛ (ii) التنبؤ بالأهداف المرشحة عبر قواعد بيانات متعددة باستخدام أداة التنبؤ بالأهداف القائمة على الربيطة وتفاعل البروتين-الكيميائي وبرنامج للرسو الجزيئي؛ (iii) تحليل التعبير الجيني التفاضلي لبيانات الترانسكريبتوم المتاحة للعموم؛ (iv) تداخل الجينات ذات التعبير التفاضلي مع الأهداف؛ (v) بناء شبكة تفاعل البروتين-البروتين وإثراء المسارات؛ (vi) الرسو الجزيئي باستخدام برنامج رسو جزيئي؛ (vii) محاكاة الديناميكا الجزيئية لمدة 200 ns باستخدام محرك ديناميكا جزيئية مع مجال قوة بروتيني مستخدم في محاكاة الديناميكا الجزيئية؛ و (viii) تقدير الطاقة الحرة للارتباط بطريقة MM-PBSA. كمثال تطبيقي، تمت معالجة تسعة مستقلبات مشتقة من ميكروبات الأمعاء أو معدلة ميكروبيًا تمثل الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة، والأحماض الصفراوية، والمستقلبات المشتقة من التريبتوفان، واليوروليثين A، باستخدام مجموعة بيانات الترانسكريبتوم لغشاء المستقيم في حالات IBS-C المتاحة للعموم GSE36701. رتب سير العمل 17 جينًا فريدًا متوقعًا مرتبطًا بالمستقلبات كانت ذات تعبير تفاضلي في هذه المجموعة من البيانات. وقد حددت تحليلات الرسو، ومحاكاة الديناميكا الجزيئية، و MM-PBSA الأولوية التركيبية لخمسة معقدات من المستقلب-البروتين: lithocholic acid-VDR، و lithocholic acid-NR1H4/FXR، و ursodeoxycholic acid-NR1H4/FXR، و tryptamine-HTR2A (تمت محاكاته في طبقة ليبيدية مزدوجة صريحة من 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC))، و urolithin A-CASP3. صُمم هذا البروتوكول ليكون قابلاً للتكيف مع مجموعات مستقلبات أخرى، ومجموعات بيانات ترانسكريبتوم لأمراض مختلفة، وفئات أهداف متنوعة؛ وتعتبر جميع المخرجات تنبؤات حوسبية لتوليد الفرضيات تتطلب تكرارًا مستقلًا لبيانات الترانسكريبتوم، وتحققًا على مستوى البروتين، ومقايسات استجابة الربيطة الوظيفية قبل التوصل إلى استنتاجات سببية أو علاجية.

المقدمة

يُعد متلازمة القولون المتهيج المصاحب للإمساك (IBS-C) اضطرابًا وظيفيًا شائعًا في الجهاز الهضمي، يتميز بآلام متكررة في البطن، وتغير في عادات التبرز، وانتفاخ، وإمساك، حيث تُقدر نسبة انتشارها عالميًا بنحو 10–15% من عامة السكان^1,2. ويمكن للعلاجات الدوائية الحالية، بما في ذلك المحفزات الإفرازية، ومحفزات الحركة، ومضادات التشنج، أن تحسن أعراضًا فردية لدى مجموعة فرعية من المرضى؛ ومع ذلك، تظل الاستجابة للعلاج متباينة ونادرًا ما يتم تحقيق هجوع مستدام للمرض، مما يعكس البيولوجيا المرضية المعقدة ومتعددة العوامل لهذه الحالة^1,3,4. لذا، ثمة حاجة إلى فهم ميكانيكي أكثر اكتمالاً لكيفية نقل إشارات الميكروبات المعوية على مستوى المخاطية لصياغة فرضيات قابلة للاختبار لأهداف علاجية جديدة.

تساهم ميكروبات الأمعاء في الحفاظ على التوازن الداخلي للجهاز الهضمي السفلي من خلال إنتاج والتحويل الحيوي لنواتج أيض متنوعة كيميائياً، بما في ذلك الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs)، وأحماض الصفراء الثانوية، والمركبات المشتقة من التريبتوفان، ونواتج أيض البوليفينول مثل اليوروليثينات^5,6,7,8. وتتواصل هذه الجزيئات مع خلايا المضيف عبر مجموعة واسعة وغير محددة بالكامل من الأهداف الجزيئية التي تتجاوز بمراحل مستقبلات الغشاء الكلاسيكية المستشعرة لنواتج الأيض لتشمل المستقبلات النووية، والإنزيمات السيتوسولية، والبروتينات المعدلة للهيستون، وسلائف الهرمونات الببتيدية، وبروتينات الإشارات داخل الخلوية⁹. وقد تم توثيق تغيرات في تكوين المجتمع الميكروبي المعوي وملفات نواتج الأيض لدى المرضى الذين يعانون من متلازمة القولون المتهيج (IBS)، مما يوفر مبرراً بيولوجياً للبحث فيما إذا كانت جينات المضيف المرتبطة بالاستجابة لنواتج الأيض الميكروبية تعاني من اضطرابات نسخية في مخاطية المستقيم لدى المصابين بـ IBS-C¹⁰.

تم تحديد لوحة المستقلبات التسعة مسبقاً لتوفير مجموعة مدمجة ومتنوعة كيميائياً وقابلة للتفسير بيولوجياً من الجزيئات الصغيرة المشتقة من ميكروبات الأمعاء أو المعدلة بواسطتها. استند الاختيار إلى خمسة معايير: تمثيل الفئات الرئيسية للمستقلبات الميكروبية المشاركة في إشارات التواصل بين المضيف والميكروبات؛ التعرض المعروف أو المحتمل للمخاطية المعوية البعيدة؛ توافر معرفات PubChem وبنى قياسية غير غامضة؛ الحجم الجزيئي والقابلية البنيوية للتنبؤ بالأهداف القائمة على الربائط والرسو الجزيئي؛ والمنطقية المسبقة للإشارات المتعلقة بالخلايا الظهارية، أو الجهاز العصبي المناعي، أو الخلايا المعوية الصماء، أو المستقبلات النووية، أو الحركية في حالة متلازمة القولون المتهيج مع الإمساك (IBS-C). شملت اللوحة المختارة butyrate و propionate كأحماض دهنية قصيرة السلسلة (SCFAs)؛ و chenodeoxycholic acid و lithocholic acid و ursodeoxycholic acid كأحماض صفراوية؛ و tryptamine و indole-3-propionic acid و indole-3-lactic acid كمستقلبات مشتقة من التريبتوفان؛ و urolithin A كمستقلب بوليفينول مشتق من ميكروبات الأمعاء^5,6,7,8,9,10.

بحثت معظم الدراسات الحسابية والتجريبية السابقة في أزواج منفردة من المستقلب والمستقبل أو المستقلب والإنزيم بشكل منعزل، وهو نهج لا يستوعب الطبيعة الموزعة والتقاربية لإشارات المستقلبات الميكروبية عبر مسارات المضيف^9,11. ويمنح دمج عدة مراحل تحليلية قوة تصفية تعزز بعضها بعضاً، وهو ما لا يمكن لأي مرحلة مفردة توفيره بشكل مستقل. إذ يؤدي التنبؤ الحسابي بالأهداف مقابل قواعد بيانات منسقة إلى الحصول على مجموعة واسعة من البروتينات المرشحة في المضيف لكل مستقلب. ثم يعمل التقاطع مع البيانات الترانسكريبتومية ذات الصلة بالمرض على تصفية هذه المجموعة بشكل كبير، مع الاحتفاظ فقط بالمرشحين الذين تتغير نسخهم الترانسكريبتية في سياق المرض. بعد ذلك، تعمل تحليلات إثراء المسارات وشبكات التفاعل بين البروتينات على ربط قائمة المرشحين المختصرة بوحدات بيولوجية معروفة. ويوفر الالتحام الجزيئي تقييماً حسابياً أولياً لتكامل جيب الارتباط لكل معقد مرشح، كما يوفر محاكاة إضافية للديناميكا الجزيئية (MD) لمدة 200 ns مع تحليل تفكيك الطاقة الحرة للارتباط بطريقة MM-PBSA بُعداً ثيرموديناميكياً دقيقاً زمنياً لتحديد الأولويات الهيكلية، وهو أمر غير متاح من خلال درجات الالتحام وحدها. إن تنفيذ كل خطوة بشكل مستقل، دون تكامل منهجي وتصفية متسلسلة، سيؤدي إلى قوائم مرشحين واسعة جداً بحيث يصعب التعامل معها تجريبياً، وسيفشل في الكشف عن بنية المسارات التقاربية.

في سياق هذا البروتوكول بالكامل، نعني بمصطلح "الجين المرتبط بالمستقلبات" (MAG) جيناً بشرياً تم ترشيح ناتجه البروتيني كهدف جزيئي مفترض لواحد أو أكثر من المستقلبات المشتقة من ميكروبات الأمعاء بواسطة قاعدة بيانات تنبؤ حاسوبية منقحة واحدة على الأقل، ويكون النسخ الخاص به معبراً عنه بشكل تفاضلي في مجموعة البيانات النسخية ذات الصلة بالمرض والمستخدمة لتوضيح سير العمل. يتضمن هذا التعريف الإجرائي عمداً المستقبلات الغشائية بالإضافة إلى المستقبلات النووية، والإنزيمات السيتوسولية، وبروتينات الإشارة، وسلائف الهرمونات الببتيدية، وغيرها من البروتينات داخل الخلوية. لا يعد تعيين MAG دليلاً تجريبياً على أن المستقلب يرتبط، أو يشكل معقداً بروتين-لجين، أو ينشط مستقبلاً، أو يغير من وفرة البروتين، أو يسبب المرض، بل هو ترشيح مشتق حاسوبياً لتوليد الفرضيات يتطلب تحققاً تجريبياً.

يصف هذا البروتوكول سير العمل الحوسبي الكامل المكون من ثماني مراحل (الشكل 1) بتفاصيل تشغيلية كافية لتمكين التكرار المستقل، والتكييف مع لوحات استقلابية أخرى أو مجموعات بيانات مرضية، والتوسع ليشمل سياقات أخرى من التفاعل بين المضيف والميكروبات. تم تحديد نطاق سير العمل صراحةً كإطار عمل لتوليد الفرضيات وتحديد الأولويات الهيكلية، بحيث يعمل حصرياً على الموارد الهيكلية والأوميكس المتاحة علناً، ولا يستنتج تغيرات في تركيزات المستقلبات، أو حالات تنشيط المستقبلات، أو تغيرات التعبير البروتيني، أو نشاط الإشارات النهائية، أو الأهمية السريرية من المخرجات الحوسبية وحدها. نقوم هنا بتوضيح البروتوكول كمثال تطبيقي باستخدام تسعة من المستقلبات المشتقة من ميكروبات الأمعاء أو المعدلة بواسطتها، ومجموعة بيانات ترانسكريبتوم المخاطية الشرجية العامة لمرض IBS-C رقم GSE36701، وذلك بهدف تحديد MAGs وترتيب أولويات معقدات المستقلب-بروتين للمتابعة التجريبية اللاحقة.

البروتوكول

استخدم التحليل فقط بيانات ترانسكريبتومية مجهولة المصدر ومتاحة للعموم من GSE36701، بالإضافة إلى قواعد بيانات كيميائية وبروتينية وهيكلية متاحة للعموم. تم الدخول إلى قواعد البيانات هذه في الفترة ما بين يناير ومايو 2026. وأي تاريخ دخول لاحق تم توثيقه في جدول المواد المنفصل.

1. تصميم الدراسة، ومتطلبات الأجهزة والبرمجيات

1. حدد سير العمل قبل بدء التحليل. استخدم ثماني مراحل: اختيار المستقلبات، والتنبؤ بالأهداف، وتحليل التعبير التفاضلي، وتداخل الجينات ذات التعبير التفاضلي (DEG) مع الأهداف، وتفاعل البروتين-بروتين (PPI)/إثراء المسارات، والالتحام الجزيئي، ومحاكاة الديناميكا الجزيئية (MD)، وتقدير MM-PBSA.
2. سجل أن كل من الالتحام الجزيئي، والديناميكا الجزيئية (MD)، وMM-PBSA هي أدوات لتحديد الأولويات الهيكلية فقط. لا تفسر هذه المخرجات كأدلة تجريبية على الارتباط، أو تنشيط المستقبلات، أو تغير وفرة البروتين، أو الفعالية العلاجية، أو مسببات المرض.
3. تحقق من أجهزة الحوسبة قبل تشغيل محاكاة MD. استخدم نظام تشغيل Linux بمعمارية 64-bit، ووحدة معالجة مركزية (CPU) بـ 6 أنوية أو أفضل، ومنصة تسريع GPU بذاكرة VRAM تبلغ ≥8 GB، أو منصة تسريع GPU مكافئة بذاكرة VRAM تبلغ ≥8 GB، وبحد أدنى 32 GB من ذاكرة الوصول العشوائي (RAM)، وما لا يقل عن 200 GB من مساحة التخزين الحرة لكل نظام MD.
4. سجل البرمجيات الأساسية: محرك ديناميكا جزيئية، وبرنامج للالتحام الجزيئي لربط المستقلبات بالبروتينات المستهدفة، وأداة لتحويل تنسيقات الملفات الكيميائية¹²، وبرنامج لتوليد الربائط ثلاثية الأبعاد، وأداة لتحضير الربائط، ومجموعة أدوات لتحضير مدخلات الالتحام، وبرنامج للالتحام الجزيئي لربط المستقلبات بالبروتينات المستهدفة، وبيئة برمجة عامة الأغراض، وبيئة حوسبة إحصائية مع إطار عمل لبرمجيات المعلوماتية الحيوية، وحزمة لتحليل التعبير الجيني التفاضلي.
5. سجل أدوات التحليل الهيكلي: أداة بناء أنظمة الغشاء القائمة على الويب، وخدمة تحديد بارامترات الربائط المتوافقة مع CHARMM، وأداة حساب طاقة الارتباط باستخدام الميكانيكا الجزيئية/المذيب المستمر، ومكتبة تحويل التوبولوجيا والبارامترات الجزيئية، وبرنامج تصور جزيئي ثلاثي الأبعاد، وأداة للتصور الجزيئي ومخططات التفاعل ثنائية الأبعاد لعام 2021 (راجع جدول المواد للحصول على روابط التنزيل ومعلومات الإصدار).
6. سجل المعرفات الدقيقة لحقل القوة البروتينية المستخدم في محاكاة الديناميكا الجزيئية، وCGenFF، وCHARMM-GUI، وإطار عمل R/المعلوماتية الحيوية، ومعرفات إصدار أداة حساب طاقة الارتباط باستخدام الميكانيكا الجزيئية/المذيب المستمر في جدول المواد/ملف البيئة. حدد المعرفات الغائبة بعبارة "غير قابلة للاسترداد"؛ ولا تقم باستنتاجها.

2. اختيار المستقلبات والتوصيف الكيميائي المعلوماتي

1. حدد مجموعة المستقلبات قبل البدء في التنبؤ بالأهداف. تشمل هذه المجموعة: butyrate (PubChem CID: 264)، وpropionate (CID: 1032)، وchenodeoxycholic acid (CID: 10133)، وlithocholic acid (CID: 9903)، وursodeoxycholic acid (CID: 31401)، وtryptamine (CID: 1150)، وindole-3-propionic acid (CID: 3744)، وindole-3-lactic acid (CID: 92904)، وurolithin A (CID: 5488186).
2. استخرج نظام إدخال السطور الجزيئية المبسط (SMILES) المعياري ومعرف PubChem CID لكل مستقلب. تحقق من المترادفات والبنى المكررة قبل التنبؤ بالأهداف. قم بتخزين المعرفات النهائية في ورقة المستقلبات الرئيسية.
3. أرسل سلاسل SMILES المعيارية إلى أداة الويب الخاصة بالتنبؤ بالخصائص الفيزيائية الكيميائية والـ ADME¹³ (راجع جدول المواد). سجل الوزن الجزيئي، ومساحة السطح القطبية الطوبولوجية (TPSA)، وقيمة consensus logP، ومانحي الروابط الهيدروجينية، ومستقبلي الروابط الهيدروجينية، والروابط القابلة للدوران، والامتصاص المعدي المعوي المتوقع، وتنبؤ P-glycoprotein، وتنبيهات Lipinski وVeber وGhose وEgan وMuegge وPAINS.
4. احتفظ بالمستقلبات التي تم التعرف على بنيتها بنجاح، والتي يبلغ وزنها الجزيئي ≤500 Da، والتي لا تظهر عليها تنبيهات PAINS. سجل أي معيار لم يتم استيفاؤه والقرار المتخذ بشأن الاحتفاظ بالمستقلب أو استبعاده.
5. حدد حالات التأين قبل التنبؤ بالأهداف والالتحام الجزيئي (docking). استخدم الكربوكسيلات منزوعة البروتون لـ butyrate وpropionate، وأشكال حمض الكربوكسيل المتعادلة للأحماض الصفراوية، والأمونيوم المبرتنت لـ tryptamine، والأشكال المتعادلة للمستقلبات المتبقية.

3. التنبؤ بالأهداف البشرية المرشحة

1. افتح برنامج التنبؤ بأهداف التفاعل بين المركبات الكيميائية والبروتينات¹⁴ (انظر جدول المواد). أدخل اسم كل مستخلص أيضي أو رقم تعريف PubChem CID، واختر Homo sapiens (معرف التصنيف: 9606)، واضبط الحد الأدنى لدرجة التفاعل المجمعة على ≥0.700.
2. أعطِ الأولوية لقنوات الأدلة التجريبية وقواعد البيانات المنسقة في برنامج التنبؤ بأهداف التفاعل بين المركبات الكيميائية والبروتينات. قم بتنزيل جدول الارتباط البروتيني الكامل لكل مستخلص أيضي.
3. افتح برنامج الإرساء الجزيئي (molecular docking)¹⁵ (انظر جدول المواد). أرسل كل سلسلة SMILES مع اختيار Homo sapiens، واحتفظ بالأهداف التي تبلغ احتمالية تفاعلها ≥0.70.
4. قم بدمج مخرجات التنبؤ بأهداف التفاعل بين المركبات الكيميائية والبروتينات ومخرجات برنامج الإرساء الجزيئي كمجموعة اتحاد لكل مستخلص أيضي. احتفظ بأي هدف يستوفي عتبة أي من قاعدتي البيانات، وقم بإزالة الإدخالات المكررة تماماً لرموز الجينات.
5. قم بتوحيد إدخالات البروتين لتتوافق مع رموز الجينات المعتمدة من لجنة تسمية جينات البشر (HGNC) باستخدام خرائط معرفات البروتين لربطها برموز الجينات الموحدة المعتمدة من HGNC أو قاعدة بيانات معلومات الجينات البشرية المتكاملة (انظر جدول المواد). قم بتسوية الأسماء المستعارة، والرموز القديمة، وتوصيفات الأشكال المتعددة للبروتين (isoforms) لتنحصر في رمز جين واحد لكل بروتين.
6. صنّف كل هدف على أنه مستقبل غشائي، أو مستقبل نووي، أو إنزيم، أو بروتين إشارات داخل خلوي، أو هرمون ببتيدي، أو بروتين مرتبط بالهرمونات، أو بروتين آخر داخل خلوي. وسجل هذه الفئة في جدول الأهداف.

4. مجموعة بيانات النسخ التحليلي وتحليل التعبير الجيني التفاضلي

1. قم بالوصول إلى GSE36701 من خلال أداة تحليل التعبير الجيني التفاضلي القائمة على الويب في NCBI^16,17 (راجع جدول المواد). دوّن أن مجموعة البيانات تتضمن بيانات التعبير عن خزعة المخاطية المستقيمة من مجموعات IBS-C، ومتلازمة القولون المتهيج السائدة بالإسهال (IBS-D)، وIBS ما بعد العدوى، ومجموعات من المتطوعين الأصحاء¹⁸.
2. ابحث في GEO و ArrayExpress عن مجموعة تحقق مستقلة. استخدم تركيبات من IBS-C، ومتلازمة القولون المتهيج السائدة بالإمساك، والمخاطية المستقيمة، والمخاطية القولونية، والخزعة، والترانسكريبتوم، والمصفوفات الدقيقة (microarray)، و RNA-seq. دوّن المستودعات، ومصطلحات البحث، وتاريخ البحث، وما إذا تم تحديد مجموعة بيانات تحقق قابلة للمقارنة.
3. قم بتشغيل أداة تحليل التعبير الجيني التفاضلي القائمة على الويب من سجل GSE36701 (راجع جدول المواد). قم بتعيين عينات IBS-C الـ 18 إلى مجموعة IBS-C، وتعيين المتطوعين الأصحاء الـ 40 إلى مجموعة التحكم، واترك عينات IBS-D و IBS ما بعد العدوى غير معينة.
4. قم بإجراء تحليل التعبير التفاضلي باستخدام إطار حزمة تحليل التعبير الجيني التفاضلي مع تصحيح معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) بطريقة Benjamini-Hochberg¹⁹. قم بتنزيل جدول النتائج الكامل الذي يحتوي على معرف المسبار (probe ID)، ورمز الجين، وعنوان الجين، و logFC، و AveExpr، وإحصائية t المعدلة، وقيمة P الخام، وقيمة P المعدلة.
5. قم بدمج المسابير إلى إدخالات على مستوى الجين. استبعد المسابير التي تفتقر إلى رموز الجينات؛ واحتفظ بالمسبار الذي يحتوي على أدنى FDR للرموز المكررة؛ واستخدم القيمة المطلقة الأكبر لـ logFC كمعيار لفك الارتباط.

5. تحليل التداخل بين الأهداف والجينات المتغيرة تعبيرياً والتقييم الإحصائي

1. قم بإجراء تقاطع بين كل قائمة أهداف متوقعة خاصة بمستقلب معين وقائمة الجينات ذات التعبير التفاضلي (DEG) عند مستوى FDR < 0.05. سجل الجينات المتداخلة، والمستقلب المصدر، وقيمة logFC، وقيمة P المعدلة، واتجاه التعبير.
2. دمج قوائم التداخل الخاصة بكل مستقلب في قائمة واحدة غير مكررة من الجينات المتأثرة بالمستقلبات (MAG). احسب إجمالي الأهداف المتوقعة، وعمليات التداخل الخاصة بكل مستقلب، وإجمالي جينات MAG الفريدة.
3. قم بتقييم اتساق الاتجاه على مستوى المسبار (probe) للجينات التي تحتوي على مسبارات متعددة. ضع علامة تمييز على أي جين تختلف مسباراته في اتجاه التعبير.
4. أنشئ جدول التوافق الخاص باختبار فيشر الدقيق (Fisher’s exact test) باستخدام إجمالي المدخلات المدمجة على مستوى الجين، وإجمالي جينات DEG، وإجمالي الأهداف المتوقعة الفريدة، وجينات MAG المرصودة. احسب قيمة P أحادية الذيل، ونسبة الأرجحية (odds ratio)، وفاصل الثقة 95% باستخدام تطبيق اختبار فيشر الدقيق.
5. إذا تجاوز معدل DEG في الخلفية 50%، يتم تسجيل التداخل كوصفي بدلاً من كونه إثراءً تم التحقق منه بشكل مستقل. تعامل مع التنظيم الخافض الموحد كنمط اتجاهي وصفي ما لم يتم إجراء اختبار اتجاهية منفصل.

6. تحليل شبكة التفاعل بين البروتينات وإثراء المسارات

1. قم بإرسال قائمة MAG الفريدة والكاملة إلى برنامج بناء شبكة التفاعلات بين البروتينات وإثراء المسارات²⁰ (راجع جدول المواد). اختر Homo sapiens واضبط الحد الأدنى لدرجة التفاعل على 0.700.
2. قم بتصدير الشبكة المدمجة الناتجة عن بناء شبكة التفاعلات بين البروتينات وإثراء المسارات وجدول التفاعلات الكامل. إذا أنتج التنقيب في النصوص (text-mining) طبوغرافيا كثيفة بشكل اصطناعي، قم بإلغاء تحديد التنقيب في النصوص والاحتفاظ بقنوات التجارب، والتعبير المشترك، وقواعد البيانات.
3. قم بإنشاء شبكات فرعية لفئات المستقلبات الخاصة بـ MAGs المرتبطة بـ SCFA، والمرتبطة بالأحماض الصفراوية، والمرتبطة بالتريبتامين/السيروتونين. استخدم نفس إعدادات الكائن ومستويات الثقة الخاصة ببرنامج بناء شبكة التفاعلات بين البروتينات وإثراء المسارات.
4. قم بتشغيل برنامج بناء شبكة التفاعلات بين البروتينات وإثراء المسارات مقابل موسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG)²¹، وReactome²²، والعمليات البيولوجية في علم الوجود الجيني (GO Biological Process)^23,24. طبق تصحيح Benjamini–Hochberg BH FDR <0.05 وقم بتصدير جميع جداول الإثراء.

7. الالتحام الجزيئي

1. استرجع بنيات المستقبلات المحددة تجريبياً من بنك بيانات البروتينات التابع لمختبر التعاون البحثي للمعلوماتية الحيوية البنيوية RCSB PDB²⁵ (راجع جدول المواد). استخدم VDR/1DB1، وNR1H4/FXR/3DCT، وCASP3/2DKO، وHTR2A/6A93 للمعقدات الخمسة ذات الأولوية من البروتين والربيطة.
2. قم بتحضير كل مستقبل عن طريق الإبقاء على السلسلة A وإزالة الماء، والربيطات المشتركة في التبلور، والعوامل المساعدة، والأيونات، وسجلات HETATM غير البروتينية. بالنسبة لـ 6A93، قم بإزالة قطعة اندماج الليزوزيم T4 قبل تحضير المستقبل.
3. أضف ذرات الهيدروجين القطبية، وخصص شحنات Gasteiger، واحفظ كل مستقبل بصيغة PDBQT باستخدام مجموعة أدوات البنية الجزيئية. افحص حالات برتنة الهيستيدين في موقع الارتباط قبل التحويل إلى PDBQT ووثق الحالات المختارة.
4. قم بتوليد البنية ثلاثية الأبعاد لكل ربيطة في مجموعة أدوات تحويل ملفات البنية الكيميائية. قم بتقليل الطاقة باستخدام حقل القوة العام (UFF) لمدة 500 خطوة، وخصص حالة التأين عند pH 7.4، وخصص شحنات Gasteiger، واحفظ الملف بصيغة PDBQT.
5. حدد صندوق إرساء بأبعاد 25 Å x 25 Å x 25 Å يتمركز حول المركز الهندسي للربيطة المشتركة في التبلور. استخدم المراكز (10, 19, 33) لـ VDR، و(137, 31, 78) لـ FXR، و(37, 34, 32) لـ CASP3، و(12, −1, 61) لـ HTR2A.
6. قم بإجراء إرساء جزيئي لربيطات المستقلبات على البروتينات المستهدفة^26,27 بقيم exhaustiveness = 8، وseed = 42، وnum_modes = 9، وenergy_range = 3 kcal/mol. سجل أعلى قيمة لدرجة Vina وقيم جذر متوسط مربع الانحراف (RMSD) لجميع الوضعيات.
7. اختر النمط 1 (mode 1) لكل معقد ذو أولوية. قم بتوليد مخططات ثنائية الأبعاد للربيطة والبقايا باستخدام أداة تصور جزيئي وأداة مخططات تفاعل ثنائية الأبعاد، ومناظر ثلاثية الأبعاد للمستقبل والربيطة في برنامج تصور جزيئي ثلاثي الأبعاد.
8. أجرِ ضوابط إعادة الإرساء (redocking) لـ VDR/1DB1 وFXR/3DCT. يتم قبول إعداد إرساء المستقبل عندما يكون RMSD للذرات الثقيلة <2.0 Å بالنسبة للوضعية البلورية.
9. أجرِ ضوابط الإرساء المتقاطع (cross-docking) عن طريق إرساء حمض الليثوكوليك (LCA) في CASP3 والتريبتامين في VDR. قارن بين درجات الربيطات المتوافقة وغير المتوافقة وسجل الحالات التي يكون فيها فرق الدرجة <1.0 kcal/mol.

8. محاكاة الديناميكيات الجزيئية

1. قم بتوليد بارامترات الربيطة باستخدام خدمة تحديد بارامترات الربيطة المتوافقة مع CHARMM²⁸ (راجع جدول المواد). افحص جميع درجات الجزاء وقم بتمييز أي بارامتر بقيمة جزاء >50.
2. حول ملفات تدفق الربيطة إلى ملفات .itp و .prm المتوافقة مع محرك الديناميكا الجزيئية باستخدام نص تحويل توبولوجيا حقل القوة. ادمج ملفات توبولوجيا الربيطة والبروتين لكل معقد.
3. طبق إعادة تقسيم كتلة الهيدروجين باستخدام مكتبة تحويل التوبولوجيا الجزيئية والبارامترات. ولد توبولوجيات مائية باستخدام حقل القوة البروتيني المستخدم في محاكاة الديناميكا الجزيئية²⁹ ونموذج مياه صريح ثلاثي المواقع³⁰.
4. قم بإذابة المعقدات المائية في صندوق اثني عشري السطوح مع خلوص لا يقل عن 1.2 nm بين المذاب والحافة. عادل الأنظمة وأضف NaCl بتركيز 0.15 M.
5. قم ببناء نظام غشاء tryptamine-HTR2A باستخدام أداة بناء أنظمة الأغشية القائمة على الويب^31,32,33 (راجع جدول المواد). استخدم إحداثيات المستقبل المحاذية لقاعدة بيانات توجيه البروتين الغشائي³⁴ (راجع جدول المواد)، وطبقة ثنائية من POPC النقي، وطبقات مياه بسمك 22.5 Å، و NaCl بتركيز 0.15 M.
6. قم بتقليل طاقة جميع الأنظمة بطريقة الانحدار الأكثر حدة لما يصل إلى 50,000 خطوة. تأكد من التقارب عند Fmax <1000 kJmol^-1nm^-1 قبل مرحلة التوازن.
7. قم بموازنة الأنظمة المائية باستخدام مراحل مجموعة العدد الثابت من الجسيمات والحجم ودرجة الحرارة (NVT) ومجموعة العدد الثابت من الجسيمات والضغط ودرجة الحرارة (NPT). وازن نظام الغشاء باستخدام سير عمل تحضير وموازنة النظام الجزيئي متعدد المراحل المكون من ست خطوات والقائم على الويب مع تحرير القيود تدريجيًا.
8. قم بتشغيل محاكاة ديناميكا جزيئية إنتاجية لمدة 200 ns لجميع المعقدات الخمسة. استخدم خطوة زمنية قدرها 4 fs مع إعادة تقسيم كتلة الهيدروجين HMR، ومنظم حرارة V-rescale عند 310 K، ومنظم ضغط Parrinello-Rahman عند 1 bar، وكهرومغناطيسية Particle mesh Ewald (PME)³⁵، وقيود LINCS³⁶.
9. حلل المسارات النهائية باستخدام أدوات تحليل مسار الديناميكا الجزيئية. احسب RMSD للعمود الفقري، وتقلب جذر متوسط المربعات (RMSF) لـ Cα، ونصف قطر الدوران، ومساحة السطح المتاحة للمذيب (SASA)، والروابط الهيدروجينية بين البروتين والربيطة، باستخدام الـ 150 ns الأخيرة كنافذة تحليل أساسية.

9. تقدير الطاقة الحرة للارتباط بطريقة MM-PBSA

1. استخرج لقطات المسار لتحليل MM-PBSA. استخدم 2,001 إطاراً لكل معقد مائي و201 إطاراً معالجاً للنظام الفرعي HTR2A المدمج في الغشاء.
2. شغّل أداة حساب طاقة الارتباط بالميكانيكا الجزيئية/المذيب المستمر³⁷ باستخدام تميه Poisson-Boltzmann، وثابت عزل داخلي = 1، وثابت عزل خارجي = 80، وتميه غير قطبي قائم على SASA، ودون تصحيح الإنتروبيا. سجّل متوسط الطاقة الحرة للارتباط والانحراف المعياري.
3. أجرِ تفكيكاً لكل ثمالة لجميع المعقدات الخمسة. سجّل الثمالات المثبتة والمزعزعة التي تبلغ مساهماتها المطلقة ≥0.5 kcalmol⁻¹.

    

النتائج

الأهداف المرشحة المرتبطة بالنواتج الأيضية

أنتجت المستقلبات التسعة مجموعات متنوعة من الأهداف المتوقعة عبر برنامج للتنبؤ بالتفاعلات بين المواد الكيميائية والبروتينات وبرنامج للرسو الجزيئي. وقد أسفر البروبيونات، والتريبتامين، والأحماض الصفراوية، واليوروليثين A عن عدة أهداف ذات صلة معروفة بإشارات الجهاز الهضمي. وشمل مشهد الأهداف المتوقعة مستقبلات غشائية نمطية، ومستقبلات نووية، وإنزيمات داخل خلوية، وبروتينات إشارات، وبروتينات مرتبطة بالهرمونات الببتيدية. لذا، توصف النتائج النهائية بأنها جينات مرتبطة بالمستقلبات (MAGs) بدلاً من كونها نتائج متعلقة بالمستقبلات فقط (الجدول 1).

المقارنة المرجعية مع تفاعلات المستقلبات والبروتينات المبلغ عنها

لمعايرة مخرجات تنبؤ الأهداف مقابل المعرفة التجريبية الحالية، صُنفت العلاقات المتنبأ بها بين الأهداف والمستقلبات المرتبطة بها إلى ثلاثة مستويات من الأدلة: (1) تفاعلات مباشرة أو تفاعلات على مستوى الفئة الوثيقة بين المستقلب والبروتين مدعومة تجريبياً، حيث تم الإبلاغ عن أن المستقلب أو مستقلب داخلي وثيق الصلة يرتبط بالبروتين المشفر أو ينشطه أو يثبطه أو ينظمه وظيفياً؛ (2) تفاعلات مدعومة بمسار حيوي أو فئة أهداف، حيث ينتمي الهدف المتنبأ به إلى مسار يستجيب للمستقلبات أو إلى عائلة مستقبلات معروفة، ولكن الأدلة المباشرة للزوج المحدد من المستقلب والبروتين محدودة؛ و(3) ارتباطات حوسبية فقط لم يتم تحديد تفاعل تجريبي مباشر لها في المراجعة الأدبية. استُخدمت عملية المعايرة هذه لوضع مجموعات الأهداف المرتبطة بالمستقلبات (MAGs) المتنبأ بها في سياقها، وليس للتحقق من صحتها.

أعادت عدة تنبؤات صياغة بيولوجيا تم الإبلاغ عنها سابقاً. تم اعتبار التنبؤ Propionate-FFAR2 مدعوماً تجريبياً لأن FFAR2/GPR43 هو مستقبل كلاسيكي للأحماض الدهنية قصيرة السلسلة. وصُنِّف التنبؤ Butyrate-HDAC3 على أنه مدعوم تجريبياً أو مدعوم فئوياً لأن البوتيرات (butyrate) مثبط معروف لإنزيم نزع الأسيتيل من الهستون، وكان التداخل المتوقع يشمل عضواً من عائلة HDAC. أما التنبؤات المرتبطة بالأحماض الصفراوية والتي تشمل NR1H4/FXR وVDR، فقد اعتُبرت مدعومة ببيولوجيا المستقبلات النووية للأحماض الصفراوية الراسخة، لا سيما بالنسبة للأحماض الصفراوية الكارهة للماء مثل LCA؛ بينما فُسِّرت تنبؤات FXR المرتبطة بحمض Ursodeoxycholic acid (UDCA) بحذر لأن UDCA يكون عموماً ربيطة (ligand) أضعف لـ FXR أو تعتمد على السياق. وصُنِّفت التنبؤات المرتبطة بالتريبتامين (Tryptamine) لـ HTR1B وHTR2A وHTR2B وHTR6 على أنها مدعومة بمسار السيروتونين بدلاً من كونها تفاعلات مؤكدة ومباشرة وخاصة بالمستقبل، لأن التريبتامين هو مونوأمين مشتق من التريبتوفان الميكروبي، ومستقبلات السيروتونين هي منظمات معروفة لحركية وإفرازات الجهاز الهضمي. واعتُبر التنبؤ Urolithin A-CASP3 مدعوماً بالمسار بناءً على الروابط المنشورة بين urolithin A والاستجابات المرتبطة بـ apoptotic/caspase، ولكن ليس بناءً على دليل مباشر لربط CASP3. أما التنبؤات Indole-3-lactic acid-KYAT1 وindole-3-propionic acid-KYAT1 فقد تم الاحتفاظ بها كفرضيات حاسوبية فقط، لأن الأدبيات الأوسع تدعم إشارات المضيف عن طريق مشتقات الإندول الميكروبية، ولكن ليس الربط المباشر بـ KYAT1 بواسطة هذه المستقلبات تحديداً^7,8,38,39,40.

وبناءً على ذلك، يفرق الجدول 1 بين ترشيح الأهداف الحسابي ومستوى الدعم التجريبي أو دعم المسارات المسبق. كما يوفر لكل هدف مصدر التنبؤ (تنبؤ بهدف تفاعل كيميائي-بروتيني، أو برنامج إرساء جزيئي، أو كليهما)، ودرجة التفاعل المجمعة لتنبؤ هدف التفاعل الكيميائي-البروتيني، واحتمالية برنامج الإرساء الجزيئي عندما يتم تحديد الهدف بواسطة برنامج إرساء جزيئي. وتوصف الأهداف المتوقعة التي تفتقر إلى أدلة تجريبية مسبقة مباشرة بأنها جينات مرشحة مرتبطة بالتمثيل الغذائي وتتطلب تحققًا مستقلاً على مستوى البروتين واستجابة الليجاند.

التداخل بين الأهداف المتوقعة والجينات ذات التعبير التفاضلي في متلازمة القولون العصبي مع الإمساك (IBS-C)

أدى تقاطع قوائم الأهداف المتوقعة المجمعة مع نتائج التعبير التفاضلي على مستوى الجينات إلى تحديد 17 جيناً فريداً متوقعاً مرتبطاً بالنواتج الأيضية، والتي أظهرت تعبيراً تفاضلياً ملحوظاً عند مقارنة مرضى متلازمة القولون المتهيج المصاحبة للإمساك (IBS-C) مقابل المتطوعين الأصحاء. وكانت جميع الجينات الـ 17 منخفضة التعبير. وشملت هذه المجموعة مستقبلات غشائية ونووية (CASR, FFAR2, GPR68, HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6, NR1H4, TBXA2R, VDR) وبروتينات غير مستقبلة (CASP3, GCG, GNAQ, GPHN, HDAC3, KYAT1, MLN) (الجدول 1، الشكل 2A,B).

استوفت جميع المجموعات الجينية المجمعة (MAGs) البالغ عددها 17 عتبة معدل الاكتشاف الكاذب (FDR) أقل من 0.05؛ واستوفت 16 من أصل 17 عتبة FDR < 0.001 الأكثر صرامة، بينما كان الجين المتبقي (HTR1B) ذا دلالة إحصائية عند FDR < 0.05. وقد حققت سبعة من الأهداف الـ 17 (CASP3, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, HDAC3, TBXA2R) كلاً من FDR < 0.001 وتغيراً طياً مطلقاً بلوغاريتمياً أساس 2 (absolute log₂ fold change) يتجاوز 1.0 (نطاق logFC من −1.34 إلى −1.10)، مما يشير إلى تثبيط قوي ومتسق لهذه المجموعة الفرعية. أما الأهداف المتبقية فقد أظهرت تثبيطاً متوسطاً ولكنه دال إحصائياً (نطاق |logFC| من 0.45 إلى 0.97). وقد تم تفسير هذا النمط الوصفي الموحد بحذر، مع مراعاة خصائص التعبير الجيني على مستوى الجينوم لمجموعة البيانات (انظر التقييم الإحصائي أدناه).

التقييم الإحصائي للتداخل في الجينات المعبّر عنها تفاضلياً (DEG) المستهدفة

لتقييم الدلالة الإحصائية لتداخل الـ 17 جينًا بشكل رسمي، تم تطبيق اختبار فيشر الدقيق (Fisher’s exact test) أحادي الطرف، باستخدام الـ 17 جينًا مستهدفًا والمتوقع كـمجموعة استعلام، وجميع المدخلات الفريدة المدمجة للجينات البالغ عددها 18,296 والتي تم اكتشافها في GSE36701 كخلفية جينومية. ومن هذه الخلفية، تبين أن 17,296 جينًا (94.5%) كانت ذات تعبير متباين عند FDR < 0.05، مما يعكس تثبيطًا نسخياً شبه شامل في مقارنة المخاطية المستقيمية لمرضى IBS-C. وكانت جميع الجينات المستهدفة الـ 17 المتوقعة من ضمن الجينات ذات التعبير المتباين (التداخل الملحوظ 17/17، 100%). وبالنظر إلى معدل التعبير المتباين للخلفية البالغ 94.5%، فإن التداخل المتوقع لأي مجموعة من 17 جينًا مختارة عشوائيًا هو 16.1 جينًا. وقد أسفر اختبار فيشر الدقيق عن p = 0.384 مع نسبة أرجحية مصححة للاستمرارية بلغت 2.03 (فاصل ثقة 95% يتراوح بين 0.12–33.73)، وهو ما لم يكن ذا دلالة إحصائية عند α = 0.05 (الشكل 3A–C).

تشير هذه النتيجة إلى أن تداخل 17/17 الملحوظ لا يتجاوز التداخل المتوقع بمحض الصدفة في ظل ملف التعبير الجيني الشامل لهذا المجموع البياني. وبناءً على ذلك، تُفسر هذه النتائج على أنها نمط اتجاهي وصفي، حيث كان جميع الأهداف الـ 17 المتوقعة منخفضة التعبير بشكل متسق وملحوظ في أنسجة المخاطية للمستقيم في حالات IBS-C، بدلاً من كونها دليلاً على إثراء إحصائي أو تحقق مستقل مقارنة بخلفية جينومية. يتطلب اختبار الإثراء الرسمي تكرار التجربة في مجموعات بيانات ترانسكريبتومية ذات ملفات تعبير تفاضلي أكثر انتقائية، بحيث تصل نسبة أقل بكثير من نصف جميع الجينات إلى مستوى الدلالة الإحصائية. ويجب التأكيد على أن الانخفاض الموحد في تعبير جميع الجينات الـ 17 المتداخلة هو ملاحظة وصفية وليس نتيجة إحصائية تم التحقق منها بشكل منفصل، وذلك لأن الخلفية ذات التعبير التفاضلي في هذا المجموع البياني هي نفسها منخفضة التعبير في الغالب، لذا فإن وجود اتجاه تنازلي مشترك بين الجينات المتداخلة هو أمر متوقع ولم يخضع لاختبار اتجاهية رسمي. وبالتالي، لا ينبغي تفسير هذا الاتجاه الموحد كدليل إحصائي مستقل على تنظيم منسق ومحدد للمستقلبات.

أنماط محددة للمستقلبات

سجل البروبيونات (Propionate) أكبر عدد من الجينات المتداخلة، بما في ذلك CASR وFFAR2 وGCG وGNAQ وGPHN وGPR68 وMLN وTBXA2R، مما يشير إلى احتمال مشاركة مسارات التأشير المستجيبة للأحماض الدهنية قصيرة السلسلة والمرتبطة بـ Gq. وتداخل البيوتيرات (Butyrate) مع HDAC3، وهو ما يتوافق مع بيولوجيا نازعة أسيتيل الهيستون المرتبطة بالبيوتيرات، على الرغم من أن انخفاض تنظيم mRNA وحده لا يثبت تغير الاستجابة للبيوتيرات. وشملت التداخلات المرتبطة بالأحماض الصفراوية المستقبلات النووية VDR وNR1H4، وكلاهما من المؤثرات المعروفة في تأشير الأحماض الصفراوية في الأمعاء^38,39. وتداخل التريبتامين (Tryptamine) مع HTR1B وHTR2A وHTR2B وHTR6، مما يشير إلى أن تأشير السيروتونين هو وحدة مرشحة، وهو نظام له أدوار راسخة في الحركة والإفراز في الجهاز الهضمي⁴⁰. كما تداخل حمض الإندول-3-لاكتيك وحمض الإندول-3-بروبيونيك مع KYAT1، وتداخل اليوروليثين A مع CASP3.

إثراء المسارات

كشف تحليل الإثراء الوظيفي للجينات الـ 17 المتداخلة عن مسارات مرتبطة بنقل الإشارات المصب للمستقبلات المقترنة بالبروتين G (GPCR)، وإشارات Gαq، وارتباط ربيطة GPCR، والتشابك السيروتونيني، والتفاعل بين الربيطة والمستقبل النشط عصبيًا، ونقل إشارات الكالسيوم، وإشارات cAMP، وإفراز الهرمونات الببتيدية. وتتسق هذه النتائج مع تكوين مجموعة الجينات وتدعم تماسكها البيولوجي، إلا أنها تعكس التوصيف الوظيفي للجينات المقدمة بدلاً من أن تكون دليلاً مستقلاً على النشاط على مستوى المسار.

بنية شبكة التفاعلات بين البروتينات

تم تفسير بناء شبكة تفاعل البروتين-بروتين وتحليل إثراء المسارات عبر ثلاث شبكات متكاملة. في الشبكة الميتا-مجمعة المكونة من 17 جينًا (الشبكة 1)، كان الهيكل الأكثر وضوحاً والمدعوم بالتعليقات التوضيحية هو مكون إشارات GPCR/Gαq الذي يتركز حول GNAQ ويربط GNAQ بالجينات المرتبطة بالمستقبلات، بما في ذلك TBXA2R و CASR و HTR2A و HTR2B. كما تم الاحتفاظ باتصال محدود لمستقبلات السيروتونين، وبشكل أبرز بين HTR2A و HTR2B، بينما ظلت عدة جينات أخرى معزولة أو ضعيفة الاتصال عند عتبة الثقة المختارة. وأظهرت الشبكة الخاصة بالبروبيونات (الشبكة 2) طوبولوجيا أكثر تقييداً، حيث احتفظ GNAQ بروابط مدعومة بالتعليقات التوضيحية مع CASR و TBXA2R، في حين كانت FFAR2 و GPR68 و GCG و GPHN و MLN معزولة أو ضعيفة الاتصال. أما شبكة التريبتامين/السيروتونين (الشبكة 3) فقد شملت HTR1B و HTR2A و HTR2B و HTR6؛ وضمن هذه المجموعة الفرعية، أظهر HTR2A و HTR2B الاتصال الرئيسي المدعوم بالتعليقات التوضيحية، بينما لم يكن HTR1B و HTR6 متصلين بشكل مباشر عند العتبة المختارة (الشكل 4A–C).

الرسو الجزيئي

أُجريت عملية الإرساء الجزيئي على خمسة معقدات مختارة من البروتينات والمستقلبات. وأظهرت أزواج الأحماض الصفراوية والمستقبلات النووية درجات Vina أكثر ملاءمة من أزواج urolithin A-CASP3 و tryptamine-HTR2A. وسجل LCA-VDR أفضل درجة بلغت −10.0 kcal/mol، يليه LCA-NR1H4/FXR (−9.9 kcal/mol) ثم UDCA-NR1H4/FXR (−9.4 kcal/mol). بينما سجل urolithin A-CASP3 و tryptamine-HTR2A درجات أقل ولكنها تظل منطقية بلغت −7.1 kcal/mol (الجدول 2).

بالنسبة لمعقد LCA-VDR (رقم PDB: 1DB1)، تم دعم الوضعية المتوقعة بواسطة رابطة هيدروجينية تقليدية بين أكسجين كربوكسيلات LCA و Ser278 (4.29 Å)، بالإضافة إلى اتصالات كارهة للماء واسعة النطاق تشمل Leu230 و Val234 و Trp286 و Val300 و His305 و Tyr295 و Leu233 و His397، واتصالات فان دير فال إضافية مع Met272 و Leu313 و Ile271 و Ile268 و Leu309 و Phe422 و Val418 و Ala231 و Ala303 و Cys288 و Ser275 و Phe150. وسجلت الوضعية الأعلى تصنيفاً درجة Vina بلغت −10.0 kcal/mol، وحجم تجويف قدره 2055 ų، ومركز شبكة عند (10, 19, 33) (الجدول 3، الشكل 5A,B).

بالنسبة لمعقد LCA-NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT)، رافق درجة الارتباط البالغة −9.9 kcal/mol روابط هيدروجينية متوقعة تشمل His294 وIle335، وتفاعل π-Sigma مع His294، وتلامسات كارهة للماء من نوع Alkyl أو π-Alkyl تشمل Met290 وMet328 وAla291 وLeu287 وIle352 وHis447، مع وجود تلامسات فان دير فالس إضافية تدعم استيعاب الهيكل الستيرويدي في جيب FXR (الجدول 4، الشكل 6A,B).

أظهر الوضع المتوقع لمعقد UDCA-NR1H4/FXR (معرف PDB: 3DCT) وجود رابطة هيدروجينية تقليدية مع His447 (3.66 Å)، ورابطة هيدروجينية أخرى مع Gly322 (3.46 Å)، وتفاعل π-Anion مع Val325 (4.96 Å)، ورابطة كربون-هيدروجين مع Trp469 (4.51 Å). كما حددت خريطة التفاعل وجود تلامسات مانح-مانح غير مواتية مع Arg395 (3.89 Å) وGln396 (3.40 Å)، مما يشير إلى أن درجة Vina المنخفضة لـ UDCA مقارنة بـ LCA في نفس جيب المستقبل قد تعود إلى هندسة محلية أو خصائص إلكتروستاتيكية أقل ملاءمة (الجدول 5، الشكل 7A,B).

في معقد urolithin A-CASP3 (PDB ID: 2DKO)، تميز وضع الارتباط المتوقع بوجود روابط هيدروجينية تقليدية مع Gln161 (3.78 و 4.19 Å)، و Ser120 (3.95 Å)، و Arg207 (3.05 و 3.77 Å)، كما تعزز استقراره من خلال تفاعلات π-Cation مع Arg207، ورابطة هيدروجينية من نوع π-Donor مع Cys163، بالإضافة إلى اتصالات π-Alkyl و van der Waals شملت Arg64 و Ala162 و His121 و Ser205 و Trp206 (الجدول 6، الشكل 8A,B).

بالنسبة لمعقد tryptamine-HTR2A (برقم PDB ID: 6A93)، تم تثبيت الوضعية المتوقعة بواسطة جسر ملحي إلكتروستاتيكي بين الأمين البروتوني لـ tryptamine و Asp155، وهو حمض الأسبارتيك المحفوظ في اللولب عبر الغشائي 3 (D3.32 وفق ترقيم Ballesteros-Weinstein) الذي يثبت الأمين البروتوني لربيطات الأمين عبر مستقبلات السيروتونين والمستقبلات ذات الصلة^41,42,43، بالإضافة إلى روابط هيدروجينية مع Thr160 و Ser159، وتلامسات أروماتية مع Phe340 و Trp336، وتفاعلات π-Alkyl مع Val156 و Ile163. كما دعمت تلامسات فان دير فالس إضافية مع Tyr370 و Phe339 و Ser242 و Phe243 و Phe332 و Leu123 نمط الارتباط بالجيب الأرثوستيري (الجدول 7، الشكل 9A,B).

التحقق من صحة بروتوكول الإرساء

لتقييم موثوقية بروتوكول الإرساء الجزيئي (docking)، تم إجراء تجربتين ضابطتين متكاملتين. بالنسبة للضوابط الإيجابية لإعادة الإرساء (redocking)، استُخلصت الربائط التي تم بلورتها بشكل مشترك من بنياتها المرجعية المحددة بالأشعة السينية وأُعيد إرساءها في مواقع ارتباطها الأصلية. وقد انحرف الوضع المتوقع الأعلى ترتيباً لنظير فيتامين D المسمى VDX في VDR/1DB1 بمقدار 0.87 Å عن الموضع البلوري، بينما انحرفت الربيطة المشتركة في البلورة WAY-362450 في FXR/3DCT بمقدار 1.79 Å؛ وكلا القيمتين كانتا أقل من عتبة القبول التقليدية البالغة 2.0 Å، مما يدعم الصحة الهندسية لبروتوكول الإرساء لأنظمة المستقبلات هذه (الشكل 10A،B). وبالنسبة للضوابط السلبية للإرساء المتقاطع (cross-docking)، تم إرساء حمض الليثوكوليك في caspase-3 (2DKO)، وهو بروتياز سيستين لا يُعرف حمض الليثوكوليك كربيطة له، مما أعطى درجة متوقعة (−8.3 kcal/mol) أضعف بمقدار 1.7 kcal/mol مقارنة بهدفه الأصلي VDR (−10.0 kcal/mol)، وهو ما يتوافق مع انتقائية موقع الارتباط المتوقعة. كما أعطى إرساء التريبتامين في VDR درجة متوقعة بلغت −6.4 kcal/mol مقارنة بـ −7.1 kcal/mol في هدفه الأصلي HTR2A، وهو فرق قدره 0.7 kcal/mol يقع ضمن نطاق عدم اليقين المبلغ عنه في درجات الإرساء الجزيئي لربائط المستقلبات مع البروتينات المستهدفة، وبالتالي يشير فقط إلى انتقائية متوقعة متواضعة لهذه الربيطة الأصغر حجماً (الشكل 10C). وبشكل عام، تشير هذه الضوابط إلى أن بروتوكول الإرساء يعيد إنتاج هندسة الارتباط المعروفة ويميز بين الأزواج المتطابقة وغير المتطابقة تحت الظروف المختبرة، مع بقائها تنبؤات حسابية لا تغني عن قياسات الألفة التجريبية (الجدول 8).

محاكاة الديناميكيات الجزيئية

أُجريت محاكاة الديناميكا الجزيئية للمعقدات الخمسة ذات الأولوية على مدار مسارات إنتاجية مدتها 200 ns. تم محاكاة المعقدات الأربعة الذائبة والمستقبلات النووية في مذيب مائي صريح، بينما تمت محاكاة معقد tryptamine-HTR2A في طبقة مزدوجة من ليبيدات POPC صريحة لتوفير بيئة غشائية مناسبة فسيولوجياً لهذا المستقبل المقترن بالبروتين G. واختبرت التحليلات الاستقرار الديناميكي لأوضاع الالتحام تحت ظروف زمنية متغيرة، وأتاحت مقارنة السلوك الهيكلي النسبي عبر مختلف المعقدات (الجدول 9).

أظهر ملف RMSD لمعقد LCA-VDR/1DB1 فترة توازن قصيرة خلال أول 10 ns، تلاها ثبات في الحالة (plateau)، مع تقلبات كانت بشكل أساسي في نطاق 0.20–0.28 nm (الشكل 11A). وكانت قيم RMSF منخفضة، حيث كانت تقلبات العمود الفقري البروتيني < 0.15 nm لمعظم الثمالات (الشكل 11B). وأظهر تحليل الروابط الهيدروجينية وجود شبكة مستمرة من 2–5 روابط هيدروجينية، مع زيادات عرضية تصل إلى 7 (الشكل 11C). كما ظل نصف قطر الدوران (Rg) ضمن نطاق 1.25–1.75 nm، وبقيت مساحة السطح المتاحة للمذيب (SASA) حول 130 nm² (الشكل 11D,E).

أظهر معقد urolithin A-CASP3/2DKO نشاطًا ديناميكيًا أكبر. فقد ارتفع مقدار RMSD في البداية ثم تذبذب بين 0.4 و0.7 nm، مع حدوث واقعة انحراف عالية لفترة وجيزة حول 165 ns (الشكل 12A). وأظهر تحليل RMSF حركة عالية على مستوى الثمالات، حيث ظهرت أكبر التقلبات في منطقة الحلقة المرنة حول الثمالة 175 (الشكل 12B). وكشف تحليل الروابط الهيدروجينية عن وجود شبكة واسعة أولية تتكون من حوالي 2–5 روابط خلال أول 30–40 ns، تلتها روابط متقطعة تراوحت في الغالب من 0 إلى 2 رابط (الشكل 12C). وتظهر مخططات نصف قطر الدوران (radius-of-gyration) ومساحة السطح المتاحة للمذيب (SASA) المقابلة في الشكل 12D,E.

بالنسبة لأنظمة الأحماض الصفراوية NR1H4/FXR (3DCT)، ظل ملف RMSD للهيكل الأساسي ضمن نطاق ضيق نسبياً عبر معظم مسار المحاكاة (الشكل 13A)، بينما أظهر ملف RMSF حركة أقل في المناطق الأساسية وتقلبات أعلى في المناطق المرنة (الشكل 13B). حافظ معقد LCA-3DCT على ما يقرب من ثلاث إلى أربع روابط هيدروجينية مستمرة طوال مسار المحاكاة، في حين أظهر معقد UDCA-3DCT تقلباً أكبر في الروابط الهيدروجينية وانخفاضاً في الترابط الهيدروجيني بعد حوالي 125 ns. تظهر ملفات نصف قطر الدوران لأنظمة الارتباط بـ LCA و UDCA في الشكل 13C,D على التوالي، وتظهر ملفات SASA المقابلة في الشكل 13E,F.

الديناميكيات الجزيئية الغشائية لمعقد tryptamine-HTR2A

تمت محاكاة معقد tryptamine-HTR2A/6A93 لمدة 200 ns ضمن طبقة ليبيدية ثنائية صريحة من POPC تتكون من 258 جزيئاً ليبيدياً، ونموذج مياه صريح ثلاثي المواقع، و 0.15 M NaCl، ليبلغ الحجم الإجمالي للنظام حوالي 100,925 ذرة^33,44,45. ظل المستقبل مغروساً بشكل مستقر في الطبقة الثنائية طوال مسار المحاكاة (الشكل 14). ارتفع جذر متوسط مربع الانحراف (RMSD) للهيكل الأساسي من حوالي 0.10 nm إلى مستوى استقرار يقارب 0.15–0.20 nm خلال أول 100 ns وظل مستقراً بعد ذلك، حيث كانت جميع القيم أقل من 0.25 nm، مما يشير إلى أن المستقبل حافظ على تشكل مستقر في بيئة الغشاء دون حدوث تفكك كلي (الشكل 15A). وأظهر جذر متوسط مربع التقلب (RMSF) لكل ثمالة تقلبات منخفضة في اللب الحلزوني عبر الغشائي مع زيادة متوقعة في الحركية في مناطق العرى والنهايات، وهو ما يتوافق مع المرونة النموذجية لمستقبلات GPCR (الشكل 15B). كان نصف قطر الدوران محصوراً بدقة بين حوالي 2.06 و 2.12 nm، وتذبذبت مساحة السطح المتاحة للمذيب (SASA) ضمن نطاق ضيق دون انزياح تدريجي، مما يؤكد كلاهما الحفاظ على الحزمة المدمجة عبر الغشائية (الشكل 15C,D).

تم الحفاظ على الترابط الهيدروجيني بين البروتين والربيطة طوال مسار المحاكاة (الشكل 15E)، مع وجود تقلبات ملحوظة في عدد الروابط الهيدروجينية، تراوحت ما بين 1 إلى 3 روابط. ولتقييم استمرارية التفاعل الأيوني الرئيسي بشكل محدد، تم رصد الحد الأدنى للمسافة بين نيتروجين الأمونيوم المبرتن في التربتامين وذرات أكسجين الكربوكسيلات في Asp155 (D3.32) طوال مسار المحاكاة بالكامل. ظلت هذه المسافة موزعة بدقة حول متوسط قدره 0.270 nm (بحد أدنى 0.247 nm، وبحد أقصى 0.424 nm)، كما تم الحفاظ على تلامس الجسر الملحي (< 0.4 nm) خلال 99.9% من وقت المحاكاة مع حدوث انحرافين عابرين وقصيرين فقط، ودون وقوع أي حدث تفكك مستمر (الشكل 16). تشير هذه النتائج إلى أن التفاعل الأيوني المحفوظ لـ Asp155 كان كافياً لتثبيت التربتامين داخل الجيب الأرثوستيري لـ HTR2A طوال فترة محاكاة الغشاء.

طاقة الربط الحرة بطريقة MM-PBSA والتحلل لكل ثمالة

أُجري تحليل MM-PBSA لإضافة طبقة إضافية من تحديد الأولويات الطاقية للمجمعات الخمسة (الجدول 10). وبالنسبة للمجمعات المائية الأربعة، حدد تفكيك الطاقة لكل ثمالة المساهمات الطاقية الرئيسية لكل نمط ارتباط متوقع. في مجمع LCA-VDR/1DB1، قدم الربيط وGln317 مساهمة إيجابية، بينما كانت مساهمة Trp286 غير مواتية. أما في مجمع urolithin A-CASP3/2DKO، فقد أظهر كل من Arg64 وArg207 مساهمات سلبية قوية لكل ثمالة، مما يشير إلى استقرار قطبي أو إلكتروستاتيكي كبير؛ ومع ذلك، ظل المسار المقابل ديناميكياً للغاية، مما يثبت أن الطاقات المواتية على مستوى الثمالات وحدها لا تضمن استقرار المجمع بشكل مستدام. بالنسبة لأنظمة 3DCT، كان ارتباط LCA مدفوعاً بشكل أساسي بـ Arg331، بينما تضمن ارتباط UDCA شبكة طاقية أكثر توزيعاً تشمل Glu326 وAsp394 وArg395 وArg441 وAsp470. وعبر الأنظمة المائية الأربعة، دعم تفكيك MM-PBSA الترتيب النسبي لأولويات المجمعات القائمة على LCA.

بالنسبة لمعقد tryptamine-HTR2A/6A93 المدمج في الغشاء، تم إجراء تحليل MM-PBSA على النظام الفرعي من البروتين والربيطة المستخلص من مسار الطبقة المزدوجة^46,47. لوحظت مساهمات إيجابية للربيطة و Asp155 (D3.32)، والذي كان المساهم الأكثر هيمنة في الاستقرار على مستوى البقايا، وهو ما يتوافق مع تفاعل الجسر الملحي الذي تم تحديده في كل من تحليلات الإرساء وتحليلات المسافة في المسار. أظهر Trp137 أكبر مساهمة غير مواتية لكل بقية بين بقايا الجيب الأرثوستيري المحيطة (Ser86, Phe87, Phe133, Phe140, Phe141, Val156, Ser159, Thr160, Ile163, Val167, Tyr171)، والتي تشكل معاً شبكة التلامس العطرية والقطبية المبطنة لجيب الارتباط. تمثل هذه القيم تقديرات حاسوبية نسبية لتحديد الأولويات الهيكلية وليست قيم ألفة ارتباط تجريبية.

الشكل 1: سير العمل الحسابي لتحديد أولويات جينات المضيف المرتبطة بالمستقلبات في حالة IBS-C. تمثيل تخطيطي لسير عمل مكون من ثماني مراحل يدمج بين اختيار المستقلبات، والتنبؤ بالأهداف، والتعبير التفاضلي للترانسكريبتوم، وتحليل التداخل، وإثراء الشبكات والمسارات، والالتحام الجزيئي، ومحاكاة الديناميكا الجزيئية، وتحليل طاقة الربط الحرة باستخدام MM-PBSA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: تحليل التعبير التفاضلي وتداخل الأهداف مع المستقلبات في مخاطية IBS-C. (A) مخطط بركاني للتعبير التفاضلي على مستوى الجينات في GSE36701. النقاط الزرقاء تمثل الجينات التي انخفض تعبيرها بشكل ملحوظ؛ النقاط الحمراء تمثل الجينات التي ارتفع تعبيرها بشكل ملحوظ؛ النقاط الرمادية تمثل الجينات غير ذات الدلالة الإحصائية. تم وضع تسميات على جينات مختارة مرتبطة بالمستقلبات والمتداخلة. (B) مخطط فين يوضح التداخل بين 330 هدفًا متوقعًا فريدًا للمستقلبات والجينات ذات التعبير المنخفض في GSE36701؛ حيث كانت هناك 17 جينًا مشتركة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: التقييم الإحصائي للجينات المستهدفة لـ 17 من المستقلبات المتوقعة مقابل GSE36701. (أ) تغير log2 الضعفي لكل جين من الجينات الـ 17، ملونة حسب مستوى الدلالة. (ب) معدل التعبير التفاضلي لجينات الخلفية مقابل الأهداف المتوقعة، باستخدام اختبار فيشر الدقيق (Fisher’s exact test). (ج) تم استخدام جدول تباين ثنائي في ثنائي لاختبار فيشر الدقيق. كانت جميع الأهداف الـ 17 مثبطة التعبير بشكل ملحوظ؛ ويُفسر التداخل على أنه نمط توجيهي وصفي بدلاً من كونه إثراءً إحصائياً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: بناء شبكة تفاعل البروتين-بروتين المركبة وإثراء المسارات لشبكات تفاعل البروتين-بروتين للجينات المتداخلة المرتبطة بالنواتج الأيضية. (A) الشبكة 1: الشبكة الشاملة المجمعة لجميع الجينات الـ 17. (B) الشبكة 2: الشبكة الخاصة بالبروبيونات والتي تضم ثمانية جينات (CASR, FFAR2, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, MLN, TBXA2R). (C) الشبكة 3: شبكة التريبتامين/السيروتونين التي تضم أربعة جينات (HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6). تم إنشاء الشبكات لـ Homo sapiens كحد أدنى، باستخدام بناء شبكة تفاعل البروتين-بروتين وإثراء المسارات بدرجة ثقة ≥ 0.700. تمثل الحواف الارتباط الوظيفي المدعوم بالتوصيف يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: تمثيل بنيوي ثلاثي الأبعاد وثنائي الأبعاد لحمض الليثوكوليك في معقد مع VDR (معرف PDB: 1DB1). (أ) تمثيل سطحي وكرتوني ثلاثي الأبعاد يظهر حمض الليثوكوليك على شكل كرات. (ب) خريطة تفاعلات ثنائية الأبعاد توضح الرابطة الهيدروجينية لـ Ser278 واتصالات فان دير فالس والتفاعلات الكارهة للماء المحيطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6. تمثيل بنيوي ثلاثي الأبعاد وثنائي الأبعاد لحمض الليثوكوليك في معقد مع NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT). (A) تمثيل سطحي وكارتوني ثلاثي الأبعاد. (B) خريطة تفاعلات ثنائية الأبعاد تظهر الروابط الهيدروجينية مع His294 و Ile335، وتفاعل π-Sigma، والاتصالات المحيطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 7: تمثيل بنيوي ثلاثي الأبعاد وثنائي الأبعاد لحمض ursodeoxycholic في معقد مع NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT). (A) تمثيل سطحي وكارتوني ثلاثي الأبعاد. (B) خريطة تفاعلات ثنائية الأبعاد توضح روابط هيدروجينية مع His447 و Gly322، وتفاعل π-Anion مع Val325، ورابطة كربون-هيدروجين مع Trp469، وتلامسات مانح-مانح غير مواتية مع Arg395 و Gln396. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 8: تمثيل هيكلي ثلاثي الأبعاد وثنائي الأبعاد لـ urolithin A في معقد مع CASP3 (PDB ID: 2DKO). (أ) تمثيل سطحي وكرتوني ثلاثي الأبعاد. (ب) خريطة تفاعلات ثنائية الأبعاد توضح الروابط الهيدروجينية مع Gln161 وSer120 وArg207، وتفاعلات π-Cation مع Arg207، ورابطة هيدروجينية من نوع π-Donor مع Cys163، والاتصالات المحيطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 9: تمثيل هيكلي ثلاثي الأبعاد وثنائي الأبعاد للتريبتامين في معقد مع HTR2A (PDB ID: 6A93). (أ) تمثيل سطحي وكارتوني ثلاثي الأبعاد تم إنتاجه باستخدام برنامج تصور جزيئي ثلاثي الأبعاد. (ب) خريطة تفاعلات ثنائية الأبعاد تم إنتاجها باستخدام أداة تصور جزيئي ومخطط تفاعلات ثنائي الأبعاد، توضح الجسر الملحي لـ Asp155 وتفاعلات إضافية في موقع الارتباط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 10: التحقق من صحة بروتوكول الإرساء (Docking). (A,B) إعادة إرساء الربائط المشتركة في البلورة داخل VDR/1DB1 (RMSD 0.87 Å) و FXR/3DCT (RMSD 1.79 Å)؛ تظهر الوضعيات البلورية ووضعيات إعادة الإرساء متراكبة، وكلاهما أقل من عتبة القبول البالغة 2.0 Å. (C) انتقائية الإرساء المتقاطع: درجات Vina للربائط المتوافقة مقابل غير المتوافقة لحمض الليثوكوليك والتريبتامين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 11. تحليل مسار الديناميكيات الجزيئية لمعقد LCA-VDR/1DB1 على مدى 200 ns. (A) مخطط RMSD. (B) مخطط RMSF. (C) عدد الروابط الهيدروجينية. (D) مخطط نصف قطر الدوران. (E) مخطط SASA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 12: تحليل مسار الديناميكا الجزيئية لمعقد urolithin A-CASP3/2DKO على مدار 200 ns. (A) ملف RMSD يظهر تقلبات تشكيلية واسعة وحدث انحراف عالٍ عابر بالقرب من 165 ns. (B) ملف RMSF يظهر مرونة واضحة على مستوى الثمالات بالقرب من الثمالة 175. (C) عدد الروابط الهيدروجينية. (D) ملف نصف قطر الدوران. (E) ملف SASA. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 13: تحليل مسار الديناميكا الجزيئية لأنظمة أحماض الصفراء NR1H4/FXR (3DCT) على مدار 200 ns. (أ) ملف RMSD للهيكل الأساسي لمعقد 3DCT. (ب) ملف RMSF للهيكل الأساسي. (ج) ملف نصف قطر الدوران لـ 3DCT-LCA. (د) ملف نصف قطر الدوران لـ 3DCT-UDCA. (هـ) ملف SASA لـ 3DCT-LCA. (و) ملف SASA لـ 3DCT-UDCA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 14: معقد tryptamine-HTR2A المدمج في طبقة ثنائية ليبيدية صريحة من POPC. يظهر المستقبل على شكل مخطط يمتد عبر الطبقة الثنائية، وتظهر ليبيدات POPC كخطوط مع إبراز مجموعات الفوسفات الرأسية، ويكون tryptamine داخل الجيب الأرثوستيري. يظهر الماء فوق وتحت الغشاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 15: تحليل مسار الديناميكا الجزيئية لمعقد tryptamine-HTR2A/6A93 على مدار 200 ns في طبقة ليبيدية ثنائية صريحة من POPC. (A) مخطط RMSD للعمود الفقري. (B) مخطط RMSF لكل ثمالة. (C) مخطط نصف قطر الدوران. (D) مخطط SASA. (E) عدد الروابط الهيدروجينية بين البروتين والربيطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 16: استمرارية التفاعل الأيوني بين التريبتامين وAsp155 (D3.32) على مدار مسار الغشاء البالغ 200 ns. يتم تمثيل الحد الأدنى للمسافة بين نيتروجين الأمونيوم في التريبتامين وذرات أكسجين الكربوكسيلات في Asp155 مقابل الزمن؛ ويمثل الخط المتقطع عتبة اتصال الجسر الملحي البالغة 0.4 nm. وقد تم الحفاظ على هذا الاتصال بنسبة 99.9% من وقت المحاكاة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

رمز الجين	المستقلبات الأصلية	الفئة الوظيفية	log2FC	FDR (القيمة الاحتمالية المعدلة P-value)	مستوى الدلالة
GCG	Propionate	بروتين مرتبط بهرمون ببتيدي	−1.342	1.97e−7	FDR <0.001 & |logFC > 1
HDAC3	Butyrate	إنزيم	−1.234	2.44e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
CASP3	Urolithin A	إنزيم	−1.198	6.66e−7	FDR <0.001 & |logFC| > 1
GPR68	Propionate	مستقبل غشائي	−1.137	4.35e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
GNAQ	Propionate	بروتين إشارات داخل الخلايا	−1.122	1.05e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
GPHN	Propionate	بروتين آخر داخل الخلايا	−1.109	1.13e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
TBXA2R	Propionate	مستقبل غشائي	−1.104	4.04e−7	FDR <0.001 & |logFC| > 1
HTR6	Tryptamine	مستقبل غشائي	−0.967	2.17e−5	FDR <0.001
VDR	Lithocholic acid	مستقبل نووي	−0.942	5.73e−7	FDR <0.001
HTR2A	Tryptamine	مستقبل غشائي	−0.937	4.99e−6	FDR <0.001
FFAR2	Propionate	مستقبل غشائي	−0.889	1.44e−4	FDR <0.001
NR1H4	Lithocholic acid / Ursodeoxycholic acid	مستقبل نووي	−0.861	3.68e−6	FDR <0.001
HTR2B	Tryptamine	مستقبل غشائي	−0.702	1.29e−4	FDR <0.001
MLN	Propionate	بروتين مرتبط بهرمون ببتيدي	−0.605	7.39e−5	FDR <0.001
KYAT1	Indole-3-lactic acid / Indole-3-propionic acid	إنزيم	−0.530	3.61e−4	FDR <0.001
CASR	Propionate	مستقبل غشائي	−0.483	4.05e−4	FDR <0.001
HTR1B	Tryptamine	مستقبل غشائي	−0.455	3.18e−2	FDR <0.05

الجدول 1: الجينات المستهدفة المرتبطة بالمستقلبات المتوقعة والمتداخلة مع الجينات ذات التعبير المتباين في مجموعة بيانات المخاطية المستقيمية لمرض IBS-C. كانت جميع الجينات المتداخلة المدرجة ذات تعبير منخفض. تم تقديم الجدول 1 بشكل منفصل كجدول بيانات إلكتروني ويوضح، لكل هدف، المستقلب (أو المستقلبات) الأصلية، والفئة الوظيفية، ومصدر التنبؤ بالهدف (التنبؤ بهدف التفاعل بين الكيماويات والبروتينات، أو برنامج الإرساء الجزيئي، أو كلاهما)، ودرجة التفاعل المجمعة للتنبؤ بهدف التفاعل بين الكيماويات والبروتينات، واحتمالية برنامج الإرساء الجزيئي، وحيثما توفرت، مستوى التنبؤ، وlog2 fold change، وFDR مع مستوى دلالة التعبير. المصدر: تم الحصول على قيم التعبير الجيني من جدول التعبير المتباين GSE36701 المدمج للجينات (المسبار ذو أدنى FDR لكل جين). تم تجميع مصدر التنبؤ بالهدف وقيم الثقة من مخرجات التنبؤ بهدف التفاعل بين الكيماويات والبروتينات وبرنامج الإرساء الجزيئي، باستخدام عتبات درجة تفاعل مجمعة للتنبؤ بهدف التفاعل بين الكيماويات والبروتينات ≥ 0.700 واحتمالية برنامج الإرساء الجزيئي ≥ 0.70. درجات التنبؤ بهدف التفاعل بين الكيماويات والبروتينات هي درجات مجمعة على مقياس 0–1؛ يشير STP إلى احتمالية برنامج الإرساء الجزيئي. المستوى 1 = دعم صارم للتنبؤ بهدف التفاعل بين الكيماويات والبروتينات؛ المستوى +1 = دعم صارم للتنبؤ بهدف التفاعل بين الكيماويات والبروتينات مدعوم تقاطعيًا بواسطة برنامج الإرساء الجزيئي.

مُعقّد	البروتين (معرف بنك بيانات البروتينات PDB ID)	رابطة (Ligand)	درجة فينا (كيلوكالوري/مول)	حجم التجويف (A^3)	مركز الشبكة X,Y,Z (أ)	صندوق البحث (أ)
LCA-VDR	VDR (1DB1)	حمض الليثوكوليك	−10.0	2055	10, 19, 33	٢٥ × ٢٥ × ٢٥
حمض الليثوكوليك-NR1H4/FXR	NR1H4/FXR (3DCT)	حمض الليثوكوليك	−9.9	3395	137, 31, 78	٢٥ × ٢٥ × ٢٥
UDCA-NR1H4/FXR	NR1H4/FXR (3DCT)	حمض أورسوديوكسي كوليك	−9.4	3395	137, 31, 78	25 × 25 × 25
يوروليثين أ-كاسبيز 3	CASP3 (2DKO)	يوروليثين أ (Urolithin A)	−7.1	233	37, 34, 32	25 × 25 × 25
تريبتامين-HTR2A	HTR2A (6A93)	تريبتامين	−7.1	3238	12, −1, 61	٢٥ × ٢٥ × ٢٥

الجدول 2: نتائج الالتحام الجزيئي: أعلى درجات الالتحام الجزيئي لربيطات المستقلبات مع البروتينات المستهدفة ومعايير التجويف لخمسة معقدات بروتين-ربيطة ذات أولوية. يتم التعبير عن حجم التجويف بـ ų. المصدر: Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsx، ورقة 'Original_Docking_Scores'. الالتحام الجزيئي لربيطات المستقلبات مع البروتينات المستهدفة؛ الشمولية = 8، البذرة = 42 (ثابتة)، عدد الأنماط = 9 لجميع المعقدات؛ تم تسجيل وضعية الأعلى تصنيفاً (النمط 1).

نوع التفاعل	الثمالة (الثمالات)	المسافة (أ)	ملاحظات
الرابطة الهيدروجينية التقليدية	Ser278	4.29	أكسجين الكربوكسيلات في LCA
تلامس كاره للماء / بي-ألكيل (Pi-Alkyl)	Leu230, Val234, Trp286, Val300, His305, Tyr295, Leu233, His397	-
تلامس فان دير فالس	Met272, Leu313, Ile271, Ile268, Leu309, Phe422, Val418, Ala231, Ala303, Cys288, Ser275, Phe150	-

الجدول 3: أوضاع الارتباط الناتجة عن عملية إرساء حمض الليثوكوليك مع مستقبل فيتامين د (VDR) (معرف PDB: 1DB1). المصدر: أداة التصوير الجزيئي ومخططات التفاعل ثنائية الأبعاد، كما ورد في قسم النتائج (الإرساء الجزيئي) في المخطوطة. تشير العلامة '-' إلى أن قيمة المسافة لم تُذكر بشكل منفصل لهذا التلامس.

نوع التفاعل	الثمالة (الثمالات)	المسافة (أ)	ملاحظات
رابطة هيدروجينية	His294	-
الرابطة الهيدروجينية	Ile335	-
تآثر باي-سيجما	His294	-
ألكيل / باي-ألكيل (كاره للماء)	Met290, Met328, Ala291, Leu287, Ile352, His447	-
تلامس فان دير فالس	بقايا جيب إضافية (غير محددة بشكل فردي في المصدر)	-	يدعم استيعاب السقالة الستيرويدية

الجدول 4: أنماط الارتباط الناتجة عن عملية الإرساء لحمض الليثوكوليك مع NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT).

المصدر: أداة التصور الجزيئي ومخطط التفاعل ثنائي الأبعاد، مخططات تفاعل الربيطة مع البقايا ثنائية الأبعاد، كما ورد في قسم النتائج (الرسو الجزيئي) في المخطوطة. تشير العلامة '-' إلى أن قيمة المسافة لم تُذكر بشكل فردي لهذا الاتصال.

نوع التفاعل	الثمالة (الثمالات)	المسافة (A)	ملاحظات
رابطة هيدروجينية تقليدية	His447	3.66
رابطة هيدروجينية	Gly322	3.46
تفاعل باي-أنيون	Val325	4.96
رابطة كربون-هيدروجين	Trp469	4.51
تلامس غير مواتٍ بين مانح ومانح	Arg395	3.89
تلامس غير مواتٍ بين مانح ومانح	Gln396	3.40

الجدول 5: أنماط الارتباط الناتجة عن رسو حمض أورسوديوكسي كوليك مع NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT). المصدر: أداة التصور الجزيئي ومخططات التفاعل ثنائية الأبعاد، كما ورد في نتائج المخطوطة (الرسو الجزيئي). تشير علامة '-' إلى أن قيمة المسافة لم يتم الإبلاغ عنها بشكل فردي لهذا التلامس.

نوع التفاعل	الثمالة (الثمالات)	المسافة (A)	ملاحظات
رابطة هيدروجينية تقليدية	Gln161	3.78
رابطة هيدروجينية تقليدية	Gln161	4.19	اتصال ثانٍ
رابطة هيدروجينية تقليدية	Ser120	3.95
رابطة هيدروجينية تقليدية	Arg207	3.05
رابطة هيدروجينية تقليدية	Arg207	3.77	اتصال ثانٍ
تفاعل Pi-Cation	Arg207	-
رابطة هيدروجينية Pi-Donor	Cys163	-
اتصال Pi-Alkyl / فان دير فالس	Arg64, Ala162, His121, Ser205, Trp206	-

الجدول 6: أنماط الارتباط الناتجة عن عملية إرساء الـ urolithin A مع البروتين CASP3 (PDB ID: 2DKO). المصدر: أداة التصور الجزيئي ومخططات التفاعل ثنائية الأبعاد لتفاعلات الربيطة والمخلفات، كما ورد في قسم النتائج (الإرساء الجزيئي) في المخطوطة. تشير العلامة '-' إلى عدم تسجيل قيمة مسافة بشكل فردي لهذا التلامس.

نوع التفاعل	الثمالة (الثمالات)	المسافة (A)	ملاحظات
جسر ملحي إلكتروستاتيكي	Asp155 (D3.32)	-	أمين مبرتن من التريبتامين
رابطة هيدروجينية	Thr160	-
رابطة هيدروجينية	Ser159	-
تلامس أروماتي	Phe340, Trp336	-
تفاعل Pi-Alkyl	Val156, Ile163	-
تلامس فان دير فالز	Tyr370, Phe339, Ser242, Phe243, Phe332, Leu123	-

الجدول 7: أنماط الارتباط الناتجة عن رسو التريبتامين مع HTR2A (PDB ID: 6A93). المصدر: أداة التصور الجزيئي ومخططات التفاعل ثنائية الأبعاد، كما ورد في قسم النتائج (الرسو الجزيئي) في المخطوطة. تشير علامة '-' إلى أن قيمة المسافة لم يتم تسجيلها بشكل فردي لهذا الاتصال.

(أ) التحقق من إعادة الإرساء (ضوابط إيجابية)
معرف PDB	البروتين	الربيطة المتبلورة معاً	درجة Vina (kcal/mol)	RMSD (A)	العتبة (A)	النتيجة
1DB1	VDR	VDX (vitamin D analogue)	−13.0	0.87	2.0	ناجح
3DCT	FXR	WAY-362450 (064)	−11.9	1.79	2.0	ناجح
(ب) التحقق من الإرساء المتقاطع (ضوابط سلبية)
الربيطة	الهدف المتوافق (PDB)	درجة التوافق (kcal/mol)	الهدف غير المتوافق (PDB)	درجة غير التوافق (kcal/mol)	Delta (kcal/mol)	الانتقائية
Lithocholic acid	VDR (1DB1)	−10.0	CASP3 (2DKO)	−8.3	1.7	مؤكدة
Tryptamine	HTR2A (6A93)	−7.1	VDR (1DB1)	−6.4	0.7	متواضعة (ضمن نطاق عدم اليقين لـ Vina +/−0.5–1.0)

الجدول 8: نتائج التحقق من بروتوكول الإرساء: قيم RMSD لإعادة الإرساء (عناصر التحكم الموجبة) ودرجات الإرساء المتقاطع (عناصر التحكم السالبة). المصدر: Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsx و Docking_Validation/Logs/*.log (إرساء جزيئي لربيطات المستقلبات على البروتينات المستهدفة، الشمولية = 8، البذرة = 42، صندوق بأبعاد 25 Å × 25 Å × 25 Å). تم حساب RMSD عن طريق مطابقة الذرات الثقيلة وأسماء الذرات (بدون تراكب).

المعقد	RMSD (nm)، المتوسط + / – الانحراف المعياري (المدى)	Rg (nm)، المتوسط + / – الانحراف المعياري (المدى)	SASA (nm^2)، المتوسط + / – الانحراف المعياري (المدى)	الروابط الهيدروجينية، المتوسط + / – الانحراف المعياري (المدى)	RMSF (nm)، المتوسط (الحد الأقصى)
LCA-VDR/1DB1	0.230 + / – 0.025 (0.167–0.296)	1.889 + / − 0.009 (1.863–1.919)	130.4 + / − 2.3 (122.3–137.4)	1.9 + / − 0.9 (0–7)	0.093 (الحد الأقصى 0.600 عند الثمالة 120)
LCA-NR1H4/FXR/3DCT	0.190 + / – 0.020 (0.135–0.281)	1.824 + / − 0.008 (1.804–1.849)	129.7 + / − 2.3 (121.9–138.1)	3.8 + / − 0.7 (1–6)	0.113 (الحد الأقصى 0.298)
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	0.190 + / – 0.020 (0.135–0.281)	1.834 + / − 0.013 (1.809–1.921)	131.0 + / −3.4 (121.6–143.5)	1.1 + / − 1.1 (0–5)	0.113 (الحد الأقصى 0.298)
Urolithin A-CASP3/2DKO	0.521 + / – 0.058 (0.244–0.755)	1.892 + / − 0.024 (1.839–1.984)	134.9 + / − 3.0 (126.4–146.4)	0.6 + / − 0.7 (0–3)	1.172 (الحد الأقصى 2.532 عند الثمالة 175)
Tryptamine-HTR2A/6A93 (الغشاء)	0.177 + / –0.017 (0.131–0.227)	2.089 + / − 0.007 (2.070–2.116)	165.1 + / − 2.7 (156.–172.7)	1.7 + / − 0.7 (0–4)	0.090 (الحد الأقصى 0.319)

الجدول 9: ملخص لسلوك محاكاة الديناميكا الجزيئية لمدة 200 ns للخمسة معقدات ذات الأولوية من البروتين والرابط، بما في ذلك نظام tryptamine-HTR2A المدمج في الغشاء. المصدر: ملفات أدوات تحليل مسار الديناميكا الجزيئية (.xvg) — gmx rms، وgmx gyrate، وgmx sasa، وgmx hbond، وgmx rmsf — التي تم حسابها على مدار آخر 150 ns (من 50 إلى 200 ns) من كل تشغيل إنتاجي مدته 200 ns، وفقاً للخطوة 8.8 من البروتوكول. تم ملاءمة RMSD/Rg للهيكل الأساسي؛ نصف قطر مسبار SASA هو 0.14 nm؛ حد قطع المانح-المستقبل للرابطة الهيدروجينية H-bond هو 0.35 nm / 30 °. يتشارك LCA-3DCT و UDCA-3DCT في مسار واحد للهيكل الأساسي للبروتين (RMSD، RMSF) مع Rg/SASA/H-bonds خاصة بكل رابط.

Tryptamine-HTR2A/6A93 (الغشاء) — تفكيك كمي لكل ثمالة
الثمالة	إجمالي مساهمة ddG (kcal/mol)، المتوسط + / − الانحراف المعياري SD	الاتجاه
Asp155 (D3.32)	−89.94 + / − 6.81	مثبت (سائد)
Tryptamine (الربيطة)	−13.01 + / − 6.22	مثبت
Tyr171	13.62 + / − 4.54	مزعزع
Val167	23.32 + / − 3.96	مزعزع
Val156	20.03 + / − 3.81	مزعزع
Thr160	4.86 + / − 3.64	مزعزع
Ser159	24.16 + / − 3.48	مزعزع
Ser86	24.48 + / − 3.65	مزعزع
Phe87	35.18 + / − 4.04	مزعزع
Phe133	32.80 + / −3.70	مزعزع
Phe140	30.63 + / − 3.84	مزعزع
Phe141	35.25 + / − 3.55	مزعزع
Ile163	27.64 + / − 3.71	مزعزع
Trp137	53.77 + / − 4.32	مزعزع (أكبر تأثير غير مواتٍ)
المعقدات الأربعة الأخرى — الثمالات المحددة في التفكيك لكل ثمالة (نوعي)
المعقد	الثمالة	الاتجاه
LCA-VDR/1DB1	الربيطة (LCA)	مواتٍ
LCA-VDR/1DB1	Gln317	مواتٍ
LCA-VDR/1DB1	Trp286	غير مواتٍ
LCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg331	مواتٍ (سائد)
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Glu326	شبكة مختلطة/موزعة
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Asp394	شبكة مختلطة/موزعة
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg395	شبكة مختلطة/موزعة
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg441	شبكة مختلطة/موزعة
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Asp470	شبكة مختلطة/موزعة
Urolithin A-CASP3/2DKO	Arg64	مواتٍ بشدة (قطبي/إلكتروستاتيكي)
Urolithin A-CASP3/2DKO	Arg207	مواتٍ بشدة (قطبي/إلكتروستاتيكي)

الجدول 10: تفكيك MM-PBSA لكل ثمالة ملخص قصير: الثمالات المثبتة والمزعزعة للاستقرار (مساهمة مطلقة ≥ 0.5 kcal mol⁻¹) لكل من معقدات البروتين-الربيطة الخمس ذات الأولوية، بما في ذلك نظام tryptamine-HTR2A المدمج في الغشاء.المصدر: Membrane Simulation/03_MMPBSA/results/FINAL_DECOMP_MMPBSA.dat (أداة حساب طاقة الارتباط بميكانيكا الجزيئات/المذيب المستمر تفكيك Generalized Born (GB) لكل ثمالة، 'Complex: Total Energy Decomposition'). تم تحويل أرقام الثمالات من الترقيم الداخلي للنظام المبني بواسطة CHARMM-GUI (إزاحة +68) إلى ترقيم PDB 6A93 الأصلي المستخدم في مواضع أخرى من هذه المخطوطة.

المصدر: بيانات محاكاة الديناميكا الجزيئية السابقة/1DB1,2KD0, LCA & UDCA_3DCT}/mmpbsa_*/Decomposition_NORMAL_GB_Complex_TDC*.svg ونتائج المخطوطة (طاقة الربط الحرة بطريقة MM-PBSA والتحلل لكل ثمالة). لا توجد لهذه المعقدات الأربعة مخرجات عددية بتنسيق .dat/.csv لكل ثمالة في دليل المشروع (توجد فقط مخططات SVG مُصيرة بنصوص مسارات متجهية غير قابلة للاستخراج آلياً)؛ وقد تم الإبلاغ فقط عن هوية الثمالة والاتجاه المفضل/غير المفضل، كما ورد في نص المخطوطة. مساهمات kcal/mol الدقيقة لهذه المعقدات الأربعة غير متوفرة في المستودع المصدري.

المناقشة

توضح هذه الدراسة الحسابية الاستكشافية سير عمل متكامل وقابل للتكرار لتحديد أولويات الجينات المضيفة المرتبطة بالمستقلبات الميكروبية ومعقدات البروتين-الربيطة، والتي طُبقت هنا على مجموعة بيانات ترانسكريبتومية عامة للغشاء المخاطي المستقيم لمرضى متلازمة القولون المتهيج المصحوب بإمساك (IBS-C). وباستخدام سير العمل هذا، تداخلت مجموعة فرعية من الجينات المتوقعة المرتبطة بالمستقلبات الميكروبية مع جينات تم خفض تعبيرها بشكل مستمر في مجموعة البيانات، حيث تجمعت ضمن مسارات GPCR، والمسارات السيروتونينية، وإشارات الكالسيوم، ومستقبلات الربيطات النشطة عصبيًا، والمسارات المرتبطة بالمستقبلات النووية، وهي أنظمة يزداد تورطها في التواصل بين الميكروبات والمضيف^48,49. ويجب تفسير هذه النتائج بدقة على أنها مولدة للفرضيات فقط؛ حيث أن التحليل لا يقيس تركيزات المستقلبات الميكروبية، أو وفرة بروتين المستقبلات، أو ارتباط الربيطة، أو تنشيط المستقبلات، أو إشارات المصب، أو الحركية، أو الإفراز، أو استجابات الألم، أو النتائج السريرية. وأقوى استنتاج يمكن دعمه هو أن الجينات والمسارات المحددة هي مرشحة للتحقق التجريبي وليست آليات مرضية مؤكدة.

تكمن الأهمية البالغة لهذا البروتوكول، مقارنة بالأعمال السابقة التي درست أزواج المستقلب-المستقبل بشكل منفرد، في دمجه للتنبؤ بالأهداف، والترانسكريبتوميات العامة، وتحليل الشبكات، والارتباط الجزيئي مع ضوابط التحقق، والديناميكيات الجزيئية، وMM-PBSA ضمن مسار تسلسلي واحد لتحديد الأولويات. حيث تعمل كل مرحلة على تضييق وسياق مجموعة المرشحين الناتجة عن المرحلة السابقة، وهذا الترشيح التسلسلي هو ما يجعل قائمة المرشحين النهائية قابلة للتنفيذ تجريبياً. وتعتبر وحدة GPCR المتمحورة حول GNAQ والوحدة المرتبطة بمستقبل السيروتونين المحددة هنا منطقية بيولوجياً بالنظر إلى دور إشارات Gq في تنشيط phospholipase C، وإنتاج inositol 1,4,5-trisphosphate، وتعبئة الكالسيوم، والإفراز، والوظيفة المعوية الصماوية، والأدوار الراسخة لإشارات الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة والتربتوفان في التوازن المخاطي، وإشارات السيروتونين في الحركية المعدية المعوية، والإفراز، والحساسية الحشوية، والتواصل بين الأمعاء والدماغ^10,18,50,51.

تتمثل إحدى السمات المنهجية الرئيسية لهذه الدراسة في التعامل مع المستقبل HTR2A المدمج في الغشاء. ونظراً لأن محاكاة الطور الذائب لا يمكنها إعادة إنتاج البيئة الدهنية التي تحكم السلوك التشكيلي للمستقبل المقترن ببروتين G، فقد تمت محاكاة معقد tryptamine-HTR2A في طبقة ثنائية صريحة من POPC. وفي هذه البيئة الغشائية، ظل المستقبل مستقراً هيكلياً على مدار مسار المحاكاة الكامل الذي استمر لمدة 200 ns، كما تم الحفاظ على الجسر الملحي بين أمونيوم tryptamine و Asp155 (D3.32) طوال فترة المحاكاة تقريباً. إن التقاء ثلاثة أدلة مستقلة -وضعية الارتباط (docking pose)، ومسافة التلامس المستمرة عبر مسار المحاكاة، ومساهمة MM-PBSA السائدة لكل ثمالة- حول التفاعل المحفوظ نفسه لـ D3.32 يمنح اتساقاً داخلياً لنمط ارتباط tryptamine المتوقع، والذي يعيد إنتاج هندسة الارتباط النموذجية للربيطات الأمينية في مستقبلات السيروتونين.

هناك بعض المسائل المنهجية التي يجب مراعاتها عند إعادة إنتاج سير العمل هذا. إن الأخطاء في البنية القانونية أو المركبات التي تسبب تداخلاً في الاختبارات العامة ((PAINS)- flagged compounds) تنتقل عبر التنبؤ بالأهداف والرسو الجزيئي، مما يتطلب اختياراً دقيقاً للمستقلبات وتنسيقاً كيميومعلوماتياً. يجب تقليل مجموعات الأهداف المدفوعة بالضجيج من خلال تطبيق معايير الثقة باستمرار (التنبؤ بأهداف التفاعل بين الكيميائيات والبروتينات: ≥0.700؛ برنامج الرسو الجزيئي: ≥0.70؛ بناء شبكة التفاعلات بين البروتينات وإثراء المسارات: ≥0.700). وينبغي تجميع الأهداف المتوقعة حسب الفئة الوظيفية لتجنب التوصيف الخاطئ لجميع الجينات المرتبطة بالمستقلبات على أنها مستقبلات. ويُعد المعالجة المسبقة الدقيقة لبنى PDB، وتقليل طاقة الرابطة، ووضع الشبكة حول بقايا الربط المعروفة جوانب أساسية في عملية الرسو، كما توفر ضوابط إعادة الرسو والرسو المتقاطع المقدمة هنا مقياساً موضوعياً لصحة منهجية الرسو. ويتم تحديد نطاق إمكانية التكرار في الديناميكيات الجزيئية من خلال مزيج من تحديد معاملات حقل القوة، والترطيب المناسب أو بناء الغشاء، والتوازن المتدرج، وأخذ عينات الإنتاج الكافية.

تشمل التعديلات المعتادة وخطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها تخفيف العتبات إذا لم تسفر التنبؤات المستهدفة عن أي نتائج، والتحقق من الاتساق الاتجاهي على مستوى المسبار للجينات التي تحتوي على مسبارات متعددة، وتفسير عقد بناء شبكة التفاعل بين البروتينات وإثراء المسارات المعزولة على أنها تعتمد على العتبة بدلاً من اعتبارها غير ذات صلة بيولوجياً. بالنسبة لمستقبلات الغشاء، يجب استخدام محاكاة صريحة لطبقة الليبيد الثنائية بدلاً من المحاكاة المائية، كما هو موضح في طريقة HTR2A الموصوفة هنا. وعندما يكون تحليل تفكيك الطاقة لكل بقايا ضرورياً، يجب إجراء الحساب باستخدام محرك قادر على التفكيك، كما يجب مطابقة ترقيم البقايا المُبلغ عنه مع ترقيم المستقبل الأصلي لتجنب الغموض. ونقترح التعامل مع نتائج إثراء المسارات كسياق تنظيمي لقائمة المرشحين بدلاً من اعتبارها تحققاً على مستوى المسار. ومن الناحية الميكانيكية، سيحدث إثراء لمصطلحات GPCR، أو السيروتونينية، أو إشارات الكالسيوم كلما احتوت قائمة الجينات على جينات متعددة لمستقبلات السيروتونين، بغض النظر عن التنظيم المشترك على مستوى البروتين. كما يجب تفسير قيم RMSD و Rg و RMSF لنظام HTR2A المدمج في الغشاء مع مراعاة طبقة الليبيد الثنائية؛ حيث قد يعكس انخفاض Rg في المسار اللاحق تكيفاً تشكيلياً لحزمة عبر الغشائية مدفوعاً بالطبقة الثنائية بدلاً من الانكشاف العالمي، ويجب تفسير الروابط الهيدروجينية المستمرة بين الليجاند والبروتين جنباً إلى جنب مع استقرار RMSD العام.

إن القيود التي شابت هذه الدراسة كبيرة وتحد من عملية التفسير. فقد استند البحث إلى مجموعة بيانات عامة واحدة صغيرة نسبيًا، ولم يسفر البحث في المستودعات العامة الرئيسية للترانسكريبتوم (أداة تحليل التعبير الجيني التفاضلي القائمة على الويب وArrayExpress) عن تحديد مجموعة بيانات مستقلة لترانسكريبتوم المخاطية المستقيمة لمرضى IBS-C ذات تصميم ومنصة مماثلة يمكن أن تكون بمثابة مجموعة تكرارية وقت التحليل. ويُعد غياب التكرار الترانسكريبتومي المستقل قيداً رئيسياً، ولا ينبغي تفسير أي عبارة في هذه المخطوطة على أنها تحقق خارجي لنتائج مجموعة البيانات الواحدة. تُظهر مجموعة البيانات تعبيراً تفاضلياً شبه شامل (حوالي 94.5% من الجينات ذات دلالة، والغالبية العظمى منها مثبطة)، وهي خاصية تجعل إحصائيات الإثراء التقليدية غير مفيدة وتمنع استخلاص استنتاجات حول خصوصية تثبيط الجينات المستهدفة مقارنة بالخلفية الجينومية؛ وبناءً على ذلك، تم الإبلاغ عن التداخل كنمط اتجاهي وصفي بدلاً من إثراء إحصائي. كما أن تحليلات الترانسكريبتوم للمخاطية الكلية (Bulk mucosal transcriptomics) لا يمكنها التمييز بين التنظيم الجيني الفعلي والتغيرات في التكوين الخلوي. ولا يحدد تعبير mRNA وفرة البروتين أو الاستجابة الوظيفية. وتعاني قواعد بيانات التنبؤ بالأهداف من تحيز التوصيف، كما تعتمد نتائج docking وMD وMM-PBSA على اختيار حقل القوة، ومعايير الربيطة (ligand parameterization)، والموضع الابتدائي، ووقت المحاكاة، وكفاية أخذ العينات. إن المعرفات الدقيقة للإصدارات/البناء لبعض مكونات خادم الويب والحزم، بما في ذلك خدمة معايير الربيطة المتوافقة مع CHARMM، وCHARMM-GUI، وبيئة الحوسبة الإحصائية

لم يكن من الممكن استعادة إصدارات بناء الحزم، والإصدارات الفرعية لأداة حساب طاقة الارتباط بالميكانيكا الجزيئية/المذيب المستمر بشكل كامل من سجل المشروع المؤرشف، ويجب الإبلاغ عنها على أنها متوفرة في جدول المواد المنفصل. وتعتبر قيم MM-PBSA تقديرات نسبية، ولا تحتوي على حد صريح لإنتروبيا التشكيل، ولا ينبغي تفسيرها على أنها ألفات تجريبية. تفتقر الدراسة إلى البيانات الميتابولومية، ولا يمكنها تحديد ما إذا كانت وفرة الربيطة تتغير في حالات IBS-C، أو ما إذا كانت تغيرات التعبير الملاحظة هي مسببات، أو نتائج، أو استجابات تعويضية، أو ارتباطات غير ذات صلة.

يجب أن تشمل التطبيقات المستقبلية لهذه الطريقة تكرار النسخ الترانسكريبتومي بشكل مستقل، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)، والتحقق من مستوى البروتين، وتحديد موقع النوع الخلوي عن طريق الترانسكريبتوميات أحادية الخلية أو الترانسكريبتوميات المكانية، والتنميط الميتابولومي لفئات المستقلبات ذات الصلة، ومقايسات استجابة الربيطة الوظيفية في الكولونيدات المشتقة من المرضى، أو المستأصلات المخاطية، أو النماذج المماثلة. ومن شأن إجراء مقارنات مع مجموعات مرضى متلازمة القولون المتهيج ذات الغلبة الإسهالية، ومتلازمة القولون المتهيج المختلطة، ومرض الأمعاء الالتهابي، ومجموعات الإمساك غير المرتبط بمتلازمة القولون المتهيج^1,2 أن تساعد في تحديد خصوصية المرض. أما بالنسبة للمكون الهيكلي، فإن تكرار مسارات الديناميكا الجزيئية (MD)، وإجراء تحليلات الحساسية باستخدام وضعيات بداية بديلة، والتوثيق الكامل لإيداع الطوبولوجيا، والمسارات، وملفات مدخلات ومخرجات MM-PBSA، من شأنه أن يعزز قابلية إعادة الإنتاج بشكل أكبر. وتظل مقايسات استجابة الربيطة التجريبية ضرورية لتحديد ما إذا كانت المعقدات ذات الأولوية ذات صلة وظيفية؛ حيث لا تدعم النتائج الحالية أي ادعاءات سريرية أو علاجية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
AutoDock Vina	مؤسسة سكريبس للأبحاث / مفتوح المصدر	v1.2.7؛ https://vina.scripps.edu/	الالتحام الجزيئي لربيطات المستقلبات بالبروتينات المستهدفة.
CGenFF/ParamChem	SilcsBio / جامعة ميريلاند	v4.6؛ https://cgenff.com/	توصيف معاملات حقل القوة للّجين في المحاكاة الديناميكية الجزيئية.
حقل القوة CHARMM36m	مطورو CHARMM / مفتوح المصدر	CHARMM36m؛ https://www.charmm.org/charmm/resources/charmm-force-fields/	حقل القوة البروتيني المستخدم في محاكاة الديناميكيات الجزيئية.
أداة بناء الغشاء CHARMM-GUI	CHARMM-GUI / جامعة ليهاي	خادم ويب؛ الإصدار الدقيق غير قابل للاسترداد؛ https://www.charmm-gui.org/?doc=input/membrane	إعداد بناء وموازنة نظام غشاء POPC الصريح.
برنامج Discovery Studio Visualizer	BIOVIA (Dassault Systèmes)èأشهر)	2021؛ https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download	تحليل ثنائي الأبعاد للتفاعل بين الربيطة والثمالة.
GEO2R	قاعدة بيانات التعبير الجيني NCBI Gene Expression Omnibus	أداة ويب؛ تم الدخول إليها في الفترة من يناير إلى مايو 2026؛ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/	تحليل التعبير التفاضلي لـ GSE36701.
GeneCards	معهد ويزمان للعلوم	قاعدة بيانات إلكترونية؛ تم الدخول إليها في الفترة من يناير إلى مايو 2026؛ https://www.genecards.org/	التحقق من رمز الجين ومعلومات الجين أثناء توحيد الهدف.
gmx_MMPBSA	مفتوح المصدر (Valdé(s-Tresanco وآخرون)	1.5.x؛ https://valdes-tresanco-ms.github.io/gmx_MMPBSA/	تقدير الطاقة الحرة للارتباط بطريقة MM-PBSA والتحلل لكل ثمالة.
GROMACS	فريق تطوير GROMACS / مفتوح المصدر	2024.2؛ https://www.gromacs.org/	محرك محاكاة الديناميكيات الجزيئية.
مجموعة بيانات النسخ GSE36701	مستودع بيانات التعبير الجيني التابع للمركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI Gene Expression Omnibus)	GSE36701؛ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE36701	مجموعة بيانات التعبير الجيني العامة لغشاء المستقيم في حالات متلازمة القولون المتهيج المصحوبة بإمساك (IBS-C).
أوبن بابيل (Open Babel)	مفتوح المصدر	3.2.0؛ https://openbabel.org/	تحويل تنسيق الملفات الكيميائية، وتوليد الربائط ثلاثية الأبعاد، وتحضير الربائط.
قاعدة بيانات OPM	جامعة ميشيغان	قاعدة بيانات ويب؛ تم الدخول إليها في الفترة من يناير إلى مايو 2026؛ https://opm.phar.umich.edu/	توجيه البروتينات في الأغشية؛ الإحداثيات المستخدمة لمحاذاة HTR2A.
ParmEd	مطورو ParmEd / مفتوح المصدر	4.x؛ https://parmed.github.io/ParmEd/html/index.html	إعادة توزيع كتلة الهيدروجين ومعالجة طوبولوجيا المحاكاة الجزيئية.
PyMOL	شرايدرöدينجر / مفتوح المصدر	2.x؛ https://www.pymol.org/	التصور البنيوي ثلاثي الأبعاد وأشكال المستقبل والربيطة.
بنك بيانات البروتينات RCSB	RCSB PDB	قاعدة بيانات إلكترونية؛ تم الدخول إليها في الفترة من يناير إلى مايو 2026؛ https://www.rcsb.org/	مصدر البنى البروتينية التجريبية وإحداثيات بنك بيانات البروتينات (PDB).
STITCH	اتحاد STITCH (EMBL)	v5.0؛ https://stitch.embl.de/	التنبؤ بأهداف التفاعل بين الكيماويات والبروتينات.
يرجى تقديم النص المراد ترجمته.	اتحاد STRING / ELIXIR	v12.0؛ https://version-12-0.string-db.org/	بناء شبكة التفاعلات البروتينية-البروتينية وإثراء المسارات.
SwissADME	المعهد السويسري للمعلوماتية الحيوية (SIB) / جامعة لوزان	أداة ويب؛ تم الوصول إليها في الفترة من يناير إلى مايو 2026؛ https://www.swissadme.ch/	واصفات المعلوماتية الكيميائية، وتنبؤات الحرائك الدوائية، وتقييم مركبات PAINS.
SwissTargetPrediction	المعهد السويسري للمعلوماتية الحيوية SIB / جامعة لوزان	أداة ويب؛ تم الوصول إليها في الفترة من يناير إلى مايو 2026؛ https://www.swisstargetprediction.ch/	التنبؤ بأهداف البروتين البشرية استناداً إلى الربيطة.
تعيين معرفات UniProt	اتحاد UniProt	خدمة ويب؛ تم الدخول إليها في الفترة من يناير إلى مايو 2026؛ https://www.uniprot.org/id-mapping	ربط معرفات البروتين برموز الجينات الموحدة والمعتمدة من قبل لجنة تسمية الجينات البشرية (HGNC).
NVIDIA RTX 3080	شركة NVIDIA Corporation	RTX 3080؛ ≥ذاكرة وصول عشوائي للفيديو (VRAM) بسعة 8 جيجابايت؛ إصدار CUDA/برنامج التشغيل غير محدد في المخطوطة	وحدة معالجة رسومات تدعم تقنية CUDA تُستخدم في محاكاة الديناميات الجزيئية.
وحدة معالجة رسومات (GPU) متوافقة مع CUDA	شركة NVIDIA	لم يتم تحديد إصدار مجموعة أدوات CUDA في المخطوطة؛ ≥ذاكرة وصول عشوائي للفيديو (VRAM) بسعة 8 جيجابايت	وحدة معالجة رسوميات (GPU) تدعم تقنية CUDA مع ≥ذاكرة وصول عشوائي للفيديو (VRAM) بسعة 8 جيجابايت؛ كما تطلب محطة العمل أيضاً ≥ذاكرة وصول عشوائي (RAM) بسعة 32 جيجابايت ووحدة معالجة مركزية (CPU) سداسية النواة.
أوبونتو لينكس (Ubuntu Linux)	شركة Canonical Ltd. / مفتوح المصدر	22.04 LTS	نظام تشغيل Linux بنظام 64 بت.
Python 3.9	مؤسسة برمجيات بايثون (Python Software Foundation)	3.9	بيئة برمجة عامة الغرض تُستخدم لكتابة نصوص سير العمل والتحليل.
مستودع التعبير الجيني (GEO)	المركز الوطني لمعلومات التقانة الحيوية (NCBI) / المكتبة الوطنية الأمريكية للطب	مستودع ويب عام؛ لم يتم تحديد إصدار البرنامج في المخطوطة	مستودع بيانات الجينوميات الوظيفية العام.
AutoDockTools/MGLTools	مختبر الرسوميات الجزيئية، Scripps Research	1.5.7	مجموعة أدوات تحضير البنية الجزيئية ومدخلات الإرساء.
أدوات تحليل GROMACS	فريق تطوير GROMACS / مفتوح المصدر	2024.2	أدوات تحليل مسارات الديناميكا الجزيئية.
بروتوكول CHARMM-GUI المكون من ست خطوات	CHARMM-GUI / جامعة ليهاي	بروتوكول الويب؛ تعذر استعادة الإصدار الدقيق	سير عمل قائم على الويب لتحضير وموازنة الأنظمة الجزيئية متعددة المراحل.
cgenff_charmm2gmx_py3.py	نص برمجي للتحويل مفتوح المصدر؛ لم يتم تحديد المصدر في المخطوطة	لم يتم تحديد الإصدار في المخطوطة	نص برمجي لتحويل توبولوجيا حقل القوة.
بايثون	مؤسسة برمجيات بايثون (Python Software Foundation)	3.9	بيئة برمجة للأغراض العامة.
SciPy	مجتمع SciPy / مفتوح المصدر	لم يتم تحديد الإصدار في المخطوطة	مكتبة الحوسبة العلمية.
scipy.stats.fisher_exact	مجتمع SciPy / مفتوح المصدر	إصدار SciPy غير محدد في المخطوطة	فيشر’تنفيذ اختبار فيشر الدقيق (Fisher's exact test).
R	مؤسسة R للحوسبة الإحصائية	4.3.x	بيئة الحوسبة الإحصائية.
Bioconductor	مشروع Bioconductor / مفتوح المصدر	3.18	إطار عمل برمجيات المعلوماتية الحيوية.
limma	مشروع Bioconductor / مفتوح المصدر	الإصدار غير محدد في المخطوطة	حزمة تحليل التعبير الجيني التفاضلي.
بنجاميني–إجراء هوكبيرج	الطريقة الإحصائية	غير قابل للتطبيق (إجراء إحصائي)	طريقة تصحيح معدل الاكتشافات الخاطئة.
NVIDIA RTX 3080	NVIDIA Corporation	RTX 3080؛ ≥ذاكرة وصول عشوائي للفيديو (VRAM) بسعة 8 جيجابايت؛ إصدار CUDA/برنامج التشغيل غير محدد في المخطوطة	وحدة معالجة رسومات بذاكرة فيديو لا تقل عن 8 جيجابايت.
وحدة معالجة رسوميات متوافقة مع CUDA	شركة NVIDIA	لم يتم تحديد إصدار مجموعة أدوات CUDA في المخطوطة؛ ≥ذاكرة وصول عشوائي للفيديو بسعة 8 جيجابايت	وحدة معالجة الرسوميات التي تدعم الحوسبة المتوازية للأغراض العامة.
Ubuntu Linux 22.04 LTS	شركة Canonical Ltd. / مفتوح المصدر	22.04 LTS	نظام تشغيل لينكس (Linux) بمعمارية 64 بت.
TIP3P	مطورو حقل القوة CHARMM / مفتوح المصدر	TIP3P؛ لا ينطبق إصدار البرنامج	نموذج الماء الصريح ثلاثي المواقع.
طريقة ميكانيكا الجزيئات/مساحة السطح لـ بويسون-بولتزمان (MM/PBSA)	مطورو gmx_MMPBSA / مفتوح المصدر	gmx_MMPBSA 1.5.x	ميكانيكا الجزيئات/بواسون–طريقة بولتزمان لحساب طاقة الربط بناءً على مساحة السطح.