مقالة منهجية

تحضير عينات نخاع العظم المثبتة بالفورمالين والمطمورة في البارافين لتحليل الترانسكريبتوميكس المكاني باستخدام إزالة التكلس القائمة على EDTA

26 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/72474

⸱

أغسطس 28, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hematology and Oncology Program, Center for Applied Medical Research (CIMA), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), 3Hematology and Cell Therapy Department, Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), 4Bioscience Program, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

في هذه المقالة

ملخص

يتضمن سير العمل الموحد لتحضير عينات العظام المثبتة بالفورمالين والمطمورة في البارافين لتحليلات الترانسكريبتوميات المكانية خطوة لإزالة التكلس باستخدام EDTA لمدة 10 أيام للحفاظ على سلامة الـ RNA. وتساعد نقاط تفتيش مراقبة الجودة الرئيسية في تحديد ما إذا كانت العينات تستوفي المتطلبات اللازمة لتحليل التعبير الجيني المكاني في المراحل اللاحقة.

الملخص

يُعد نخاع العظم (BM) بنية معقدة وديناميكية تؤثر فيها العلاقات المكانية على سلوك الخلايا وإشاراتها ووظائفها. وبسبب ذلك، فإن فهم الديناميكيات الكاملة للتفاعلات الخلوية يتطلب تقنيات مكانية تكميلية تعمل على حفظ ورسم خريطة لبنية المجموعات الخلوية in situ. وعلى الرغم من التقدم الكبير في تقنيات الخلية الواحدة التي ساهمت في فهم التباين النسخي لأنسجة نخاع العظم السليمة والمصابة، إلا أن التنظيم المكاني لأنواع الخلايا المختلفة، والبرامج التنظيمية الخاصة بالبيئة الخلوية (niche)، وتفاعلاتها، لا تزال بحاجة إلى مزيد من الدراسة. وقد مكنت التطورات الأخيرة في علم النسخ المكاني (spatial transcriptomics) من إجراء تحليل غير متحيز للتعبير الجيني مع سياق مكاني عبر الأنسجة المختلفة، مما يجعل هذه التقنيات مكملة لطرق الخلية الواحدة التي تفتقر إلى الدقة المكانية. وبينما استُخدم علم النسخ المكاني على نطاق واسع في الأنسجة الرخوة، فإن استخدامه في الأنسجة الممعدنة مثل نخاع العظم لا يزال محدوداً بسبب التحديات المرتبطة بمعالجة أنسجة العظام. لقد استُخدم البروتوكول المقدم هنا لتحضير عينات مثبتة بالفورمالين ومطمورة في البارافين (FFPE) من أنسجة فئران وبشر، سواء كانت سليمة أو مصابة. يتضمن البروتوكول خطوة إزالة تكلس تعتمد على حمض إيثيلين ثنائي أمين رباعي الخليك (EDTA) لمدة 10 أيام للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبوزي (RNA) ودعم استخدام علم النسخ المكاني في عينات العظام الطويلة. يصف هذا البروتوكول تحضير عينات نخاع العظم لتحليل النسخ المكاني، بما في ذلك معالجة الأنسجة وحفظها وتقطيعها، بالإضافة إلى خطوات تقييم الجودة الأساسية، مثل تقييم سلامة المقاطع، ومورفولوجيا الأنسجة، وجودة الـ RNA. كما يدعم سير العمل هذا تحديد أنواع الخلايا والدمج مع بيانات النسخ للخلية الواحدة لتوصيف التركيب الخلوي، وتحديد التفاعلات بين الخلايا، وتصور التوزيع المكاني للخلايا المتباينة نسخياً في الحالات السليمة والمرضية. وبشكل عام، يقوم سير العمل هذا بتجهيز الأنسجة الممعدنة بالكامل، السليمة والخبيثة، لتحليل النسخ المكاني مع الحفاظ على بنية نخاع العظم.

المقدمة

يعد نخاع العظم (BM) عضواً شديد التعقيد ومقسماً إلى حجيرات، حيث يعمل كالموقع الرئيسي لعملية تكوين الدم ونضج الخلايا المناعية1,2. وتتكون هذه الأنسجة غير المتجانسة من مجموعة متنوعة من سلالات الخلايا المكونة للدم، والخلايا الميزنشيمية، والخلايا البطانية، والخلايا المناعية التي تتعايش في بيئة مجهرية ثلاثية الأبعاد متخصصة ومنظمة للغاية3,4. وضمن هذه البيئة المجهرية، تشغل كل مجموعة خلوية مناطق تشريحية متميزة، ويلعب السياق المكاني دوراً أساسياً في تنظيم السلوك الخلوي والإشارات والوظائف4,5. كما أن القرب الفيزيائي من تراكيب محددة، مثل العظم التربيقي أو الشبكات الوعائية، يتحكم في العمليات الفسيولوجية الأساسية، بما في ذلك الحفاظ على سكون الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) وإعادة تشكيل العظام6,7. وبناءً على ذلك، فإن هذه البيئة المجهرية الديناميكية والتفاعلات المنظمة بدقة بين مكوناتها الخلوية والسدوية تشكل الشبكات التنظيمية التي تحافظ على التوازن الداخلي وتؤثر في تطور الأورام الخبيثة في الدم8,9,10,11,12,13.

أحدثت التطورات في تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (scRNA-seq) ثورة في فهمنا للتنوع الخلوي في نخاع العظم (BM)، مما مكن من اكتشاف أنواع فرعية من الخلايا لم تكن معروفة سابقاً وتفاعلاتها المتوقعة داخل البيئة الموضعية (niche)3,10,11,12,14,15,16. ومع ذلك، فإن ترانسكريبتوميكا الخلية الواحدة، رغم تقديمها لمعلومات عالية الدقة حول المكونات الفردية للبيئة الموضعية المكونة للدم، إلا أنها محدودة بطبيعتها بسبب عملية هضم الأنسجة، التي تفصل الخلايا عن بيئتها الأصلية وقد تغير حالتها الطبيعية17، وبسبب الافتقار إلى السياق المكاني الذي يحدد تنظيم أنسجة العظام4,18. وهذا الفقدان للسياق الموضعي يجعل من المستحيل تحديد مكان استقرار مجموعات خلوية محددة ومتميزة ترانسكريبتومياً بدقة أو كيفية تفاعلها مع الخلايا المجاورة19. علاوة على ذلك، غالباً ما يتم تفكيك أنسجة العظام الكثيفة جزئياً فقط، مما يؤدي إلى تمثيل ناقص لمجموعات خلوية رئيسية، مثل الخلايا العظمية والخلايا الدهنية، في مجموعات بيانات scRNA-seq وتمثيل متحيز لعدم تجانس الأنسجة20,21. تسمح الترانسكريبتوميكا المكانية بدراسة التعبير الجيني in situ، ضمن مقاطع نسيجية محفوظة مكانياً، وبالتالي استعادة المعلومات السياقية ومعالجة قيود تقنيات الخلية الواحدة8,19,22,23,24,25,26. تمثل هذه التكنولوجيا تقدماً أساسياً في هذا المجال، حيث تتيح تحديد الموضع المكاني بدقة والتنظيم الهيكلي لمختلف المجموعات الخلوية التي تشكل نخاع العظم، وهو أمر لا غنى عنه لفهم تفاعلاتها وأدوارها الوظيفية داخل بيئتها المجهرية الأصلية8,26. وعلاوة على ذلك، في سياق المرض، تمكن الترانسكريبتوميكا المكانية الباحثين والأطباء من سد الفجوة بين علم الأمراض التقليدي وعلم الجينوم عالي الإنتاجية، مما يسمح لهم بدمج البيانات الجزيئية فوق الصور المورفولوجية1,8. يمكن تصنيف تقنيات الترانسكريبتوميكا المكانية إلى مجموعتين رئيسيتين: الطرق القائمة على التسلسل والطرق القائمة على التصوير17,24. تقوم المنصات القائمة على التسلسل، مثل Visium وCurio Seeker وGeoMx Digital Spatial Profiler (GeoMx DSP) وStereo-seq وDeterministic Barcoding in Tissue sequencing (DBiT-seq) وOpen-ST مفتوحة المصدر، بالتقاط mRNA على مصفوفات أو حبيبات مشفرة مكانياً قبل إجراء تسلسل الجيل التالي. أما الطرق القائمة على التصوير، بما في ذلك Multiplexed Error-Robust Fluorescence in Situ Hybridization (MERFISH) وMolecular Cartography وRNAscope وCosMX وXenium، فتقوم بتصوير الترانسكريبتات مباشرة in situ من خلال التهجين المتعدد أو كيمياء مسابر القفل (padlock probe)27,28. وبدلاً من ذلك، يمكن تصنيف المنصات إلى مستهدفة أو غير مستهدفة، اعتماداً على ما إذا كانت تتطلب كشفاً قائماً على المسابر17,24.

لقد تم تطبيق طرق علم النسخ المكاني (Spatial transcriptomics) بسهولة على الأنسجة الرخوة، مثل الدماغ والقلب والكبد، حيث يكون إنشاء مقاطع نسيجية سليمة أمراً بسيطاً29,30,31. وفي المقابل، فإن تنفيذ علم النسخ المكاني في العظام يمثل تحدياً أكبر بكثير نظراً لطبيعتها المعدنية، والتي تتطلب عملية إزالة التكلس32,33، وهي الإزالة المنضبطة لفوسفات الكالسيوم، مما يجعل النسيج ليناً بما يكفي للتقطيع وللتحليلات النسيجية أو الجزيئية اللاحقة8,20,23,34. وتعتمد طرق إزالة التكلس التقليدية المستخدمة روتينياً في الممارسة السريرية عادةً على محاليل حمضية قاسية مثل حمض الهيدروكلوريك، أو حمض النيتريك، أو حمض الفورميك، أو حمض الفوسفوريك، والتي تؤدي إلى تدهور شديد في سلامة الـ RNA وتشويه المورفولوجيا الخلوية35,36. ويؤدي هذا التدهور الجزيئي إلى خفض نسبة الإشارة إلى الضجيج (signal-to-noise ratio) في المقاييس المكانية، مما ينتج عنه غالباً معدلات كشف جيني منخفضة بشكل غير مقبول مقارنة بالأنسجة الرخوة8,10. ويسلط هذا القصور الضوء على الحاجة إلى سير عمل معياري لإزالة التكلس يحافظ بشكل موثوق على سلامة الـ mRNA في العينات المعدنية من أجل التحليلات المكانية القائمة على التسلسل8,20.

يقدم هذا البروتوكول سير عمل موحد لتحضير عينات نخاع العظم (BM) المثبتة بالفورمالين والمطمورة في البارافين (FFPE) من أجل النسخ النصي المكاني (spatial transcriptomics)، وهو ما طبقه سابقاً Muiños-Lopez وزملاؤه8. يتضمن سير العمل خطوة إزالة التكلس لمدة 10 أيام باستخدام حمض إيثيلين ثنائي أمين رباعي حمض الأسيتيك (EDTA) عند درجة حموضة (pH) مضبوطة. وبخلاف الأحماض القوية، يعمل EDTA كعامل مخلبي لطيف يحافظ على البنية المجهرية وجودة الأحماض النووية، مما يدعم استخدامه في التطبيقات الجزيئية8,20,33,36,37. وكإثبات للمفهوم، تم تنفيذ البروتوكول على عينات من أنسجة عظمية من نماذج فئران سليمة وأخرى مصابة بالورم النخاعي المتعدد (MM)، بالإضافة إلى عينات من نخاع العظم البشري من أشخاص سليمين ومصابين، ثم خضعت العينات لاحقاً للتسلسل باستخدام منصة Visium Spatial Gene Expression38. يتضمن سير العمل إجراءات موحدة للحصول على الأنسجة من عينات العظام البشرية وعينات الفئران، والتثبيت، وإزالة التكلس، والتجفيف، والطمر في البارافين، والتقطيع، يليه مسار شامل لمراقبة الجودة يشمل تقييم سلامة المقاطع، والتصبيغ بالهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E)، وتقييم جودة RNA (DV200)، والفلورة المناعية (IF) الاختيارية للتحقق من أنواع الخلايا. تضمن هذه الخطوات التحضيرية انتقال المقاطع عالية الجودة فقط إلى سير عمل النسخ النصي المكاني اللاحق، بما في ذلك المعالجة المسبقة لمقاطع الأنسجة، وبناء المكتبة، والتسلسل، ومراقبة جودة البيانات وتحليلها لاحقاً.

يدعم هذا الإجراء الموحد تحضير وتقييم جودة عينات نخاع العظم (BM) البشرية والفأرية لتحليل النسخ المكاني. ويهدف إلى تسهيل الدراسات الخاصة بالبرامج التنظيمية المحددة للمناشئ (niche) في الاضطرابات الدموية والهيكلية.

البروتوكول

أُجريت جميع التجارب الحيوانية وفقاً للتوجيه الأوروبي 2010/63/EU بشأن حماية الحيوانات المستخدمة للأغراض العلمية، وبموافقة لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة نافارا (Comité de Ética para la Experimentación Animal؛ البروتوكولات CEEA082-20 وCEEA039-20). كما تم تنفيذ رعاية الحيوانات ومناولتها والقتل الرحيم بما يتوافق مع التشريعات الإسبانية لتقليل الألم والمعاناة.

تمت الموافقة على الدراسة البشرية من قبل لجنة أخلاقيات البحث في كلية الطب بجامعة نافارا (Comisión de Ética de Investigación, CEI؛ المشروعان 2022.100mod1 و 2023.172) ولجنة أخلاقيات البحث في خدمة نافارا الصحية (CEIm–Departamento de Salud de Navarra؛ PI_2022/92 MS-1). وقد أُجريت جميع الإجراءات التي شملت مشاركين بشريين وفقاً للمبادئ الأخلاقية لإعلان هلسنكي. كما تم التعامل مع البيانات الشخصية بسرية تامة امتثالاً للقانون العضوي الإسباني 3/2018 بشأن حماية البيانات الشخصية وضمان الحقوق الرقمية والقانون الإسباني 14/2007 بشأن الأبحاث الطبية الحيوية.

ملاحظة: تتوفر قائمة مفصلة بالكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في الـ جدول المواديتم توضيح خط سير العمل التجريبي الشامل لتنفيذ النسخ الترانسكريبتومي المكاني في أنسجة العظام تخطيطياً في الشكل 1 وتُنظم إلى ثلاث مراحل تشغيلية: الحصول على العينات، ومراقبة الجودة (QC)، والتنميط النسخي المكاني. تتضمن عملية الحصول على العينات جمع قطع عظمية بشرية أو فئرانية، يليه التثبيت، وإزالة الكالسيوم باستخدام EDTA، والتجفيف، والطمر في البارافين، والتقطيع وتحضير الشرائح. وتعمل مرحلة مراقبة الجودة على تقييم السلامة النسيجية ومدى الحفاظ على الحمض النووي الريبي (RNA). ثم تخضع المقاطع العظمية المعتمدة لعملية نفاذية الأنسجة على الشريحة، وتحضير المكتبة، والتسلسل، وتحليل البيانات.

figure-protocol-1
الشكل 1: سير عمل جمع العينات والتحضير القائم على EDTA لأنسجة العظام الفأرية والبشرية. يتم جمع عظام الفخذ من الفئران وعينات العظام البشرية، ثم تثبيتها، وإزالة التكلس منها باستخدام EDTA، وتجفيفها، وطمرها في البارافين، وتقطيعها إلى مقاطع. يتم تقييم جودة العينة عن طريق صبغ H&E وتقييم سلامة الـ RNA (DV200)، يليه المعالجة المسبقة لأنسجة الترانسكريبتوميكس المكانية، وتحضير المكتبة، والتسلسل، ومراقبة جودة البيانات. الاختصارات: BM = نخاع العظم؛ DV200 = نسبة شظايا RNA التي يزيد طولها عن 200 نوكليوتيد؛ EDTA = حمض إيثيلين ثنائي الأمين رباعي حمض الأسيتيك؛ H&E = الهيماتوكسيلين والإيوزين؛ QC = مراقبة الجودة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

1. الحصول على عينات الأنسجة العظمية ومعالجتها

  1. جمع عظام الفئران
    1. خدر الحيوانات باستخدام 5% isoflurane وتأكد من فقدان المنعكسات.
    2. بمجرد التخدير الكامل، قم بإجراء القتل الرحيم عن طريق خلع الفقرات العنقية وفقاً للإرشادات المؤسسية والتنظيمية.
      ​ملاحظة: يجب تنفيذ القتل الرحيم بواسطة موظفين مدربين، ويجب تأكيد الوفاة قبل البدء في جمع الأنسجة.
    3. طهر الجلد عن طريق رش 70% ethanol على السطح الظهري للفأر، وباستخدام مقص جراحي، اصنع شقاً صغيراً لإزالة الجلد بعناية وكشف الأطراف الخلفية.
    4. قم بتشريح الأطراف الخلفية عن طريق القطع فوق مفصل الورك وانقلها إلى أنبوب سعة 50 mL يحتوي على 10 mL من محلول Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline  (DPBS) البارد. ضع الأنبوب على الثلج.
    5. أزل العضلات والأنسجة الضامة الملتصقة باستخدام ملاقط معقمة ومشرط.
    6. انقل العظام إلى حاوية معقمة سعة 50 mL مملوءة مسبقاً بمحلول DPBS نظيف وبارد، ثم ضع الحاوية على الثلج.
    7. ابدأ فوراً في تثبيت أنسجة العينة للحفاظ على سلامة الأنسجة.
  2. التعامل مع عينات العظام البشرية
    1. استلم خزعات لب العظام أو شظايا العظام الجراحية في حاويات معقمة سعة 100 mL.
    2. انقل شظايا العظام إلى حاوية نظيفة ومعقمة سعة 100 mL مملوءة مسبقاً بمحلول DPBS بارد، ثم ضعها على الثلج.
    3. ابدأ فوراً في تثبيت العينة للحفاظ على سلامة الأنسجة.
      تنبيه: يجب التعامل مع العينات البشرية تحت ظروف BSL 2.
  3. تثبيت أنسجة العظام
    1. خذ الحاوية سعة 50 mL أو 100 mL التي تحتوي على عينة العظم وتخلص من محلول DPBS.
    2. قم بتسمية الكاسيتات البلاستيكية وضع عينات العظام في كاسيتات فردية. أغلق الأغطية بإحكام لمنع فقدان الأنسجة أثناء المعالجة اللاحقة.
      ​ملاحظة: بالنسبة لعينات الفئران، ضع عظماً واحداً في كل كاسيت. بالنسبة لعينات العظام البشرية، إذا لزم الأمر، استخدم مشرطاً معقماً لتقطيع النسيج إلى شظايا صغيرة بما يكفي لتناسب الكاسيتات القياسية، وضع شظية واحدة في كل كاسيت. إذا كانت عينات العظام البشرية صلبة جداً بحيث لا يمكن تقطيعها في هذه المرحلة، يمكن تركها سليمة ونقلها إلى محلول إزالة الكالسيوم؛ وبمجرد إزالة الكالسيوم، يمكن تقطيع النسيج الذي أصبح ليناً إلى شظايا ذات حجم مناسب ووضعها في كاسيتات مسمى.
    3. أضف محلول formaldehyde منظم بتركيز 4% بنسبة عينة إلى مثبت قدرها 1:20، وحضن العينة لمدة 24 h عند 4 °C.
      تنبيه: تعامل مع المثبت داخل خزانة استخلاص كيميائية بسبب سميته وأبخرته المتطايرة.
      ملاحظة: تجنب التثبيت المفرط (>48 h)، والذي يقلل من سلامة RNA في سير عمل FFPE39.
  4. إزالة الكالسيوم من أنسجة العظام المعدنية
    1. تخلص من الفورمالين واغسل عينة العظم بماء فائق النقاء. اشطفها بالماء، ورجها لفترة وجيزة، ثم تخلص من الماء لإزالة أي بقايا فورمالين متبقية.
    2. حضر محلول EDTA بتركيز 0.25 M في ماء فائق النقاء واضبط الرقم الهيدروجيني pH على 6.95.
      ملاحظة: على الرغم من أنه غالباً ما يتم ضبط EDTA على pH 8.0 في بروتوكولات إزالة الكالسيوم التقليدية، إلا أن سير العمل هذا يستخدم EDTA عند pH 6.95 تقريباً لدعم عملية المخلبية الفعالة مع الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة وجودة RNA8.
    3. أضف محلول EDTA إلى الحاوية التي تحتوي على عينة العظم وحضنها لمدة 10 أيام عند 4 °C مع الرج اللطيف.
      ​ملاحظة: بالنسبة لعينات الفئران، عادة ما يكون حوالي 50 mL من محلول EDTA كافياً. بالنسبة لعينات العظام البشرية، يستخدم عادة حوالي 100 mL. ومع ذلك، يمكن تعديل هذا الحجم بناءً على حجم العظمة لضمان الغمر الكامل وإزالة الكالسيوم بفعالية.
    4. بعد 5 أيام من إزالة الكالسيوم، تخلص من محلول EDTA واستبدله بنفس الحجم من EDTA طازج، حيث تتشبع قدرة المخلبية بمرور الوقت. استمر في التحضين تحت نفس الظروف.
    5. بعد 10 أيام من التحضين، تخلص من محلول EDTA وقيم ما إذا كانت عملية إزالة الكالسيوم قد اكتملت.
      1. اصنع قطعاً صغيراً بمشرط معقم أو أدخل إبرة معقمة دقيقة في زاوية أو منطقة محيطية من النسيج، مع اختيار منطقة ذات أهمية تحليلية منخفضة دائماً لتجنب تغيير المناطق ذات الاهتمام. ضع العظمة على طبق بتري معقم لتثبيت العينة أثناء القطع أو إدخال الإبرة. إذا كان من الممكن قطع النسيج بسهولة أو تمر الإبرة بأقل قدر من المقاومة، فإن العينة قد أزيل منها الكالسيوم بشكل كافٍ.
      2. في حالة عظام فخذ الفئران، قم بثني العظمة بلطف باستخدام الملاقط لتقييم المرونة، وهي مؤشر موثوق على الإزالة الكاملة للمعادن.
        ملاحظة: تعتمد مدة خطوة إزالة الكالسيوم على حجم وسمك عينة العظم، بالإضافة إلى حجم EDTA المستخدم. إذا ظلت العظمة صلبة بعد فترة التحضين الأولية، استمر في إزالة الكالسيوم حتى يصبح النسيج ليناً بما يكفي لقطعه بسهولة. قد يؤدي الإطالة المفرطة إلى الإضرار بجودة الأنسجة وسلامة RNA، لذا يجب أن يقتصر التمديد على الحد الأدنى من الوقت المطلوب لتحقيق التليين الكافي20.
  5. إزالة الماء
    1. اغسل بإضافة ماء فائق النقاء إلى الحاوية التي تحتوي على عينة العظم، ثم حضنها لمدة 5 min عند 4 °C مع الرج.
    2. تخلص من الماء واستبدله بمحلول ethanol بتركيز 70%. حضن لمدة 1 h عند 4 °C.
      ملاحظة: يمكن أن تكون هذه الخطوة نقطة توقف. يمكن تخزين العينات في 70% ethanol عند 4 °C قبل الانتقال إلى الخطوات التالية. لم يتم التحقق تجريبياً من أقصى مدة للتخزين في هذا البروتوكول، لذا يجب على المستخدمين المتابعة وفقاً للممارسات القياسية في مختبراتهم.
    3. قم بإزالة الماء من العينة بالتتابع في تركيزات متزايدة من ethanol (70%، 80%، 96%؛ لمدة 1 h لكل منها عند 4 °C)، يليه ethanol بتركيز 100% طوال الليل عند 4 °C.
    4. تخلص من ethanol 100% واستبدله بـ xylene. حضن لمدة 4 h في درجة حرارة الغرفة (RT).
    5. تخلص من xylene وضع كاسيت العينة في وعاء زجاجي يحتوي على بارافين نظيف ومذاب. حضن في البارافين المذاب طوال الليل عند 60 °C.
      ملاحظة: يمكن استخدام أوقات تغلغل أقصر عند توفر أنظمة معالجة بمساعدة الفراغ، حيث تسهل هذه الأجهزة تغلغل البارافين بشكل أكثر كفاءة40,41,42.
      تنبيه: يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تتضمن xylene ومحاليل ethanol المتدرجة داخل خزانة استخلاص كيميائية لضمان التهوية المناسبة وتقليل التعرض للأبخرة السامة والقابلة للاشتعال.
  6. الصب في البارافين
    ​ملاحظة: نظف أسطح محطة الصب بمحلول تخلص من RNase لمنع تحلل RNA.
    1. قم بتشغيل محطة الصب وسخن مسبقاً خزان البارافين، وحمام بارافين الكاسيت، وحمام بارافين القوالب، ولوحة تسخين القوالب إلى 60 °C. قم بتنشيط اللوحة الباردة لتركها تبرد قبل الصب.
    2. اترك البارافين يذوب تماماً، وعندئذ فقط ضع الكاسيتات التي تحتوي على عينات متغلغل فيها البارافين في حمام بارافين الكاسيت. حضن لمدة 2 h لضمان التخلص الكامل من xylene قبل الصب.
    3. ضع جميع القوالب اللازمة في حمام بارافين القوالب.
      ملاحظة: بالنسبة للعينات البشرية، استخدم قوالب صب معدنية قياسية. بالنسبة لعينات الفئران، استخدم قوالب صب بلاستيكية متوافقة مع منصة Visium تتضمن تجويفاً مربعاً بأبعاد مناسبة لوضع المقاطع بشكل صحيح على شرائح Visium. نظراً لأن عظام الفئران الكاملة لا تتناسب تماماً داخل التجويف المربع لهذه القوالب، اقطع العظام مباشرة قبل الصب باستخدام مشرط معقم للحصول على شظايا ذات حجم مناسب. يمكن صب شظية أو شظيتين من العظام لكل قالب، اعتماداً على أبعادهما.
    4. أضف طبقة قاعدية رقيقة من البارافين الطازج عن طريق توزيع البارافين المذاب من المخرج المركزي لمحطة الصب.
    5. افتح الكاسيت وانقل النسيج بلطف من الكاسيت إلى القالب باستخدام ملاقط دافئة.
    6. ضع القالب المملوء بالبارافين على لوحة تسخين القوالب، وبينما لا يزال البارافين سائلاً، وجه النسيج في مستوى القطع المطلوب باستخدام ملاقط دافئة.
    7. ضع القالب على السطح البارد لمحطة الصب لتثبيت موضع شظية العظم لفترة وجيزة.
    8. املأ القالب تماماً بالبارافين المذاب من الموزع، مع التأكد من تغطية النسيج بالكامل وعدم وجود فقاعات كبيرة.
    9. ضع الكاسيت المسمى فوق القالب بحيث يشكل قاعدة كتلة البارافين.
    10. انقل القالب مع الكاسيت الملحق به إلى اللوحة الباردة لمحطة الصب. اترك البارافين يتصلب تماماً لمدة 10 min، حتى تصبح الكتلة معتمة وصلبة.
    11. بمجرد أن تتصلب، أخرج كتلة البارافين من القالب وخزنها عند 4 °C حتى يتم التقطيع.
      ملاحظة: يمكن أن تكون هذه الخطوة نقطة توقف. يمكن تخزين كتلة البارافين عند 4 °C؛ ومع ذلك، كلما كان ذلك ممكناً، يجب إجراء تقطيع الأنسجة وتحليلات transcriptomic المكانية اللاحقة في أقرب وقت ممكن عملياً بعد الصب لتقليل تحلل RNA أثناء التخزين43,44.
  7. التقطيع وتحضير الشرائح
    ملاحظة: نظف الميكروتوم وحمام الماء بمحلول تخلص من RNase لمنع تحلل RNA.
    1. املأ حمام الماء بماء مقطر وسخنه مسبقاً إلى 42 °C. قم بتشغيل الميكروتوم وتركيب شفرة جديدة. سم شرائح المجهر باستخدام قلم رصاص.
    2. ثبت كتلة البارافين في حامل العينات، مع التأكد من توجيه الكاسيت وفقاً لمستوى القطع الطولي المطلوب.
      ​ملاحظة: جهز كيساً بلاستيكياً مملوءاً بالثلج، وعندما يصبح التقطيع صعباً بسبب ليونة البارافين، ضع كيس الثلج مباشرة فوق الكتلة بينما تظل مثبتة في الميكروتوم، وثبته برباط مطاطي لعدة دقائق لتصلب البارافين وتحسين جودة المقاطع.
    3. اضبط سمك الميكروتوم على 20 µm وقم بإجراء قطعات التشذيب.
    4. غير إعداد الميكروتوم إلى 5 µm. اجمع أربعة مقاطع بسمك 5 µm في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL مسمى وخالٍ من RNase. احتفظ بالأنبوب على الثلج الجاف وخزنه عند -80 °C.
    5. استمر في التقطيع بسمك 5 µm واجعل الشرائط تطفو في حمام الماء. بمجرد أن يتمدد المقطع بالكامل ويصبح خالياً من التجاعيد، التقطه باستخدام الشريحة المسمى.
      1. عند كل عدد محدد من المقاطع (على سبيل المثال، كل 5-10 شرائط، اعتماداً على حجم النسيج)، اجمع 4 مقاطع إضافية بسمك 5 µm في أنبوب جديد مسمى سعة 1.5 mL. كرر هذه العملية حتى يتم الحصول على ما مجموعه ثلاثة أنابيب سعة 1.5 mL تحتوي على مقاطع بسمك 5 µm.
        ملاحظة: إذا تشقق النسيج أو انكسر أو تعذر الحصول عليه في مقطع مستمر، فإن العينة لم يتم إزالة الكالسيوم منها بالكامل وتتطلب وقتاً إضافياً لإزالة الكالسيوم. استعد العينة عن طريق عكس خطوات سير العمل حتى الوصول إلى مرحلة إزالة الكالسيوم. للقيام بذلك، صهر كتلة البارافين عند 60 °C لمدة ساعتين تقريباً، وانقل العينة إلى xylene (لمدة 2 h). أعد ترطيب العينة من خلال محاليل ethanol متدرجة (100%، 96%، 80%، 70%) يليه ماء مقطر. أعد العينة المرطبة إلى محلول 0.25 M EDTA طازج (pH 6.95) ومدد فترة إزالة الكالسيوم حسب الحاجة قبل المتابعة في إزالة الماء والصصب مرة أخرى والتقطيع. يجب استخدام إجراء الاستعادة هذا بدقة كخيار أخير، لأن عكس معالجة FFPE قد يضر بسلامة RNA.
    6. ضع الشرائح في فرن عند 37 °C طوال الليل لتبخير أي ماء متبقٍ، ثم خزنها عند 4 °C.
    7. لتحسين التصاق الأنسجة، يمكن اختيارياً خبز الشرائح لمدة 3 h عند 42 °C قبل تحضينها طوال الليل عند 37 °C.
      ملاحظة: هذه الخطوة ليست ضرورية بشكل عام عند استخدام الشرائح الزجاجية المدرجة في جدول المواد، حيث توفر هذه الشرائح التصاقاً قوياً وعادة ما يظل النسيج ملتصقاً بإحكام طوال عملية المعالجة. يمكن أن تكون هذه الخطوة نقطة توقف. يمكن تخزين الشرائح عند 4 °C؛ ومع ذلك، كلما كان ذلك ممكناً، يجب إجراء تحليلات transcriptomic المكانية اللاحقة في أقرب وقت ممكن عملياً بعد الصب لتقليل تحلل RNA أثناء التخزين43,44.

2. تقييم جودة العينة

  1. تقييم جودة المقطع
    1. افحص جميع المقاطع واحدًا تلو الآخر باستخدام مجهر ضوئي قياسي ذي مجال ساطع (4×–10×). افحص كل شريحة للتأكد من أن المقاطع غير متجزئة، وسجل جودة كل مقطع.
      ​ملاحظة: تحقق من وجود أي طيات، أو تجاعيد، أو انضغاطات، أو علامات اهتزاز (chatter marks)، والتي قد تشير إلى وجود مشكلات في صلابة البارافين، أو حدة الشفرة، أو عدم اكتمال عملية إزالة الكالسيوم. كما يجب التأكد من عدم فقدان أي مناطق من النسيج نتيجة الانفصال أثناء عملية القطاع أو عند النقل إلى حمام الماء.
    2. اختر المقاطع الأكثر حفظاً لتحليل النسخ المكاني (الأكثر اكتمالاً والأفضل من حيث المورفولوجيا).
    3. حدد الأقسام المتتالية المجاورة للأقسام المختارة وخصصها لـ H&صبغ E والتألق المناعي (IF)، مع ضمان تطابق الصورة المصبوغة قدر الإمكان مع النسيج الذي سيتم تسلسله.
  2. هـ& صبغ E لسلامة الأنسجة
    1. ضع الشرائح في حامل صبغ شرائح زجاجي، واتركها في الحضانة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 60 °C.
    2. انقل الحامل إلى جارات صبغ زجاجية تحتوي على الزايلين لمدة 15 دقيقة
    3. أعد ترطيب القطاعات بنقل الحامل عبر جارات صبغ تحتوي على إيثانول بتركيزات 100% و96% و80% و70%، مع التحضين لمدة 5 دقيقة في كل محلول.
      ​تنبيه: يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تتضمن الزايلين ومحاليل الإيثانول المتدرجة التركيز داخل خزانة استخلاص الكيماويات (chemical fume hood) لضمان التهوية المناسبة وتقليل التعرض للأبخرة السامة والقابلة للاشتعال.
    4. اشطف الشرائح لمدة 5 دقيقة في وعاء تلوين مملوء بالماء.
    5. اغمر الحامل في صبغة الهيماتوكسيلين لمدة 10 دقائق، ثم اغسله تحت ماء الصنبور الجاري حتى يصبح ماء الشطف رائقاً.
    6. اغمر الحامل في ماء يحتوي على خمس قطرات من حمض الهيدروكلوريك المركز، مع الرج برفق حتى يظهر لون محمر.
    7. انقل الحامل إلى ماء مشبع بكربونات الليثيوم حتى يتكون لون أزرق مستقر، ثم اشطفه سريعاً بالماء.
    8. قم بصبغ المقاطع في محلول إيوزين بنسبة 1% (وزن/حجم) لمدة 5 دقائق، ثم اشطفها مرة أخرى بالماء.
    9. قم بتجفيف الشرائح عن طريق نقل الحامل عبر أوعية صبغ تحتوي على الماء، وإيثانول بتركيزات 70% و80% و96% و100%، مع التحضين لمدة 5 دقائق في كل محلول.
    10. قم بعملية ترويق الشرائح في الزايلين لمدة 15 دقيقة دقيقة
    11. جفف ظهر كل شريحة برفق، ثم ضع وسط التثبيت على غطاء الشريحة، وقم بتثبيت المقاطع. اترك الشرائح لتجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة ساعة قبل التصوير.
    12. أجرِ تصويراً للأنسجة باستخدام مجهر عالي الدقة بتكبير 20x.
      ملاحظة: قم بإجراء H&صبغ H&E على مقاطع متجاورة أولاً كخطوة لضبط الجودة لتقييم مدى ملاءمة العينة لتقنية الترانسكريبتوميات المكانية. بعد الاختيار، يتم إجراء صبغ H&E ثانٍ& صبغ E مباشرة على المقطع المخصص للنسخ المختلط مكانيًا، وفقًا لإرشادات الشركة المصنعة لتحضير الأنسجة لمنصة التعبير الجيني المكاني المدرجة في الـ جدول المواد.
  3. تقييم سلامة الحمض النووي الريبوزي (DV200)
    ​ملاحظة: بالنسبة لبروتوكول التعبير الجيني المكاني، فإن رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) التقليدي يكون غير فعال لأن قمم الحمض النووي الريبي الريبوسومي 18S و28S عادة ما تكون غائبة في الأنسجة المثبتة. لذلك، يُستخدم مقياس DV200، الذي يُعرَّف بأنه نسبة قطع الحمض النووي الريبي التي يزيد طولها عن 200 نيوكليوتيدة، بشكل شائع كمعيار جودة أكثر دقة من رقم RIN. للعينات السريرية المتدهورة. بالنسبة لـ Visium v2، توصي شركة 10x Genomics باستخدام كتل FFPE التي تبلغ قيمة DV200 فيها ≥ 30% لضمان تهجين فعال للمجاسات وتحقيق الأداء الأمثل للمقايسة. ويساعد اختيار كتل الأنسجة ذات أعلى قيم DV200 متاحة في منع حدوث فقد في التسلسل (sequencing dropouts) ورفع حساسية البقع إلى الحد الأقصى.
    1. استرجع الأنابيب سعة 1.5 مل التي تحتوي على 5 µm تُجمع المقاطع التي تم الحصول عليها خلال خطوة تقطيع الأنسجة وتوضع على الثلج لاستخلاص الحمض النووي الريبي (RNA).
    2. استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) الكلي. يتضمن هذا الإجراء الموحد إزالة البارافين من العينة، والهضم بواسطة البروتينيز ك (proteinase K) لعكس الروابط التشابكية التي يسببها الفورمالين، وإزالة الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (gDNA) الجينومي عبر المعالجة بإنزيم دي إن إيز 1 (DNase I)، والاستخلاص النهائي للحمض النووي الريبوزي (RNA) المنقى في ماء خالٍ من إنزيم الريبونوكلياز (RNase).
    3. تقييم سلامة الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام نظام يعتمد على الرحلان الكهربائي الشعيري مع مقايسة RNA عالية الحساسية. ويرد ملخص لسير العمل في الملف التكميلي 142,45,46,47,48.
  4. صبغة مناعية فلورية اختيارية للتحقق من نوع الخلايا
    1. ضع شريحة FFPE في حامل تلوين شرائح زجاجي، واتركها في الحاضنة لمدة 15 دقيقة عند 60 °C.
    2. انقل الحامل إلى برطمانات تلوين زجاجية تحتوي على الزايلين لمدة 15 دقيقة
    3. أعد ترطيب المقطع بنقل الحامل عبر إيثانول بتركيزات 100% و96% و80% و70% لمدة دقيقتين في كل تركيز، يليه غمر لمدة 5 دقائق في الماء و5 دقائق في محلول PBS-Tween (محلول PBS بتركيز 1x مضاف إليه 0.1% من Tween-20).
      تنبيه: يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تتضمن الزيلين والإيثانول داخل خزانة استخلاص الغازات الكيميائية.
    4. أجرِ عملية استعادة المستضد وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة للأجسام المضادة الأولية، مع التأكد من مطابقة محلول الاستعادة والأس الهيدروجيني (pH) وظروف التسخين لما ورد في ورقة بيانات الجسم المضاد. ملاحظة: في سير العمل هذا، تُجرى استعادة المستضد باستخدام 10 مللي مولار من Tris و1 مللي مولار من EDTA، بأس هيدروجيني 9.0، في نظام تسخين بوعاء طهي لمدة 30 دقيقة عند 95 °C، ثم بُرِّدت لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. اغسل الشريحة مرتين لمدة 10 دقائق في كل مرة باستخدام محلول PBS-Tween.
    6. ارسم حاجزاً كارهاً للماء حول النسيج باستخدام قلم رسم الحواجز الكارهة للماء، ثم امنع الارتباط غير النوعي عن طريق وضع BSA بتركيز 5% في DPBS بتركيز 1x على قطاعات النسيج لمدة 40 دقيقة على الأقل. دقيقة في درجة حرارة الغرفة داخل غرفة رطبة.
      ملاحظة: يتم تحضير الغرفة الرطبة بوضع ورقة ترشيح في صندوق تلوين شرائح بلاستيكي وترطيبها جيداً بالماء المقطر للحفاظ على بيئة رطبة ومستقرة أثناء فترة تحضين الأجسام المضادة.
    7. قم بتحضير محلول الأجسام المضادة الأولية في محلول DPBS بتركيز 1x وفقاً للتخفيف الموصى به لكل جسم مضاد.
      ملاحظة: في سير العمل هذا، استُخدمت أجسام مضادة أولية ضد Emcn (V.7C7) وCd271 (ME20.4) لتحديد الخلايا البطانية (EC) والخلايا الجذعية الميزنشيمية (MSC) الفأرية على التوالي، بينما استُخدمت أجسام مضادة ضد CD31 (JC70A) أو PRRX1 (متعددة النسائل) لتحديد نظيراتها البشرية، وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة.
    8. قم بإزالة محلول الحجب عن طريق النقر برفق على حافة الشريحة فوق ورق ماص لإزالة القطرات المتبقية، ثم ضع مزيج الأجسام المضادة الأولية واحضن الشريحة طوال الليل في درجة حرارة 4 °C في غرفة ترطيب.
    9. اغسل الشريحة مرتين لمدة 5 دقائق في محلول PBS-Tween، وجهز محلول الأجسام المضادة الثانوية بالتخفيف الموصى به من قبل الشركة المصنعة، مع التأكد من توافق الفلوروفورات طيفياً وعدم تداخلها.
      ملاحظة: في سير العمل هذا، تم استخدام جسم مضاد ثانوي مقترن بـ Alexa Fluor بتخفيف 1:200.
    10. ضع مزيج الأجسام المضادة الثانوية واتركه ليتفاعل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع الحماية من الضوء في غرفة ترطيب.
    11. اغسل الشريحة مرتين لمدة 5 دقائق في محلول PBS-Tween.
    12. قم بتطبيق تخفيف بنسبة 1:10 من وسط التثبيت المحتوي على DAPI (راجع جدول المواد)، والمُحضّر في محلول PBS-glycerol بنسبة 1:1، ثم حضن العينة لمدة 5 دقائق.
    13. قم بتثبيت المقطع باستخدام شريحة غطاء، وأحكم إغلاق الحواف بطلاء الأظافر لمنع الجفاف.
    14. قم بتصوير النسيج المصبوغ باستخدام منصة تصوير متعددة الأطياف.

الملف التكميلي 1: ملخص لخطوات البروتوكول الخاصة بتقييم سلامة الـ RNA ومسار عمل ترانسكريبتوميكس Visium المكاني. يوفر هذا الملف التكميلي ملخصاً مفصلاً للخطوات الإجرائية التي تم تنفيذها وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. ويتضمن: (1) مقايسة High Sensitivity RNA ScreenTape المستخدمة لتقييم سلامة الـ RNA (DV200) كما هو موضح في الخطوة 2.3.3 من البروتوكول الرئيسي، و(2) نظرة عامة على مسار عمل Visium CytAssist للتعبير الجيني المكاني الذي يشمل المعالجة المسبقة للأنسجة، وتحضير المكتبة، والتسلسل (الخطوات 3.1–3.3 من البروتوكول الرئيسي).يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

3. علم النسخ المكاني

ملاحظة: قم بتنفيذ سير عمل الترانسكريبتوميات المكانية باستخدام المنصة والكواشف المدرجة في جدول المواد، مع اتباع أدلة المستخدم المقابلة42,45,46. يلخص الملف التكميلي 1 الخطوات الرئيسية للمعالجة المسبقة للأنسجة، وإعداد المكتبة، والتسلسل.

  1. ضبط جودة بيانات النسخ المكاني
    1. قم بفك تعدد الإرسال (Demultiplex) لبيانات النسخ المكاني باستخدام خط المعالجة القياسي لمجموعات بيانات Visium (راجع جدول المواد).
    2. قم بمطابقة القراءات مع المرجع الجيني المناسب من Ensembl 105.
      ملاحظة: تم استخدام GRCh38 للعينات البشرية و mm10 لعينات الفئران.
    3. قم بتوليد مصفوفات الميزات والباركود المصفاة باستخدام خط المعالجة نفسه واستوردها في بيئة تحليل الخلايا المفردة/التحليل المكاني اللاحقة (راجع جدول المواد).
    4. افحص صور H&E في واجهة التصور التي يوفرها خط معالجة النسخ المكاني (راجع جدول المواد) وقم بإزالة البقع التي تتداخل مع منطقة العظم القشري أو أنسجة العظام يدويًا، اعتمادًا على مجموعة البيانات.
    5. قم بتطبيع مجموعات البيانات باستخدام طريقة تحويل تثبيت التباين المطبقة عادةً في سير عمل تحليل الخلايا المفردة (راجع جدول المواد).

النتائج

لتقييم مدى قابلية تطبيق سير العمل المعتمد على EDTA عبر الأنواع والسياقات المرضية المختلفة، تم تطبيق البروتوكول على أربع عينات من نخاع العظم: عظمتا فخذ من الفئران وعينتان من عظام البشر تمثلان الحالات الصحية وحالات الورم النخاعي المتعدد (MM) (الجدول 1 والشكل 1).

تعريف العينةالنوعالجنسالعمرالمرض
YFPcγ1فأرأنثى210 daysسليم
mMMفأرذكر314 daysMM
hHBMإنسانذكر76 yearsسليم
hMMإنسانأنثى50 yearsMM

الجدول 1: عينات العظام الفأرية والبشرية المشمولة في الدراسة. يتم توفير النوع، والجنس، والعمر، والحالة الصحية لكل عينة. الاختصارات: hHBM = نخاع العظم البشري السليم؛ hMM = الورم النخاعي المتعدد البشري؛ mMM = الورم النخاعي المتعدد الفأري؛ MM = الورم النخاعي المتعدد؛ YFPcγ1 = فأر التحكم السليم.

لقد تم توصيف العينات المستخدمة في هذه الدراسة مسبقاً وذكرها في منشورات سابقة للمجموعة البحثية، وتحديداً في أعمال Muiños-Lopez et al. وCenzano et al.، باستثناء عينة فأر MM. وبالنسبة للعينات التي تم الإبلاغ عنها مسبقاً، فإن بيانات ونتائج الترانسكريبتوميكس المكاني (spatial transcriptomics) معروضة في تلك الدراسات8,10. وبناءً على ذلك، فإن المواد المدرجة هنا تُستخدم لتقييم الملاءمة التقنية للبروتوكول في تحليل الترانسكريبتوميكس المكاني، بدلاً من تقديم نتائج بيولوجية جديدة.

تم الحصول على عينات من عظم الفخذ للفئران من نموذج فئران MM المعدلة وراثياً BIC (BIcγ1)، والتي تحاكي الخصائص السريرية والمناعية لمرضى MM، ومن فئران التحكم السليمة المقابلة لها (YFPcγ1)8,49. تم استئصال عظم فخذ واحد من كل حيوان، وتنظيفه، ومعالجته وفقاً للبروتوكول الموحد (الشكل 2A). استُخدمت عظام الفخذ خصيصاً لهذه التحليلات لأنها توفر نخاعاً متاحاً وبوفرة، وجودة بيئة خلوية فائقة، وسهولة في المعالجة القابلة للتكرار، مما يجعلها مناسبة تماماً لمنصة النسخ المكاني القائمة على التسلسل8,10. تم التأكد من نجاح عملية إزالة الكالسيوم من عظم فخذ فأر التحكم عيانياً من خلال زيادة ملحوظة في مرونة الأنسجة أثناء التعامل اليدوي باستخدام الملاقط (الشكل 2B). لاحقاً، تم طمر قطعة العظم هذه بكفاءة في البارافين باستخدام قالب متخصص متوافق مع تقنية النسخ المكاني للحفاظ على سلامة RNA وبنية الأنسجة من أجل التحليل الجزيئي اللاحق (الشكل 2C).

تم أيضاً تحليل عينتين من نخاع العظم (BM) البشري بسجلات معالجة متباينة8,10. تم الحصول على عينة نخاع عظم بشرية طازجة وسليمة دموياً من النفايات الجراحية أثناء عملية استبدال مفصل الورك في Hospital Universitario de Navarra (الشكل 2D–F). ولإثبات الفائدة الترجمية لهذا البروتوكول، تمت معالجة هذه العينة كما هو الحال مع العينات الفأرية. وتماشياً مع النتائج الملحوظة في أنسجة الفئران، تم التأكد عيانياً من نجاح عملية إزالة الكالسيوم من العظم البشري باستخدام EDTA من خلال التليين الكامل للنسيج، وهو ما ظهر جلياً من خلال اختراق الإبرة للنسيج دون جهد (الشكل 2E). وقد تم بنجاح تضمين قطعة العظم البشري منزوعة الكالسيوم في البارافين باستخدام قالب معدني قياسي للمعالجة اللاحقة (الشكل 2F). أما العينة البشرية الثانية فتكونت من خزعات نخاع عظم مؤرشفة مثبتة بالفورمالين ومضمنة في البارافين (FFPE) مأخوذة من العرف الحرقفي لمريض مصاب بورم النخاع المتعدد (MM) في قسم الباثولوجيا في Clínica Universidad de Navarra (CUN). ومن الجدير بالذكر أن عينة MM المؤرشفة هذه قد خضعت مسبقاً لعملية إزالة الكالسيوم باستخدام بروتوكول سريري قياسي يتضمن أحماضاً قوية36. وتوفر هذه العينة تبايناً نوعياً مع العينات المعالجة بـ EDTA؛ ومع ذلك، فإن الاختلافات في مصدر النسيج، وتاريخ التثبيت، والتخزين، وعملية إزالة الكالسيوم تعني أن الاختلافات الملحوظة لا يمكن إرجاعها فقط إلى عامل إزالة الكالسيوم.

figure-results-1
الشكل 2: عينات عظمية من الفئران والبشر أثناء التحضير القائم على EDTA. (A) عظام فخذ فئران ضابطة سليمة قبل إزالة الكالسيوم. (B) عظمة فخذ فأر ضابطة منزوعة الكالسيوم تظهر زيادة في المرونة. (C) شظايا عظمية لفئران ضابطة مغمورة في البارافين. (D) شظايا عظمية بشرية سليمة من جراحة الورك قبل إزالة الكالسيوم. (E) الشظية نفسها بعد إزالة الكالسيوم بواسطة EDTA، وتظهر اختراق الإبرة. (F) عظم بشري سليم منزوع الكالسيوم بواسطة EDTA ومغمور في البارافين. أشرطة المقياس: (A, B) 5 mm؛ (C–F) 1 cm. الاختصار: EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

لتحليل البنية العامة للأنسجة، تم إجراء صبغ H&E (الشكل 3). وقد يعكس الحفاظ الأفضل على المورفولوجيا الملاحظ في المقاطع الفأرية اختلافات في التعامل مع العينات ومعالجتها بدلاً من السمات المتأصلة الخاصة بالنوع. فقد جُمعت عظام الفخذ من الفئران خصيصاً من أجل النسخ المكاني (spatial transcriptomics) وعولجت فوراً كعظام سليمة، مما حافظ على بنيتها (الشكل 3A، B). في المقابل، فإن العينات البشرية مصدرها إما مواد متبقية تم الحصول عليها أثناء جراحة استبدال الورك (الشكل 3C) أو من خزعات عظمية تشخيصية لمرض MM (الشكل 3D)، وكلاهما قد يتسم بجودة نسيجية متغيرة في مرحلة ما قبل التحليل. ونتيجة لذلك، فإن الاختلافات المورفولوجية بين العينة البشرية منزوعة الكالسيوم بـ EDTA والخزعة المصابة بـ MM منزوعة الكالسيوم بالحمض تكون طفيفة، حيث أن كلا العيّنتين البشرتين تظهران بالفعل قيوداً هيكلية أساسية لم تكن ناتجة عن إزالة الكالسيوم فحسب، بل وأيضاً عن المعالجة العامة للأنسجة (الشكل 3C، D). وبناءً على ذلك، يتطلب التقييم الشامل لجودة العينات من أجل النسخ المكاني تقييم عدة معايير متميزة. أولاً، يجب مراقبة سلامة الأنسجة بعناية، حيث يمكن أن يختلف الحفاظ الهيكلي بشكل كبير حسب نوع العينة المحدد بدلاً من الاعتماد فقط على الحمض المستخدم في إزالة الكالسيوم. ثانياً، يجب أيضاً تقييم جودة RNA لأن ظروف إزالة الكالسيوم يمكن أن تؤثر عليها20,35,36.

figure-results-2
الشكل 3: مقاطع مصبوغة بـ H&E المستخدمة لتقييم جودة الأنسجة. تمثل المقاطع المتتالية من FFPE كلًا من (A) فأر تحكم سليم10، و(B) فأر مصاب بـ MM، و(C) عظم بشري سليم8,10، و(D) خزعة MM بشرية8. أشرطة المقياس = 500 µm. الاختصارات: FFPE = مثبت بالفورمالين ومطمور في البارافين؛ H&E = الهيماتوكسيلين والإيوسين؛ MM = المايلوما المتعددة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

لاستكمال التحليل النسيجي، تم تقييم جودة الـ RNA. وبينما أظهر صبغ H&E اختلافات غامضة، ميزت سلامة الـ RNA بوضوح بين تأثيرات طريقتي إزالة التكلس (الجدول 2). تجاوزت قيم DV200 في كل من العينات الفأرية وعينة العظم البشري السليمة الحد الموصى به لمقاييس Visium FFPE، مما يشير إلى توزيع كافٍ لطول قطع الـ RNA لتهجين المجسات وبناء المكتبة. وتظهر عينة الفأر السليم YFP قيمة DV200 تبلغ 82.55%، بينما تصل عينة العظم البشري السليم (hHBM) إلى 58%، وكلاهما أعلى بكثير من حد القبول البالغ 30% الذي حددته شركة 10x Genomics. أما عينة فأر MM (mMM) فتظهر قيمة DV200 تبلغ 31.3%، وهي قريبة من الحد الأدنى للقبول، وهو ما قد يعكس التخزين الممدد لكتلة البارافين عند 4 °C قبل التقطيع، من بين عوامل أخرى خاصة بالعينة. وفي المقابل، أظهرت خزعة MM البشرية (hMM) التي خضعت لإزالة التكلس بالحمض قيمة DV200 تبلغ 8% فقط، وهو ما ارتبط بانخفاض ملحوظ في سلامة الـ RNA، حتى عندما كان التدهور المورفولوجي أقل وضوحاً. وباختصار، فإن إجراء التقييمات الهيكلية والجزيئية معاً أمر مهم لتقدير مدى ملاءمة العينة للتحليلات المكانية اللاحقة.

تعريف العيناتDV200 (%)1
YFPcγ182.55
ملليمولار31.3
نموذج الدم البشري الحيوي (hHBM)58
hMM28
1DV200: نسبة شظايا الحمض النووي الريبي الكلي > ٢٠٠ نيوكليوتيد.
2تم إزالة التكلس من هذه العينة باستخدام بروتوكول سريري قياسي يتضمن أحماضاً قوية.

الجدول 2: جودة الحمض الريبي النووي (RNA) لعينات الدراسة. يمثل DV200 النسبة المئوية لشظايا RNA التي يزيد طولها عن 200 نيوكليوتيد؛ واعتُبرت القيم التي لا تقل عن 30% مناسبة لعمليات النسخ المكاني (spatial transcriptomics) اللاحقة. الاختصارات: hHBM = نخاع عظم بشري سليم؛ hMM = ورم نقيصي متعدد بشري؛ mMM = ورم نقيصي متعدد فأري.

يمكن أيضاً إجراء تقييمات إضافية للجودة. وللمزيد من التحقق من سلامة الأنسجة وتأكيد الحفاظ على مقصورات خلوية محددة بعد إزالة التكلس باستخدام EDTA، تم إجراء صبغ مناعي فلوري (IF) اختياري على مقاطع متجاورة من الأنسجة المدمجة في البارافين والمثبتة بالفورمالين (FFPE) من أنسجة الفئران والبشر. استُخدمت أجسام مضادة لـ Endomucin (Emcn) وCd271 لتصوير الخلايا البطانية (EC) والخلايا الميزانشيمية (MSC)، على التوالي، في عينة الفأر المصاب بالورم النخاعي المتعدد (MM) (الشكل 4A). وأظهر هذا الصبغ أن الأنسجة التي تمت معالجتها بـ EDTA أظهرت تراكيب وعائية محددة جيداً مع صبغ مستمر لـ Emcn وشبكات سدوية محفوظة، مما يشير إلى أن العلامات المختبرة ظلت قابلة للكشف بعد المعالجة. علاوة على ذلك، قدم التصوير عالي الدقة باستخدام نظام تصوير متعدد الأطياف آلي أدلة إضافية على أن المستضدات المختبرة ظلت قابلة للكشف للتحقق من نوع الخلايا، مما وفر طبقة إضافية من مراقبة الجودة قبل تحليل الترانسكريبتوميك المكاني. بالإضافة إلى ذلك، لوحظت هذه النتائج أيضاً في عينات بشرية سليمة من كبار السن، حيث تم الكشف أيضاً عن تعبير EC بواسطة CD31 وتعبير MSC بواسطة أجسام مضادة لـ PRRX1 (Paired Related Homeobox 1)، مما يظهر أن علامات النيش (niche markers) المختبرة ظلت قابلة للتحديد بعد إزالة التكلس بـ EDTA (الشكل 4B). وفي المقابل، لم يتسنَّ تكرار هذه النتائج في خزعات الورم النخاعي المتعدد البشرية التي خضعت لبروتوكولات مختلفة لإزالة التكلس القائمة على الأحماض. وكما ذكر سابقاً، كانت سلامة RNA في هذه العينات منخفضة، مما حد من تحليل الترانسكريبتوميك اللاحق. ونظراً للطبيعة المتحللة لهذه العينات البشرية، اقتصرت فائدتها اللاحقة على توصيف الترانسكريبتوميك الأساسي8 والتقييم الكيميائي النسيجي المناعي (IHC) لخلايا البلازما (PC) الخبيثة (الشكل 4C).

figure-results-3
الشكل 4: التألق المناعي والكيمياء النسيجية المناعية الاختيارية للتحقق من نوع الخلايا. (A) نسيج MM من فأر يظهر النوى المصبوغة بـ DAPI (باللون الأزرق)، وخلايا MSC الموجبة لـ CD271 (باللون الأخضر)، وخلايا EC الموجبة لـ EMCN (باللون الأحمر). (B) عظم بشري سليم يظهر النوى المصبوغة بـ DAPI (باللون الأزرق)، وخلايا MSC الموجبة لـ PRRX1 (باللون الأخضر)، وخلايا EC الموجبة لـ CD31 (باللون الأحمر)10. (C) خزعة MM بشرية تظهر خلايا PC خبيثة موجبة لـ CD1388. أشرطة المقياس: (A) 250 µm (نظرة عامة)، 20 µm (تكبير مدمج)، و 50 µm (صور القناة الواحدة)؛ (B) 500 µm (نظرة عامة) و 20 µm (تكبيرات مدمجة وبقناة واحدة)؛ (C) 500 µm. الاختصارات: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole؛ EC = خلية بطانية؛ MM = ورم نخاعي متعدد؛ MSC = خلية سدوية ميزنكيمية؛ PC = خلية بلازمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تدعم نتائج مورفولوجيا الأنسجة وDV200 معاً ملاءمة العينات المعالجة بـ EDTA لإجراء تحليل الترانسكريبتوم المكاني اللاحق. وقد تم الإبلاغ مسبقاً عن تطبيقات الترانسكريبتوم المكاني لسير عمل التحضير هذا8,10.

المناقشة

من خلال دمج عملية إزالة التكلس المحكومة القائمة على EDTA، ومعالجة FFPE القياسية، ونقاط تفتيش صارمة لمراقبة الجودة، يتجاوز هذا البروتوكول العديد من القيود المرتبطة تقليدياً بتحضير أنسجة العظام لتقنية النسخ المكاني (spatial transcriptomics)، وبالأخص تلك المتعلقة بتدهور RNA والتلف المورفولوجي الناجم عن طرق إزالة التكلس القائمة على الأحماض القوية8,10,20,33,36. وتعد إزالة التكلس الخطوة الأكثر أهمية في معالجة العينات المعدنية المخصصة للنسخ المكاني؛ حيث تؤدي إزالة التكلس غير الكافية إلى بقاء العظام صلبة للغاية بحيث يصعب تقطيعها، مما يجعل من المستحيل مادياً الحصول على مقاطع عالية الجودة للنسخ المكاني8,20,23,37,50. وعندما تظل أنسجة العظام صلبة جداً، فإنها تتفتت أو تهتز عند ملامستها لشفرة الميكروتوم، مما يؤدي إلى تمزق المقاطع أو ظهور ثقوب لا تمثل البنية الأصلية لنخاع العظم (BM) بدقة. ومن المهم الإشارة إلى أن نجاح عملية إزالة التكلس لا يمكن تأكيده بشكل كامل إلا في مرحلة التقطيع المجهري (microtomy)؛ فحتى العينات التي تبدو لينة ظاهرياً قد تظل تحتوي على معادن متبقية لا تظهر إلا عند محاولة قطع مقاطع رقيقة من FFPE. لهذا السبب، يعد الرصد الدقيق لتقدم عملية إزالة التكلس أمراً ضرورياً لضمان الحصول على نتائج قابلة للتكرار.

يستخدم سير العمل 0.25 M EDTA عند pH 6.95 لمدة 10 أيام مع تقليب مستمر واستبدال للمحلول في اليوم الخامس8,10. أثناء تطوير البروتوكول، تم تقييم EDTA بمفرده، وEDTA مدعماً بـ polyvinylpyrrolidone، وحمض الفورميك بتركيز 10%، إلى جانب فترات إزالة تكلس مختلفة وجداول زمنية لاستبدال المحلول؛ ولم تُعرض البيانات المقارنة هنا. وغالباً ما أدت الفترات التي تقل عن 10 أيام إلى تكسر الأنسجة أثناء تقطيع عينات الفئران، بينما أظهرت العينات البشرية سلوكاً يعتمد على طبيعة العينة. ولذلك، تُستخدم مدة 10 أيام لعظام الفخذ لدى الفئران، بينما قد تتطلب العينات البشرية فترة إزالة تكلس أطول وفقاً للكثافة والمحتوى التربيقي. يجب استخدام نقاط تفتيش لمراقبة الجودة الفيزيائية قبل الطمر في البارافين. وإذا تبين عدم كفاية إزالة التكلس أثناء عملية التقطيع المجهري، يتم استخدام إجراء إعادة المعالجة فقط كخطوة إنقاذ أخيرة لأن التعرض الإضافي للحرارة والمذيبات وإعادة الترطيب قد يؤثر سلباً على جودة RNA.

يتمثل القيد الأساسي لهذه الطريقة في وقت المعالجة الطويل، وهو ما يتناقض بشكل صارخ مع البروتوكولات السريعة القائمة على الأحماض والمستخدمة عادةً في علم الأمراض السريري20,36. وعلى الرغم من أن أوقات المعالجة الأطول تكون مقبولة عموماً في سياقات البحث، إلا أن الدراسات الحديثة، مثل البروتوكول الذي وصفه Miao et al.، والذي يستخدم محلول Morse (حمض الفورميك 22.5% وسترات الصوديوم 10%) لإزالة التكلس في غضون 24 h، تسلط الضوء على الاهتمام المتزايد بتسريع تحضير العظام للمقاييس المكانية20. ومع ذلك، فإن الطرق القائمة على الأحماض تحمل تاريخياً مخاطر أعلى بكثير لتحلل الـ RNA، مما يقلل من قيم DV200 ويحد في النهاية من توافقها مع النسخ المكانية (spatial transcriptomics)1,8,35,36. ويمنح هذا النهج القائم على EDTA الأولوية للحفاظ على الـ RNA على حساب السرعة، مما يضمن التوافق مع المنصات المكانية القائمة على التسلسل مثل Visium.

تتمثل إحدى القيود المحتملة للنسخ المكاني (spatial transcriptomics) لنخاع العظم في الوفرة العالية لنسخ الغلوبولين المناعي المشتقة من الخلايا البلازمية (PC)، مما قد يقلل من القدرة على الكشف عن الجينات ذات الوفرة المنخفضة. وكما هو الحال مع استراتيجيات مراقبة الجودة والترشيح المطبقة في دراسة سابقة للمجموعة البحثية، بما في ذلك إزالة البقع منخفضة الجودة (<200 UMIs و <150 جينًا مكتشفًا)، وترشيح أنواع الخلايا ذات المساهمة المنخفضة (<20% لكل بقعة) أثناء تحليلات فك الالتفاف (deconvolution analyses)، واختيار الجينات الواسمة المكتشفة في مجموعات بيانات النسخ المكاني، يمكن أيضًا ترشيح نسخ الغلوبولين المناعي حاسوبيًا أثناء التحليل اللاحق لتقليل تأثيرها عند الاقتضاء8. وقد تؤدي مناهج النسخ المكاني المستهدفة إلى تحسين الكشف عن النسخ ذات الوفرة المنخفضة بشكل أكبر في تطبيقات محددة.

تتعدد التطبيقات المحتملة لهذه الطريقة بشكل كبير. فقد كشف التكامل الحديث بين البيانات المكانية وبيانات الخلية الواحدة عن وجود محادق عظمية بشرية متخصصة وتدرجات إشارية معقدة تشع من العظم التربيقي3,26. علاوة على ذلك، أظهر علم النسخ المكاني أن الشيخوخة تعيد تشكيل البيئة المجهرية لنخاع العظم (BM) من خلال تغيير التنظيم المكاني والتواصل بين الخلايا البطانية (EC)، مما يؤدي إلى ضعف الدعم العظمي وظهور شبكات إشارية التهابية داخل المحدقة المتقدمة في السن10. كما حدد التنميط متعدد الأوميك أحياء بيئية مجهرية متميزة، مثل المناطق الشريانية-بطانة العظم التي تدعم تكوين النقاوة المبكر، والمناطق المحيطة بالخلايا الدهنية الغنية بالخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم3. وفي سياق الورم النخاعي المتعدد (MM)، يتيح هذا البروتوكول دمج أطر النسخ المكانية والخاصة بالخلية الواحدة لتوصيف تكوين نخاع العظم الفأري المصاب والتفاعلات بين الخلايا. وقد كشفت أعمال سابقة عن توزيعات متميزة مكانياً للخلايا البلازمية (PC) الخبيثة، وحددت برامج مناعية والتهابية، مثل عملية NETosis وإشارات IL-17، والتي كانت مرتبطة عكسياً بالمناطق الغنية بالأورام. بالإضافة إلى ذلك، ارتبطت الزيادة في كثافة الخلايا البلازمية الخبيثة بتحول في حالات الخلايا التائية (T-cell) من الحالة المؤثرة إلى الحالة المجهدة. وتم التحقق من هذه النتائج أيضاً في عينات نخاع العظم البشرية المثبتة بالفورمالين والمطمورة في البارافين (FFPE)، مما يثبت أهميتها الترجمية عبر مختلف أحمال المرض8. وفي النهاية، يوفر سير عمل التحضير هذا الأساس التقني لاستكشاف التفاعلات الخلوية المعقدة داخل البنية المعدنية لنخاع العظم.

يمكن لمنصات التعبير الجيني المكاني عالية الدقة أن توفر توصيفاً كاملاً للترانسكريبتوم بدقة تقارب دقة الخلية الواحدة38,51,52. وقد تعمل هذه المنهجيات على توسيع نطاق استخدام سير عمل التحضير لإجراء تحليلات أكثر دقة لنخاع العظم (BM) والسرطانات الدموية المنظمة مكانياً. وبناءً على ذلك، يوفر سير العمل هذا أساساً تقنياً للدراسات المستقبلية حول تكوين الدم الفسيولوجي والخبيث.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح. وقد تم منح ترخيص لبراءة اختراع تتعلق بالمعرفة الفنية والاستخدام التجريبي لنماذج الفئران MIcγ1 المصابة بـ MM لشركة MIMO Biosciences (طلب رقم PCT/EP2023/071025).

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل Instituto de Salud Carlos III وبتمويل مشترك من ERDF A way of making Europe (PI22/00983)؛ وCIBERONC (CB16/12/00489)، وRICORS TERAV (RD21/0017/0009) وRICORS TERAV Plus (RD24/0014/0010)؛ وAGATA 0011-1411-2020- 000010/0011-1411-2020-000011؛ وDepartamento de Salud Gobierno de Navarra (GN2024/04)؛ وCancer Research UK [C355/A26819]؛ وFC AECC وAIRC ضمن برنامج Accelerator Award؛ وThe International Myeloma Foundation (Brian van Novis) وThe Paula and Rodger Riney Foundation لـ FP. كما حصل IAC على دعم من منحة ماري كوري (H2020- MSCA-IF-837491) من المفوضية الأوروبية، ومنحة AECC Talent (INVES258003CALV)، وDepartamento de Salud, Gobierno de Navarra (GN2023/03). وحصل MC على دعم من زمالة FPU (FPU22/03283) من Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. نود أن نشكر موظفي مختبر الجينوميات المتقدمة ومرفق الحيوانات في CIMA Universidad de Navarra على مساعدتهم الفنية والفكرية القيمة. كما نعرب عن تقديرنا لأقسام الباثولوجيا في Clínica Universidad de Navarra (CUN) وHospital Universitario de Navarra لتوفير عينات BM ولتعاونهم المتميز. وتوجه شكر خاص إلى José Ángel Martínez-Climent وMarta Larrayoz على نماذج الفئران المصابة بـ MM. والشكر موجه إلى Patxi San Martín-Uriz وTania López وEduardo Larequi لدعمهم الممتاز في تحسين التقنية، وتطوير البروتوكولات، وحل مشكلات معالجة عينات BM للفئران والبشر في التحليل النسخي المكاني. كما نشكر Beñat Ariceta وAsier Ullate على جميع أعمالهم الحسابية في التحليل النسخي المكاني. وأخيرًا، نعرب عن امتناننا العميق للمرضى والمتبرعين الأصحاء الذين شاركوا بسخاء في هذه الدراسة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب سعة 1.5 mLEppendorf15625367
وعاء معقم سعة 100 mL deltalab723-510
4200 TapeStationAgilentG2991Aنظام يعتمد على الفصل الكهربائي الشعيري – لتقييم سلامة RNA
وعاء معقم سعة 50 mL IberoMedREOR001
أنبوب سعة 50 mL FALCON352070
Advanced PAP PenTed Pella 22309Z377821-1EAقلم حاجز كاره للماء 
جسم مضاد Anti-PRRX1 مُنتج في أرنبSigma-AldrichHPA051084
BSA (ألبومين المصل البقري)Sigma-AldrichA9418-50G
كاسيتات KartellLABWARE2921
جسم مضاد أحادي النسيلة CD271 (مستقبل NGF) (ME20.4)Invitrogen14-9400-82
CD31، خلية بطانية (مركز) مستنسخة JC70AAligent DakoM0823
شرائح غطاءFisher Scientific12-544-EP50 mm x 24 mm
DAPI (وسط تثبيت VECTASHIELD مانع للتلاشي مع DAPI)Vector LaboratoriesH-1200-10
محلول إزالة البارافينQiagen19093
DPBSThermo Scientific AAJ67802APمحلول ملحي منظم بالفوسفات (DPBS, 1×) من Thermo Scientific Chemicals، صيغة Dulbecco، بدون كالسيوم، بدون مغنيسيوم
وسط تثبيت DPX للأنسجةSigma-Aldrich06522-500ML
EDTAThermo Scientific 15748687حمض إيثيلين ثنائي أمين رباعي الخليك، (EDTA)، محلول بتركيز 0.5 M، درجة البيولوجيا الجزيئية، فائق النقاء
محطة طمر Leica Biosystems14 0388 81101Leica EG1150H
جسم مضاد Emcn (V.7C7)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
الجينوم المرجعي Ensembl (GRCh38 / mm10، الإصدار 105)EMBL-EBIN/Aالجينوم المرجعي المستخدم لمحاذاة القراءات.
إيوسينMillipore SigmaHT110116
إيثانولMillipore SigmaE7023-500MLمقصات جراحية
حمام مائي للأنسجة Falc Instruments B-IFalc610.1030.00
فورمالين 4% PanReac AppliChem2524311315فورمالدهيد 3.7%–4.0% w/v منظم عند pH = 7 ومثبت بالميثانول (CE-IVD) للتشخيص السريري
حامل صبغ للشرائح الزجاجية WHEATONZ710970-3EA
جرار صبغ زجاجية BRANDBR472200-10EAMastercycler  X50
جليسرولSigma-AldrichC3H803
جسم مضاد ثانوي Goat anti-Mouse IgG (H+L) ممتز متبادل، Alexa Fluo 568InvitrogenA11004
جسم مضاد ثانوي Goat anti-Mouse IgG (H+L) ممتز متبادل بدرجة عالية، Alexa Fluo Plus 488InvitrogenA32723
جسم مضاد ثانوي Goat anti-Rabbit IgG (H+L) ممتز متبادل بدرجة عالية، Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
هيماتوكسيلين Millipore SigmaMHS16
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579تقييم سلامة RNA
High Sensitivity RNA ScreenTape LadderAgilent5067-5581تقييم سلامة RNA
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample BufferAgilent5067-5580تقييم سلامة RNA
مجهر عالي الدقة Leica BiosystemsN/Aماسح Aperio CS2
حمض الهيدروكلوريك (0.1 N HCl)Fisher ChemicalSA54-1
منصة Illumina NextSeq 2000Illumina20038897
جسم مضاد ثانوي Invitroge Goat anti-Rat IgG (H+L) ممتز متبادل، Alexa Fluo 568InvitrogenA11077
مقصات قزحية - ToughCutF.S.T 14058-11
IsovetBRAUNBR3009إيزوفلورين
كربونات الليثيوم Merck554-13-2
Loupe Browser (v6.0.0) 10x GenomicsN/Aبرنامج مستخدم لتصور صور HE وتنظيم بقع Visium؛ يفتح ملفات .cloupe الناتجة عن خط تحليل البيانات.
قوالب طمر معدنيةBio-Optica07-BM24256
شرائح مجهريةavantor631-0108شرائح مجهرية Superfrost Plus
شفرات الميكروتومFEATHERFEAT207500006_U
ميكروتوم HM 340EEprediaN/Aطراز HM 340E
إبرةBD301156إبرة BD Microlanc 3 بسعة 21 G وطول 1 IN (25 MM)
Nikon Optiphot-2Nikon71052مجهر ضوئي بمجال مضيء
بارافين PanReac AppliChem256993بارافين بـ M.P. 55–58°C ملدن + حبيبات DMSO (CE-IVD) للتشخيص السريري
طبق بتري CorningCLS430167-100EA
قوالب طمر بلاستيكية Bio-Optica07-MP7070
ملقط Potts-SmithF.S.T 11012-18ملقط
مقياس فلورية Qubit 3.0Invotrogen Q33216
أنابيب مقايسة QubitInvotrogen Q32856
طقم مقايسة Qubit RNA HSInvotrogen Q32855
أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL خالٍ من RNAseThermo Scientific AM12400
ماء خالٍ من RNase MerkW4502
RNaseZap RnaseInvotrogen AM9780محلول تطهير
طقم RNeasy FFPE (50)Qiagen73504استخلاص RNA الكلي
SCTransform (v0.3.5)Satija LabN/Aطريقة تسوية تثبيت التباين المطبقة في Seurat.
Seurat (v4.3.0.1) Satija LabN/Aحزمة R مستخدمة لتحليل الترانسكريبتوميكس وحيد الخلية والمكاني.
Space Ranger (v2.0.1)10x GenomicsN/Aبرنامج مستخدم لإلغاء تعدد الإرسال، والمحاذاة، وتوليد مصفوفات السمات-الباركود لمجموعات بيانات Visium.
مشرط Stlime Schreiber GmbH 51-11-030
STutility (v1.1.1)Bergen LabN/Aحزمة R مستخدمة لتصور وتكامل الترانسكريبتوميكس المكاني.
شفرة مشرط جراحي رقم 23Swann-Morton210شفرات مشرط جراحي
دورة حرارية Eppendorf6313000018
Tween-200Sigma-AldrichP2287-500ML
Vectra Polaris PerkinElmerCLS143455منصة تصوير متعدد الأطياف لتصور IF
طقم ملحقات Visium 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000194
Visium CytAssist10x GenomicsPN-1000441
طقم مجسات الترانسكريبتوم البشري Visium الصغير 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000363
طقم مجسات الترانسكريبتوم الفأري Visium الصغير 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000365
طقم شرائح التعبير الجيني المكاني Visium لـ 4 تفاعلات 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000188
زايلينPanreac214736زايلين، خليط من المتصاوغات للتحليل، ACS, ISO

المراجع

  1. Cooper RA, et al. Spatial transcriptomic approaches for characterising the bone marrow landscape: pitfalls and potential. Leukemia. 2025;39(2):291-295.
  2. Mercier FE, Ragu C, Scadden DT. The bone marrow at the crossroads of blood and immunity. Nat Rev Immunol. 2012;12(1):49-60.
  3. Bandyopadhyay S, et al. Mapping the cellular biogeography of human bone marrow niches using single-cell transcriptomics and proteomic imaging. Cell. 2024;187(12):3120-3140.e29.
  4. Tikhonova AN, et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 2019;569(7755):222-228.
  5. Baccin C, et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 2020;22(1):38-48.
  6. Kunisaki Y, et al. Arteriolar niches maintain haematopoietic stem cell quiescence. Nature. 2013;502(7473):637-643.
  7. Kusumbe AP, Ramasamy SK, Adams RH. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 2014;507(7492):323-328.
  8. Muiños-Lopez E, et al. Characterization of the bone marrow architecture of multiple myeloma using spatial transcriptomics. Commun Biol. 2025;8(1):1620.
  9. Gui G, et al. Single-cell spatial transcriptomics reveals immunotherapy-driven bone marrow niche remodeling in AML. Sci Adv. 2025;11(28):eadw4871.
  10. Cenzano I, et al. Single-cell profiling reveals RAB13+ endothelial cells and profibrotic mesenchymal cells in aged human bone marrow. Aging Cell. 2026;25(4):e70475.
  11. de Jong MME, et al. The multiple myeloma microenvironment is defined by an inflammatory stromal cell landscape. Nat Immunol. 2021;22(6):769-780.
  12. de Jong MME, et al. An IL-1β-driven neutrophil–stromal cell axis fosters a BAFF-rich protumor microenvironment in individuals with multiple myeloma. Nat Immunol. 2024;25(5):820-833.
  13. Cenzano I, et al. Stromal and endothelial transcriptional changes during progression from MGUS to myeloma and after treatment response. Nat Commun. 2026;17:74389.
  14. Ye J, et al. Deconvolution of the hematopoietic stem cell microenvironment reveals a high degree of specialization and conservation. iScience. 2022;25(5):104225.
  15. Chen L, et al. An inflammatory T-cell-stromal axis contributes to hematopoietic stem/progenitor cell failure and clonal evolution in human myelodysplastic syndrome. Nat Commun. 2025;16(1):10041.
  16. Prummel KD, et al. Inflammatory stromal and T cells mediate human bone marrow niche remodeling in clonal hematopoiesis and myelodysplasia. Nat Commun. 2025;16(1):10042.
  17. De Jonghe J, et al. scTrends: A living review of commercial single-cell and spatial 'omic technologies. Cell Genom. 2024;4(12):100723.
  18. van den Brink SC, et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 2017;14(10):935-936.
  19. Asp M, Bergenstråhle J, Lundeberg J. Spatially resolved transcriptomes—next generation tools for tissue exploration. Bioessays. 2020;42(10):1900221.
  20. Miao J, et al. A practical protocol of processing mineralized tissue for Visium spatial transcriptomics. Mechanobiol Med. 2025;3(4):100163.
  21. Baldwin M, et al. A roadmap for delivering a human musculoskeletal cell atlas. Nat Rev Rheumatol. 2023;19(11):738-752.
  22. Duan H, Cheng T, Cheng H. Spatially resolved transcriptomics: advances and applications. Blood Sci. 2023;5(1):1-12.
  23. Xiao X, et al. Spatial transcriptomic interrogation of the murine bone marrow signaling landscape. Bone Res. 2023;11(1):59.
  24. Jain S, Eadon MT. Spatial transcriptomics in health and disease. Nat Rev Nephrol. 2024;20(10):659-671.
  25. Tilburg J, et al. Spatial transcriptomics of murine bone marrow megakaryocytes at single-cell resolution. Res Pract Thromb Haemost. 2023;7(4):100158.
  26. Lin W, et al. Mapping the spatial atlas of the human bone tissue integrating spatial and single-cell transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2025;53(2):gkae1298.
  27. Marx V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 2021;18(1):9-14.
  28. Yue L, et al. A guidebook of spatial transcriptomic technologies, data resources and analysis approaches. Comput Struct Biotechnol J. 2023;21:940-955.
  29. Joglekar A, et al. A spatially resolved brain region- and cell type-specific isoform atlas of the postnatal mouse brain. Nat Commun. 2021;12(1):463.
  30. Madissoon E, et al. A spatially resolved atlas of the human lung characterizes a gland-associated immune niche. Nat Genet. 2023;55(1):66-77.
  31. Wang F, et al. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 2023;9(24):eadf5464.
  32. Robinson MH, et al. Regulation of antigen-specific T cell infiltration and spatial architecture in multiple myeloma and premalignancy. J Clin Invest. 2023;133(15):e167303.
  33. Wehrle E, et al. Protocol for preparing formalin-fixed paraffin-embedded musculoskeletal tissue samples from mice for spatial transcriptomics. STAR Protoc. 2024;5(2):103089.
  34. Sangeetha R, Uma K, Chandavarkar V. Comparison of routine decalcification methods with microwave decalcification of bone and teeth. J Oral Maxillofac Pathol. 2013;17(3):386-391.
  35. Yip RKH, et al. Profiling the spatial architecture of multiple myeloma in human bone marrow trephine biopsy specimens with spatial transcriptomics. Blood. 2025;146(15):1837-1849.
  36. Miquelestorena-Standley E, et al. Effect of decalcification protocols on immunohistochemistry and molecular analyses of bone samples. Mod Pathol. 2020;33(8):1505-1517.
  37. Ambrosi TH, et al. Human skeletal development and regeneration are shaped by functional diversity of stem cells across skeletal sites. Cell Stem Cell. 2025;32(5):811-823.e11.
  38. 10x Genomics. Visium Spatial Platform. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/platforms/visium#assays
  39. Amemiya K, et al. Influence of formalin fixation duration on RNA quality and quantity from formalin-fixed paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissues. Pathol Int. 2023;73(12):593-600.
  40. Srinivasan M, Sedmak D, Jewell S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 2002;161(6):1961-1971.
  41. Nam SK, et al. Effects of fixation and storage of human tissue samples on nucleic acid preservation. Korean J Pathol. 2014;48(1):36-42.
  42. 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE User Guide. Document CG000407, Revision E. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/support/spatial-gene-expression-ffpe/documentation/steps/library-construction/visium-spatial-gene-expression-reagent-kits-for-ffpe-user-guide
  43. Eccher A, et al. Pathology laboratory archives: conservation quality of nucleic acids and proteins for NSCLC molecular testing. J Pers Med. 2024;14(4):333.
  44. Bai Z, et al. Spatially exploring RNA biology in archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Cell. 2024;187(23):6760-6779.e24.
  45. 10x Genomics. Visium CytAssist Spatial Gene Expression for FFPE—Tissue Preparation Guide. Document CG000518, Revision D. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/support/cytassist-spatial-gene-expression/documentation/steps/tissue-prep/visium-cyt-assist-spatial-gene-expression-for-ffpe-tissue-preparation-guide
  46. 10x Genomics. Visium CytAssist Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE User Guide. Document CG000495, Revision G. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026. Available from: https://www.10xgenomics.com/support/cytassist-spatial-gene-expression/documentation/steps/library-construction/visium-cyt-assist-spatial-gene-expression-reagent-kits-for-ffpe
  47. Agilent Technologies. High Sensitivity RNA ScreenTape assay for TapeStation systems quick guide. Version A.01.05. Santa Clara (CA): Agilent Technologies. 2024: Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/HS-RNA_QuickGuide.pdf
  48. Agilent Technologies. Agilent 4200 TapeStation system—System manual. Publication G2991-90000, Version A.02.02. Santa Clara (CA): Agilent Technologies. 2024: Available from: https://download.chem.agilent.com/software/4200_tapestation_user_info_package_v2/tapestation%20user%20information/tapestation%20manuals/agilent%204200%20tapestation%20system%20manual_g2991-90000.pdf
  49. Larrayoz M, et al. Preclinical models for prediction of immunotherapy outcomes and immune evasion mechanisms in genetically heterogeneous multiple myeloma. Nat Med. 2023;29(3):632-645.
  50. Wang S. Resolving the bone – optimizing decalcification in spatial transcriptomics and molecular pathology. J Histotechnol. 2025;48(1):68-77.
  51. Oliveira MF, et al. High-definition spatial transcriptomic profiling of immune cell populations in colorectal cancer. Nat Genet. 2025;57(6):1512-1523.
  52. Bourgain-Chang E, Kuang X, Cang Z, Nie Q. Reconstructing single-cell resolution from spatial transcriptomics with CellRefiner. Nat Commun. 2026;17(1):3304.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FFPE EDTA RNA
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة