مقالة منهجية

الكشف عن البروتينات داخل الخلوية في خلايا K562 البشرية المصابة بابيضاض الدم الحمري باستخدام قياس التدفق الخلوي والأجسام المضادة الأولية غير المقترنة

52 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72500

⸱

سبتمبر 8, 2026

 ,  , 
1Department of Basic Medical Sciences, College of Medicine-Phoenix, University of Arizona

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول الكشف عن البروتينات داخل الخلوية في خلايا K562 البشرية المصابة بابيضاض الدم eritroكيميائي باستخدام أجسام مضادة أولية متعددة النسيلات غير مقترنة. ويتم إثبات خصوصية الأجسام المضادة من خلال تثبيط الصبغ المعتمد على الجرعة عن طريق التنافس الببتيدي.

الملخص

يُعد قياس التدفق الخلوي تقنية قوية للتحليل الكمي للتعبير البروتيني بدقة الخلية الواحدة. يصف هذا البروتوكول سير عمل للكشف عن البروتينات داخل الخلوية في خلايا K562 البشرية المصابة بابيضاض الدم المแดง باستخدام أجسام مضادة أولية متعددة النسائل غير مقترنة وأجسام مضادة ثانوية مقترنة بفلوروفور. يتم تثبيت الخلايا، ثم نفاذها، ثم حجبها بالتتابع قبل صبغ الأجسام المضادة. ومن خلال تغيير ترتيب حضانة الأجسام المضادة بالنسبة لعمليتي التثبيت والنفاذ، يتيح البروتوكول تقييم البروتينات ذات التموضع السطحي أو داخل الخلوي باستخدام مسارات صبغ منفصلة. كما يتم توضيح الصبغ النووي للوحدة الفرعية 1 من عامل التضفير 3أ (SF3A1) باستخدام جسم مضاد أرنبي متعدد النسائل لـ SF3A1 منقى بالألفة، ويتم تقييم خصوصية الجسم المضاد عن طريق التثبيط المعتمد على الجرعة للصبغ باستخدام الببتيد المستضدي المقابل. بالإضافة إلى ذلك، تُستخدم ظروف الصبغ لتقييم تفاعلية جسم مضاد يستهدف النطاق داخل الخلوي لمستقبل الإريثروبويتين. يوسع سير العمل الموحد هذا استخدام الأجسام المضادة الأولية غير المقترنة في قياس التدفق الخلوي ويوفر نهجاً عملياً لتقييم التعبير البروتيني وتموضعه، فضلاً عن خصوصية الأجسام المضادة في خلايا K562 البشرية المصابة بابيضاض الدم المแดง.

المقدمة

يُعد قياس التدفق الخلوي أداة تحليلية قوية وواسعة الاستخدام تتيح التقييم الكمي للتعبير البروتيني بدقة الخلية الواحدة، مما يسهل فحص المجموعات الخلوية غير المتجانسة والنادرة1,2,3. وبينما تعتمد مناهج قياس التدفق الخلوي التقليدية بشكل أساسي على استخدام أجسام مضادة تستهدف مستضدات سطح الخلية، فإن العديد من البروتينات المهمة وظيفياً، مثل عوامل النسخ، ومنظمات معالجة الـ RNA، والمستقبلات التي تخضع لعملية الإدخال الخلوي المحفزة بالرابط، تتركز داخل الحجرات داخل الخلوية. وبالConsequently، فإن هذه البروتينات السيتوبلازمية والنووية لا يمكن الوصول إليها باستخدام بروتوكولات صبغ السطح القياسية. وقد أدى دمج طرق الصبغ داخل الخلوي، والتي تتضمن تثبيت ونفاذية الأغشية الخلوية، إلى توسيع فائدة قياس التدفق الخلوي بشكل كبير من خلال السماح بالتقييم الكمي للبروتينات داخل الخلوية، والسيتوكينات، ووسطاء الإشارات، مع الحفاظ على قدرات الإنتاجية العالية والتحليل متعدد المعلمات المميزة لتحليل قياس التدفق الخلوي التقليدي4,5,6,7.

يتمثل أحد العوائق الرئيسية في الكشف عن البروتينات المرتبطة بالسطح والبروتينات داخل الخلوية عن طريق قياس التدفق الخلوي في مدى توفر الأجسام المضادة المناسبة، وفي حالات كثيرة، النقص في المعرفة بتسلسلات الحاتمة أو المستضدات8,9. وبما أن استراتيجيات التنميط المناعي تعتمد بشكل كبير على علامات سطح الخلية، فإن معظم الأجسام المضادة المتاحة تجارياً والمُصادق عليها لقياس التدفق الخلوي هي أجسام مضادة أحادية النسيلة، تتعرف على حاتمات خارجية مفردة، وتكون مقترنة مسبقاً بالفلوروفورات. وفي المقابل، تتميز الأجسام المضادة متعددة النسيلة بقدرتها على التعرف على حاتمات متعددة ضمن البروتين المستهدف، وتُستخدم عادةً في لطخة وسترن، أو الكيمياء النسيجية المناعية، أو التألق المناعي. ومع ذلك، تكون هذه الأجسام المضادة عادةً غير مقترنة، وبالتالي فهي غير متوافقة بشكل مباشر مع سير عمل قياس التدفق الخلوي القياسي. ويوفر استخدام الأجسام المضادة الأولية غير المقترنة بالتزامن مع الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بالفلوروفور بديلاً مرناً يوسع نطاق الأهداف القابلة للكشف وقد يسمح بتضخيم الإشارة، وهو ما قد يكون مفيداً في حالة البروتينات ذات الوفرة المنخفضة.

لمعالجة هذه المحدوديات، قمنا بتحسين بروتوكول لصبغ البروتينات في خلايا K562 البشرية المصابة بابيضاض الدم الحمري10. يتطلب الصبغ داخل الخلايا إجراء عملية تثبيت للحفاظ على بنية الخلية وحالتها، بالإضافة إلى النفاذية للسماح للأجسام المضادة بالوصول إلى الحجرات داخل الخلوية. في هذا البروتوكول، يتم تثبيت الخلايا باستخدام البارافورمالدهيد (PFA)، وهو مثبت تشابكي شائع الاستخدام يحافظ على المورفولوجيا الخلوية وقد يزيد من نفاذية غشاء الخلية في ظروف معينة11,12,13,14. وتسمح عملية النفاذية باستخدام الإيثانول (EtOH) بدخول الأجسام المضادة إلى الحجرات داخل الخلوية، بما في ذلك الوصول إلى الأهداف النووية5,13,15. تلي عملية النفاذية الصبغ باستخدام أجسام مضادة أولية متعددة النسائل غير مقترنة وأجسام مضادة ثانوية مقترنة بفلوروفور. وباستخدام سير العمل هذا، يتم استخدام المعالجة بـ PFA وحدها للكشف عن التفاعلية المناعية غير السطحية، بينما تُستخدم خطوة نفاذية إضافية بـ EtOH للكشف عن الأهداف النووية. وقد أظهر تقييم خصوصية الصبغ النووي عن طريق تنافس الببتيد تثبيطاً يعتمد على الجرعة لارتباط الجسم المضاد بواسطة الببتيد المتوافق وليس بواسطة تحكم غير محدد. بشكل عام، يوسع استخدام الأجسام المضادة الأولية متعددة النسائل غير المقترنة من إمكانية تطبيق قياس التدفق الخلوي إلى ما يتجاوز تحليل العلامات السطحية التقليدي باستخدام الأجسام المضادة المقترنة بفلوروفور، ويوفر نهجاً مرناً لتقييم تعبير البروتين داخل الخلايا بدقة الخلية الواحدة.

البروتوكول

تم الحصول على خلايا K562 تجاريًا، وتم التحقق من هويتها واختبارها دوريًا للكشف عن الميكوبلازما بواسطة وحدة الوراثة الأساسية في جامعة أريزونا. لم يشارك في هذه الدراسة أي من المشاركين البشريين أو الحيوانات الفقارية.

1. تحضير الكواشف

  1. استنبت الخلايا تحت ظروف معقمة. استخدم خط خلايا سرطان الدم النقوي البشري K562 لهذا البروتوكول.
    1. أذب وحافظ على خلايا K562 في وسط Roswell Park Memorial Institute (RPMI) المكمل بـ 10% مصل جنين بقري و1% بنسلين-ستربتومايسين عند 37°C في 5% CO₂16. ولغرض الإكثار، ازرع الخلايا بكثافة تبلغ حوالي 1 × 105 خلية/mL، واحصدها عندما تصل المزارع إلى 75%–95% من أقصى كثافة خلوية موصى بها، ولا تستنبتها لأكثر من 20 ممرًا. ولغرض التلوين، احصد الخلايا عند 50%–75% من أقصى كثافة خلوية موصى بها.
  2. حضّر محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) بتركيز 10× معقم داخل كابينة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية.
    1. أضف 80 g من كلوريد الصوديوم (NaCl)، و2 g من كلوريد البوتاسيوم (KCl)، و2.4 g من فوسفات البوتاسيوم أحادية القاعدة (KH₂PO₄)، و14.4 g من فوسفات الصوديوم ثنائية القاعدة (Na₂HPO₄) إلى 800 mL من الماء المعقم بجهاز الأوتوكلاف في مخبار مدرج سعة 1 L.
    2. أضف قضيب تحريك وحرك المحلول على لوح تحريك مغناطيسي حتى يذوب المسحوق بالكامل.
    3. استخدم مسبار pH لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2–7.4. أكمل الحجم النهائي إلى 1 L باستخدام ماء معقم بجهاز الأوتوكلاف. عقم المحلول بالترشيح باستخدام مرشح علوي للزجاجة مزود بغشاء نايلون بحجم مسام 0.2 µm.
  3. خفف محلول 10× PBS إلى 1× PBS بإضافة 100 mL من محلول 10× PBS المعقم إلى 900 mL من الماء المعقم بجهاز الأوتوكلاف داخل كابينة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية.
  4. حضّر صبغة الحيوية القابلة للتثبيت وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. لهذا البروتوكول، أضف 50 µL من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى أنبوب واحد من الصبغة المجففة بالتجميد ورجها بجهاز الفورتيكس حتى تذوب الصبغة تمامًا.
    1. خزن الصبغة المعاد تشكيلها عند −20°C، محمية من الضوء، لمدة تصل إلى سنة واحدة. خزن الصبغة في حصص صغيرة لتجنب دورات التجميد والإذابة المتكررة.
  5. حضّر محلول منظم لفرز الخلايا المنشط بالفلوريسنس (FACS buffer) عن طريق دمج 10% من محلول 10× PBS، و86% ماء، و4% مصل جنين بقري (FBS). على سبيل المثال، ادمج 10 mL من محلول 10× PBS، و86 mL من الماء، و4 mL من FBS لتحضير 100 mL من FACS buffer.
    1. حضّر فقط حجم FACS buffer المطلوب لمدة أسبوعين تقريبًا.
    2. خزن FACS buffer عند 4°C.
  6. حضّر بارافورمالدهيد (PFA) بتركيز 1%.
    تحذير: تعامل مع PFA كمادة مسرطنة قابلة للاشتعال والتفاعل. ارتدِ معدات الوقاية الشخصية المناسبة وحضّر PFA داخل خزانة أبخرة كيميائية معتمدة.
    1. امزج 350 mL من الماء و50 mL من محلول 10× PBS، وضع المحلول على لوح تحريك مسخن، وسخنه إلى 65°C. أضف تدريجيًا 20 g من مسحوق PFA إلى المحلول المسخن لتحضير 4% PFA (وزن/حجم).
    2. أضف 1–3 قطرات من هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بتركيز 5 M لتسهيل ذوبان PFA. حرك المحلول على لوح تحريك مسخن لمدة 20 دقيقة تقريبًا. استخدم مقياس pH لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4.
    3. أكمل الحجم النهائي إلى 500 mL بالماء.
    4. قسم محلول 4% PFA إلى حصص بحجم 50 mL وخزنها عند −20°C لمدة تصل إلى سنة واحدة. بعد الإذابة، خزن محلول 4% PFA عند 4°C لمدة تصل إلى شهرين. تخلص من أي محلول 4% PFA مذاب متبقٍ بعد شهرين.
    5. خفف محلول 4% PFA إلى 1% PFA باستخدام 1× PBS وخزن المحلول المخفف عند 4°C لمدة تصل إلى 4 أسابيع17.
  7. حضّر إيثانول (EtOH) بارد بتركيز 70% عن طريق دمج 70 mL من إيثانول نقي (200-proof) مع 30 mL من ماء فائق النقاء من النوع الأول.
    1. خزن الإيثانول 70% عند −20°C لمدة تصل إلى سنة واحدة. حافظ على المحلول باردًا كالثلج مباشرة قبل إضافته إلى الخلايا لزيادة النفاذية.

2. جمع الخلايا وعدّها

  1. انقل الخلايا من طبق زراعة أنسجة بحجم 10 cm إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 mL.
  2. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 600 × g لمدة 5 min عند 4°C مع تفعيل المكابح لترسيب الخلايا.
  3. أزل وسط الزراعة واغسل الخلايا عن طريق إعادة تعليقهما في 5 mL من 1× PBS. قم بالطرد المركزي مرة أخرى عند 600 × g لمدة 5 min عند 4°C مع تفعيل المكابح، ثم اسحب السائل الطافي، مع ترك الراسب الخلوي.
  4. أعد تعليق الراسب الخلوي في 1× PBS. قم بعد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) أو عداد خلايا آلي عن طريق خلط 10 µL من معلق الخلايا مع 10 µL من صبغة trypan blue، وتحميل العينة على شريحة عد الخلايا، وتحديد تركيز الخلايا.
    ملاحظة: استمر في العمل فقط إذا كانت حيوية الخلايا >90% لضمان الحصول على نتائج موثوقة.
  5. قم بطرد معلق الخلايا مركزياً عند 600 × g لمدة 5 min عند 4°C مع تفعيل المكابح واسحب السائل الطافي، مع ترك الراسب الخلوي. أعد تعليق الخلايا لتصل كثافتها إلى 2 × 105 خلية حية/mL (بحد أدنى 0.5 × 105 خلية حية/mL).
  6. وزع 1 mL من معلق الخلايا في العدد المطلوب من أنابيب تدفق العينات والضوابط.
    1. جهز أنابيب عينات منفصلة لكل بروتين مستهدف ومسار عمل صبغ. يتم إجراء ظروف صبغ السطح (Pre-PFA)، وPost-PFA، وPre-EtOH، وPost-EtOH باستخدام أنابيب عينات مستقلة بدلاً من الصبغ المتسلسل لنفس الخلايا. على سبيل المثال، عند تقييم بروتينين مستهدفين، جهز ثمانية أنابيب: الأنبوب 1 (جسم مضاد أولي A، Pre-PFA)، الأنبوب 2 (جسم مضاد أولي B، Pre-PFA)، الأنبوب 3 (جسم مضاد أولي A، Post-PFA)، الأنبوب 4 (جسم مضاد أولي B، Post-PFA)، الأنبوب 5 (جسم مضاد أولي A، Pre-EtOH)، الأنبوب 6 (جسم مضاد أولي B، Pre-EtOH)، الأنبوب 7 (جسم مضاد أولي A، Post-EtOH)، والأنبوب 8 (جسم مضاد أولي B، Post-EtOH).
      ملاحظة: كما هو موضح في مسار عمل الصبغ (الشكل 1)، قم بإجراء صبغ الأجسام المضادة الأولية والثانوية لعينات Pre-PFA وPre-EtOH في اليوم الأول. وقم بإجراء صبغ الأجسام المضادة الأولية والثانوية لعينات Post-PFA وPost-EtOH في اليوم الثاني.
    2. جهز أنابيب ضابطة غير مصبوغة ومصبوغة صبغاً أحادياً لكل حالة معالجة. في حال تقييم الحيوية وبروتينين مستهدفين، جهز ضابطاً واحداً غير مصبوغ، وضابطاً واحداً لصبغة الحيوية فقط، وضابطاً واحداً للجسم المضاد الثانوي فقط لكل حالة معالجة.
      ملاحظة: على الرغم من أن الجسم المضاد الأولي غير مقترن، يمكن إدراج ضابط للجسم المضاد الأولي فقط أثناء التحقق من صحة المقايسة أو عند تقييم الارتباط غير النوعي للجسم المضاد الأولي.
    3. أخضع جميع الأنابيب الضابطة غير المصبوغة والمصبوغة صبغاً أحادياً لنفس المعاملات التي خضعت لها أنابيب العينات. إذا تم تثبيت العينات باستخدام 1% PFA ونفاذها باستخدام 70% EtOH، فعالج الأنابيب الضابطة بنفس الطريقة تماماً.
  7. جهز ضوابط تعويض مصبوغة صبغاً أحادياً باستخدام حبيبات التعويض.
    ملاحظة: يمكن استخدام الحبيبات بدلاً من الخلايا لتجهيز ضوابط التعويض.
    1. ضع ملصقاً على أنبوب ضابط تعويض واحد لكل فلوروفور وأنبوب ضابط واحد غير مصبوغ. في حالة استخدام صبغة حيوية وجسمين مضادين ثانويين مقترنين بفلوروفورات مختلفة، جهز أربعة أنابيب: ضابط واحد غير مصبوغ، وضابط واحد لصبغة الحيوية (فلوروفور 1)، وضابط واحد للجسم المضاد الثانوي A (فلوروفور 2)، وضابط واحد للجسم المضاد الثانوي B (فلوروفور 3).
      ملاحظة: في حالة استخدام صبغة حيوية تفاعلية مع الأمين، استخدم حبيبات تعويض تفاعلية مع الأمين لضابط صبغة الحيوية.
    2. أضف صبغة واحدة أو جسماً مضاداً واحداً فقط إلى كل أنبوب ضابط تعويض بحيث يكون كل ضابط موجباً لفلوروفور واحد فقط أثناء التعويض في قياس التدفق الخلوي.

مخطط بروتوكول صبغ الأجسام المضادة مع خطوات ما قبل وما بعد التثبيت، ويوضح العمليات المتسلسلة.
الشكل 1. سير عمل الصبغ المُحسَّن للكشف عن الأهداف المرتبطة بالسطح والأهداف داخل الخلايا. يوضح سير العمل تسلسل وتوقيت التثبيت، والنفاذية، والحجب، والصبغ بالأجسام المضادة الأولية، والصبغ بالأجسام المضادة الثانوية بعد الصبغ بصبغة الحيوية القابلة للتثبيت. تظهر مسارات عمل منفصلة لحالات Pre-PFA و Post-PFA و Pre-EtOH و Post-EtOH. يتم إجراء الصبغ بالأجسام المضادة الأولية والثانوية في اليوم الأول لمسارات عمل Pre-PFA و Pre-EtOH، وفي اليوم الثاني لمسارات عمل Post-PFA و Post-EtOH. PFA: بارافورمالدهيد؛ EtOH: إيثانول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. صبغ الخلايا بصبغة حيوية قابلة للتثبيت

  1. اصبغ الخلايا بصبغة حيوية قابلة للتثبيت وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. أضف 1 µL من المحلول المخزون للصبغة الحيوية (الذي تم تحضيره في الخطوة 1.4) مباشرة إلى كل أنبوب عينة وإلى أنبوب التحكم المصبوغ بصبغة حيوية واحدة المقابل، والذي يحتوي على 1 × 106 خلية في 1 mL من 1× PBS.
  2. قم بالرج باستخدام جهاز الفورتيكس بلطف لمدة 3 s وحضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 min، مع حمايتها من الضوء.
    ملاحظة: يجب حماية الخلايا من الضوء خلال هذه الخطوة وجميع الخطوات اللاحقة.
  3. قم بطرد مركزي لمعلق الخلايا عند 600 × g لمدة 5 min في درجة حرارة 4°C مع تفعيل المكابح، ثم اسحب السائل العلوي، مع ترك كتلة الخلايا المترسبة.
  4. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 mL من 1× PBS وأعد تعليق كتلة الخلايا النهائية في 100 µL من 1× PBS.
    ملاحظة: في حال صبغ أهداف سطح الخلية باستخدام أجسام مضادة أولية مقترنة بفلوروفور، قم بإجراء صبغ السطح في هذه المرحلة وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة قبل الانتقال إلى عملية التثبيت.

4. معاملة الخلايا بـ 1% PFA

ملاحظة: بالنسبة لعينات ما قبل تثبيت الـ PFA (راجع الخطوة 2.6.1 والشكل 1)، قم بتنفيذ الخطوات 6 و7 و8 قبل المتابعة في هذا القسم.

  1. أضف 1 mL من PFA بتركيز 1% إلى كل أنبوب عينة، بما في ذلك جميع أنابيب التحكم المصبوغة بلون واحد، وذلك إلى الخلايا المعاد تعليقها في 100 µL من 1× PBS. قم بالرج بـ Vortex بلطف لمدة 3 s ثم حضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15–20 min، مع حمايتها من الضوء.
  2. قم بطرد مركزي لمعلق الخلايا عند 600 × g لمدة 5 min عند 4°C مع تشغيل المكبح. اسحب وتخلص من السائل الطافي، مع الإبقاء على كريّة الخلايا.
  3. اغسل كريّة الخلايا مرتين عن طريق إعادة تعليقها في 1 mL من FACS buffer، يليه طرد مركزي عند 600 × g لمدة 5 min عند 4°C مع تشغيل المكبح.
  4. أعد تعليق كريّة الخلايا النهائية في 100 µL من FACS buffer.
    ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا المثبتة (المصبوغة أو غير المصبوغة) في 1 mL من FACS buffer عند 4°C لمدة 12–48 h. لاستئناف البروتوكول، قم بطرد مركزي لمعلق الخلايا عند 600 × g لمدة 5 min عند 4°C مع تشغيل المكبح، ثم اسحب السائل الطافي وأعد تعليق كريّة الخلايا في 100 µL من FACS buffer.

5. نفاذية الخلايا باستخدام EtOH

ملاحظة: بالنسبة لعينات ما قبل الإيثانول Pre-EtOH (راجع الخطوة 2.6.1 والشكل 1)، قم بتنفيذ الخطوات 6 و7 و8 قبل البدء في هذا القسم.

  1. أضف برفق 1 mL من EtOH بتركيز 70% مبردة بالثلج إلى الجدار الداخلي لكل أنبوب عينة يحتوي على 100 µL من معلق الخلايا، ثم قم فوراً بالرج باستخدام جهاز الفورتكس (vortex) بقوة 50% تقريباً لمدة 5 s. كرر هذه العملية لجميع أنابيب العينات المتبقية وأنابيب الضبط المصبوغة بلون واحد.
  2. حضن الأنابيب عند درجة حرارة −20°C لمدة ساعتين على الأقل، مع حمايتها من الضوء.
    ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا في 1 mL من EtOH بتركيز 70% عند درجة حرارة −20°C لمدة تتراوح بين 12–48 h قبل استكمال البروتوكول.
  3. قم بطرد مركزي لمعلق الخلايا عند 600 × g لمدة 5 min عند درجة حرارة 4°C مع تفعيل المكابح، ثم اسحب السائل الطافي مع ترك كتلة الخلايا المترسبة.
  4. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1 mL من FACS buffer، مع إجراء طرد مركزي عند 600 × g لمدة 5 min عند درجة حرارة 4°C مع تفعيل المكابح بين كل غسلة وأخرى.
  5. أعد تعليق كتلة الخلايا النهائية في 100 µL من FACS buffer.

6. حجب الخلايا

  1. أضف 820 µL من منظم FACS و 80 µL من مصل الماعز الطبيعي (NGS) إلى كل أنبوب لتحضير محلول حجب نهائي يحتوي على 92% من منظم FACS و 8% من NGS. قم بالرج باستخدام جهاز الفورتيكس بلطف لمدة 3 s ثم حضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 min، مع بقائها ثابتة ومحمية من الضوء.
  2. قم بمركزة معلق الخلايا عند 600 × g لمدة 5 min عند درجة حرارة 4°C مع تفعيل المكابح، ثم اسحب السائل الطافي مع ترك كتلة الخلايا المترسبة.
  3. اغسل الخلايا مرتين عن طريق إعادة تعليق الكتلة المترسبة في 1 mL من منظم FACS متبوعاً بالمركزة كما هو موضح في الخطوة 6.2.
  4. أعد تعليق كتلة الخلايا النهائية في 100 µL من منظم FACS.

7. صبغ الخلايا باستخدام جسم مضاد أولي غير مقترن

  1. أضف 0.5 µL من الجسم المضاد الأولي غير المقترن إلى 100 µL من معلق الخلايا (تخفيف 1:200). قم بحضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 h، مع حمايتها من الضوء.
    ملاحظة: يُعد التخفيف بنسبة 1:200 تركيزاً ابتدائياً موصى به وقد يتطلب الأمر تحسيناً للأجسام المضادة الأخرى.
    1. في حال إجراء منافسة الببتيد، أضف الببتيد مباشرة قبل إضافة الجسم المضاد الأولي. في هذا البروتوكول، تم معايرة الببتيدات بنسب مولية من الببتيد إلى الجسم المضاد تتراوح من 50 إلى 0.625، والتي حُسبت بالنسبة لتركيز الجسم المضاد (4.3 nM) في خليط التفاعل. قد يتطلب الأمر تحسيناً لكل زوج من الببتيد والجسم المضاد على حدة.
  2. أضف 1 mL من منظم FACS وقم بطرد مركزي لمعلق الخلايا بسرعة 600 × g لمدة 5 min عند 4°C مع تفعيل المكبح. اسحب السائل الطافي، مع ترك كتلة الخلايا المترسبة.
  3. اغسل الخلايا مرتين إضافيتين باستخدام 1 mL من منظم FACS، مع إجراء الطرد المركزي كما هو موضح في الخطوة 7.2.
  4. أعد تعليق كتلة الخلايا النهائية في 100 µL من منظم FACS.

8. صبغ الخلايا باستخدام جسم مضاد ثانوي مقترن بفلوروفور

  1. أضف تخفيفاً بنسبة 1:200 من الجسم المضاد الثانوي المقترن بالفلوروفور (0.5 µL من الجسم المضاد في 100 µL من معلق الخلايا) إلى كل أنبوب عينة وأنبوب التحكم المقابل.
    ملاحظة: استُخدم الجسم المضاد الثانوي Goat anti-rabbit DyLight 488 في هذا البروتوكول.
  2. حضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 h، مع حمايتها من الضوء.
  3. أضف 1 mL من FACS buffer. قم بطرد مركزي لمعلق الخلايا بسرعة 600 × g لمدة 5 min عند 4°C مع تفعيل المكابح، ثم اسحب السائل الطافي مع ترك كتلة الخلايا.
  4. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 mL من FACS buffer عن طريق تكرار عملية الطرد المركزي الموصوفة في الخطوة 8.3.
  5. أعد تعليق الخلايا في 300–500 µL من FACS buffer.
    ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا في FACS buffer عند 4°C، محمية من الضوء، لمدة تتراوح بين 1–3 days قبل تحليل قياس التدفق الخلوي.

9. تحليل العينات بواسطة قياس التدفق الخلوي

  1. قم بإجراء تعويض الفلورة باستخدام الضوابط المناسبة المصبوغة بصبغة واحدة. اكتسب العينات باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي واجمع ما لا يقل عن 5,000–10,000 حدث خلوي فردي حي للتحليل. في هذا البروتوكول، تم استخدام برنامج FACSDiva لاكتساب البيانات.
  2. حلل البيانات من خلال استبعاد الحطام أولاً باستخدام مساحة التشتت الأمامي (FSC-A) مقابل مساحة التشتت الجانبي (SSC-A)، يليه استبعاد الخلايا المزدوجة باستخدام ارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H) مقابل عرض التشتت الأمامي (FSC-W) وارتفاع التشتت الجانبي (SSC-H) مقابل عرض التشتت الجانبي (SSC-W). استبعد الخلايا الميتة باستخدام قناة صبغة الحيوية.
  3. حلل النسبة المئوية للخلايا الفردية الحية المتبقية التي تكون إيجابية أو سلبية للبروتينات المستهدفة المختارة (انظر النتائج التمثيلية). حدد بوابات الإيجابية باستخدام الضوابط غير المصبوغة وضوابط الأجسام المضادة الثانوية فقط، وطبق معايير تحديد البوابات المتطابقة على جميع العينات المقارنة ضمن نفس دفعة الاكتساب.

النتائج

يتيح البروتوكول الموصوف هنا الصبغ داخل الخلايا للأهداف البروتينية التي لا تتوفر لها أجسام مضادة تجارية معتمدة لقياس التدفق الخلوي. وكمثال نموذجي، تم تقييم صبغ الوحدة الفرعية 1 من عامل الربط 3أ (SF3A1)، وهو بروتين ربط يتم التعبير عنه في جميع أنحاء الجسم ويتمركز في النواة، باستخدام جسم مضاد متعدد النسائل من الأرانب تم إنتاجه ضد ببتيد يتوافق مع الأحماض الأمينية 18–37 من SF3A1 (SF3A118–37; EPKQPTEEEASSKEDSAPSK)18,19.

لتقييم سير عمل التصبغ، صُبغت الخلايا باستخدام الجسم المضاد SF3A1 غير المقترن.18–37 جسم مضاد متعدد النسائل أولي إما قبل أو بعد المعالجة بالبارافورمالدهيد (PFA) وحده، أو المعالجة المتسلسلة بالبارافورمالدهيد (PFA) + الإيثانول (EtOH) (الشكلان 1 و2). وكما كان متوقعاً، لم يتم الكشف عن أي مجموعة إيجابية لبروتين SF3A1 في العينات التي صُبغت قبل المعالجة بـ PFA (Pre-PFA) أو قبل المعالجة المتتابعة بـ PFA و EtOH (Pre-EtOH) (الشكل 2أأظهر التلوين الذي أُجري بعد المعالجة بـ PFA وحدها (Post-PFA) وجود مجموعة صغيرة موجبة لـ SF3A1 (الشكل 2ب). وفي المقابل، لوحظ وجود مجموعة متميزة موجبة لـ SF3A1 فقط عندما تم إجراء الصبغ بعد النفاذية باستخدام الإيثانول (Post-EtOH) (الشكل 2Bتشير هذه النتائج إلى أن سير العمل يكشف عن تلوين لبروتين SF3A1 أكبر بكثير بعد النفاذ باستخدام EtOH مقارنةً بالمعالجة بـ PFA وحدها.

رسم بياني للتدفق الخلوي؛ تحليل خلايا SF3A1+ قبل/بعد التثبيت؛ مقارنة بين EtOH/PFA؛ DL488، SSC-A.
الشكل 2. تقييم صبغ SF3A1 بعد التثبيت بالبارافورمالدهيد والنفاذية بالإيثانول. مخططات تدفق خلوي ممثلة لخلايا K562 حية وسالبة لصبغة الحيوية، توضح فلورة DyLight 488 (DL488) مقابل مساحة التشتت الجانبي (SSC-A). تشير المنطقة المؤطرة إلى مجتمع خلايا SF3A1 الإيجابية (SF3A1⁺). SF3A1: عامل الربط 3a الوحدة الفرعية 1؛ PFA: بارافورمالدهيد؛ EtOH: إيثانول. (أ) صبغ الأجسام المضادة لـ SF3A1 الذي أُجري قبل التثبيت بـ PFA (Pre-PFA؛ اليسار) أو قبل التثبيت المتسلسل بـ PFA والنفاذية بـ EtOH (Pre-EtOH؛ اليمين). (ب) صبغ الأجسام المضادة لـ SF3A1 الذي أُجري بعد التثبيت بـ PFA (Post-PFA؛ اليسار) أو بعد التثبيت المتسلسل بـ PFA والنفاذية بـ EtOH (Post-EtOH؛ اليمين). (ج) مقارنة صبغ SF3A1 بعد النفاذية بـ EtOH لمدة 2 h أو طوال الليل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

لتحديد ما إذا كانت مدة التعرض لـ EtOH قد أثرت على الصبغ أو سلامة الخلايا، تمت معالجة الخلايا بـ EtOH إما لمدة 2 h أو طوال الليل. وأظهر تحليل قياس التدفق الخلوي عدم وجود فروق ملحوظة في كثافة الصبغ أو سلامة الخلايا الظاهرة بين الحالتين (الشكل 2C). وتشير هذه النتائج إلى أن نفاذية EtOH لمدة 2 h قد أنتجت صبغاً مماثلاً للتحضين طوال الليل تحت الظروف المختبرة.

بعد التأكد من أن النفاذية باستخدام EtOH أدت إلى ظهور صبغ SF3A1 يمكن الكشف عنه (الشكل 2B) وتحديد المستوى المرجعي لصبغ SF3A1 في غياب الببتيد المنافس (الشكل 3A)، تم تقييم نوعية الأجسام المضادة عن طريق منافسة الببتيد. حُضنت الخلايا إما مع SF3A118–37 أو ببتيد تحكم غير نوعي يقابل الأحماض الأمينية 778–793 من SF3A1 (SF3A1778–793؛ GAVIHLALKERGGRKK). أضيفت الببتيدات بالتزامن مع الجسم المضاد الأولي (البروتوكول، الخطوة 7). أدى التحضين بزيادة من الببتيد النوعي SF3A118–37 إلى خفض النسبة المئوية للخلايا الموجبة لـ SF3A1 إلى مستوى مماثل للتحكم غير المصبوغ، بينما لم يؤدِّ الببتيد غير النوعي SF3A1778–793 إلى تغيير ملموس في ملف الصبغ (الشكل 3B,C). وأظهرت تجارب معايرة الببتيد تثبيطاً مرتبطاً بالجرعة لارتباط الأجسام المضادة بواسطة الببتيد المتوافق SF3A118–37 (IC50 = 21.6 nM)، في حين لم يُلاحظ أي تثبيط حتى مع وجود زيادة مولارية تصل إلى 50 ضعفاً من الببتيد غير النوعي SF3A1778–793 (الشكل 3D). تثبت هذه النتائج إمكانية استخدام مقايسة منافسة الببتيد لتقييم تثبيط ارتباط الأجسام المضادة عن طريق قياس التدفق الخلوي.

تحليل قياس التدفق الخلوي للتعبير عن SF3A1 باستخدام جسم مضاد لـ SF3A1، وببتيد محدد، والتثبيط.
الشكل 3. تثبيط تنافسي يعتمد على الجرعة لصبغ الجسم المضاد SF3A1 بواسطة ببتيد متماثل. مخططات تمثيلية لقياس التدفق الخلوي لخلايا K562 حية وسالبة لصبغة الحيوية، تظهر فلورة DyLight 488 (DL488) مقابل مساحة التشتت الجانبي (SSC-A). تشير المنطقة المؤطرة إلى المجتمع الإيجابي لـ SF3A1 (SF3A1⁺). SF3A1، الوحدة الفرعية 1 من عامل التوصيل 3a. (A) تحكم غير مصبوغ وصبغ الجسم المضاد لـ SF3A1. (B) صبغ SF3A1 بعد إضافة الببتيد المتماثل SF3A1(18–37) بجرعات مختلفة. (C) صبغ SF3A1 بعد إضافة الببتيد غير النوعي SF3A1(778–793) بجرعات مختلفة. كانت تركيزات الببتيد 216 و 43.3 و 21.7 و 10.8 و 5.4 و 2.7 nM، وحُسبت نسب المولات المقابلة للببتيد إلى الجسم المضاد الموضحة في الشكل نسبةً إلى تركيز الجسم المضاد لـ SF3A1 البالغ 4.33 nM. (D) منحنى التثبيط التنافسي الذي يوضح النسبة المئوية للخلايا الإيجابية لـ SF3A1 كدالة في تركيز الببتيد. قام الببتيد المتماثل SF3A1(18–37) بتثبيط ارتباط الجسم المضاد بطريقة تعتمد على الجرعة، بينما لم يفعل الببتيد SF3A1(778–793) ذلك. كان التركيز المثبط النصفي الأقصى (IC₅₀) للببتيد المتماثل 21.6 nM، والذي تم تحديده باستخدام نموذج أفضل ملاءمة غير خطي للمثبط مقابل الاستجابة المعيارية مع ميل متغير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

أخيرًا، تم تقييم البروتوكول للكشف عن مستقبل الإريثروبويتين (EpoR)، وهو مستقبل على سطح الخلية يتواجد أيضًا داخل الخلايا أثناء الاصطناع الحيوي للمستقبل وبعد عملية الإدخال الخلوي المستحثة بالربيطة20,21. البروتين EpoR مكون من 508 حمض أميني، ويتألف من نطاق طرفي N خارج خلوي، ومنطقة واحدة عابرة للغشاء تمتد من الأحماض الأمينية 251–273، ونطاق طرفي C داخل خلوي. تم استخدام جسم مضاد متعدد النسائل للأرنب ضد EpoR غير مقترن (BS-1424R)، والذي تم التحقق من صلاحيته مسبقًا في تقنية لطخة ويسترن، والكيمياء النسيجية المناعية، والفلورة المناعية، ولكن ليس لتقنية قياس التدفق الخلوي22,23,24,25,26، وذلك باستخدام سير عمل الصبغ الموضح أعلاه. ووفقًا للشركة المصنعة، فقد تم إنتاج BS-1424R ضد الأحماض الأمينية 330–365 الموجودة ضمن النطاق داخل الخلوي لـ EpoR.

عندما صُبغت الخلايا قبل المعالجة بـ PFA (ما قبل PFA)، <كانت نسبة 10% من خلايا K562 إيجابية لصبغة EpoR (الشكل 4أوفي المقابل، كانت نسبة الخلايا الموجبة من خلايا K562 تقريباً 77% بعد المعالجة بـ PFA وحده (Post-PFA)، و84% بعد المعالجة المتتالية بـ PFA ثم EtOH (Post-EtOH) (الشكل 4ب–D). وفي المقابل مع صبغ SF3A1، لُوحظ زيادة في صبغ EpoR عقب كل من سير عمل ما بعد تثبيت البارافورمالدهيد (Post-PFA) وسير عمل ما بعد الإيثانول (Post-EtOH) (قارن الشكلان 2B و4Dتتوافق هذه النتائج مع موقع الحاتمة BS-1424R ضمن النطاق داخل الخلوي لمستقبل الإريثروبويتين (EpoR). ويشير الكشف عن التفاعل المناعي لـ EpoR تحت كلا ظرفي التلوين إلى أن المعالجة بـ PFA تعمل على نفاذية الغشاء البلازمي لخلايا K562 بشكل كافٍ للسماح بارتباط الأجسام المضادة بالحاتمة داخل الخلوية. وفي سير العمل هذا، يتطلب استخدام جسم مضاد ثانوي واحد تقييم مخزونات EpoR السطحية وداخل الخلوية باستخدام عينات تمت معالجتها وتلوينها بشكل منفصل. ويمكن التغلب على هذا القصور باستخدام أجسام مضادة أولية تم إنتاجها في أنواع مضيفة مختلفة لتمكين الكشف المتعدد باستخدام أجسام مضادة ثانوية نوعية لكل نوع.

مخططات نقطية للتدفق الخلوي ورسم بياني شريطي يوضح نسب الخلايا EpoR+ قبل التثبيت وبعده.
الشكل 4. الكشف عن مستقبل الإريثروبويتين (EpoR) في خلايا K562 بعد ظروف تثبيت ونفاذية مختلفة. مخططات تدفق خلوي تمثيلية لخلايا K562 حية وسلبية صبغة الحيوية تظهر فلورة DyLight 488 (DL488) مقابل منطقة التشتت الجانبي (SSC-A). تشير المنطقة المحددة بإطار إلى مجموعة الخلايا الموجبة لـ EpoR (EpoR⁺). تم إجراء صبغ EpoR باستخدام الجسم المضاد متعدد النسائل BS-1424R المطور ضد الأحماض الأمينية 330–365 داخل النطاق داخل الخلوي لـ EpoR. (أ) صبغ EpoR قبل التثبيت بـ PFA (Pre-PFA). (ب) صبغ EpoR بعد التثبيت بـ PFA (Post-PFA). (ج) صبغ EpoR بعد التثبيت المتسلسل بـ PFA والنفاذية بـ EtOH (Post-EtOH). (د) كمية الخلايا الموجبة لـ EpoR تحت كل حالة صبغ. يتم عرض البيانات كالمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) من ثلاث تجارب مستقلة (n = 3). تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار Student's t-test. يشار إلى P < 0.01 بـ **. المقارنات الموضحة هي Pre-PFA مقابل Post-PFA و Pre-PFA مقابل Post-EtOH. Ab: جسم مضاد؛ EpoR: مستقبل الإريثروبويتين؛ PFA: بارافورمالدهايد؛ EtOH: إيثانول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

تسلط النتائج المعروضة هنا الضوء على عدة معاملات حاسمة للكشف عن البروتينات بواسطة قياس التدفق الخلوي داخل الخلايا باستخدام أجسام مضادة أولية غير مقترنة. ومن الاعتبارات المهمة استراتيجية النفاذية، والتي يجب اختيارها وفقاً للتوضع داخل الخلايا للبروتين المستهدف. في سير العمل الموصوف هنا، أتاح التثبيت بـ PFA متبوعاً بالنفاذية بـ EtOH الكشف عن البروتين النووي SF3A1، بينما تم الكشف عن التفاعلية المناعية لـ EpoR باستخدام كل من سير عمل ما بعد PFA وسير عمل ما بعد EtOH. عند تقييم البروتينات السطحية، يجب إجراء الصبغ قبل المعالجة بـ PFA، بينما يمكن إجراء الصبغ داخل الخلايا بعد المعالجة بـ PFA، وعندما يكون ذلك مطلوباً، يتبع ذلك نفاذية إضافية بـ EtOH. يتيح سير العمل هذا تقييم البروتينات المرتبطة بالسطح والبروتينات داخل الخلايا ضمن مجموعات خلوية محددة مناعياً باستخدام ظروف صبغ منفصلة.

على الرغم من أن PFA يُستخدم عموماً كمثبت للخلايا، إلا أن المعالجة بـ 1% PFA أدت إلى نفاذية كافية في الغشاء البلازمي لخلايا K562 للسماح بارتباط جسم المضاد EpoR بحاتمة داخل خلوية. وقد ثبت أيضاً أن النفاذية التي يتوسطها PFA تسمح بدخول الأجسام المضادة في خطوط خلوية أخرى، بما في ذلك خلايا HEK293T وخلايا HeLa؛ ومع ذلك، تم تحقيق ذلك باستخدام تركيز أعلى من PFA بنسبة (4%)11. وتشير هذه الاختلافات إلى وجود تأثيرات لـ PFA تعتمد على نوع الخلية؛ لذا، قد يتطلب الأمر تحسين ظروف التثبيت لتحقيق أقصى قدر من الكشف عن الحاتمة. وتشمل الكواشف البديلة لنفاذية الخلايا المنظفات مثل saponin وdigitonin وTriton X-100، والتي تعمل من خلال آليات مختلفة. وبينما يقوم Triton X-100 بنفاذية أغشية الخلايا بشكل غير متخصص، يقوم saponin وdigitonin بنفاذية الخلايا عن طريق الارتباط بالكوليسترول والستيرولات الغشائية الأخرى27. وقد أثبتت الدراسات أن التركيزات المنخفضة من digitonin تزيد من نفاذية الغشاء البلازمي بشكل انتقائي مع الحفاظ على سلامة أغشية الميتوكوندريا والنواة28,29,30. وبالتالي، يمكن استخدام تركيبات مناسبة من هذه الكواشف لتمييز تموضع البروتين داخل المقصورات المختلفة تحت الخلوية، رغم أن أحد قيود هذه الطرق هو الفقد المحتمل للمستضدات داخل الخلوية وسلامة الحاتمة13,31.

يعد هذا البروتوكول قابلاً للتكييف بسهولة ويمكن تعديله وفقاً للمتطلبات التجريبية. على سبيل المثال، يمكن ضبط مدة المعالجة بـ EtOH دون حدوث فقدان ملحوظ في أداء الصبغ أو سلامة الخلايا، مما يوفر مرونة في سير العمل الممتد لعدة أيام، خاصة عندما يتم إجراء ظروف الصبغ قبل النفاذية وبعدها على التوازي (الشكل 1). كما يمكن تطبيق البروتوكول على أنواع أخرى من الخلايا، بما في ذلك الخلايا المكونة للدم البشرية الأولية؛ ومع ذلك، قد تتطلب ظروف التثبيت والنفاذية والطرد المركزي تحسيناً لأن هذه المعالجات يمكن أن تؤثر على إمكانية الوصول إلى الحاتمة، وكفاءة ارتباط الأجسام المضادة، والسلامة الخلوية، وكثافة إشارة الفلورسنت14,32,33. بالإضافة إلى ذلك، قد يساعد تحسين أوقات التعرض لـ PFA و EtOH، وكذلك ظروف الطرد المركزي، في الحفاظ على حيوية الخلايا وتقليل الفقد المفرط للخلايا. وبالمثل، يمكن الكشف عن أهداف بروتينية إضافية بعد تحسين تركيز الأجسام المضادة وظروف الحضانة.

تشمل القيود المحتملة ضعف شدة الإشارة، والتي يمكن تحسينها عن طريق زيادة تركيز الأجسام المضادة الأولية أو باستخدام تضخيم الأجسام المضادة الثانوية. كما يمكن تقليل الصبغ غير النوعي من خلال تحسين ظروف الحجب أو عن طريق التنافس الببتيدي. وقد يؤدي استخدام الأجسام المضادة متعددة النسائل أيضًا إلى تباين بين الدفعات وزيادة احتمالية الارتباط خارج الهدف؛ لذا يجب التحقق من نوعية الجسم المضاد بعناية لكل تطبيق. علاوة على ذلك، يظهر التنافس الببتيدي الاعتماد على الببتيد المُحصّن ولكنه لا يثبت نوعية الجسم المضاد بشكل مستقل. وفي حالة الجسم المضاد anti-SF3A1، أثبتت دراسات الترسيب المناعي السابقة نوعية الجسم المضاد19. وتشمل النهج التكميلية الإضافية للتحقق من نوعية الجسم المضاد استنزاف المستضد، أو إسكات الجينات، أو تعطيل الجينات، أو استخدام نماذج خلوية سالبة المستضد. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النهج ليس متوافقًا بطبيعته مع جميع لوحات الألوان المتعددة لأن استخدام عدة أجسام مضادة ثانوية قد يؤدي إلى تفاعل تبادلي ويحد من تعدد الإرسال ما لم يتم تنفيذ الضوابط المناسبة. لذا فإن الاختيار الدقيق للأجسام المضادة الثانوية والفلوروفورات أمر مهم لتقليل الصبغ الخلفي ورفع دقة الإشارة إلى أقصى حد.

يوفر البروتوكول الموصوف هنا سير عمل للتقييم عن طريق قياس التدفق الخلوي للبروتينات داخل الخلوية في خلايا K562 البشرية المصابة بسرطان الدم الحمراء. كما يدعم تقييم أداء الأجسام المضادة عن طريق التنافس الببتيدي، وتقييم التفاعل المناعي المرتبط بالمستقبلات تحت ظروف صبغ مختلفة. قد يكون هذا النهج مفيداً لاستقصاء التغيرات في التعبير البروتيني أثناء التمايز الخلوي أو استجابةً للمؤثرات خارج الخلوية، بما في ذلك دراسات عوامل النسخ، وبروتينات معالجة الـ RNA، وبيولوجيا المستقبلات ضمن مجموعات خلوية محددة مناعياً. وفي دراسة منفصلة، استُخدم سير العمل هذا لاستقصاء التغيرات التي يتوسطها الإريثروبويتين في الإنزيمات الأيضية للدهون داخل الخلوية في الخلايا الجذعية والخلايا السلفية المكونة للدم البشرية التي تخضع للتمايز الحمراوي34، مما يثبت قابلية هذا البروتوكول للتكيف مع الخلايا الأولية. وبشكل عام، يوسع هذا البروتوكول من تطبيق الأجسام المضادة الأولية غير المقترنة في قياس التدفق الخلوي ويوفر سير عمل مرناً لتقييم التعبير البروتيني في الخلايا المستزرعة.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

يقر المؤلفون بتلقي SS دعمًا تمويليًا من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (R01GM127464) والمعهد الوطني للسرطان (P30CA023074)، وكلاهما تابعان للمعاهد الوطنية للصحة، وبرنامج شراكة أبحاث فالي (VRP P1-4009 و VRP77)، ومركز أريزونا للأبحاث الطبية الحيوية (ABRC: RFGA2022-010-30). تقع مسؤولية المحتوى على عاتق المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. كما يقر المؤلفون بدعم الدكتورة Mrinalini Kala، مديرة مرفق التدفق الخلوي المركزي، بكلية الطب-فينيكس، جامعة أريزونا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10× المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS)داخلياًنظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالمحتوى العلمي الذي ترغب في ترجمته إلى اللغة العربية وفقًا للمعايير المذكورة.بديل: محلول منظم من الفوسفات الملحي (PBS) متوفر تجارياً
أنابيب طرد مركزي سعة 15 ملVWR89039-664بديل: أي أنبوب طرد مركزي معقم بالحجم المناسب
أنابيب بوليسترين ذات قاع مستدير سعة 5 ملCorning352052البديل: أي أنبوب قياس التدفق الخلوي يتوافق مع جهاز قياس التدفق الخلوي المتاح
جسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب DyLight 488Thermo Fisher ScientificPI35553بديل: جسم مضاد ثانوي متوافق مع الأنواع المضيفة للجسم المضاد الأولي
عداد خلايا آليThermo Fisher ScientificAMQAF2000بديل لمقياس كرات الدم (hemocytometer)
طقم خرزات التعويض التفاعلية مع الأمينات ArCThermo Fisher ScientificA10628البديل: الخلايا؛ في حال استخدام الخلايا كضوابط للصبغة الواحدة، تُعالج جميع أنابيب الضبط بشكل مطابق لأنابيب العينات
مرشح علوي للقارورةThermo Fisher Scientific595-4520غشاء نايلون؛ 0.2 µm
شرائح عد الخلاياThermo Fisher ScientificC10228مطلوب فقط عند استخدام عداد خلايا آلي
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)مرفق مع طقم صبغة الحيويةغير متوفرتُستخدم لإعادة تشكيل صبغة الحيوية المجففة بالتجميد
إيثانول، بنقاء 200 درجةThermo Fisher ScientificBP28184درجة البيولوجيا الجزيئية؛ يستخدم لتحضير إيثانول بتركيز 70% مبرد بالثلج
جسم مضاد أولي متعدد النسائل لمستقبل الإريثروبويتينBiossBS-1424R
مصل جنين البقر (FBS)أوميجا ساينتيفيك (Omega Scientific)FB-12البديل: أي مصل جنين بقري (FBS) تم التحقق من صلاحيته لخط الخلايا المستهدف
مقياس التدفق الخلويBD BiosciencesBD Canto II البديل: أي جهاز قياس التدفق الخلوي مناسب
مقياس كرات الدم (هيموسيتومتر)Hausser ScientificHS3200بديل: عداد خلايا آلي
لوح تحريك مغناطيسي ساخنThermo Fisher ScientificSP88857100تُستخدم لتحضير المحلول الملحي الموقوف بالفوسفات (PBS) والبارافورمالدهيد
خلايا K562 لسرطان الدم النقوي البشريATCCCCL-243يمكن شراؤها من أي مصدر موثوق آخر
صبغة حيوية قابلة للتثبيت من نوع Live-or-Dye (405/545)Biotium32009البديل: أي صبغة حيوية متوافقة قابلة للتثبيت. أما الصبغات غير القابلة للتثبيت (مثل 7-AAD) فهي غير مناسبة.
مصل ماعز طبيعيThermo Fisher Scientific16210064تُستخدم للحجب
مسحوق البارافورمالدهيدSigma-AldrichP6148بديل: محلول بارافورمالدهيد المتوفر تجارياً
مقياس/مسبار درجة الحموضة (pH)AccumetAB15تُستخدم لضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول المنظم
كلوريد البوتاسيوم (KCl)Thermo Fisher ScientificBP366-1
فوسفات البوتاسيوم أحادية القاعدة (KH2PO4)2أمر شراء4)Thermo Fisher ScientificBP362-1
SF3A1  جسم مضاد أولي متعدد النسائلداخلينظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته من الإنجليزية إلى العربية، وسأقوم بتنفيذه وفقًا للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة.
كلوريد الصوديوم (NaCl)Thermo Fisher ScientificBP358-1
محلول هيدروكسيد الصوديوم (5 مولار)MilliporeSigmaS8263بديل: تحضير محلول بتركيز 5 مولار من حبيبات هيدروكسيد الصوديوم
فوسفات الصوديوم ثنائية القاعدة (Na2المجهر الضوئي عالي الدقة (HPO)4)Thermo Fisher ScientificBP332-1
قضيب تحريك مغناطيسيVWR74950-286تُستخدم مع لوح التحريك المغناطيسي
صبغة تريبان الزرقاء، 0.4%Thermo Fisher Scientific15250061تُستخدم لعد خلايا الحيوية
خرزات التعويض UltraComp eBeadsThermo Fisher Scientific01-2222-42البديل: الخلايا؛ في حال استخدام الخلايا كضوابط صبغ أحادية، تُعالج جميع أنابيب الضوابط بشكل مطابق لأنابيب العينات

المراجع

  1. Schippel N, Sharma S. Dynamics of human hematopoietic stem and progenitor cell differentiation to the erythroid lineage. Exp Hematol. 2023;123:1-17. DOI:10.1016/j.exphem.2023.05.001.
  2. Schippel N, Kala M, Sharma S. Erythropoietin-dependent acquisition of CD71hiCD105hi phenotype within CD235a- early erythroid progenitors. Stem Cells. 2025;43(12). DOI:10.1093/stmcls/sxaf061.
  3. Robinson JP. Flow cytometry: past and future. BioTechniques. 2022;72(4):159-169. DOI:10.2144/btn-2022-0005.
  4. Freer G, Rindi L. Intracellular cytokine detection by fluorescence-activated flow cytometry: basic principles and recent advances. Methods. 2013;61(1):30-38. DOI:10.1016/j.ymeth.2013.03.035.
  5. Krutzik PO, Nolan GP. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single-cell signaling events. Cytometry A. 2003;55(2):61-70. DOI:10.1002/cyto.a.10072.
  6. Manso BA, Medina KL. Standardized flow-cytometry-based protocol to simultaneously measure transcription factor levels. STAR Protoc. 2021;2(2):100485. DOI:10.1016/j.xpro.2021.100485.
  7. Hallden G, Andersson U, Hed J, Johansson SG. A new membrane permeabilization method for the detection of intracellular antigens by flow cytometry. J Immunol Methods. 1989;124(1):103-109. DOI:10.1016/0022-1759(89)90191-9.
  8. Kalina T, Lundsten K, Engel P. Relevance of antibody validation for flow cytometry. Cytometry A. 2020;97(2):126-136. DOI:10.1002/cyto.a.23895.
  9. Voskuil JL. The challenges with the validation of research antibodies. F1000Res. 2017;6:161. DOI:10.12688/f1000research.10851.1.
  10. Koeffler HP, Golde DW. Human myeloid leukemia cell lines: a review. Blood. 1980;56(3):344-350.
  11. Bernard E, et al. Assessing the limitations of paraformaldehyde fixation for accurate cell surface receptor measurement. Front Pharmacol. 2026;17:1727410. DOI:10.3389/fphar.2026.1727410.
  12. Jamur MC, Oliver C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 2010;588:63-66. DOI:10.1007/978-1-59745-324-0_9.
  13. Cheng R, et al. Influence of fixation and permeabilization on the mass density of single cells: a surface plasmon resonance imaging study. Front Chem. 2019;7:588. DOI:10.3389/fchem.2019.00588.
  14. Hobro AJ, Smith NI. An evaluation of fixation methods: spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vib Spectrosc. 2017;91:31-45. DOI:10.1016/j.vibspec.2016.10.012.
  15. Schimenti KJ, Jacobberger JW. Fixation of mammalian cells for flow cytometric evaluation of DNA content and nuclear immunofluorescence. Cytometry. 1992;13(1):48-59. DOI:10.1002/cyto.990130109.
  16. Kandarian F, Sunga GM, Arango-Saenz D, Rossetti M. A flow cytometry-based cytotoxicity assay for the assessment of human NK cell activity. J Vis Exp. 2017;(126). DOI:10.3791/56191.
  17. Bapat A, Keita N, Sharma S. Pan-myeloid differentiation of human cord blood derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. J Vis Exp. 2019;(150). DOI:10.3791/59836.
  18. Martelly W, et al. Identification of a noncanonical RNA binding domain in the U2 snRNP protein SF3A1. RNA. 2019;25(11):1509-1521. DOI:10.1261/rna.072256.119.
  19. Sharma S, et al. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes Dev. 2014;28(22):2518-2531. DOI:10.1101/gad.248625.114.
  20. Sulahian R, Cleaver O, Huang LJ. Ligand-induced EpoR internalization is mediated by JAK2 and p85 and is impaired by mutations responsible for primary familial and congenital polycythemia. Blood. 2009;113(21):5287-5297. DOI:10.1182/blood-2008-09-179572.
  21. Sinclair AM, et al. Erythropoietin receptor transcription is neither elevated nor predictive of surface expression in human tumour cells. Br J Cancer. 2008;98(6):1059-1067. DOI:10.1038/sj.bjc.6604220.
  22. Li X, et al. Oxidative stress induces the decline of brain EPO expression in aging rats. Exp Gerontol. 2016;83:89-93. DOI:10.1016/j.exger.2016.07.012.
  23. Liu T, et al. Multifaceted roles of a bioengineered nanoreactor in repressing radiation-induced lung injury. Biomaterials. 2021;277:121103. DOI:10.1016/j.biomaterials.2021.121103.
  24. Zhang Y, et al. Erythropoietin receptor is a risk factor for prognosis: a potential biomarker in lung adenocarcinoma. Pathol Res Pract. 2023;251:154891. DOI:10.1016/j.prp.2023.154891.
  25. Liu J, et al. Lithium chloride promotes endogenous synthesis of CLA in bovine mammary epithelial cells. Biol Trace Elem Res. 2024;202(2):513-526. DOI:10.1007/s12011-023-03679-z.
  26. Wu G, et al. EPO promotes the progression of rheumatoid arthritis by inducing desialylation via increasing the expression of neuraminidase 3. Ann Rheum Dis. 2024;83(5):564-575. DOI:10.1136/ard-2023-224852.
  27. Sudji IR, et al. Membrane disintegration caused by the steroid saponin digitonin is related to the presence of cholesterol. Molecules. 2015;20(11):20146-20160. DOI:10.3390/molecules201119682.
  28. Niklas J, Melnyk A, Yuan Y, Heinzle E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal Biochem. 2011;416(2):218-227. DOI:10.1016/j.ab.2011.05.039.
  29. Liu J, Xiao N, DeFranco DB. Use of digitonin-permeabilized cells in studies of steroid receptor subnuclear trafficking. Methods. 1999;19(3):403-409. DOI:10.1006/meth.1999.0876.
  30. Krawczyk E, Suprynowicz FA, Sudarshan SR, Schlegel R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 2010;84(4):1696-1703. DOI:10.1128/JVI.01968-09.
  31. Goldenthal KL, et al. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. J Histochem Cytochem. 1985;33(8):813-820. DOI:10.1177/33.8.3894499.
  32. Fahlberg MD, et al. Overcoming fixation and permeabilization challenges in flow cytometry by optical barcoding and multi-pass acquisition. Cytometry A. 2024;105(11):838-848. DOI:10.1002/cyto.a.24904.
  33. Law JP, et al. The importance of Foxp3 antibody and fixation/permeabilization buffer combinations in identifying CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells. Cytometry A. 2009;75(12):1040-1050. DOI:10.1002/cyto.a.20815.
  34. Schippel N, et al. Erythropoietin mediates glycerophospholipid remodeling during human early erythropoiesis. bioRxiv. 2026. DOI:10.64898/2026.02.20.707106.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

K562

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.