مقالة منهجية

سير عمل شامل ومتكامل عبر منصة مزدوجة للتحليل الأيضي لعينات دم مجففة دقيقة

60 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72533

⸱

أكتوبر 6, 2026

 ,  ,  , 
1School of Chemistry, Aristotle University of Thessaloniki, 2Biomic AUTh, Center for Interdisciplinary Research and Innovation (CIRI-AUTH), 3School of Medicine, Aristotle University of Thessaloniki, 4ThetaBiomarkers

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هذا البروتوكول سير عمل شاملاً ومتكاملاً للميتابولوميات غير المستهدفة باستخدام أجهزة أخذ العينات الدقيقة الامتصاصية الحجمية (VAMS). والهدف من ذلك هو تحليل العينة بكفاءة باستخدام عملية استخلاص واحدة عبر منصتين تحليليتين متكاملتين (RP-LC-MS و GC-MS)، مما يؤسس إطاراً قوياً للدراسات السريرية اللامركزية واسعة النطاق.

الملخص

برزت عملية أخذ عينات الدم الدقيقة (BµS) كبديل قوي وغير باضع بشكل طفيف لسحب الدم التقليدي من الوريد، مما يتيح جمع عينات ذات أحجام منخفضة خارج الإعدادات السريرية التقليدية. ومن خلال دعم أخذ العينات اللامركزي وتحسين التزام المرضى، يمكن دمج هذه الأجهزة مع تقنيات الأوميكس المتقدمة لتسهيل تصميمات الدراسات الطولية واسعة النطاق. ومع ذلك، يتطلب التنفيذ الناجح تحسين العديد من الخطوات الحرجة، بدءاً من جمع العينات وتخزينها وصولاً إلى الاستخلاص والتحضير التحليلي. في هذا العمل، نقترح سير عمل شاملاً وغير مستهدف للميتابولوميكس من البداية إلى النهاية لعملية BµS، مع التركيز على المعايير الرئيسية التي تحكم تحضير العينات والأداء التحليلي. تم تقييم أجهزة أخذ العينات الدقيقة الامتصاصية الحجمية (VAMS) باستخدام منصتين متكاملتين: الكروماتوغرافيا السائلة ذات الطور المعكوس المقترنة بمطياف الكتلة، والكروماتوغرافيا الغازية المقترنة بمطياف الكتلة. وقد أظهر تطبيق سير العمل المحسن تغطية ميتابولوميكية واسعة عبر فئات كيميائية متنوعة، مما يسلط الضوء على إمكانات أخذ العينات القائم على VAMS في دعم دراسات الميتابولوميكس اللامركزية والقابلة للتوسع مع الحفاظ على المتانة التحليلية، وقابلية التكرار، والأهمية البيولوجية.

المقدمة

لقد اكتسبت الميتابولوميات، وهي الدراسة الممنهجة للجزيئات ذات الوزن الجزيئي المنخفض في المصفوفات البيولوجية، أهمية كبيرة كأداة حاسمة لتوضيح الأنماط الظاهرية الخلوية والحالات الأيضية الديناميكية1,2. وفي السياقات السريرية، تفتح ميتابولوميات الدم آفاقاً واعدة من خلال تعزيز كفاءة التشخيص وتمكين إجراء تقييم أكثر شمولاً لمخاطر الأمراض، وغالباً ما تسد الثغرات التي تتركها التشخيصات التقليدية. ومع ذلك، فإن التقاط الميتابولوم الكامل يمثل تحدياً بطبيعته؛ فبالنظر إلى التعقيد الكيميائي الهائل ونطاقات التركيز المتنوعة للميتابوليتات الداخلية، لا يمكن لمنصة تحليلية واحدة أن تحقق تغطية كاملة، مما يجعل استخدام تقنيات تحليلية تكميلية أمراً ضرورياً لتعظيم النظرة العامة للأيض.

تُعد عملية أخذ عينات الدم الدقيقة (BµS) تقنية لجمع العينات طفيفة التوغل تتضمن جمع بضعة µL من الدم. ويؤدي تبسيط عملية الحصول على العينة إلى إلغاء الحاجة إلى فصد الدم، مما يسمح بالجمع المنزلي ويعزز راحة المريض. علاوة على ذلك، ثبت أن الانتقال من مصفوفة سائلة إلى مصفوفة مجففة يعزز استقرار مختلف المستقلبات غير المستقرة ويبسط لوجستيات النقل والتخزين حيث لا تتطلب درجات حرارة منخفضة3,4,5. وعلى الرغم من استخدام BµS لعقود، وبشكل أساسي في شكل بقع الدم المجففة (DBS) لتشخيص الأخطاء التمثيلية الخلقية، إلا أن هذه التقنية التقليدية تعاني من بعض العيوب التحليلية؛ إذ لا تسمح إجراءات الجمع بجمع كمي للعينات، مما يجعل التقنية عرضة لـ "تأثير الهيماتوكريت"، حيث تؤدي الاختلافات في لزوجة الدم إلى تغيير توزيع الدم، وبالتالي تضعف الدقة الكمية. وللتغلب على هذا القصور، تم تطوير أجهزة BµS كمية. ويُعد أخذ العينات الدقيقة الامتصاصية الحجمية (VAMS) تقنية حديثة من تقنيات BµS تستخدم طرفاً بوليمرياً مصمماً لأخذ حجم دقيق من الدم والتغلب على قيود DBS التقليدية6,7,8.

وبناءً على ذلك، أثار المقطع الأيضي الشامل لـ BµS اهتماماً متزايداً في السنوات الأخيرة9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. وتستخدم الدراسات المنشورة التي تقارن BµS بالمصفوفات التقليدية عدة تقنيات تحليلية تغطي نطاقاً واسعاً من القطبية، بدءاً من الفصل الكهربائي الشعيري17 (CE) وكروماتوغرافيا السائل ذات التفاعل الهيدروفيلي18,19 (HILIC) المقترنة بمطياف الكتلة (MS) للأنواع القطبية، وصولاً إلى مطياف الكتلة ذو الطور المعكوس18,19,21 (RP-MS) للمواد الأيضية والليبيدات متوسطة القطبية. وتواجه طرق الاستخلاص التقليدية عقبة أساسية، حيث أن التحسين لجهاز واحد غالباً ما يعني التخلص من كسور كيميائية حاسمة وفقدان بيانات أيضية. وعندما تكون أحجام العينات محدودة للغاية، يصبح إجراء تحليلات منفصلة متعددة أمراً صعباً. وبالتالي، لا يزال تطوير بروتوكول استخلاص واحد متوافق مع منصات تحليلية متعددة يشكل تحدياً كبيراً.

يفصل سير العمل هذا الإجراءات الخاصة بالتحليلات المزدوجة لكل من الكروماتوغرافيا السائلة ذات الطور المعكوس المقترنة بمطياف الكتلة (RP-LC-MS) والكروماتوغرافيا الغازية (GC) لأجهزة VAMS. وبحسب علمنا، فإن سير العمل هذا هو الأول لإجراء التنميط الأيضي غير المستهدف لـ BµS والذي يجمع بين هاتين المنصتين المتعامدتين باستخدام إجراء استخلاص عينة واحد. علاوة على ذلك، فإنه يسلط الضوء على الخطوات الأكثر أهمية لضمان الحصول الموثوق والقابل للتكرار على تنميط أيضي شامل وغير مستهدف.

البروتوكول

قدم جميع المشاركين موافقة كتابية مستنيرة للمشاركة. وقد تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات البحث في جامعة أرسطو في ثيسالونيكي (#306272/2022).

1. جمع العينات

  1. اغسل يدي الخاضع للاختبار بماء دافئ لإزالة الملوثات المحتملة وزيادة تدفق الدم.
  2. نظف الإصبع باستخدام محلول إيثانول بتركيز 70%. انتظر حتى يتبخر المحلول طبيعيًا.
    ملاحظة: قد يؤدي استخدام المطهرات القائمة على اليود أو الصابون إلى التداخل مع تحاليل LC-MS.
  3. قم بلف غطاء مشرط وخز معقم أحادي الاستخدام يتم تفعيله عند التلامس (بعمق 1.5 mm). ضعه مقابل مركز طرف الإصبع واضغط.
  4. امسح قطرة الدم الأولى وانتظر حتى تتكون قطرة جديدة.
    ملاحظة: نظرًا لاحتمال التلوث بسائل خارج الخلية موضعي، قد لا تعكس القطرة الأولى المستويات الجارية في الجهاز الجسماني.
  5. دون إزالة الجهاز من حامله، لامس طرف جهاز VAMS بسعة 20 µL قطرة الدم. يجب وضع الجهاز رأسيًا فوق العينة. تجنب غمر الطرف بالكامل في الدم، لأن ذلك قد يؤدي إلى أخذ عينة زائدة عن الحد.
    ملاحظة: عند أخذ عينة من أنبوب يحتوي على دم وريدي، كما قد يكون ضروريًا في بيئة المختبر، تأكد من أن الطرف يلامس سطح السائل فقط، دون غمره، لتجنب أخذ عينة زائدة عن الحد.
  6. بعد تشبع الطرف، والذي يتحقق عندما يتحول لونه بالكامل إلى الأحمر، ثبته في مكانه لمدة ثانيتين إضافيتين، ثم أخرجه من عينة الدم.
  7. ضع العينات في صناديقها الأصلية على سطح مستوٍ ونظيف، بعيدًا عن أشعة الشمس المباشرة أو الحرارة، مع منع الطرف من ملامسة أي جسم خارجي، واتركها تجف لمدة 2 h في درجة حرارة الغرفة وفي الرطوبة المحيطة.
  8. خزن العينات في كيس يحتوي على مجفف عند −80 °C حتى وقت التحليل. يجب أن يتم النقل باستخدام الثلج الجاف.
    ملاحظة: في حالات التحليل المستهدف لـ BµS التي تم فيها بحث استقرار المادة التحليلية مسبقًا، يمكن تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة للمدة المقترحة. ومع ذلك، بالنسبة للتحليل غير المستهدف، يوصى بالتخزين عند –80 °C، حيث تظل بعض المواد التحليلية عرضة للتحلل حتى في المصفوفة المجففة. يظهر جدول استكشاف الأخطاء وإصلاحها للمشكلات الأكثر شيوعًا في جمع العينات في Table 1.

2. إجراء استخلاص المستقلبات

  1. افصل الطرف بالكامل عن المقبض البلاستيكي وضعه في أنبوب طرد مركزي صغير مستدير القاع (استخدم غطاء أنبوب الطرد المركزي الصغير لفصل الطرف عن المقبض).
  2. أعد الترطيب بإضافة 50 µL من الماء عالي النقاء مباشرة فوق الطرف.
  3. أضف 400 µL من الميثانول الذي يحتوي على مزيج من المعايير الداخلية IS (على سبيل المثال، حمض D-Myristic المسمى نظائرياً) لاستخلاص المستقلبات وتعزيز ترسيب البروتين.
    ملاحظة: تنبيه: الميثانول مادة سامة وسريعة الاشتعال للغاية، لذا يجب التعامل معه داخل خزانة استخلاص الغازات.
  4. قم بمعالجة العينات بالموجات فوق الصوتية في حمام ثلجي لمدة 10 min تحت التشغيل المستمر (القدرة الموصى بها 215/860 W، والتردد 35 kHz).
  5. أخرج الطرف بعناية باستخدام ملاقط، مع تنظيف الملاقط بالميثانول بين العينات.
  6. قم بإجراء الطرد المركزي بسرعة 6720 x g لمدة 10 min عند درجة حرارة 4 °C.
  7. انقل 150 µL من السائل الطافي إلى أنابيب جديدة. استخدم نفس الحجم لكل عينة. استخدم أنبوب طرد مركزي صغير جديد لتحليل RPLC، وقارورة زجاجية جديدة سعة 1.5 mL لتحليل GC.
  8. انقل 50 µL من السائل الطافي لكل عينة إلى قارورة واحدة لتحضير عينة ضبط جودة QC مجمعة داخل الدراسة.
  9. قم بالرج باستخدام جهاز Vortex لفترة وجيزة لضمان التجانس التام، ثم قسمها إلى عدة حصص بنفس حجم عينات الدراسة. استخدم أنبوب طرد مركزي صغير جديد لتحليل RPLC، وقارورة زجاجية جديدة سعة 1.5 mL لتحليل GC.
  10. بخر السوائل الطافية حتى الجفاف باستخدام مكثف فراغي، في وضع التبخير المائي، تحت مستوى فراغ يبلغ −600 mmHg (−800 mbar)، وبسرعة دوران 1400 rpm، في درجة حرارة الغرفة. تجف العينات في غضون ساعتين تقريباً.
    ملاحظة: راقب عملية التبخير بعناية وأخرج القوارير من المكثف لمنع فقدان المركبات المتطايرة بمجرد تبخر المذيب تماماً. نقطة توقف: يمكن تجميد العينات في شكلها الجاف عند −80 °C طوال الليل حتى موعد التحليل.

3. الإجراءات التي تسبق تحليل LC-MS

  1. أعد تكوين الراسب المجفف في 100 µL من مذيب إعادة التكوين مثل الطور المتحرك الأولي (على سبيل المثال، 5–10% ميثانول في الماء).
    ملاحظة: يمكن تعديل الحجم ومذيب إعادة التكوين بناءً على الظروف الكروماتوغرافية.
  2. أعد تكوين عينة مراقبة الجودة (QC) في نفس المذيب والحجم المستخدمين لعينة الدراسة (حافظ دائماً على نفس نسبة حجم العينة إلى المذيب).
  3. قم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس لفترة وجيزة، ثم انقل العينات إلى جهاز الطرد المركزي لمدة 10 min بسرعة 6720 x g عند درجة حرارة 4 °C.
  4. انقل السائل الطافي إلى قارورة جهاز أخذ العينات التلقائي (autosampler vial) المزودة بـ insert.

4. الإجراءات التي تسبق تحليل GC-MS

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات التالية داخل خزانة استخلاص الغازات.

  1. قم بتحضير عامل الميثوكسي أمين (methoxyamination agent) عن طريق إذابة 40 mg من هيدروكلوريد الميثوكسي أمين (methoxyamine hydrochloride) في 1 mL من البيريدين (pyridine).
    ملاحظة: تحذير: البيريدين مادة سامة، ويجب التعامل معها داخل خزانة استخلاص الأدخنة (fume hood).
  2. قم بتحضير عامل الاشتقاق (derivatization agent) بإضافة 10 µL من ثلاثي ميثيل كلوروسيلان (TMCS) إلى 1 mL من N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (MSTFA).
    ملاحظة: تحذير: كل من TMCS وMSTFA مادتان سامتان، ويجب التعامل معهما داخل خزانة استخلاص الأدخنة.
  3. أضف 10 µL من عامل الميثوكسي أمين (هيدروكلوريد الميثوكسي أمين بتركيز 40 mg/mL في البيريدين) إلى الرواسب المجففة لعينات الاختبار وعينات ضبط الجودة (QC samples).
  4. قم برج العينات باستخدام جهاز الفورتكس (Vortex) لفترة وجيزة لضمان خلط الكاشف جيداً.
  5. حضن العينات عند 30 °C لمدة 90 min، على أن يتم التحضين بشكل ثابت (statically).
  6. انتظر حتى تبرد العينات وتصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم أضف 90 µL من عامل الاشتقاق (MSTFA 1% TMCS).
  7. استبدل أغطية القوارير بأخرى جديدة، وقم برج العينات بجهاز الفورتكس لمدة 30 s لضمان الحصول على مزيج متجانس.
  8. حضن المزيج عند 37 °C لمدة 30 min، على أن يتم التحضين بشكل ثابت.
  9. انتظر حتى تبرد العينات وتصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم أضف 10 µL من معيار الحقن (مثل pentadecane بتركيز 6.25 mg/L في البيريدين) إلى كل عينة.
  10. استبدل أغطية القوارير بأخرى جديدة، وارجها لفترة وجيزة بجهاز الفورتكس، ثم انقل المزيج النهائي إلى قوارير كروماتوغرافيا زجاجية تحتوي على حشوات دقيقة (micro-inserts).
  11. ضع القوارير في صينية جهاز أخذ العينات التلقائي (autosampler).
  12. اترك العينات لتتوازن في جهاز أخذ العينات التلقائي لمدة 4 h عند درجة حرارة الغرفة قبل عملية الحقن الأولى.
    ملاحظة: تكتمل عملية الاشتقاق بعد 4 h، وتكون النواتج الأيضية (metabolites) مستقرة عند درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 24 h بعد اكتمال الاشتقاق. قم بتعديل عدد العينات في كل دفعة وفقاً لذلك بحيث لا تترك العينات في جهاز أخذ العينات التلقائي لأكثر من 28 h (بعد إضافة MSTFA 1% TMCS). تظهر المخططات التوضيحية لطرق تحضير العينات في الشكل 1A–C.

5. إعدادات جهاز RP-LC-MS

  1. قم بتحضير محاليل الشطف ومواد الاستخلاص للطور المعكوس (RP) وفقاً لـ الجدول 2.
    ملاحظة: تنبيه: حمض الفورميك والإيزوبروبانول مواد قابلة للاشتعال، كما أن حمض الفورميك مادة سامة. يجب التعامل مع كليهما داخل خزانة استخلاص الأدخنة.
  2. قم بتركيب عمود HSS T3 C18 (100 mm x 2.1 mm, 1.7 µm) في فرن الأعمدة.
  3. ضع جميع الخطوط في القناة المقابلة لها وقم بتطهير كل قناة وفقاً لذلك.
  4. اضبط درجة حرارة العمود على 40 °C.
  5. ابدأ بغسل العمود باستخدام 100% A:0% B بمعدل تدفق 0.1 mL/min.
  6. زد معدل التدفق بخطوات قدرها 0.1 mL/min، مع الانتظار حتى يستقر ضغط العمود بين الخطوات، إلى أن يتم الوصول إلى تدفق 0.35 mL/min. تحقق من عدم وجود تسريبات.
  7. قم بموازنة العمود عند الظروف الأولية للتدرج (0% B) لمدة 30 min تقريباً.
    ملاحظة: راقب ضغط العمود وتأكد من بقائه ضمن النطاق المتوقع (5000–6000 psi).
  8. ابدأ تسلسل العينات.

6. إعدادات جهاز GC-MS

  1. قم بتركيب العمود الشعري DB-5 (5% – phenyl-methyl-polysiloxane) في فرن العمود.
  2. اضبط درجة حرارة العمود الأولية على 60 °C.
  3. اضبط درجة حرارة حاقن PTV الأولية على 110 °C.
  4. ابدأ تسلسل العينات.

النتائج

تُعرض هنا النتائج التمثيلية للتحليل غير المستهدف لأجهزة VAMS، وذلك باتباع الإجراء الموضح أعلاه.

تم تقييم البيانات الناتجة عن تحليل ثلاثي لعينة مجمعة تم تحضيرها من الدم الوريدي لـ 10 أفراد، جُمعت باستخدام أجهزة VAMS، وموضحة خصائص البصمات الأيضية الناتجة. كما تم تقييم جودة البيانات والمعلومات المستخلصة من أجهزة VAMS بناءً على معيارين أساسيين: العدد الإجمالي للميزات الكيميائية المكتشفة، وقابلية تكرار هذه الميزات (n = 3)، والتي عُبِّر عنها بنسبة الانحراف المعياري النسبي (%RSD). استُخدم العدد الإجمالي للميزات لتقييم نطاق الاستخلاص والتغطية الكيميائية للمذيب، بينما تمت مراقبة %RSD لضمان الدقة التقنية ومنهجية العمل؛ حيث تشير قيمة %RSD المنخفضة إلى عملية استخلاص عالية القابلية للتكرار تقلل من الضجيج التحليلي.

بعد استخلاص البيانات الخام ومعالجتها، تم الحصول على مصفوفة من سمات نسبة الكتلة إلى الشحنة (m/z)-زمن الاحتباس (RT)، بالإضافة إلى شدتها. وقد تم اعتبار السمات التي تظهر إشارة يمكن اكتشافها في اثنتين من أصل ثلاث مكررات فقط، وذلك بعد إجراء خطوات المعالجة المسبقة المناسبة وتصفية العينات الفارغة. يوضح الشكل 2A،B مخططات m/z مقابل RT لنفس العينة التي تم تحليلها وفقاً للبروتوكولات الموصوفة لكل من LC-MS و GC-MS.

يُعزى العدد الكبير من الميزات التي شُطفت مبكراً في تشغيل الـ RPLC إلى المستقلبات شديدة الألفة للماء التي استُخلصت بواسطة البروتوكول المطبق ولكنها لم تُحتجز بشكل جيد على عمود الطور المعكوس. ورغم أن المستقلبات التي تُشطف مبكراً تفرض تحديات في تحديد الهوية، إلا أن التوصيف الدقيق لا يزال ممكناً باستخدام بيانات تكسير MS/MS إلى جانب المقارنات مع قواعد البيانات الطيفية والمعايير المرجعية الداخلية. علاوة على ذلك، من المتوقع التقاط جزء كبير من هذا الجزء المحب للماء عبر تحليل GC-MS. وفي نهاية المطاف، يمثل هذا قصوراً متأصلاً في هذا المجال، حيث تفرض التعقيدات الهائلة للميتابولوم ضرورة استخدام منصات تحليلية متعددة.

يُظهر التقييم متعدد المنصات للمستخلصات الميثانولية بوضوح الطبيعة التكاملية العالية لسير عمل التحليل باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة (LC) والكروماتوغرافيا الغازية (GC)، حيث وقعت مقاييس الأداء ضمن النطاق المتوقع للتوصيف الشامل للأيضات (metabolomics profiling). يوضح الشكل 3A،B العدد الإجمالي للميزات وتوزيع نسبة الانحراف المعياري النسبي (RSD%) لكل منصة. وفرت منصة LC تغطية كيميائية واسعة، حيث تم فصل 4,169 ميزة، وهو ما يتماشى مع قدرتها الراسخة على رصد مجموعة واسعة من المركبات القطبية وشبه القطبية وغير المتطايرة. وفي الوقت ذاته، أظهرت منصة GC مجموعة فرعية أصغر من الميزات، بواقع 187 ميزة. وكان هذا متوقعاً، لأن الكروماتوغرافيا الغازية (GC) يمكنها فقط الكشف عن المركبات المتطايرة القابلة للاشتقاق.

فيما يتعلق بقابلية التكرار، وكما هو موضح في مخطط الكمان (violin plot)، فإن التوزيع العام ومدى انتشار قيم %RSD متشابهان بشكل ملحوظ بين تقنيتي LC-MS وGC-MS. كان متوسط %RSD نموذجياً لكلا المنصتين، حيث بلغ حوالي 29.7% لـ LC (كانت قيمة %RSD لأقل من 30% في 2,655 من أصل 4,169 حالة) و32.3% لـ GC (كانت قيمة %RSD لأقل من 30% في 114 من أصل 187 حالة). وبينما أظهر عدد صغير من السمات قيم RSD أعلى في كلا الجانبين، فإن هذا التباين شائع ومتوقع في الميتابولوميات غير الموجهة (untargeted metabolomics). وعادةً ما تعود هذه القيم المرتفعة إلى المستقلبات ذات الوفرة المنخفضة التي تقترب من حد الكشف الخاص بالجهاز. وبشكل عام، تؤكد ملفات التوزيع المتقاربة تحقيق قابلية تكرار مرضية لكلا التجهيزين التحليليين.

يمكن دراسة الحيز الكيميائي للمستقلبات التي تم رصدها بواسطة البروتوكول من خلال توصيفات هذه المستقلبات. تم الكشف عن مركبات متنوعة بواسطة تقنيتي LC-MS و GC-MS، وهو أمر متوقع نظراً للتكامل الجوهري بين المنصتين. تتوفر قائمة كاملة بتوصيفات المستقلبات لأجهزة VAMS في الجدول التكميلي 1 والجدول التكميلي 2. إجمالاً، تم الكشف عن 97 مستقلاً وتوصيفها (المستوى 1 و2، وفقاً لما اقترحه Sumner et al. (2007)22) بواسطة هذا البروتوكول عبر التقنيتين، بالإضافة إلى مركبات أخرى تم توصيفها افتراضياً في المستوى 3. تم تأكيد توصيفات GC بشكل أكبر من خلال مقارنة مؤشرات الاحتجاز التجريبية – التي تم الحصول عليها من خلال المقارنة مع FAMES – مع المؤشرات المجدولة23. يوضح الشكل 4A،B توزيع الفئات الفرعية للمستقلبات الموصوفة لكلا الطريقتين، بينما يوضح الشكل 4C التداخل بين التقنيتين، مما يسلط الضوء على تكاملهما. يمكن التحقق المتقاطع من عدد قليل من المستقلبات الوسيطة الرئيسية بواسطة كلتا التقنيتين، في حين يمكن للميزات الفريدة هيكلياً أو الخاصة بالمنصة سد الثغرات في مسارات الكربون المركزية والمسارات الأيضية الثانوية. وعلى الرغم من أن الأحماض الأمينية والببتيدات هي الفئات الكيميائية الرئيسية في كلا التحليلين، إلا أن عدداً قليلاً فقط من المستقلبات يتداخل بين التقنيتين. وتعتبر العديد من فئات المستقلبات خاصة بالأجهزة، مثل acyl carnitines في LC-MS والسكريات السداسية (hexoses) في GC-MS.

لإثبات كفاءة الميثانول كمذيب استخلاص لكلا التقنيتين، أُجريت تجارب مقارنة على عينات VAMS باستخدام أنظمة مذيبات متنوعة، تلتها تحاليل LC-MS وGC-MS. تمت مقارنة ثلاثة أنظمة مذيبات متميزة مع الميثانول في ثلاث مكررات: الأسيتونتريل النقي (ACN)، ومزيج من الميثانول والماء (60:40، v/v)، ومزيج من الأسيتونتريل والميثانول (70:30، v/v). وقد استند اختيار هذه المذيبات والمزيج إلى تجارب أولية أجراها فريقنا، بالإضافة إلى الدراسات المنشورة سابقاً13,14,24,25. تم تقييم كفاءة الاستخلاص لكل نظام باستخدام ثلاثة معايير أساسية: العدد الإجمالي للسمات المكتشفة، والشدة الكلية للسمات، وتكرارية السمات، والتي عُبّر عنها بالانحراف المعياري النسبي (RSD, %).

بالنسبة لسير عمل LC-MS، تم رصد أكبر عدد من السمات باستخدام MeOH-H2O (60:40, v/v)، بمتوسط 4,514 سمة عبر ثلاث مكررات، تلاها مباشرة MeOH النقي (4,169 سمة). وأعطى مزيج ACN–MeOH (70:30, v/v) متوسط 3,502 سمة، بينما أعطى ACN النقي أدنى متوسط لعدد السمات، وهو 2,836. يوضح التمثيل البياني لأعداد هذه السمات لكل مكرر في الشكل 5A.

لفحص خصائص الدقة لكل شرط من شروط الاستخلاص، تم تحليل شدة الميزات وقيم RSD (%) لثلاث حقنات مكررة. يظهر في الشكل 5A مقارنة بين الوفرة الإجمالية للميزات ومتوسط %RSD لكل مذيب استخلاص في نظام LC-MS. كانت توزيعات إشارة log2 متشابهة لجميع المستخلصات، حيث حقق كل من MeOH-H2O 60:40 (v/v) وACN وMeOH وفرة أعلى قليلاً من ACN-MeOH 70:30 (v/v). وقد حقق MeOH متوسط %RSD إجمالي أقل، مما يشير إلى أن الاستخلاص كان أكثر قابلية للتكرار باستخدام هذا المذيب.

أُجري تقييم مماثل لكفاءة نظام مذيب الاستخلاص في بيانات GC-MS. ومرة أخرى، لتقييم عدد الميزات، تم اعتبار تلك التي تم اكتشاف إشارتها في اثنين على الأقل من أصل ثلاث مكررات فقط. وكان المذيب الذي أعطى أكبر عدد من الميزات هو ACN-MeOH 70:30 (v/v) (216 ميزة)، يليه مباشرة MeOH (187 ميزة). ويظهر توضيح رسومي لعدد الميزات المكتشفة لكل مذيب استخلاص وBµS في الشكل 5B.

فيما يتعلق بالوفرة الإجمالية للميزات المكتشفة، بدا MeOH الأكثر كفاءة، حيث حقق وفرة أعلى، كما هو موضح في الشكل 5B. وكان MeOH-H₂O 60:40 (v/v) هو ثاني أفضل مذيب، يليه ACN-MeOH 70:30 (v/v). أما ACN فكان المذيب الأقل فعالية. وبالنسبة لنسبة الانحراف المعياري النسبي (%RSD) للميزات، فقد وفر MeOH-H₂O 60:40 (v/v) أدنى قيم RSD لـ VAMS (RSD = 38.57%)، تلاه ACN بنسبة (42.65%)، ثم MeOH بنسبة (44.14%)، وأخيرًا ACN-MeOH 70:30 (v/v) بنسبة (49.14%). وتم تمثيل هذه القيم في الشكل 5B.

تتفق النتائج المذكورة أعلاه بشكل جيد مع الدراسات المنشورة سابقاً. فقد أشار Couacault et al. (2026)19 إلى وجود عدد مماثل من الميزات في تحليل RP-LC-MS لعينات DBS وVAMS باستخدام تركيبة مذيب استخلاص مشابهة (إعادة الترطيب بـ 80 µL من الماء، تليها إضافة 320 µL من MeOH). وبالمثل، اكتشف Cala et al. (2017)11 عدداً مماثلاً من الميزات (153) عبر تحليل GC-MS لرؤوس VAMS. ورغم أن معظم الدراسات الحالية لم تقيّم دقة التحليلات في هذه الأجهزة، إلا أن نتائجنا الإجمالية تتوافق مع التوقعات الخاصة بالتحليل غير المستهدف. علاوة على ذلك، تتفق نتائج LC مع تلك التي أبلغ عنها Bossi et al. (2025)26 لتحليل HILIC لعينات DBS وqDBS الدقيقة، حيث كانت قيم RSD لمعظم الميزات المكتشفة < 30%.

وبوجه عام، تُظهر هذه النتائج أن الاستخلاص القائم على الميثانول يوفر توازناً قوياً بين عدد الميزات، والشدة، والدقة (متوسط RSD، %) لتحليلات LC-MS وGC-MS لعينات VAMS. وبناءً على ذلك، يمكن لبروتوكول استخلاص واحد بالميثانول أن يبسّط عملية التحضير المزدوج للعينات، ويسهل الحصول المتوازي على ملفات تعريف استقلابية متكاملة، ويرفع من مقدار المعلومات المستخلصة إلى الحد الأقصى.

مخطط تحضير عينات الميتابولوميات؛ خطوات الكروماتوغرافيا، والميثوكسيمات، والاشتقاق.
الشكل 1: مخططات البروتوكول التي توضح (A) بروتوكول استخلاص العينة، و(B) إعادة تكوين LC-MS، و(C) اشتقاق GC-MS/MS. تم الإنشاء بواسطة BioRender. Marques, D. (2026) https://BioRender.com/dprdv18, https://biorender.com/xu2qh34, https://biorender.com/7ztz2qv. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

كروماتوغرام مطيافية الكتلة، زمن الاستبقاء مقابل m/z، تحليل توزيع القمم، نتيجة التجربة.
الشكل 2: مقارنات m/z و rt لعينة ممثلة لـ (A) تحليل LC-MS و (B) تحليل GC-MS. تمثل كل نقطة إشارة واحدة قبل تجميعها في سمات. تمثل الألوان شدة إشارة MS1 لسمة معينة، حيث تزداد الشدة من اللون الأزرق إلى الأحمر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخططات تغطية السمات وقابلية التكرار؛ تحليل LC مقابل GC؛ مخططات شريطية ومخططات كمان.
الشكل 3: تغطية السمات وقابلية التكرار عبر المنصات التحليلية. (A) تغطية السمات: العدد الإجمالي للسمات الفريدة التي تم اكتشافها بواسطة LC (باللون الأزرق المخضر) و GC (باللون البرتقالي)، مع تدوين الأعداد الدقيقة فوق كل شريط. (B) قابلية تكرار السمات: مخططات كمان توضح كثافة توزيع الانحرافات المعيارية النسبية (RSD%) لجميع السمات. تشير مخططات الصندوق المدمجة إلى الوسيط والنطاقات الربيعية؛ وقد حُذفت نقاط البيانات الفردية من أجل الوضوح البصري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الفئات الكيميائية في LC/GC، ومخططات شريطية ومخططات فين، ومقارنة عدد المستقلبات.
الشكل 4: مدرجات تكرارية توضح عدد المركبات من الفئات الكيميائية المختلفة التي تم الكشف عنها بواسطة (A>) LC-MS و (B>) GC-MS. (C>) تداخل المستقلبات التي تم تعيينها بالمستويين 1 و 2 بين المنصات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مقارنة بين مِذيبات الكروماتوغرافيا؛ مخطط شريطي؛ % RSD؛ كفاءة استخلاص المادة التحليلية؛ تصور البيانات.
الشكل 5: نتائج مِذيبات الاستخلاص من تحليل LC-MS (A>) و GC-MS (B>) لأجهزة VAMS. تمثل المخططات الشريطية في الجزء العلوي من الشكل عدد الميزات الناتجة عن كل مِذيب استخلاص طُبق على أجهزة VAMS لكل مكررة. وتوضح المخططات الموجودة في الجزء السفلي من الشكل مجموع الكثافات ومتوسط RSD (%) لكل مِذيب استخلاص استُخدم مع جهاز VAMS. يمثل حجم الدائرة مجموع الكثافة الكلية للميزات المكتشفة على مقياس log2، مما يعكس كفاءة الاستخلاص. ويشير التدرج اللوني إلى الدقة التحليلية، المعبر عنها بالانحراف المعياري النسبي (RSD)، حيث يمثل اللون الأصفر دقة أعلى واللون الأحمر يشير إلى تباين أكبر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: جدول استكشاف الأخطاء وإصلاحها. نظرة عامة على مشكلات أخذ العينات الشائعة، وأسبابها، وحلولها عند أخذ العينات باستخدام أجهزة VAMS. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول 2: محاليل شطف ومحاليل استخلاص RP. نظرة عامة على تركيبات الأطوار المتحركة، ومحلول غسل سداد الصمام، ومذيب التطهير، ومذيب الغسيل المستخدمة في التحليل الكروماتوغرافي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: تفاصيل تجريبية إضافية. معلمات LC-MS و GC-MS. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: تعليقات LC-MS. المركبات التي تم تحديدها باستخدام البروتوكول الحالي على منصة LC-MS. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: تعليقات GC-MS. المركبات التي تم تحديدها باستخدام البروتوكول الحالي على منصة GC-MS. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

توفر الميتابولوميات غير المستهدفة رؤية فريدة للتكوين الكيميائي للعينات البيولوجية. ومع ذلك، ونظرًا للتنوع الكيميائي الكبير للميتابولوم، لا يمكن لأي تقنية توصيف الجزيئات الصغيرة الموجودة في الدم بشكل كامل. لذلك، يعد استخدام تقنيات تكميلية أمرًا ضروريًا لزيادة تغطية الميتابوليتات وتحسين المعلومات الإجمالية المستمدة من تلك الدراسات. بيد أن الحجم الصغير للعينات الدموية الدقيقة، مثل VAMS، يجعل من تحضير العينات لتحليلات مختلفة أمرًا صعبًا.

يُقدم هذا البروتوكول سير عمل شاملاً للتوصيف الأيضي لرؤوس أجهزة VAMS باستخدام استخلاص مزدوج وتقنيتين تحليليتين متكاملتين. ورغم نشر أعمال سابقة أجرت تحليلات غير مستهدفة على عينات VAMS11,12,13,15,17,18,19,20,21,27، إلا أن كل منها ركز على تقنية تحليلية واحدة. ويعد هذا البروتوكول الأول الذي يكيف عملية استخلاص أجهزة VAMS لدعم تحليلات LC و GC-MS معاً ضمن سير عمل واحد.

يوفر هذا البروتوكول أحجاماً محددة من المذيبات والمستخلصات لتحقيق النتائج المعروضة؛ ويمكن إجراء تعديلات طفيفة لتناسب التجهيزات الفردية بناءً على حساسية الأجهزة، وأحجام الحقن المتاحة، ومتطلبات عينات مراقبة الجودة (QC). على سبيل المثال، يمكن تغيير حجم الماء المستخدم لإعادة الترطيب في الخطوة 2.2 من 50 إلى 80 µL، لضمان ترطيب الطرف بالكامل. كما يمكن زيادة حجم الميثانول في الخطوة 2.3 من 400 إلى 500 µL للحصول على حجم مستخلص أكبر لتقسيمه إلى عدد أكبر من عينات مراقبة الجودة. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن زيادة حجم المذيب ستؤدي إلى تخفيف أعلى للمواد المراد تحليلها. علاوة على ذلك، يمكن تعديل الأحجام المقسمة للتحليل وعينات مراقبة الجودة في الخطوتين 2.7 و 2.8 على التوالي (من 150 إلى 200 µL في الخطوة 2.7 ومن 20 إلى 50 µL في الخطوة 2.8) لتناسب الحجم المطلوب لكل عينة. ومن الجدير بالذكر أن أحجام المذيبات هذه يمكن تعديلها بحرية دون الحاجة إلى تغيير تناسبي. ورغم أن نسبة المذيب إلى العينة القياسية 3:1 تكون كافية عادةً للاستخلاص الكامل، فإن هذه الطريقة تستخدم فائضاً أكبر من المذيب لضمان بقاء جهاز BµS مغموراً بالكامل، مما يجعل البروتوكول قوياً وقابلاً للتطبيق المباشر عبر جميع الأحجام المقترحة.

يمكن تحليل بيانات كل من LC-MS وGC-MS باستخدام أدوات برمجية متنوعة مفتوحة المصدر. وفي هذه الدراسة، تم الحصول على نتائج LC-MS باستخدام مسار عمل Metabonaut28 مع XCMS. أما بالنسبة لعينات GC-MS، فقد تم إجراء معالجة البيانات باستخدام MSDial v. 5.5.260323. ويمكن العثور على الدروس التعليمية في (https://systemsomicslab.github.io/mtbinfo.github.io/MS-DIAL/tutorial.html). تتوفر المعلمات التفصيلية لمعالجة بيانات LC-MS وGC-MS في الملف التكميلي 1.

يُوصى بمعالجة كل مجموعة بيانات بشكل فردي، مع استخدام عينات مراقبة الجودة (QC) في دفعة منفصلة لتحسين معاملات المعالجة قبل تطبيقها على مجموعة البيانات بأكملها. ويجب إجراء عملية التسوية بعد المعالجة المسبقة للبيانات. تتوفر في كل من XCMS و MSDial أدوات مدمجة للتسوية. وفي العمل الحالي، تم إجراء التسوية باستخدام البرنامج مفتوح المصدر QCMXP29، وذلك باستخدام نموذج خطي يعتمد على استجابات عينات مراقبة الجودة.

يجب تسليط الضوء على بعض الخطوات الحرجة، خاصة في جزء تحضير العينات، لضمان موثوقية النتائج.

تم تطوير البروتوكول الحالي باستخدام نظام LC مقترن بمطياف كتلة زمن الطيران رباعي الأقطاب (LC-QTOF-MS) ونظام كروماتوغرافيا غازية-مطيافية الكتلة (GC-MS)، مع المعالم المدرجة في المواد التكميلية S1. في حال استخدام نوع مختلف من LC أو GC، يجب تحسين المعالم وفقًا للإعداد المحدد. في تحليلات الميتابولوميات القائمة على GC-MS وLC-MS، يجب جدولة حقن العينات الفارغة (blank injections) في بداية ونهاية الدفعة التحليلية. قبل حقن أي عينات مراقبة جودة (QC)، يجب حقن عينات مراقبة جودة لتهيئة النظام (conditioning QCs) من 10 إلى 15 مرة في نظام LC-MS ومن 5 إلى 10 مرات في نظام GC-MS لتهيئة العمود باستخدام المصفوفة المراد تحليلها. يجب تحضير عينات مراقبة جودة التهيئة باتباع نفس الإجراء المتبع مع عينات مراقبة الجودة الأخرى. كما يجب حقن عينات مراقبة جودة داخل الدراسة (Intra-study QC) بشكل دوري، على أن تشكل حوالي 10% من المحاليل المحقونة.

يعد التعامل مع رؤوس VAMS إحدى أكثر الخطوات أهمية في سير العمل هذا. ومن الضروري ألا يلامس الرأس أي أسطح باستثناء الجزء الداخلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق، لأن ذلك قد يؤدي إلى فقدان المادة التحليلية. علاوة على ذلك، فإن خطوة الترطيب المسبق أساسية لاستخلاص المادة التحليلية بشكل صحيح: فبينما يبدو أن إعادة الترطيب الأولية تعزز الاستعادة من خلال تسهيل إطلاق المادة التحليلية قبل الترسيب، يُفترض أن إضافة المذيبات العضوية مباشرة تؤدي إلى ترسيب البروتين الفوري داخل بنية الرأس، مما يخلق حاجزاً مادياً يحد من استخلاص المستقلبات لاحقاً.

علاوة على ذلك، يجب التأكد من إزالة الطرف البلاستيكي قبل خطوة الطرد المركزي. ورغم أن هذا قد يؤدي إلى فقدان كمية صغيرة من المحلول، إلا أن عدم القيام بذلك يؤثر على استعادة السائل الطافي. حيث يمكن للطرف البلاستيكي أن يعيد تعليق الراسب بسهولة، مما يجعل جمع سائل طافي نقي أمراً مستحيلاً.

يجب مراعاة بعض النقاط العامة المتعلقة بالاستقرار لضمان تحقيق أفضل النتائج. أولاً، ينبغي تخزين العينات تحت التبريد، ويفضل أن يكون ذلك عند −80 °C حتى وقت التحليل. ويوصى بإذابة العينات في حمام ثلجي أو في الثلاجة. ولمنع التحلل، يوصى بحقن العينة في نظام الكروماتوغرافيا في أقرب وقت ممكن. ومع ذلك، إذا تعذر الحقن بسبب قيود الوقت، يمكن تجميد المستخلص المجفف طوال الليل دون حدوث فقدان ملحوظ في الاستقرار.

يجب أيضاً تسليط الضوء على بعض الخطوات في سير عمل GC-MS. تتكون عملية الاشتقاق من خطوتين؛ الأولى هي الميثوكسي أمين (methoxyamination)، والتي تعمل على حماية مجموعات الكيتون التي تعاني من فقدان الكربوكسيل على شكل ثاني أكسيد الكربون إذا تركت دون حماية. ويلي ذلك عملية trimethylsilylation، حيث يتفاعل MSTFA مع الجزيئات التي تحتوي على بروتونات حمضية، وهي شائعة في مجموعات الكربوكسيل، والهيدروكسيل، والأمينو، والإيمينو، والسلفونيل. يعمل هذا التفاعل على تقليل قطبية المادة المراد تحليلها وإدخال مجموعة إعاقة كبيرة، مما يؤدي إلى خفض نقطة غليانها23. ومن الضروري أن تكون العينة جافة تماماً قبل إضافة الميثوكسي أمين، حيث يمكن للماء أن يتداخل مع عملية حماية المادة المراد تحليلها. كما ينبغي الانتباه إلى أهمية ترك العينات لتستقر في درجة حرارة الغرفة بعد إخراجها من الفرن، لأن فتح القارورة قبل ذلك قد يؤدي إلى فقدان المستقلبات المتطايرة. علاوة على ذلك، قد تتمدد أغطية GC عند التسخين، مما قد يؤدي إلى إغلاق غير محكم للقارورة وفقدان المواد المراد تحليلها بمرور الوقت. لهذا السبب، يوصى بتغيير غطاء GC بعد كل خطوة تحضين.

ومع ذلك، فيما يتعلق ببروتوكول GC-MS، يجب مراعاة بعض النقاط بخصوص وقت الاشتقاق. فقد ثبت أن المستقلبات تستمر في التفاعل حتى بعد إخراجها من الفرن، حيث تصل التركيزات إلى مرحلة الثبات بعد 4 h. وتظل هذه المرحلة مستقرة لمدة تصل إلى 24 h بعد اكتمال عملية الاشتقاق30,31. لذا، من المهم جداً تنظيم تحضير العينات لضمان بقاء العينات المشتقة في جهاز أخذ العينات التلقائي (autosampler) لمدة لا تزيد عن 28 h بعد التفاعل مع MSTFA. وبالنسبة للدفعات التحليلية الكبيرة، يُوصى بتحضير جميع العينات في وقت واحد لتقليل التباين اليومي في تحضير العينات ولضمان إمكانية تجميع أجزاء من كل عينة في خليط مراقبة الجودة (QC mix). يمكن تخزين العينات على هيئة رواسب مجففة عند −80 °C، ويجب إذابة العينات التي سيتم تحليلها خلال الـ 24 h القادمة وإجراء عملية الاشتقاق لها فقط27. كما يُوصى بتغطية القوارير بغشاء مختبري لمنع العينة من امتصاص الرطوبة في المجمد. وأخيراً، يُوصى باستخدام محاليل اشتقاق مُحضرة حديثاً واتباع الإرشادات العامة لضمان الجودة في تحليل الميتابولوميات عبر كلا المنهجيتين لضمان الحصول على نتائج موثوقة32.

بينما تخرج مقارنة سير العمل الحالي بتحليل البلازما التقليدي عن نطاق هذا العمل، فقد تم استكشاف هذا الموضوع باستفاضة في الأدبيات العلمية17,18,19,20,21,27. وبشكل عام، توفر أجهزة VAMS ملفات تعريفية نوعية قابلة للمقارنة بالبلازما، إلا أن الوفرة تختلف بين المصفوفات بطرق تعتمد على نوع المادة المُحللة، حتى عند استخدام أحجام متكافئة (20 µL). ومن المرجح أن تعود هذه الاختلافات إلى المكونات الخلوية الموجودة في BµS، أو الاختلافات بين الدم الشعيري والدم الوريدي، أو التداخل الناتج عن المصفوفة المجففة أثناء التحليل. وهذا يستلزم التحقق من صحة النتائج المستخلصة من أجهزة BµS قبل تطبيقها في الممارسة السريرية.

لتكييف البروتوكول المقترح مع سير العمل الروتيني في المختبرات ذات الإنتاجية العالية، يمكن تنفيذ عدة تعديلات واستراتيجيات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. أولاً، يمكن زيادة أحجام مذيب الاستخلاص، خاصة عند تحضير دفعات أكبر من عينات مراقبة الجودة (QC). ومع ذلك، يجب مراعاة أن زيادة حجم الاستخلاص تؤدي بطبيعتها إلى تخفيف العينة، مما قد يقلل من الكثافة ما لم يتم تعديل حجم إعادة التكوين اللاحق بشكل تناسبي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحسين تركيبة مذيب إعادة التكوين المخصص للكروماتوغرافيا السائلة لتتوافق مع تدرج الطور المتحرك الأولي لتكوينات أجهزة محددة.

تتمثل القيد الأساسي لهذا البروتوكول في صغر حجم العينة؛ فحيثما يتم تقسيم عينة واحدة بحجم 20 µL للتحليل على نظامين مختلفين، قد تنخفض المركبات ذات الوفرة المنخفضة إلى مستويات أقل من حدود الكشف في الجهاز الأقل حساسية. ومع ذلك، فإن هذه السلبية يتجاوزها تيسير جمع العينات الذي توفره تقنية BµS والتغطية الكيميائية الأوسع التي تمنحها التقنيات التكميلية. بالإضافة إلى ذلك، وبالرغم من أن خطوة التبخير في البروتوكول قد تؤدي نظرياً إلى فقدان المركبات المتطايرة، إلا أن تأثيرها الفعلي على هذه المركبات لم يتم تقييمه. ورغم ذلك، وبما أن التبخير ضروري لاشتقاق العينة ويسمح بإعادة الذوبان في حجم أصغر لتعزيز حساسية LC، فإن فوائده العملية تفوق أي فقدان محتمل في الإشارة. وعلى الرغم من أن دراسات سابقة تناولت تحليل العينات الدقيقة غير المستهدفة7,11,12,13,15,17,18,19,20,27، فإن هذا البروتوكول، على حد علم المؤلفين، يمثل أول سير عمل كامل لتحليل أجهزة أخذ العينات الدقيقة بالامتصاص الحجمي (VAMS) عبر تحليلات LC و GC-MS من عملية استخلاص واحدة.

علاوة على ذلك، فإن تقييم مقاييس إضافية من شأنه أن يعزز هذه النتائج بشكل أكبر. أولاً، إن التحقق من صحة النتائج من خلال مقارنة متعددة المختبرات باستخدام نفس البروتوكول المزدوج للمنصات بدقة سيؤكد متانة الطريقة ويقيم الأداء عبر أجهزة LC-MS و GC-MS المختلفة. بالإضافة إلى ذلك، لم تقيم الدراسة الحالية التباين بين المشغلين أثناء تحضير العينات أو جمعها. وأخيراً، يمثل إجراء المزيد من التحليلات لاستكشاف تأثيرات التخزين على سلامة العينات وتأثير الهيماتوكريت مجالات رئيسية يمكن من خلالها توسيع البحث الحالي. وبالنظر إلى أننا في التحليل غير المستهدف نعطي الأولوية لاتساع تغطية المستقلبات والمقارنات النسبية بين العينات، فإن الاختلافات الفردية في مستقلبات محددة عبر الفئات الكيميائية المتنوعة لا تخل بصلاحية البيانات. لذا ينبغي دراسة تأثيرات الهيماتوكريت والتخزين من هذا المنظور. وتعتبر مثل هذه البيانات نادرة، باستثناء دراسة أجراها Volani et al. (2023)، والتي أظهرت أن أجهزة VAMS تظل مستقرة عند −80 °C لمدة 6 أشهر24.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود أي تضارب في المصالح ذي صلة بمحتوى هذا المقال.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل HUMAN-HORIZON-MSCA-2021-DN-01. وقد تم تمويل المشروع من قبل الاتحاد الأوروبي Horizon 2020، ومن خلال إجراءات ماري كوري، منحة رقم 101073062. ويود المؤلفون شكر دومينيكي غالو على دعمها أثناء تصوير الفيديو.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
قوارير زجاجية سعة 1.5 ملحلول مختبريةACSV0902Aتُستخدم لنقل وتبخير جزء الكروماتوغرافيا الغازية (GC)، وإجراء تفاعلات الاشتقاق، والحقن النهائي في جهاز الكروماتوغرافيا الغازية.
أسيتونيتريل (AcN)كيماويات VWR BDABDH92497.320درجة LC-MS. تم تقييمه كمكون لمذيب استخلاص.
D27-حمض الميريستيكSigma Aldrich366889أُضيفت إلى مذيب الاستخلاص الميثانولي لمراقبة كفاءة الاستخلاص والأداء التحليلي.
عمود شعري من نوع DBS-5 (5% فينيل-مثيل-بولي سيلوكسان)Agilent Technologies122-5332UIعمود شعري للكروماتوغرافيا الغازية مُثبت في فرن جهاز الكروماتوغرافيا الغازية لتحليل الكروماتوغرافيا الغازية مطياف الكتلة (GC-MS).
Eppendorf Concentrator plusEppendorf5.3E+09تُستخدم لتبخير السوائل الطافية للعينة حتى الجفاف التام قبل التخزين أو إعادة الذوبان/الاشتقاق.
مزيج معياري من إسترات ميثيل الأحماض الدهنيةSigma AldrichSMB00937-1MLتُستخدم للحصول على مؤشرات الاحتجاز للمستقلبات بغرض التوصيف باستخدام الكروماتوغرافيا الغازية.
حمض الفورميككيماويات VWR BDAPI85178درجة LC-MS. يُستخدم كمادة مضافة بنسبة 0.1% في الطورين المتحركين A وB لتقنية RP-LC-MS.
عمود HSS T3 C18 (100 مم × 2.1 مم، 1.7 µm)Waters Corporation1.9E+08عمود تحليل الكروماتوغرافيا السائلة ذات الطور المعكوس مثبت في فرن الأعمدة لإجراء تحليل RP-LC-MS/MS.
إيزوبروبانولمختبر الكيمياءCL00.0926.2500درجة LC-MS. مكون من محلول غسيل مانع التسرب (H2إيزوبروبانول 80:20 حجماً/حجماً).
لاب فيلم (Labfilm)بارافيلم (Parafilm)PM-996تُستخدم لتغليف وتغطية القوارير أثناء التخزين عند درجة حرارة -80°C لتجنب امتصاص الرطوبة.
الميثانول (MeOH)كيماويات VWR BDAAA47192-K2درجة LC-MS أو GC-MS. تُستخدم لتحسين مذيب الاستخلاص، وتحضير المعيار الداخلي، والأطوار المتحركة.
هيدروكلوريد الميثوكسي أمينSigma Aldrich89803تُستخدم لتحضير عامل الميثوكسي أمين (40 ملغم/مل في البيريدين) لحماية مجموعات الكيتون/ الكربونيل.
المدرجات الدقيقةحلول المختبراتACIV300ICتُستخدم لاحتواء المحلول قبل الحقن.
أخذ عينات دم دقيقة باستخدام جهاز Mitra (BµSالأجهزة 20 µLنيوتيريكس / تراجان للعلوم والطب200004رؤوس بوليمرية لأخذ عينات مجهرية امتصاصية حجمية (VAMS) تُستخدم لجمع عينات دم دقيقة ذات أحجام منخفضة.
إن-ميثيل-إن-(تريميثيل سيليل) ثلاثي فلورو أسيتاميد (MSTFA)Restek35601كاشف السيللة المستخدم لتقليل قطبية المادة المُحللة ودرجات غليانها عن طريق التفاعل مع البروتونات الحمضية.
فرنهيراليوس8.1E+09تُستخدم في تفاعلات الاشتقاق: الميثوكسي أمين في 30°C لمدة 90 دقيقة، وعملية السيللة باستخدام ثلاثي ميثيل السيليل عند 37°C لمدة 30 دقيقة.
بنتاديكانSigma AldrichK2015Rأُعدَّ بتركيز 6.25 مجم/لتر. يُضاف إلى كل عينة قبل النقل النهائي إلى قارورة جهاز GC للتحقق من جودة الحقن.
جهاز طرد مركزي مبرد للأبحاث (Pro-Research)مختبر سنتوريون ساينتيفيك (Centurion Scientific Lab)CL00.1688.2500قادر على التبريد حتى 4°C والوصول إلى سرعات تصل إلى 10,000 x g.
بيريدينSigma Aldrich23053درجة لامائية. مُذيب يُستخدم لإذابة هيدروكلوريد الميثوكسي أمين لخطوة الاشتقاق الأولى.
أنابيب طرد مركزي دقيقة ذات قاع مستديرإف إل ميديكال (FL Medical)TS-88530تُستخدم لفصل رأس نظام أخذ العينات الدقيق المعتمد على الحجم (VAMS) واحتوائه أثناء عمليات إعادة الترطيب والاستخلاص والطرد المركزي.
ثلاثي ميثيل كلوروسيلان (TMCS)Alfa Aesarيرجى تقديم النص المصدر المراد ترجمته.عامل حفاز للاشتقاق. يضاف إلى MSTFA بنسبة 1% حجم/حجم.
ملقطنظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تقديم النص الإنجليزي المراد ترجمته إلى اللغة العربية وفقًا للمعايير العلمية والتقنية المذكورة.لا ينطبقتُستخدم لإزالة رؤوس أخذ العينات ذات المصفوفة المتغيرة (VAMS) بعناية من الأنابيب. ويجب تنظيفها باستخدام الميثانول بين العينات.
ماء فائق النقاء (H2أ)جهاز إزالة المعادن من Hydrolab (ستراسين، بولندا)غير متاح١٨.٢ مولارΩ·مقاومة كهربائية بـ cm. تُستخدم في إعادة ترطيب الرؤوس، وخليط الاستخلاص، والطور المتحرك A.
حمام الموجات فوق الصوتية Sonorex Digitec DTبانديلينغير متاح*يُستخدم مع حمام ثلجي لخيار الاستخلاص لمدة 10 دقائق بدلاً من استخدام طاولة رج لمدة 30-60 دقيقة.
مشرط وخز أحادي الاستخدام ينشط عند التلامس (بعمق 1.5 مم)[الشركة — يرجى التأكيد][رقم الكتالوج # — يرجى التأكيدتُستخدم لإجراء وخز الإصبع لجمع الدم الشعيري (الخطوة 1.3).
محلول الإيثانول (70%)[الشركة — يرجى التأكيد[رقم الكتالوج # — يرجى التأكيدتُستخدم لتطهير طرف الإصبع قبل أخذ العينة (الخطوة 1.2).
نظام LC-QTOF-MS (جهاز Bruker Elute LC مقترن بمطياف كتلة رباعي القطب وزمن الطيران)Bruker[رقم الكتالوج # — يرجى التأكيدنظام الكروماتوغرافيا السائلة المقترنة بمطياف الكتلة بالطور المعكوس (LC-MS) المستخدم في تحليل RP-LC-MS (القسم 5)؛ والذي سبق ذكره مباشرة في نص المناقشة دون إدراجه في جدول المواد.
نظام GC-MS (Bruker EVOQ-456)Bruker[رقم الكتالوج # — يرجى التأكيدنظام الكروماتوغرافيا الغازية-مطياف الكتلة المستخدم لتحليل GC-MS (القسم 6)؛ سُمي سابقاً بشكل مباشر في نص المناقشة دون...  مدخل المواد.

المراجع

  1. Gertsman I, Barshop BA. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. J Inherit Metab Dis. 2018;41(3):355-366.
  2. Gika H, Theodoridis G, Plumb RS, Wilson ID. Metabolic phenotyping (metabonomics/metabolomics) by liquid chromatography-mass spectrometry. In: Fanali S, Chankvetadze B, Haddad PR, Poole CF, Riekkola ML, editors. Liquid Chromatography. 3rd ed. Amsterdam: Elsevier; 2023. p. 403-429.
  3. Bossi E, et al. Revolutionizing blood collection: innovations, applications, and the potential of microsampling technologies for monitoring metabolites and lipids. Metabolites. 2024;14(1):46.
  4. Nys G, Kok MGM, Servais AC, Fillet M. Beyond dried blood spot: current microsampling techniques in the context of biomedical applications. TrAC Trends Anal Chem. 2017;97:326-332.
  5. Londhe V, Rajadhyaksha M. Opportunities and obstacles for microsampling techniques in bioanalysis: special focus on DBS and VAMS. J Pharm Biomed Anal. 2020;182:113102.
  6. Denniff P, Spooner N. Volumetric absorptive microsampling: a dried sample collection technique for quantitative bioanalysis. Anal Chem. 2014;86(16):8489-8495.
  7. de Sá e Silva DM, et al. Volumetric absorptive microsampling in the analysis of endogenous metabolites. Metabolites. 2023;13(10):1038.
  8. Thaitumu M, Gkanali V, Theodoridis G, Gika H. Connecting the dots: bridging microsamples and conventional blood matrices in metabolic biomarker analysis. Anal Sci Adv. 2025;6(2):e70044.
  9. Chiu HH, et al. A comparative study of plasma and dried blood spot metabolomics and its application to diabetes mellitus. Clin Chim Acta. 2024;552:117655.
  10. Tobin NH, et al. Comparison of dried blood spot and plasma sampling for untargeted metabolomics. Metabolomics. 2021;17(7):62.
  11. Cala MP, Meesters RJW. Comparative study on microsampling techniques in metabolic fingerprinting studies applying gas chromatography-MS analysis. Bioanalysis. 2017;9(17):1329-1340.
  12. Shen X, et al. Multi-omics microsampling for the profiling of lifestyle-associated changes in health. Nat Biomed Eng. 2024;8(1):11-29.
  13. Volani C, et al. VAMS-based blood capillary sampling for mass spectrometry-based human metabolomics studies. Metabolites. 2023;13(2):146.
  14. Drolet J, et al. Integrated metabolomics assessment of human dried blood spots and urine strips. Metabolites. 2017;7(3):35.
  15. Petrick LM, et al. Effects of storage temperature and time on metabolite profiles measured in dried blood spots, dried blood microsamplers, and plasma. Sci Total Environ. 2024;912:169383.
  16. Kong ST, Lim SH, Ching J, Ho PCL. GC-MS uncovers unique metabolic markers of drug-resistant epilepsy in capillary but not venous dried blood spots. J Pharm Biomed Anal. 2025;253:116561.
  17. Londoño-Osorio S, et al. Integrating blood microsampling devices with CE-MS for untargeted analysis of polar metabolomics. Microchem J. 2025;218:115278.
  18. Avella D, et al. An LC-MS untargeted metabolomic comparison between three blood microsampling devices, whole blood, and plasma. Metabolomics. 2026;22(3):89.
  19. Couacault P, Witting M. RPLC- and HILIC-based non-targeted metabolomics workflow for blood microsamples. Metabolomics. 2026;22(2):23.
  20. Londoño-Osorio S, et al. Deep insights into microsampling technologies for global lipidomic profiling of human whole blood using high-throughput LC-MS. Microchem J. 2025;213:113760.
  21. Thaitumu MN, et al. LC-MS-based global metabolic profiles of alternative blood specimens collected by microsampling. Metabolites. 2025;15(1):62.
  22. Sumner LW, et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 2007;3(3):211-221.
  23. Fiehn O. Metabolomics by gas chromatography-mass spectrometry: combined targeted and untargeted profiling. Curr Protoc Mol Biol. 2016;114(1):30.4.1-30.4.32.
  24. Volani C, et al. Pre-analytic evaluation of volumetric absorptive microsampling and integration in a mass spectrometry-based metabolomics workflow. Anal Bioanal Chem. 2017;409(26):6263-6276.
  25. Want EJ, et al. Solvent-dependent metabolite distribution, clustering, and protein extraction for serum profiling with mass spectrometry. Anal Chem. 2006;78(3):743-752.
  26. Bossi E, et al. Pre-analytic assessment of dried blood and dried plasma spots: integration in mass spectrometry-based metabolomics and lipidomics workflow. Anal Bioanal Chem. 2025;417(9):1791-1805.
  27. Marques de Sá e Silva D, et al. Toward minimally invasive metabolomics: GC-MS metabolic fingerprints of dried blood microsamples in comparison to plasma. Analyst. 2025;150(24):5445-5456.
  28. Louail P, et al. rformassspectrometry/Metabonaut: v1.1.0. Zenodo. 2025. Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.15190305
  29. Broadhurst D. broadhurstdavid/QC-MXP: QC:MXP version 2.0. Zenodo. 2025. Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.15233092
  30. Moros G, et al. Investigation of the derivatization conditions for GC-MS metabolomics of biological samples. Bioanalysis. 2017;9(1):53-65.
  31. Ioannidis M, et al. Analytical workflow for comprehensive blood metabolomics analysis by GC-MS: application to children with ventilator-associated pneumonia. J Chromatogr A. 2025;1753:465924.
  32. Kirwan JA, et al. Quality assurance and quality control reporting in untargeted metabolic phenotyping: mQACC recommendations for analytical quality management. Metabolomics. 2022;18(9):70.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

أخذ عينات الدم الدقيقةأخذ عينات الامتصاص الحجمي الدقيقعينات الدم المجففةالميتابولوميات غير المستهدفةتحضير العيناتالكروماتوغرافيا السائلةمطيافية الكتلةالكروماتوغرافيا الغازيةأخذ العينات اللامركزي

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.