مقالة منهجية

طريقة تعتمد على الممانعة في الوقت الحقيقي وخالية من الوسوم للفحص عالي الإنتاجية للمضادات الفيروسية

0 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/72539

⸱

سبتمبر 3, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vanderbilt Center for Antibody Therapeutics, Vanderbilt University Medical Center, 2Agilent Technologies, Inc., 11011 N Torry Pines, 3Department of Pathology, Microbiology and Immunology, 4Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

يتيح نهج تحليل الخلايا في الوقت الفعلي القائم على المعاوقة (RTCA) قياساً كمياً في الوقت الفعلي وبدون استخدام علامات للتأثيرات المرضية الخلوية الناجمة عن الفيروسات، مما يوفر طريقة سريعة لتقييم المركبات المضادة للفيروسات والأجسام المضادة أحادية النسيلة من خلال سير عمل فحص متكامل ومدعوم برمجياً.

الملخص

توفر التقنيات القائمة على المعاوقة وسيلة قوية وموضوعية لقياس التأثيرات المرضية الخلوية (CPE) في الطبقات الخلوية الأحادية المزرعة، متجاوزةً بذلك قيود المقايسات التقليدية التي تعتمد على نقطة النهاية أو التقييمات البصرية الذاتية. عادةً ما تحفز الفيروسات الحالة للخلايا تغيرات مورفولوجية واضحة وموتاً خلوياً في المزارع المصابة، مما يجعل قياسات المعاوقة، التي تعكس التغيرات في التصاق الخلايا ومورفولوجيتها وحيويتها، مؤشراً حساساً وديناميكياً للإصابة الفيروسية وتطورها. ونتيجة لذلك، توفر القراءات القائمة على المعاوقة نهجاً قوياً وفعالاً لتقييم التأثيرات الوقائية للتدخلات المضادة للفيروسات. تقدم هذه الدراسة منصة فحص في الوقت الحقيقي وخالية من الوسوم تستفيد من أنظمة قياس المعاوقة المتقدمة لمراقبة التأثيرات المرضية الخلوية الناجمة عن الفيروسات بشكل مستمر. يتيح هذا النهج تقييماً كمياً سريعاً لفعالية مضادات الفيروسات سواء كانت عقاقير جزيئية صغيرة أو أجساماً مضادة أحادية النسيلة، دون الحاجة إلى خطوات وسم أو صبغ إضافية. يفصل البروتوكول سير عمل المقايسة بالكامل، بدءاً من استزراع الخلايا والإصابة الفيروسية وصولاً إلى الحصول على البيانات وتحليلها. علاوة على ذلك، يعمل البرنامج المدمج في النظام، والمصمم خصيصاً لتطبيقات علم الفيروسات، على تبسيط معالجة البيانات وتفسيرها، مما يسهل تحديد القدرة التعادلية للأجسام المضادة أحادية النسيلة ونشاط المركبات المضادة للفيروسات.

المقدمة

عند مواجهة تهديد بتفشٍ فيروسي، تمثل اللقاحات والعلاجات المضادة للفيروسات الاستراتيجيات الأساسية للحد من انتقال الفيروس وعلاج المرضى المصابين1. وتعمل اللقاحات على منع العدوى من خلال تهيئة الجهاز المناعي للتعرف على المسببات المرضية وتوفير حماية استباقية وطويلة الأمد. أما العلاجات المضادة للفيروسات فلها استخدامات متنوعة تعتمد على نمط الدواء وتصميمه. وعلى غرار اللقاحات، يمكن للأجسام المضادة أحادية النسيلة أن توفر حماية استباقية ومستدامة (من أسابيع إلى عدة أشهر)، كما يمكن استخدامها كأداة للسيطرة بعد التعرض للفيروس. ويُستخدم كل من الأجسام المضادة أحادية النسيلة والعلاجات الجزيئية الصغيرة المضادة للفيروسات لعلاج حالات العدوى القائمة من خلال استهداف المكونات الفيروسية أو تثبيطها بشكل مباشر، مما يقلل من شدة المرض ويعمل كتدخل تفاعلي قصير الأمد.

إن النهج التقليدي لتقييم النشاط المضاد للفيروسات وظيفياً في الأنظمة البيولوجية هو اختبار تحييد خفض الفيروس (VRNT)، والذي يحدد كمياً الانخفاض في تكوين اللويحات في اختبارات تحييد خفض اللويحات (PRNT)، أو البؤر via الصبغ المناعي في اختبار تحييد خفض البؤر (FRNT)، أو التأثيرات المرضية الخلوية (CPE) باستخدام فحوصات تعتمد على حيوية الخلايا. ويُعتبر PRNT الطريقة المظهرية المعيارية الذهبية لتحديد النشاط المثبط للعوامل المضادة للفيروسات ضد مجموعة واسعة من الإصابات الفيروسية2. ومع ذلك، فإن PRNT يستغرق وقتاً طويلاً ويتطلب جهداً مكثفاً، كما يمكن أن يكون تفسير النتائج ذاتياً، خاصة عند حدوث نمو مفرط لللويحات أو اندماجها أثناء الحضن المطول. ويمكن تحسين موضوعية قراءات الفحص باستخدام FRNT، الذي يعتمد على الكشف عن مستضدات محددة للفيروس أو تعبير الجينات المراسلة. ومع ذلك، قد يكون هذا النهج محدوداً بتوفر وأداء الأجسام المضادة عالية الجودة أو إنزيمات الكشف. وهناك العديد من الكواشف وبروتوكولات الفحص الراسخة والمستخدمة على نطاق واسع لتقييم حيوية الخلايا، والتي تقيس جوانب معينة من CPE. حيث يؤدي الاختزال الإنزيمي لكاشف MTT اللوني وهو ملح مونو-تيترازوليوم (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) بواسطة نزعات الهيدروجين الميتوكوندرية في الخلايا الحية إلى إنتاج إشارة لونية قابلة للقياس الكمي يسببها ناتج الفورمازان الملون. أما كاشف فحص الحيوية (الذي يعمل على تحلل الخلايا وتحرير ATP داخل الخلايا والذي يحفز تفاعلاً بواسطة إنزيم اللوسيفيراز، محولاً مادة الركيزة لوسيفيرين إلى أوكسيلوسيفيرين) فهو فحص لوميني متجانس. ويمكن استخدام فحوصات حيوية الخلايا هذه لتقدير الانخفاض في CPE أثناء فحص العوامل المضادة للفيروسات كمياً3. ومع ذلك، تتطلب هذه الطرق أيضاً خطوات متعددة من الغسيل والصبغ، وهي، مثل فحوصات PRNT وFRNT، فحوصات نقطة نهاية. ونتيجة لذلك، قد يتم إغفال العوامل المضادة للفيروسات ذات الفعالية الجزئية التي تمارس تأثيرات متأخرة على العدوى الفيروسية إذا تم إنهاء الفحص المضاد للفيروسات في نقطة زمنية غير مثالية. لذلك، هناك حاجة ماسة إلى فحص مؤتمت، متوسط إلى عالي الإنتاجية، يتيح المراقبة في الوقت الفعلي للاستجابات الخلوية للإصابات الفيروسية.

تتيح أنظمة تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي (RTCA) المراقبة المستمرة لتطور التأثير المرضي الخلوي (CPE) والاستجابات المضادة للفيروسات في نماذج خلوية قابلة للإصابة، وذلك من خلال قراءة تعتمد على المعاوقة الكهربائية وتكون غير بضعية وخالية من الوسوم. ولا يشمل التأثير المرضي الخلوي الناجم عن الفيروس موت الخلايا فحسب، بل يشمل أيضاً التغيرات في مورفولوجيا الخلايا والتصاقها، وكل ذلك يمكن اكتشافه بدقة من خلال التغيرات في المعاوقة الكهربائية4,5. ويتم الحصول على قياسات المعاوقة هذه باستخدام مستشعرات قطبية كهربائية دقيقة من الذهب مدمجة في طبق زراعة خلايا متخصص مكون من 96 بئراً، مما يسمح بالتقييم الكمي للاستجابات الخلوية الديناميكية دون الحاجة إلى وسوم أو تعبير عن جينات مراسلة. وقد تم توثيق تقنية RTCA على نطاق واسع للكشف عن التأثير المرضي الخلوي عبر نماذج خلوية متنوعة مصابة بفيروسات من عائلات متعددة، وكذلك لتقييم النشاط التحيدي للأجسام المضادة6–10.

هنا، نورد الخطوات الحاسمة لهذا الإجراء القائم على قياس المعاوقة في الوقت الحقيقي وبدون استخدام علامات، في المختبر تم تحديد المقايسة المضادة للفيروسات. وقد استند هذا النهج إلى دراسات سابقة تضمنت فحص المركبات المضادة للفيروسات في خلايا HEK293A المصابة بالفيروس الغدي 5، وتقييم الأجسام المضادة المُحيّدة باستخدام فيروس التهاب الفم الحويصلي المؤتلف قادر على التضاعف والذي يعبّر عن البروتين السكري لفيروس لاسا (rVSV-LASV(Lin IV)) في خلايا Vero CCL-81.11أُجريت كل هذه التجارب باستخدام نظام RTCA MP، الذي يدعم تشغيل ما يصل إلى 6× أطباق ذات 96 بئراً في آن واحد. كان الهدف من هذا العمل هو إرساء أساس للفحص المضاد للفيروسات القائم على المعاوقة. ويمكن توسيع هذه الطريقة بسهولة لتشمل مجموعة واسعة من نماذج الفيروسات والخلايا بمجرد تحديد ظروف المقايسة المثلى باستخدام البروتوكول الموصوف هنا.

البروتوكول

الكواشف والأجهزة المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. زراعة الخلايا المتقبلة وتمريرها

ملاحظة: في هذا البروتوكول، تُستخدم خلايا Vero CCL-81 لمعادلة الأجسام المضادة، بينما تُستخدم خلايا HEK293A لفحص المركبات المضادة للفيروسات. وللحد من التباين بين التجارب، يُوصى بشدة بإنشاء بنك خلايا من الخلايا القابلة للإصابة عند نفس رقم الممر (passage) الخاص بالفحص.

  1. قم بتدفئة وسط نمو الخلايا مسبقاً—وهو وسط Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) المكمل بـ 10% مصل جنين البقري (FBS) و 1% بنسيلين-ستربتومايسين—في حمام مائي درجة حرارته 37°C قبل الاستخدام.
  2. قم بإذابة أنبوبة من الخلايا المسموح بها والمحفوظة بالتجميد في حمام مائي درجة حرارته 37°C حتى تبقى قطعة صغيرة فقط من بلورة الجليد؛ مع مراعاة عدم غمر الغطاء في الحمام المائي. 
  3. ضع الأنبوبة التي تحتوي على الخلايا المستعادة داخل كابينة السلامة البيولوجية (BSC) بعد مسح الجزء الخارجي منها بإيثانول 70%.
  4. انقل الخلايا برفق إلى أنبوبة مخروطية جديدة سعة 50 mL وأضف 9 mL من وسط النمو الدافئ إلى الخلايا على شكل قطرات. اخلط بلطف.
  5. قم بتركيز معلق الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 200 × g لمدة 5 min في درجة حرارة الغرفة (RT).
  6. انقل الخلايا المعاد تعليقها في 5 mL من وسط النمو المدفأ مسبقاً إلى قارورة T-25 جديدة.
  7. اترك الخلايا تنمو حتى تصل إلى درجة تلاقي (confluency) تتراوح بين 80% و 90% في حاضنة درجة حرارتها 37°C مع 5% CO2 قبل عملية الاستنبات الفرعي التالية للخلايا. 
  8. قم بتمرير الخلايا (Passage).
    1. اسحب الوسط واغسل طبقة الخلايا الأحادية برفق مرتين باستخدام 3 mL من محلول Phosphate-Buffered Saline (PBS) بتركيز 1× الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم لإزالة بقايا وسط النمو.
    2. أضف 2 mL من 0.25% trypsin-EDTA إلى القارورة لتغطية الخلايا.
    3. بعد تحضينها لمدة 2–5 min عند 37°C، قم بمعادلة التريبسين بإضافة حجم يعادل 5 أضعاف من وسط النمو المدفأ مسبقاً.
    4. أعد تعليق الخلايا عن طريق سحب و دفع معلق الخلايا بلطف باستخدام الماصة مقابل جدار القارورة.
    5. ازرع الخلايا بكثافة الزرع المطلوبة أو بنسبة التقسيم المحددة باستخدام وسط طازج. 
      ملاحظة: يتم تحديد كثافة زرع الخلايا المطلوبة تجريبياً بناءً على معدل نمو الخلايا، وتكرار التمرير، ودرجة التلاقي المستهدفة وقت التمرير. على سبيل المثال، فإن زرع خلايا Vero CCL-81 بحد أدنى 0.4 × 104 cells/cm2 يسمح بتمرير الخلايا كل 3 days قبل أن تصل إلى 90% من درجة التلاقي.

2. فحص العوامل المضادة للفيروسات

ملاحظة: الشكل 1 يوضح هذا المخطط سير العمل في مقايسة الفحص المضاد للفيروسات القائمة على الممانعة. وباختصار، تُزرع الخلايا القابلة للإصابة في أطباق دقيقة ذات 96 بئراً مدمج بها أقطاب كهربائية دقيقة، ويتم مراقبة أداء الخلايا لمدة 24 ساعة تقريباً قبل بدء المقايسة. وفيما يخص اختبارات تحييد الأجسام المضادة، تُخلط الفيروسات بتعدد عدوى (MOI) ثابت مع الأجسام المضادة وتُحضن مسبقاً لمدة ساعة واحدة قبل إضافتها إلى الخلايا. وفي المقابل، بالنسبة لفحص المركبات المضادة للفيروسات، تُضاف الفيروسات بتعدد عدوى (MOI) ثابت والمركبات إلى الخلايا في آن واحد. ويتم مراقبة التأثير المرضي الخلوي (CPE) الناجم عن الفيروس بشكل مستمر باستخدام قراءات قائمة على الممانعة، ويمكن إجراء تحليل البيانات إما أثناء المقايسة أو بعد اكتمالها.

  1. اليوم 0: قياس خلفية الطبق واستزراع الخلايا المسموحة
    1. لبدء التجربة، افتح برنامج الجهاز (RTCA Pro) واختيار الحامل المطلوب للمقايسة. بعد ذلك، اختر الـ علم الفيروسات الوحدة قبل البدء في التجربة.
    2. أدخل أي ملاحظات ذات صلة في الـ ملاحظات التجربة علامة تبويب (على سبيل المثال، اسم التجربة, الرقم التسلسلي للجهاز, نوع الجهاز، أو أي تفاصيل أخرى ذات صلة). هذه الحقول اختيارية ويمكن تركها فارغة إذا كانت غير قابلة للتطبيق.
    3. انتقل إلى تنسيق قم بتبويب وتحديد الآبار المستخدمة في التجربة. وفي حال عدم استخدام آبار معينة، حدد الآبار غير المستخدمة، ثم انقر بزر الفأرة الأيمن داخل واجهة مخطط اللوح، واختر إيقاف تشغيل البئر (الأبآر) من القائمة المنسدلة لاستبعادها من المقايسة.
    4. قياس الخلفية للصفيحة الدقيقة ذات الـ 96 بئراً والمدمجة بالأقطاب الكهربائية الدقيقة
      1. صرف 50 µL من وسط المقايسة في كل بئر من آبار اللوحة باستخدام ماصة متعددة القنوات بنمط السحب العكسي لتقليل تكون الفقاعات.
        ملاحظة: يجب تحسين اختيار وسط المقايسة قبل إجراء الفحص لتقليل التداخل مع حساسية المقايسة وضمان التقييم الدقيق لفعالية العلاج. على سبيل المثال، أُجريت مقايسات تحييد الأجسام المضادة في وسط DMEM المحتوي على 2% من مصل جنين العجل (FBS) و1% من البنسلين-ستريبتومايسين، بينما استخدمت مقايسات فحص المركبات المضادة للفيروسات وسط نمو الخلايا، وهو وسط DMEM المحتوي على 10% من مصل جنين العجل (FBS) و1% من البنسلين-ستريبتومايسين.
      2. ضع الطبق في حامل الجهاز الموجود داخل الـ 37 °C حضّانة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2)2تأكد من توجيه الطبق بشكل صحيح بحيث تكون البئر A1 في الموضع المحدد. بعد ذلك، تحقق من علامة تبويب الرسائل (Message) للتأكد من عدم وجود أي إشعارات خطأ.
        ملاحظة: في كل مرة يتم فيها وضع الطبق في الحامل، تحقق من ظهور رسالة "Plate scanned. Connections okay" (تم مسح الطبق. الاتصالات سليمة). وفي حال حدوث خطأ، قم بإزالة الطبق وإعادة تثبيته في الحامل.
      3. انتقل إلى الجدول الزمني علامة تبويب؛ تظهر الخطوة 1 افتراضيًا، حيث إنها خطوة مطلوبة لقياس خلفية الطبق. انقر فوق الـ ابدأ زر لبدء التسجيل من الآبار. تنتهي هذه الخطوة تلقائياً بعد تسجيل قياس واحد لمعاوقة الخلفية.
        ملاحظة: يجب تنفيذ خطوة الخلفية هذه قبل كل تجربة. يجب أن تحتوي جميع الآبار المستخدمة في التجربة على وسط المقايسة فقط (أي قبل استزراع الخلايا).
    5. استزراع الخلايا بطريقة تسمحية في لوحة ذات 96 بئراً مدمجة بأقطاب كهربائية دقيقة
      1. قم بمعالجة الخلايا المسموح بها في قارورة T25 بالتريبسين باتباع الخطوات الموضحة في قسم تمرير الخلايا المسموح بها.
      2. قم بعدّ الخلايا المعاد تعليقها في وسط المقايسة وأجرِ الحسابات التالية:
        1. احسب العدد الإجمالي للخلايا الحية في المعلق باستخدام كثافة الخلايا الحية: إجمالي الخلايا الحية = كثافة الخلايا الحية × حجم المعلق
        2. اضبط معلق الخلايا للوصول إلى كثافة نهائية (على سبيل المثال، 0.30-0.35 × 106 خلية/مل لـ Vero CCL-81، وهو ما يعادل تقريبًا 15,000-18,000 خلية لكل 50 µL، أو 0.12 × 106 خلية/مل لـ HEK293A، وهو ما يعادل 6,000 خلية لكل 50 µL).
          ملاحظة: تم تحديد كثافات الاستزراع هذه مسبقاً لتكون مثالية لكل نموذج من نماذج الفيروسات والخلايا. وتعد كثافة استزراع الخلايا الصحيحة أمراً أساسياً، حيث إن استخدام عدد كبير جداً أو قليل جداً من الخلايا قد يؤثر على حساسية المقايسة.
      3. أخرجِ الصفيحة الدقيقة التي تحتوي على 50 µL من وسط المقايسة من الجهاز ونقله إلى كابينة السلامة البيولوجية (BSC) لاستزراع الخلايا.
      4. صرف 50 µL من معلق الخلايا في كل بئر من آبار الطبق باستخدام ماصة متعددة القنوات بنمط السحب العكسي لتقليل تكون الفقاعات، ليصل الحجم النهائي في كل بئر إلى 100 µL.
    6. بعد إضافة الخلايا، تُترك اللوحة في كابينة السلامة البيولوجية (BSC) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح بتوزيع الخلايا بشكل متساوٍ على قاع كل بئر.
    7. أعد الطبق إلى حامل الجهاز الموجود داخل الـ 37 °C حضّانة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2)2.
      ملاحظة: في حال استخدام أطباق متعددة، يجب وضع ملصق تعريف واضح على كل طبق، والتأكد من إعادته إلى الحامل نفسه الذي استُخدم أثناء قياس الخلفية.
    8. انتقل إلى التصميم علامة التبويب وافتح الـ خلية علامة تبويب فرعية. اختر الآبار المناسبة، ثم أدخل الخلايا المتقبلة الاسم و رقم، ثم انقر على تطبيق لحفظ المعلومات. كما يمكن إدخال معلومات الخلايا أو تحديثها في أي وقت أثناء التجربة.
    9. أضف الخطوة 2 على الـ الجدول الزمني علامة التبويب باستخدام إعدادات التسجيل الافتراضية (100 مسح وفترة زمنية مدتها 15 دقيقة)، ثم انقر فوق بداية لبدء المراقبة المستمرة لالتصاق الخلايا وتكاثرها طوال الليل.
      ملاحظة: تعمل هذه الخطوة كإجراء لضبط جودة (QC) الخلايا قبل التلقيح بالفيروس. وبما أن مؤشر الخلايا (CI) يعكس التصاق الخلايا وتكاثرها، تُستخدم قيم مؤشر الخلايا التي يتم الحصول عليها خلال فترة 18-24 ساعة بعد الاستزراع كمقياس أساسي لضبط الجودة. ويُعد سلوك الخلايا القابل للتكرار عبر التجارب أمراً ضرورياً لتحقيق القابلية المثلى لتكرار المقايسة. ومن الجدير بالذكر أن كلاً من سعة مؤشر الخلايا ومخططاته الحركية تعتمد على نوع الخلية؛ فعلى سبيل المثال، بعد الزرع لليلة واحدة، تُظهر خلايا Vero CCL-81 السليمة التي تم استزراعها بكثافة 18,000 خلية/بئر عادةً مؤشر خلايا يتراوح بين 6-8، بينما تُظهر خلايا HEK293A السليمة التي تم استزراعها بكثافة 6,000 خلية/بئر عموماً مؤشر خلايا يتراوح بين 0.8-1.2.
  2. اليوم الأول: فحص العوامل المضادة للفيروسات القائم على الممانعة
    ملاحظة: قبل إجراء مقايسة الفحص، يجب معايرة الفيروس بشكل مناسب لتحديد التخفيف الأمثل للعمل. تحدد هذه الخطوة تركيزاً للفيروس يدعم أداءً قوياً وقابلاً للتكرار للمقايسة مع تلبية المتطلبات المحددة من قبل المستخدم، مثل مدة المقايسة المطلوبة. على سبيل المثال، في بروتوكول تحييد الأجسام المضادة11تم اختيار تعدد عدوى (MOI) بمقدار 0.01 لمقايسة التعادل، حيث أدى ذلك إلى حدوث تأثير اعتلال خلوي (CPE) كامل (100%) في غضون 40 ساعة بعد التلقيح. وفي المقايسة القائمة على الممانعة، يُستدل على حدوث تأثير اعتلال خلوي كامل من خلال انخفاض مؤشر الخلية أو مؤشر الخلية المعياري إلى الصفر. أما أثناء فحص المركبات المضادة للفيروسات، فقد استُخدم تعدد عدوى بمقدار 1، ولوحظ حدوث تأثير اعتلال خلوي بنسبة 100% في غضون 70 ساعة بعد التلقيح. وقد اتبع بروتوكول التعيير الفيروسي الإجراءات المعتمدة الموضحة في تقرير سابق.12إذا استُخدمت في المقايسة فيروسات معدية، فيجب التأكد من اتباع جميع احتياطات السلامة المعمول بها. يُرجى الرجوع إلى قسم إرشادات السلامة الخاصة بالتعامل مع الفيروسات المعدية.
    1. يتم تحضير الفيروس بالتركيز المحدد مسبقاً، وتحضير تخفيفات متسلسلة من الجسم المضاد أو المركب المضاد للفيروسات في وسط المقايسة.
    2. لإجراء اختبارات تحييد الأجسام المضادة أحادية النسيلة، اخلط 60 µL للفيروس عند 4× التركيز النهائي للمقايسة مع 60 µL من الأجسام المضادة عند 4× التركيز النهائي للمقايسة وتحضينها عند 37 °C لمدة ساعة واحدة قبل الإضافة إلى الخلايا المتقبلة. وبعد الخلط، يتواجد الفيروس والجسم المضاد بتركيز 2× تركيزاتها النهائية في المقايسة. وفي المقابل، لا تتطلب مقايسات فحص المركبات المضادة للفيروسات أي تحضين مسبق للفيروس مع المركب.
    3. انتقل إلى تنسيق انقر على علامة التبويب وحدد الـ العلاج علامة تبويب فرعية لإدخال معلومات المعالجة الخاصة بالعوامل المضادة للفيروسات في الآبار المناسبة.
    4. حدد الآبار التي خضعت لنفس المعالجة، ثم أدخل الـ الاسم من العوامل وأدخل نقطة البداية التخفيف أو التركيزعلى سبيل المثال، إذا كان التركيز الابتدائي هو 10 µg/mL، إدخال 10 واختيار µg/mL بصفتها "وحدة". أدخل 3 بما أن الـ معامل التخفيف وتحديد الـ الاتجاه للتخفيف (على سبيل المثال، من الأعلى إلى الأسفل).
      ملاحظة: بعد النقر على تطبيقسيتم حساب تركيزات أو تخفيفات العامل المضاد للفيروسات وحفظها تلقائيًا بناءً على مدخلات تخطيط الطبق، وستظهر في الآبار المقابلة. كما تُحفظ القيم المحسوبة لاستخدامها في تحليل البيانات اللاحق. وعند إدخال معلومات الفيروس (على سبيل المثال، الاسم و التخفيف(اختياري)، حيث يستخدم المقايسة تعددية عدوى (MOI) ثابتة واحدة لجميع الآبار المعالجة بالفيروس.
    5. تعيين الآبار المعالجة بالفيروس فقط كضوابط إيجابية عن طريق تحديد الآبار المناسبة واختيار عينة ضابطة موجبة تحت نوع البئر.
    6. قم بتعيين الآبار غير المصابة كضوابط سلبية باتباع الخطوة الموضحة أعلاه والتحقق من ضابط سلبي تحت نوع البئر.
      ملاحظة: التعيين الصحيح للآبار التي تحتوي على الفيروس فقط والآبار غير المصابة كـ ضابط إيجابي و ضابط سلبيعلى التوالي، باستخدام الـ نوع البئر يعد الضبط أمراً بالغ الأهمية، حيث تُستخدم قيم مؤشر التصحيح (CI) المستمدة من هذه الآبار في جميع الحسابات المتعلقة بالتعادل (على سبيل المثال، نسبة التعادل %Neutralization). أما بالنسبة للحسابات المتعلقة بالتأثير المرضي الخلوي (على سبيل المثال، نسبة التأثير المرضي الخلوي %CPE)، فيلزم وجود آبار مخصصة صراحةً كضوابط سلبية. وبالنسبة لمقايسات تعادل الأجسام المضادة، يُوصى بشدة بتضمين أجسام مضادة ضابطة إيجابية وسلبية على نفس الطبق لضمان التفسير الدقيق للبيانات. ومع ذلك، يجب تحديد هذه الأجسام المضادة الضابطة على أنها العينات تحت نوع البئر.
    7. عندما يصبح المقايسة جاهزة لإضافة العامل المضاد للفيروسات، اضغط على إلغاء الخطوة الحالية زر لتجاوز عمليات المسح المتبقية في الخطوة 2 والانتقال إلى الخطوة التالية.
    8. انقر على فتح الصفيحة الزر، ثم قم بإزالة الطبق من الحامل ووضعه في كابينة السلامة البيولوجية (BSC).
    9. يُوزع بلطف 100 µL من خليط الفيروس والأجسام المضادة أو خليط الفيروس والمركب المضاد للفيروسات في كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات، ليصل الحجم النهائي في البئر إلى 200 µLيحتوي اللقاح على الفيروس والأجسام المضادة أو المركب المضاد للفيروسات بتركيز 2× تركيزات المقايسة النهائية الخاصة بها، والتي تُخفف إلى تركيزات العمل النهائية عند إضافتها إلى الخلايا.
    10. بعد إعادة الطبق إلى الحامل، انتقل إلى الجدول الزمني انقر على علامة التبويب وأضف الخطوة 3. حدد عدد الـ عمليات المسح و الـ إنترفا (Interva)بين عمليات المسح. تأكد من أن إجمالي مدة المسح (عدد عمليات المسح × يتجاوز مدة العلاج المتوقعة. انقر فوق ابدأ لاستئناف عملية الحصول على البيانات ومواصلة المقايسة.
      ملاحظة: يسهل تخصيص خطوة منفصلة (على سبيل المثال، الخطوة 3) بعد إضافة العامل المضاد للفيروسات عملية تحديد فترة المراقبة ما بعد العلاج. يجب دائمًا برمجة كل خطوة (باستثناء الخطوة 1) لتعمل لفترة زمنية أطول من المدة المتوقعة للمقايسة؛ إذ سيتوقف الجهاز عن إجراء القياسات في حال الوصول إلى وقت التشغيل المبرمج، مما سيؤدي إلى فقدان بعض نقاط البيانات.
  3. اليوم الأول وما يليه: تحليل البيانات
    1. لمراجعة التسجيل والتحليل الفوري للاستجابات الخلوية أثناء عملية الحصول على البيانات، انتقل إلى تحليل البيانات علامة التبويب، حدد نقطة زمنية محددة أو فاصلًا زمنيًا، ثم اختر وأضف الآبار المراد تضمينها في التحليل لعرضها على المخطط البياني.
    2. حدد المعاملات من الـ المحور الصادي قائمة منسدلة. عندما مؤشر الخلية المُطَبَّع إذا تم اختيار المعهد الوطني للسرطان (NCI)، فحدد الـ وقت التسوية، وهي النقطة الزمنية التي تسبق العلاج مباشرةً، من القائمة المنسدلة للوقت. %CPE أو %التعادل ويمكن عرضها أيضاً عن طريق اختيار الخيار المقابل من القائمة المنسدلة لمحور Y.
      ملاحظة: يستخدم الجهاز معلماً عديم الوحدة، وهو مؤشر الخلية (CI)، لتمثيل المعاوقة. ويُنصح باستخدام مؤشر الخلية المعياري (NCI) لتقييم الفروق في العلاج مع تقليل تأثير التباين المتأصل بين الآبار.
    3. انتقل إلى مَعلَمَة قسم حول الـ تحليل البيانات علامة تبويب لحساب وإنشاء أنواع مختلفة من الأشكال البيانية، مثل المخطط الشريطي ومنحنيات استجابة الجرعة القائمة على انحدار لوجستي رباعي المعلمات (4PL، بميل متغير) عند نقطة زمنية محددة (على سبيل المثال، عند منتصف أو نهاية المقايسة). بدلاً من ذلك، فإن الـ IC₅₀ توفر القيمة المشتقة من المساحة تحت المنحنى (AUC) لمؤشر الخلية أو مؤشر الخلية المُطبع بعد المعالجة مقياساً للاستجابة الإجمالية للجرعة من العوامل المضادة للفيروسات طوال فترة المعالجة.
    4. في نهاية الاختبار، انقر على إيقاف مؤقت، ثم اضغط على فتح اللوحة زر. أخرج الطبق من الحامل وقم إلكترونياً إطلاق هذا عن طريق الـ طبق القائمة

3. إرشادات السلامة للتعامل مع الفيروسات المعدية

  1. ارتدِ معدات الوقاية الشخصية المناسبة من خلال ارتداء زوجين من القفازات، وواقي الوجه، ومعطف المختبر. يوصى بشدة باتباع ذلك عند التعامل مع الفيروسات.
  2. تعامل مع المواد التي تحتوي على الفيروسات وأضفها إلى الأطباق حصرياً داخل كابينة السلامة البيولوجية (BSC) قيد التشغيل.
  3. انقل أمبولات الفيروس وأي أطباق تحتوي على فيروسات من وإلى كابينة السلامة البيولوجية داخل حاوية نقل حيوية محكمة الإغلاق.
  4. قبل وبعد التعامل مع المواد التي تحتوي على الفيروسات في كابينة السلامة البيولوجية، قم برش جميع الأسطح الداخلية جيداً بمطهر واتركه لمدة 5 min لضمان التعطيل الكامل للفيروس. امسح الأسطح لتنظيفها، ثم عقمها باستخدام ethanol 70% لإزالة أي بقايا للمطهر.
  5. عند الانتهاء من مقايسة فحص مضادات الفيروسات القائمة على الممانعة، قم بإزالة جميع الأطباق من الجهاز وانقلها باستخدام حاوية نقل حيوية محكمة الإغلاق مباشرة إلى كابينة سلامة بيولوجية نظيفة.
  6. حضّر محلول مبيض طازج بتركيز 20% وأضفه إلى كل بئر في أطباق المقايسة. اترك المبيض لمدة 10 min قبل شفطه من جميع الآبار والتخلص من الأطباق.
  7. قم بتطهير جميع أطباق المقايسة، والماصات المصلية، ورؤوس الماصات، والأنابيب، وغيرها من البلاستيكيات ذات الاستخدام الواحد التي قد تكونلامست الفيروس باستخدام المبيض، وتخلص منها في أكياس نفايات المخاطر البيولوجية المخصصة.
  8. رش المواد البلاستيكية غير المخصصة للاستخدام الواحد، مثل رفوف الأنابيب والماصات، بمطهر ثم امسحها.

النتائج

القراءة الآنية للمقاومة الكهربائية دون استخدام واسمات تكشف عن التأثير المرضي الخلوي الناجم عن الفيروس والحماية المضادة للفيروسات
كما هو موضح في Figure 2A، تم استزراع خلايا المضيف HEK293A في لوحة ذات 96 بئراً مدمج بها أقطاب كهربائية دقيقة بكثافة 6,000 خلية لكل بئر13. وبعد تحضين لمدة 24 h، تمت إضافة الفيروس الغدي من النوع 5 (adenovirus type 5) بمعدل عدوى (MOI) قدره 1 بوجود أو غياب مركبات مضادة للفيروسات. وتمت مراقبة الاستجابات الخلوية للعدوى الفيروسية والعلاج المضاد للفيروسات باستمرار باستخدام قياسات المقاومة الكهربائية الآنية والخالية من الواسمات. وفي غياب الفيروس، تكاثرت الخلايا باستمرار خلال فترة المراقبة التي استمرت 80 h، ووصلت إلى مرحلة الاندماج كما يتضح من الزيادة المستمرة في المقاومة الكهربائية المتبوعة بمرحلة ثبات. أما في حالة العدوى بالفيروس الغدي، فقد سمحت في البداية بنمو الخلايا لمدة 20 h تقريباً، وبعد ذلك لوحظ تأثير مرضي خلوي (CPE) واضح، مما أدى إلى انخفاض سريع في إشارة المقاومة الكهربائية وصولاً إلى خط الأساس بحلول الساعة 65 h تقريباً بعد العدوى. وكان للعلاج بمركب stavudine (50 µM) أو ribavirin (20 µM) تأثير ضئيل على التأثير المرضي الخلوي الناجم عن الفيروس، حيث كانت مسارات المقاومة الكهربائية مشابهة إلى حد كبير لتلك الخاصة بالخلايا المصابة بالفيروس وحده. وأظهر ganciclovir (50 µM) نشاطاً مضاداً للفيروسات بدرجة متوسطة، وهو ما ثبت من خلال استعادة جزئية لمؤشر الخلايا المعياري (Normalized Cell Index). وفي المقابل، عمل cidofovir (50 µM) و brincidofovir (1 µM) على تخفيف التأثير المرضي الخلوي بشكل ملحوظ، مما أنتج أنماط مقاومة كهربائية قابلة للمقارنة مع تلك الملاحظة في خلايا المجموعة الضابطة السالبة غير المصابة. ومن الجدير بالذكر أن أياً من المركبات لم يؤثر بشكل كبير على مؤشر الخلايا (Cell Index) مقارنة بالمجموعات الضابطة المعالجة بالمذيب (vehicle) عند التركيزات المختبرة في الدراسات الأولية (البيانات غير معروضة).

في مقايسة تحييد الأجسام المضادة القائمة على المعاوقة، تم استزراع خلايا Vero CCL-81 بكثافة 18,000 خلية لكل بئر في طبق 96 بئر مدمج بالأقطاب الكهربائية الدقيقة، وحُضنت لمدة 24 h قبل العدوى. وفي يوم المقايسة، تم تحضين الأجسام المضادة أحادية النسيلة مسبقاً مع rVSV–LASV بمعدل عدوى MOI يبلغ 0.01 لمدة 1 h قبل إضافتها إلى الخلايا. وقد لُوحظت أنماط تحييد متباينة عبر الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) التي تم اختبارها. وللتوضيح، يعرض الشكل 2B نتائج نموذجية لأجسام مضادة أظهرت نشاطاً تحييدياً قوياً، أو جزئياً، أو انعدام النشاط التحييدي. حيث تسببت الأجسام المضادة غير المحيِّدة في حدوث تأثير اعتلال خلوي (CPE) كامل، مع تداخل مسارات المعاوقة مع مسارات ضوابط الفيروس فقط. أما الأجسام المضادة ذات النشاط التحييدي المتوسط فقد قللت جزئياً من السمية الخلوية الناجمة عن الفيروس، مما أدى إلى ظهور تأثير اعتلال خلوي (CPE) منخفض ولكن يمكن اكتشافه. وفي المقابل، ثبطت الأجسام المضادة المحيِّدة تماماً تأثير الاعتلال الخلوي (CPE)، وحافظت على إشارات معاوقة مماثلة لضوابط الخلايا غير المصابة. ومجتمعةً، أتاحت أنماط المعاوقة هذه تمييزاً واضحاً بين الأجسام المضادة أحادية النسيلة غير المحيِّدة، والمحيِّدة جزئياً، والمحيِّدة تماماً.

تحديد كمية وخصائص النشاط المضاد للفيروسات
بعد إثبات قدرة مقايسة RTCA القائمة على الممانعة على تحديد "الضربات الناجحة" (hits) من مكتبة من الأدوية والأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs)، سعت الدراسة بعد ذلك إلى توصيف فعالية المركبات والأجسام المضادة الرائدة. ويؤدي زيادة تركيز الدواء المضاد للفيروسات brincidofovir تدريجياً من 15.6 نانومولار إلى 1,000 نانومولار إلى زيادة تدريجية في إشارة الممانعة؛ فكلما زاد تركيز الدواء، زاد تشابه سلوك الخلايا مع سلوك مجموعة التحكم غير المصابة (الشكل 3أبالإضافة إلى ذلك، أدى العلاج بـ brincidofovir وحده إلى زيادة طفيفة في مؤشر السعة الخلوية (NCI) فقط عند أعلى تركيز تم اختباره (1100 نانومولار). ومع ذلك، انخفض مؤشر السعة الخلوية بشكل متوسط عند التركيزات التي تقل عن 1100 نانومولار، على الرغم من أن هذا التأثير لم يكن معتمداً على الجرعة. وتُشير هذه النتيجة إلى أن تعافي مؤشر السعة الخلوية يعود حصرياً إلى النشاط المضاد للفيروسات للعقار، وليس إلى أي تعزيز مباشر لتكاثر الخلايا أو التصاقها.الشكل 3Bيؤدي رسم المساحة تحت مؤشر الخلية المعياري (AUC) كدالة لتركيز brincidofovir إلى إنتاج منحنى الاستجابة للجرعة، والذي يوفر ملاءمة ممتازة (R2 بواقع 0.99) ويشير إلى تركيز مثبط نصفي (IC50 بتركيز 265 نانومولار (الشكل 3ج). وفي مقايسة تعادل الأجسام المضادة، عند نهاية المقايسة (بعد حوالي 50 ساعة من المعالجة)، قام برنامج النظام تلقائياً بحساب نسب التعادل عند كل تركيز من الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAb)، و IC50 وتم استخلاص القيم لاحقًا. وكما هو موضح في الشكل 3Dوعلى النقيض من الأجسام المضادة للتحكم السلبي rANDV-5، أظهرت الأجسام المضادة أحادية النسيلة الثلاثة الأخرى، r37.2D وr25.1C وr12.1F، فاعلية عالية مضادة للفيروسات، مع IC₅₀ قيم بلغت 4,315 نانوجرام/ملليلتر، و83 نانوجرام/ملليلتر، و232 نانوجرام/ملليلتر، على التوالي14,15.

figure-results-1
الشكل 1: توضيح تخطيطي لسير العمل الخاص بمقايسة الفرز المضاد للفيروسات القائمة على الممانعة. اليوم 0، الخطوة 1: تم استزراع الخلايا القابلة للإصابة في أطباق ميكروية، وتمت مراقبة نمو الخلايا في حامل الجهاز الموجود داخل حضانة عند 37 °C مع 5% CO2 لمدة 24 h تقريباً. اليوم 1، الخطوة 2: تم تحضير الفيروس بتعددية عدوى (MOI) ثابتة وتخفيفات متسلسلة من العوامل المضادة للفيروسات. بالنسبة لمقايسات التعادل بالأجسام المضادة، تم تحضين الفيروس مسبقاً مع الأجسام المضادة عند 37 °C لمدة 1 h قبل إضافة الخليط إلى الخلايا. الخطوة 3: أضيفت خلائط الفيروس والعامل المضاد للفيروسات إلى الخلايا. اليوم 1 وما بعده، الخطوة 4: تمت مراقبة التأثير المرضي الخلوي (CPE) الناجم عن الفيروس باستمرار باستخدام قياسات قائمة على الممانعة على مدار عدة أيام. الخطوة 5: حُللت البيانات في الوقت الفعلي أو بعد اكتمال المقايسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: مراقبة فورية للنشاط المضاد للفيروسات باستخدام قياسات مؤشر الخلية (Cell Index) القائمة على المعاوقة الكهربائية. (A) فحص الأدوية المضادة للفيروسات الذي تم تقييمه بواسطة تحليل المعاوقة. تم اختبار جميع المركبات بتركيز 50 µM، باستثناء ribavirin (تركيز 20 µM) وbrincidofovir (تركيز 1 µM) في وجود adenovirus type 5 بمعدل عدوى (MOI) يبلغ 1. يتم عرض البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD) من ثلاث آبار مكررة. تم اقتباس الشكل من Zhang et al.13. (B) مقايسة تحييد الأجسام المضادة أحادية النسيلة القائمة على المعاوقة الكهربائية. تظهر ملفات مؤشر الخلية (Cell Index) التمثيلية للأجسام المضادة أحادية النسيلة التي لا تظهر أي تحييد (تأثير اعتلال خلوي CPE كامل، باللون الأحمر)، أو تحييد جزئي (تأثير اعتلال خلوي CPE جزئي، باللون البرتقالي)، أو تحييد قوي (لا يوجد تأثير اعتلال خلوي CPE قابل للكشف، باللون الأسود). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: تقدير النشاط المضاد للفيروسات كمياً باستخدام الممانعة. (A) التغيرات الديناميكية لمؤشر الخلايا المُطبع (Normalized Cell Index) في الوقت الفعلي بعد المعالجة بتراكيز متزايدة من brincidofovir بالتزامن مع العدوى بالفيروس الغدي من النوع 5 (adenovirus type 5) بمعدل عدوى (MOI) يبلغ 1. (B) التغيرات الديناميكية لمؤشر الخلايا المُطبع في الوقت الفعلي بعد المعالجة بتراكيز متزايدة من brincidofovir وحده. (C) تم رسم المساحة تحت منحنيات الممانعة كدالة لـ brincidofovir لإنتاج منحنى الاستجابة للجرعة. (A) و(C) مقتبسان من Zhang et al.13. (D) منحنيات تعادل تمثيلية لـ rVSV–LASV Lineage IV (Josiah) للأجسام المضادة أحادية النسيلة r37.2D وr25.1C وr12.1F، مع إدراج rANDV-5 كعنصر تحكم سلبي. تم إنتاج الأجسام المضادة أحادية النسيلة 37.2D و25.1C و12.1F وANDV-5 بطريقة إعادة التركيب بناءً على الدراسات المرجعية المتاحة (انظر قسم النتائج). البيانات المعروضة هي منحنيات تمثيلية من تجربتين مستقلتين، وتم تسجيلها كمتوسط ± SD من ثلاثة آبار مكررة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

مثل جميع المقايسات القائمة على الخلايا، يتطلب مقياس الفحص المضاد للفيروسات بتقنية RTCA تحسيناً لكل نظام من أنظمة "الفيروس-الخلية". وبما أن المقايسة تكتشف التأثير cytopathic CPE الناجم عن الفيروس من خلال تغيرات المعاوقة، فإنها تعتمد على نموذج خلوي ميسر يدعم التكاثر الفيروسي وتطور CPE قابل للقياس. وقد لا تكون الفيروسات التي لا تسبب CPE يمكن اكتشافه عبر المعاوقة مناسبة لهذا النهج؛ وفي مثل هذه الحالات، يمكن استخدام طرق بديلة مثل FRNT عند توفر أجسام مضادة خاصة بالفيروس. ومن الاعتبارات المهمة الأخرى أن التغيرات في مؤشر الخلية Cell Index لا تنتج حصراً عن التحلل الخلوي الناجم عن الفيروس، إذ يمكن أن تؤثر التغيرات في مورفولوجيا الخلايا، والالتصاق، والتكاثر، والارتباط أيضاً على إشارات المعاوقة، مما قد يربك تقييم النشاط المضاد للفيروسات. لذا، يجب تقييم تأثيرات العوامل المضادة للفيروسات على مؤشر الخلية Cell Index في دراسات أولية أو من خلال ضوابط مناسبة للعامل وحده. وفي الدراسة الحالية، ولزيادة عدد العوامل التي يتم تقييمها في كل طبق، تم اختبار ضوابط العامل المضاد للفيروسات وحده قبل مقايسة الفحص لتحديد التأثيرات الأساسية لكل مرشح في غياب العدوى الفيروسية. كما يتأثر أداء المقايسة بعوامل مثل كثافة استزراع الخلايا، وتوقيت تلقيح الفيروس، وظروف الوسط، والتي يمكن أن تؤثر على نمو الخلايا، والتكاثر الفيروسي، وتطور CPE، وقابلية تكرار المقايسة7,10,16. وبناءً على ذلك، يعد التحسين المنهجي ضرورياً لإجراء فحص مضاد للفيروسات قائم على RTCA بشكل قوي وموثوق.

بعد تحديد الظروف المثلى للمقايسة، يتطلب التنفيذ الناجح لمقايسات مضادات الفيروسات في الوقت الفعلي القائمة على الممانعة بذراً متسقاً للخلايا، وخلايا سليمة، وظروف مقايسة مستقرة. غالباً ما يكون التباين العالي بين الآبار ناتجاً عن التوزيع غير المتساوي للخلايا أو عدم الدقة في السحب بالماصة؛ لذا يجب خلط معلقات الخلايا جيداً قبل البذر، وترك الأطباق في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 min بعد البذر لتعزيز استقرار الخلايا بشكل موحد وتقليل تأثيرات الحواف. يوصى بإجراء ثلاث مكررات على الأقل لكل معاملة، مع التشجيع بقوة على إضافة مكررات إضافية لضوابط السلبية (غير المصابة) والإيجابية (الفيروس فقط)، حيث تعمل هذه القيم كنقاط مرجعية لحسابات %CPE و %Neutralization عبر جميع ظروف المعاملة. إذا كان التأثير المرضي الخلوي (CPE) الناجم عن الفيروس ضعيفاً أو غير متسق، فيجب التحقق من جودة المخزون الفيروسي وسلامة الخط الخلوي المتقبل. وللحفاظ على القدرة المعدية للفيروس، تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة عن طريق تحضير حصص فيروسية (aliquots) أحادية الاستخدام لكل تجربة. أخيراً، يوصى بشدة باستخدام بنك خلايا يحتوي على خلايا متقبلة برقم ممر (passage number) متسق لتقليل التباين التجريبي وتحسين إمكانية تكرار المقايسة. إذا انخفض مؤشر الخلايا (Cell Index) المقاس مباشرة قبل العدوى (عادةً بعد حوالي 24 h من البذر) عن المعيار المحدد للخط الخلوي المتقبل، مما يشير إلى عدم كفاية صحة الخلايا أو نموها، يجب إيقاف التجربة. في مثل هذه الحالات، يجب إذابة أمبولة جديدة من الخلايا المحفوظة بالتجميد، وإعادة إجراء مقايسة فحص مضادات الفيروسات.

عندما يتم إجراء اختبار الفحص المضاد للفيروسات تحت ظروف محسنة ومتحكم بها بدقة، كما هو موضح في بيانات الفحص المعروضة هنا، يمكن للاختبار القائم على المقاومة الكهربائية (impedance-based assay) قياس الانخفاض في التأثير المرضي الخلوي (CPE) في الوقت الفعلي وبدقة بواسطة العوامل المضادة للفيروسات. وعلى عكس النهج التقليدية التي تعتمد على قياسات نقطة النهاية كثيفة العمالة، فإن قراءة المقاومة الكهربائية المستمرة وغير الغازية تتيح المراقبة الطولية للطيف الكامل للتلف الخلوي الناجم عن الفيروس والملفات الحركية للاستجابات المضادة للفيروسات. تسهل قدرة القياس في الوقت الفعلي هذه تحديد النوافذ الزمنية المثلى للكشف ليس فقط عن التأثيرات المضادة للفيروسات سريعة المفعول، بل وأيضاً التأثيرات المتأخرة التي قد تغفل عنها اختبارات نقطة النهاية التقليدية.

علاوة على ذلك، يوفر بروتوكول RTCA الموصوف هنا سير عمل أسرع وأكثر بساطة بشكل ملحوظ للفحص المضاد للفيروسات مقارنة بالطرق التقليدية. لا يتطلب المقايسة سوى خطوة أولية لزراعة الخلايا، تليها إضافة الفيروس في وجود أو غياب العوامل المضادة للفيروسات، دون الحاجة إلى أي مناولة إضافية أو معالجة بعد المقايسة. كما يتم تبسيط الإعداد التجريبي وتحليل البيانات بشكل أكبر من خلال وحدة برمجيات Virology المخصصة للنظام، والتي تتيح الحساب الآلي للمعايير المستخدمة عادةً في VRNT، بما في ذلك %CPE و%neutralization، وأعلى تخفيف أو أدنى تركيز لعامل مضاد للفيروسات يحقق مستوى تحييد يحدده المستخدم. وتسمح هذه المزايا مجتمعة بإجراء فحص سريع ومتوازٍ لعدد أكبر بكثير من ظروف المقايسة (مقارنات الأدوية، والتخفيفات الموسعة، وغيرها) مما هو ممكن عادةً باستخدام الطرق التقليدية.

على الرغم من أن المقايسة الموصوفة هنا قد طُوّرت بتنسيق لوح يحتوي على 96 بئرًا، مع ظروف المقايسة المناسبة الموضحة أعلاه، إلا أنه يمكن تكييفها لتناسب تنسيق لوح يحتوي على 384 بئرًا. ولدعم هذه المقايسة القائمة على المعاوقة ذات الإنتاجية الأعلى، يمكن استخدام نظام RTCA مؤتمت قائم على المعاوقة، مما يسمح بالمعالجة المتزامنة لما يصل إلى أربعة ألواح تحتوي كل منها على 384 بئرًا.

علاوة على الفحص المضاد للفيروسات، يمكن تطبيق طريقة RTCA هذه في دراسات العلاج المركب، وعلم المصل، وأبحاث الهروب المناعي الفيروسي. ومن خلال قياس قدرة الأجسام المضادة العلاجية أو الأمصال المناعية على منع التغير الخلوي المرضي (CPE) الناجم عن الفيروس، يوفر هذا المقايسة تقييماً فورياً وبدون استخدام واسمات للنشاط الم neutralising والاستجابات المناعية الواقية بعد الإصابة أو التطعيم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكشف مقارنة ملفات التعادل عبر المتغيرات الفيروسية عن تغيرات في القابلية للإصابة مرتبطة بالهروب المناعي. وعند دمج هذا النهج مع التسلسل الجيني، قد يسهل ذلك تحديد المتغيرات المقاومة للأجسام المضادة ويدعم تطوير الجيل القادم من اللقاحات، والعلاجات بالأجسام المضادة، والاستراتيجيات المضادة للفيروسات.

الإفصاحات

عمل J.E.C. مستشاراً لشركتي Moderna وMerck، وهو مؤسس شركة IDBiologics، ويتلقى إتاوات من UpToDate. كما تلقى مختبر J.E.C. اتفاقيات بحثية ممولة غير مرتبطة بهذا البحث من شركة IDBiologics أثناء فترة إجراء الدراسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل جزئيًا من خلال المنحتين U19 AI181979 وU19AI181930 المقدمتين من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID) التابع للمعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الفيروس الغدي-GFPVector Biolabs 1060
برينسيدوفوفير (CMX001)AdooQA13326
CaviCideMetrex13-5024مُطهر 
سيدوفوفيرSelleck S1516
وسط دلبكو المعدل من وسط إيجل (DMEM)ATCC30-2002
لوح E-Plate 96Agilent5232368001لوحة ذات 96 بئراً مدمجة بالأقطاب الكهربائية الدقيقة
مصل جنين البقرAvantor97068-085
صوديوم غانسيكلوفير Selleck S5065
خلية HEK293AThermo Fisher Scientific  R70507
جهاز Viaflo متعدد القنواتINTEGRAVIAFLO 96
محلول البنسلين-ستريبتومايسينGibco10378016
المحلول المنظم من فوسفات الصوديوم الملحي (1x)HyCloneSH30256.01
الأجسام المضادة أحادية النسيلة المؤشبةمختبر كرو (Crowe Lab)نظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي الذي ترغب في ترجمته إلى اللغة العربية وفقًا للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة.
ريبافيرينSelleck S2504
rVSV-LASV (Lin IV)مختبر كرو (Crowe Lab)لا ينطبق
ستافودين Selleck S1398
تريپسين 0.25%، EDTA بتركيز 0.53 ملي مولار  (1x)ATCC30-2101
خزانات كواشف ذات 12 قناةVistaLab Technologies3054-1011
Vero CCL-81ATCCCCL-81
وحدة علم الفيروساتAgilentS2807-90089
نظام xCELLigence RTCA MPAgilent380601040

المراجع

  1. Pardi N, Weissman D. Development of vaccines and antivirals for combating viral pandemics. Nat Biomed Eng. 2020;4(12):1128-1133.
  2. Rocha VPC, Quadros HC, Fernandes AMS, Gonçalves LP, Badaró R, Soares MBP, et al. An overview of the conventional and novel methods employed for SARS-CoV-2 neutralizing antibody measurement. Viruses. 2023;15(7). doi:10.3390/v15071552.
  3. Chen CZ, Shinn P, Itkin Z, Eastman RT, Bostwick R, Rasmussen L, et al. Drug repurposing screen for compounds inhibiting the cytopathic effect of SARS-CoV-2. Front Pharmacol. 2021;11:592737.
  4. Giaever I, Keese CR. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 1993;366(6455):591-592.
  5. Giaever I, Keese CR. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(17):7896-7900.
  6. Suryadevara N, Shrihari S, Gilchuk P, VanBlargan LA, Binshtein E, Zost SJ, et al. Neutralizing and protective human monoclonal antibodies recognizing the N-terminal domain of the SARS-CoV-2 spike protein. Cell. 2021;184(9):2316-2331.e15.
  7. Charretier C, Saulnier A, Benair L, Armanet C, Bassard I, Daulon S, et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. J Virol Methods. 2018;252:57-64.
  8. Ebersohn K, Coetzee P, Venter EH. An improved method for determining virucidal efficacy of a chemical disinfectant using an electrical impedance assay. J Virol Methods. 2014;199:25-28.
  9. Marlina S, Shu MH, Abubakar S, Zandi K. Development of a real-time cell analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasit Vectors. 2015;8:240.
  10. Teng Z, Kuang X, Wang J, Zhang X. Real-time cell analysis—a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. J Virol Methods. 2013;193(2):364-370.
  11. Suryadevara N, Gilchuk P, Zost SJ, Mittal N, Zhao LL, Crowe JE Jr, et al. Real-time cell analysis: a high-throughput approach for testing SARS-CoV-2 antibody neutralization and escape. STAR Protoc. 2022;3(2):101387.
  12. Zhang J, Abassi YA, Li N, Wang X, Zhang X. A streamlined, label-free real-time 50% tissue culture infectious dose (TCID50) assay using impedance for automated viral titer quantification. J Vis Exp. 2026;(227). doi:10.3791/73686.
  13. Zhang J, Giang C, Li N, Abassi YA, Lamarche BJ. Screening and characterizing antiviral drugs in real time using xCELLigence RTCA eSight's combination of impedance and imaging. Agilent Technologies; 2022.
  14. Engdahl TB, Kuzmina NA, Ronk AJ, Mire CE, Hyde MA, Kose N, et al. Broad and potently neutralizing monoclonal antibodies isolated from human survivors of New World hantavirus infection. Cell Rep. 2021;35(5):109086.
  15. Robinson JE, Hastie KM, Cross RW, Yenni RE, Elliott DH, Rouelle JA, et al. Most neutralizing human monoclonal antibodies target novel epitopes requiring both Lassa virus glycoprotein subunits. Nat Commun. 2016;7:11544.
  16. Piret J, Goyette N, Boivin G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. J Clin Microbiol. 2016;54(8):2120-2127.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.