سير عمل عرض سطح الخميرة المحسن للتطور الموجه للبروتياز

ملخص

يوفر هذا البروتوكول سير عمل محسن للتطور الموجه للبروتيازات الفيروسية في Saccharomyces cerevisiae باستخدام نظام اختيار قائم على العرض السطحي. يوضح تصميم مكتبات إدخال الحمض النووي وتصميم كاسيت الركيزة، والتقسيم الكهربائي المحسن لكفاءة التحويل العالية، واختيار الفرز الخلوي المنشط بالفلورة لتقسيم البروتيزا، وتسلسل المتغيرات المثرية.

الملخص

يحاكي التطور الموجه العملية التطورية الطبيعية في بيئة مختبرية سريعة ومتحكم بها لتطوير بروتينات ذات وظائف أو صفات مرغوبة. يسمح فحص مجموعة كبيرة من الجينات المشفرة للبروتين الطفرة باختيار وظيفي للمتغيرات المطلوبة لتطبيقاتها في التكنولوجيا الحيوية والطب والبيولوجيا التركيبية. باستخدام هذا البروتوكول، نقوم بإجراء تطور موجه في Saccharomyces cerevisiae لهندسة متغيرات بروتياز ذات خصوصية عالية لتسلسل ركيزة غير أصلي. نعرض هذه المتغيرات البروتيزية على سطح خلية الخميرة لتسهيل اختيار المتغيرات المطلوبة عبر فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) عبر عدة جولات من التخصيب. أربعة عناصر رئيسية من شريط الركيزة معبر عنها مع مكتبة البروتياز: بروتين اندماج يتكون من (1) وحدة مستقبلات الالتصاق الخميرة Aga2، (2) اختيار و(3) تسلسلات ركيزة الانتقاء المضاد، (4) تسلسلات علامات الهيتوب، وتسلسل إشارة استرجاع اختياري للشبكة الإندوبلازمية (ER). يتم عزل خلايا الخميرة التي يتم فيها شق تسلسل ركيزة الانتقاء فقط باستخدام FACS متعدد الألوان عبر أجسام مضادة مضادة للحوابيت فلورية (فيكوإيريثرين/فلوريساين-إيزوثيوسيانات) مضادة للحوايات. هنا نقدم تفاصيل البروتوكول المحسن خطوة بخطوة لتنفيذ حملة تطور البروتياز، بما في ذلك تصميم مكتبة إدخالات الحمض النووي وتصميم شريط الركيزة، وتحليل الخلايا الكهربائية لخلايا الخميرة بكفاءة تحويل عالية (حتى 10⁹ محولات لكل ميكروغرام من الحمض النووي)، والاختيار المعتمد على FACS، والإثراء، وتسلسل المتغيرات المتطورة. نعرض بروتوكول التطور الموجه لدينا من خلال تطوير بروتياز التضمين النووي A (TEVp) من التأثير على فيروس توباكو إيتش من تقسيم تسلسل الركيزة الطبيعي الخاص به، ENLYFQ↓S، إلى شق تسلسل جديد، ENLYFE↓S.

المقدمة

تمثل بروتياز السيستين من عائلة Potyviridae، وبشكل خاص بروتيازات التضمين النووي A (NIa)، مصدرا غير مستغل إلى حد كبير للببتيدازات الخاصة بالتسلسل. مع أكثر من 3,800 عضو من العائلة المميزة، تقطع بروتياز NIa تسلسل مميز من سبعة أحماض أمينية مميزة. تقدم عائلة الفيروسات البوتيفيرالية مجموعة متنوعة من البروتيازات لهندسة أنظمة التحكم في البروتينات القابلة للبرمجة، وبناء دوائر جينية قائمة على البروتيازات المتعامدة، وتطوير أدوات بيولوجية متخصصة في^{التسلسلات 1,2}. على الرغم من هذا التنوع الطبيعي، تم تصنيف وهندسة بروتيازين فقط من NIa، وهما TEVp وبروتياز فيروس تنقع عروق التبغ (TVMVp)،....

البروتوكول

تم إجراء جميع التجارب التي تناولت S. cerevisiae المؤتلف وفقا لسياسات وإجراءات لجنة السلامة البيولوجية والسلامة الكيميائية المؤسسية في جامعة تكساس في دالاس. تم التعامل مع سلالات الخميرة المؤتلفة تحت احتواء مستوى السلامة الحيوية 1 (BSL-1) وفقا للممارسات الميكروبيولوجية المؤسسية المعتمدة. تم إجراء عمليات التقشير الكهربائي، والزراعة، وفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) وفقا لإجراءات السلامة البيولوجية المؤسسية المعتمدة. تم تطهير مزرعات الخميرة والمواد الاستهلاكية الملوثة والتخلص منها كنفايات بيولوجية خطرة وفقا للإرشادات المؤسسية.

1. تحضير الناقل والإدخال

1. توليد مكتب....

النتائج

يعد بناء مكتبة فعال أمرا بالغ الأهمية لضمان تغطية كافية للمساحة الطفرية. لتجنب فقدان المتغيرات الوظيفية النادرة، يجب أن يصل عدد المحولات إلى ما لا يقل عن 10× إلى 100× وهو حجم المكتبة النظرية. نظرا لأن كفاءة التحول في S. cerevisiae تتأثر بتركيز الخلايا وتكون الأعلى في الخلايا اللوغاريتمية^{المبكرة والمتوسطة 16}، قمنا بتحسين كثافة الخلايا الأولية قبل التعرض الكهربائي. تم زراعة زراعة الخميرة الفرعية عند قيم OD₆₀₀ الأولية تتراوح بين 1.0–4.0 وحضنتها لم.......

المناقشة

التطور الموجه هو طريقة عالية الإنتاج تستخدم دورات تكرارية من التنويع والاختيار لتحديد البروتينات ذات الوظائف الكيميائية الحيوية المحسنة^{أو الجديدة 17}. في هذا البروتوكول، نستعرض سير عمل محسن لتطوير التعرف على ركيزة البروتيز باستخدام نظام عرض سطح الخلية في S. cerevisiae. يقوم نظام عرض السطح بربط نشاط البروتيازات إلى نمط ظاهري قائم على الفلورة قابل للكشف، مما يمكن من إثراء النسخ المرغوبة باستخدام FACS. نقدم الخطوات التفصيلية لتجميع كاسيت مكتبة البروتيز والركي.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الكواشف
10 ملي مولار مزيج dNTP	NEB	N0447S	تفاعلات PCR (الجدولان 1 و 3)
10X PBS، pH 7.4	Fisher	BP3994	قاعدة سائل التلوين (الخطوات 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction Buffer	NEB	B9027S	يباع بشكل منفصل؛ يأتي أيضًا مع Q5 polymerase
أجار، Bacto	BD Difco	281230-500g	ألواح أجار SDCAA (الجدول 5)؛ 15 جرام/لتر
أجاروز (درجة منخفضة EEO/متعددة الأغراض/درجة الأحياء الجزيئية)	Fisher BioReagents	BP160-500	الرحلان الكهربائي على الهلام
الجسم المضاد المضاد لـ FLAG PE	BioLegend	637309	تلطيخ FACS؛ مضاد PE-conjugated لـ FLAG
الجسم المضاد المضاد لـ HA Tag [FITC]	GenScript	A01621	تلطيخ FACS؛ مضاد FITC-conjugated لـ HA
Bacto Casamino Acids	BD Difco	223120	SDCAA+، SGCAA+، SCAA media (الجدول 5)؛ 5 جرام/لتر
Bacto Peptone / Tryptone	RPI	T60060-10000.0	تحضير وسط LB/SOB؛ 20 جرام/لتر في YPD (الجدول 5)
BSA، البومبن المصل البقري، الكسر الخامس	Sigma-Aldrich	126575-10GM	0.5٪ في PBS؛ سائل التلوين (الخطوات 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 وحدة)	NEB	R0739S	التجميع Golden Gate لكبسولة الركيزة (الجدول 8)
محلول كلوريد الكالسيوم (1 مولار)	Sigma-Aldrich	21115-100mL	مخزن إلكتروبوريشن: 1 ملي مولار النهائي (الجدول 5)
ColiRollers® Plating Beads	Sigma-Aldrich	71013-3	تعقيم عن طريق وضعها في زجاجات الكواشف والتعقيم في جهاز الأوتوكلاف عند 121ºC، 15 psi، لمدة 15 دقيقة.
D-Galactose	Thermo Fisher	A12813.30	250 جرام؛ مخزون 20٪ وزن/حجم لـ SGCAA+ induction (الجدول 5)
D-Sorbitol	Thermo Fisher	1327300.10	مخزن إلكتروبوريشن (1 مولار) ومخزن نمو الخارج (الجدول 5)
Dextrose (D-Glucose)، عديم الماء	Sigma-Aldrich	G8270-1KG	YPD، SDCAA+، مخزون 20٪ وزن/حجم dextrose (الجدول 5)
Difco Yeast Nitrogen Base بدون الأحماض الأمينية	Sigma	Y0626-250G	6.7 جرام/لتر في SDCAA/SGCAA (الجدول 5)
Difco YPD Broth (مختلط مسبقًا)	BD	242820-500g	YPD جاهز مسبقًا؛ 500 جرام
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-1G	سائل التكييف: 10 ملي مولار النهائي؛ قسّم إلى 250 ميكرولتر، احفظ عند -20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification Kit	Omega Bio-tek	D6492-02	تنظيف منتج PCR
E.Z.N.A. Gel Extraction Kit	Omega Bio-tek	D2500-01	تنقيه الهلام بعد PCR والتخمير المحدودي (الخطوات 1.1.8، 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-tek	D6942-02	تنقيه البلازميد (الخطوة 4.2)
جليسيرول (≥99٪)	Fisher	BP229-4	مخزون 50٪ وزن/حجم لـ مخزونات الجليسيرول (الخطوة 4.1.1)
Kanamycin Sulfate	Fisher	BP906-5	SDCAA+ و SGCAA+: 50 ميكروجرام/ملليلتر النهائي؛ يحل محل Sigma K0879-5G
KLD Enzyme Mix	NEB	M0554S	Kinase-Ligase-DpnI؛ التغير الطفري الموجه
KLD Reaction Buffer	NEB	B0554A	يستخدم مع KLD Enzyme Mix
LB Broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	ثقافة E. coli السائلة
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc·2H2O)	Thermo Fisher	A17921.30	سائل التكييف: 0.1 مولار النهائي؛ أضف قبل DTT (الجدول 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)	RPI	L24020-2000.0	زراعة E. coli؛ يحل محل Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino Acids	Sigma	2240-500GM	مصدر بديل لـ Casamino Acids
pDD1523	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI؛ Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
محلول البنسلين-ستربتومايسين، 100X	Corning	30-002-CI	SDCAA+، SGCAA+: 1X النهائي
PstI-HF (5000 وحدة)	NEB	R3140S	تسطيح المتجه (الجدول 10)؛ استخدم الإصدار HF
Q5 HF DNA Polymerase	NEB	M0492S	بوليميراز عالي الدقة؛ بديل لـ Q5 Hot Start
Q5 High GC Enhancer	NEB	B9028A	لتفاعلات PCR عالية المحتوى من GC
Q5 Hot Start DNA Polymerase	NEB	M0491L	تجميع PCR وتضخيمه (الجدولان 1 و 3)
rCutSmart Buffer (10X)	NEB	B6004S	يتم توفيره مع PstI-HF و SphI-HF (الجدول 10)
SalI-HF	NEB	R