سير عمل عرض سطح الخميرة المحسن للتطور الموجه للبروتياز

ملخص

يوفر هذا البروتوكول سير عمل محسن للتطور الموجه للبروتيازات الفيروسية في Saccharomyces cerevisiae باستخدام نظام اختيار قائم على العرض السطحي. يوضح تصميم مكتبات إدخال الحمض النووي وتصميم كاسيت الركيزة، والتقسيم الكهربائي المحسن لكفاءة التحويل العالية، واختيار الفرز الخلوي المنشط بالفلورة لتقسيم البروتيزا، وتسلسل المتغيرات المثرية.

الملخص

يحاكي التطور الموجه العملية التطورية الطبيعية في بيئة مختبرية سريعة ومتحكم بها لتطوير بروتينات ذات وظائف أو صفات مرغوبة. يسمح فحص مجموعة كبيرة من الجينات المشفرة للبروتين الطفرة باختيار وظيفي للمتغيرات المطلوبة لتطبيقاتها في التكنولوجيا الحيوية والطب والبيولوجيا التركيبية. باستخدام هذا البروتوكول، نقوم بإجراء تطور موجه في Saccharomyces cerevisiae لهندسة متغيرات بروتياز ذات خصوصية عالية لتسلسل ركيزة غير أصلي. نعرض هذه المتغيرات البروتيزية على سطح خلية الخميرة لتسهيل اختيار المتغيرات المطلوبة عبر فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) عبر عدة جولات من التخصيب. أربعة عناصر رئيسية من شريط الركيزة معبر عنها مع مكتبة البروتياز: بروتين اندماج يتكون من (1) وحدة مستقبلات الالتصاق الخميرة Aga2، (2) اختيار و(3) تسلسلات ركيزة الانتقاء المضاد، (4) تسلسلات علامات الهيتوب، وتسلسل إشارة استرجاع اختياري للشبكة الإندوبلازمية (ER). يتم عزل خلايا الخميرة التي يتم فيها شق تسلسل ركيزة الانتقاء فقط باستخدام FACS متعدد الألوان عبر أجسام مضادة مضادة للحوابيت فلورية (فيكوإيريثرين/فلوريساين-إيزوثيوسيانات) مضادة للحوايات. هنا نقدم تفاصيل البروتوكول المحسن خطوة بخطوة لتنفيذ حملة تطور البروتياز، بما في ذلك تصميم مكتبة إدخالات الحمض النووي وتصميم شريط الركيزة، وتحليل الخلايا الكهربائية لخلايا الخميرة بكفاءة تحويل عالية (حتى 10⁹ محولات لكل ميكروغرام من الحمض النووي)، والاختيار المعتمد على FACS، والإثراء، وتسلسل المتغيرات المتطورة. نعرض بروتوكول التطور الموجه لدينا من خلال تطوير بروتياز التضمين النووي A (TEVp) من التأثير على فيروس توباكو إيتش من تقسيم تسلسل الركيزة الطبيعي الخاص به، ENLYFQ↓S، إلى شق تسلسل جديد، ENLYFE↓S.

المقدمة

تمثل بروتياز السيستين من عائلة Potyviridae، وبشكل خاص بروتيازات التضمين النووي A (NIa)، مصدرا غير مستغل إلى حد كبير للببتيدازات الخاصة بالتسلسل. مع أكثر من 3,800 عضو من العائلة المميزة، تقطع بروتياز NIa تسلسل مميز من سبعة أحماض أمينية مميزة. تقدم عائلة الفيروسات البوتيفيرالية مجموعة متنوعة من البروتيازات لهندسة أنظمة التحكم في البروتينات القابلة للبرمجة، وبناء دوائر جينية قائمة على البروتيازات المتعامدة، وتطوير أدوات بيولوجية متخصصة في^{التسلسلات 1,2}. على الرغم من هذا التنوع الطبيعي، تم تصنيف وهندسة بروتيازين فقط من NIa، وهما TEVp وبروتياز فيروس تنقع عروق التبغ (TVMVp)، بشكل شامل للاستخدام الواسع في المختبرات والتقنيات الحيوية ^3,4. تحد هذه المجموعة المحدودة من أدوات البروتيز من مساحة التصميم للدوائر متعددة المكونات التي^{تتطلب أنشطة} بروتياز متعامدة، مما يحفز الجهود لتوسيع وتوصيف بروتياز NIa من خلال التطور الموجه ^6,7.

برزت شاشة سطح الخميرة كواحدة من أقوى المنصات للتطور الموجه، حيث تتيح فحص مكتبة البروتينات عالية الإنتاجية عبر فرز الخلايا المنشطة بالفلورية (FACS^)6,7. على سبيل المثال، يربط نظام فحص احتجاز الشبكة الداخلية للخميرة (YESS) نشاط البروتيازات بعرض السطح عبر مسار الإفرازات في S. cerevisiae ^6,7. تم تطبيق نظام YESS على هندسة خصائص جديدة للبروتياز-ركيزة وأثبت فائدة في حملات التطور الموجه متعددة الجولات. في هذا النظام، يتم التعبير عن متغيرات البروتيازات مع بروتين اندماج يحتوي على شريط ركيزة انفصام مع علامات الاقتباس، ويتم التعبير عن مرساة سطح Aga1p في سلالة الخميرة EBY100. التمييز التفريقي باستخدام الأجسام المضادة الفلورية يميز الكاسيت المقطوعة عن أشرطة الركيزة غير المشقوقة المعروضة على سطح الخلية. آلية العرض المعتمدة على النشاط هذه متوافقة مباشرة مع الاختيار التكراري القائم على FACS لمكتبات من 10 أو⁷ أو أكثر^{من النسخ 6,7}.

شرط أساسي للتطور الموجه هو القدرة على إدخال مكتبات متغيرة على نطاق كاف لتحقيق تغطية كافية لمساحة التسلسل المستهدفة. بالنسبة لمكتبات الطفرات المشبعة في الموقع التي تمتد عبر عدة مواقع للأحماض الأمينية، هناك حاجة إلى عوائد تحويل تتراوح بين 10⁸ إلى^{10 9} محولات فريدة لضمان تمثيل التنوع المدخل في المكتبة بشكل جيد في المجموعة المختلطة. توجد عدة طرق لإدخال الحمض النووي الخارجي إلى S. cerevisiae، ولكل منها حدود إنتاج مميزة. تستخدم طريقة التحويل الكيميائي التقليدية حمض نووي أحادي السلسلة من أسيتات الليثيوم/البولي إيثيلين جليكول (LiAc/ssDNA/PEG) بسبب بساطتها وسهولة الوصول إليها. ومع ذلك، عادة ما تحقق كفاءات تحويل تبلغ فقط 10^{وحدات تشكيل مستعمرات} (CFU) 4–10 6 وحدات تكوين مستعمرات (CFU) لكل ميكروغرام من الحمض النووي، وهو أقل من التنوع التسلسلي المطلوب لحملات المكتبات الكبيرة⁸. وعلى النقيض من ذلك، تطبق طريقة الحفر الكهربائية مجالا كهربائيا عالي الجهد لاختراق غشية الخلية بشكل مؤقت وتسهيل امتصاص الحمض النووي. يحقق التقسيم الكهربائي باستمرار أعلى كفاءة التحويل بين طرق التحويل المتاحة، مع بروتوكولات محسنة تبلغ عوائد 10⁸–10⁹ CFU⁹. لوحظ أن كفاءة التقميم الكهربائي في S. cerevisiae حساسة للغاية لمرحلة نمو الخلية، وكتلة الحمض النووي، وتركيب المخزن الخلوي، مما يوفر إطارا تم تكييفه لاحقا على نطاق واسع للتطور الموجه على نطاق المكتبات⁹.

يستخدم البروتوكول الموضح هنا سلالة S. cerevisiae EBY100، وهي سلالة مضيفة معتمدة على نطاق واسع لعرض سطح الخميرة. تم هندسة EBY100 بواسطة بودير وويتروب من خلال دمج شريط تعبير AGA1 تحت سيطرة محفز GAL1 المحفز للجالاكتوز في موقع AGA1 الكروموسومي للسلالة الأم BJ5465¹⁰ التي تفتقر إلى البروتياز. السلالة متوفرة تجاريا من ATCC (رقم الكتالوج) MYA-4941؛ المودع K.D. Wittrup)، حاملا النمط الجيني MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−). نتيجة لذلك، يتم التعبير عن كل من Aga1p واندماج الكاسيت التابع ل Aga2p من نفس المحفز المحفز للجالاكتوز، مما يضمن أن الوحدتين الفرعيتين تتجمع معا وتتجمعهما في مركب Aga1p–Aga2p المرتبط بثنائي الكبريتيد الذي يربط الاندماج المعروض بجدار الخلية.

على الرغم من الاستخدام الواسع ل EBY100 في تطبيقات عرض الخميرة، لم يتم تحسين أي بروتوكول منشور بشكل منهجي لتحليل هذه السلالة بمستويات مكتبية. تظل معايير EBY100 المحددة، مثل مرحلة النمو المثلى عند الحصاد، وتركيب الوسط أثناء الزراعة الفرعية، والعلاقة الكمية بين الكثافة البصرية الأولية عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) وكفاءة التحول، يجب توصيفه وتحسينها بدقة. هنا، نبلغ أن كفاءة التحول في EBY100 تزداد بشكل أحادي مع كمية OD₆₀₀ في الزراعة عند الحصاد، حيث تنتج الخلايا في مرحلة اللوغاريتيوم المتأخرة معدلات تحول أعلى بكثير من تلك التي تم حصادها في مرحلة السجل المبكر. قمنا بتقييم معايير البروتوكول الحرجة، بما في ذلك قيم OD₆₀₀ الأولية عند التطعيم، واستخدام وسطين من ببتون ديكستروز مستخلص الخميرة (YPD) × للزراعة الفرعية، وتركيبات مخزن التقشير الكهربائي، وظروف النمو بعد التغذية الكهربائية. يوفر البروتوكول المعروض هنا سير عمل محسن خطوة بخطوة (الشكل 1A–C، الشكل 2، الشكل 3A–D، الشكل 4A–E) لتحضير خلايا EBY100 الكفؤة الكهربائية وأداء الحفر الكهربائية عالية الكفاءة في مكتبة DNA، مما ينتج معدلات تحويل باستمرار فوق 10⁹ CFU. للتحقق من صحة هذا البروتوكول، أجرينا حملة تطور موجهة شاملة لهندسة TEVp مع تعديل خصوصية الانقسام عبر أربع جولات من الاختيار والإثراء المعتمد على FACS. أكد تسلسل متغيرات البروتيز المغنية تنويعا كبيرا في البقايا المستهدفة داخل جيب ارتباط الركيزة للبروتياز، مما يدل على أن البروتوكول يوفر تغطية مكتبية كافية لمساحة التسلسل لدعم حملات التطور المثمرة. سيكون هذا البروتوكول ذا فائدة واسعة للباحثين الذين يستخدمون EBY100 للتطور الموجه المعتمد على عرض سطح الخميرة والفحص عالي الإنتاجية المتوافق مع FACS للبروتيازات والأجسام المضادة⁹ والكيناز¹¹ والمستقبلات¹²، إلى جانب بروتينات أخرى.

البروتوكول

تم إجراء جميع التجارب التي تناولت S. cerevisiae المؤتلف وفقا لسياسات وإجراءات لجنة السلامة البيولوجية والسلامة الكيميائية المؤسسية في جامعة تكساس في دالاس. تم التعامل مع سلالات الخميرة المؤتلفة تحت احتواء مستوى السلامة الحيوية 1 (BSL-1) وفقا للممارسات الميكروبيولوجية المؤسسية المعتمدة. تم إجراء عمليات التقشير الكهربائي، والزراعة، وفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) وفقا لإجراءات السلامة البيولوجية المؤسسية المعتمدة. تم تطهير مزرعات الخميرة والمواد الاستهلاكية الملوثة والتخلص منها كنفايات بيولوجية خطرة وفقا للإرشادات المؤسسية.

1. تحضير الناقل والإدخال

1. توليد مكتبات بروتياز الفيروسي الزهري عبر الطفرات التشبعية بالموقع
   1. التصميم باستخدام برامج تصميم تسلسل تتداخل مع أوليجوننيوكليوتيدات من 30 إلى 50 مير، أمامي وعكسي لتوليد مكتبة طفرة من البروتيازات. استبدل الكودون من النوع البري في الأوليجونكليوتيد المقابل بكودون متدهور NNS، حيث يمثل N A أو T أو G أو C، وS يمثل G أو C، للمواقع المستهدفة للطفرة.
   2. صمم التداخل بمقدار 3′ بين كل زوج أوليجونكليوتيد أمامي وخلفي بدرجة انصهار (Tm) تتراوح بين 55–60 °م. صمم أول وآخر أوليجونوكليوتيدات لتحتوي على تداخل 50 نيوكليوتيدات مع متجه عرض سطح الخميرة خارج مواقع التقييد.
   3. تأكد من أن أحد طرفي الإدخال على الأقل يتداخل تماما مع أحد طرفي المتجه الخطي لتسهيل إعادة التركيب المتماثلة¹³. تجنب الفجوات بين الأوليجونكليوتيدات المجاورة¹⁴.
   4. أعد تعليق الأوليغوس إلى 100 ميكرومولار مع_H2O منزوع الأيون. في أنبوب معقم بسعة 1.5 مل، اجمع 0.5 ميكرولتر من كل أوليغو إلى حجم نهائي 200 ميكرولتر (تركيز نهائي 250 نانومتر لكل أوليغو).
   5. قم بإعداد تفاعل PCR باستخدام المكونات المدرجة في الجدول 1 لتجميع مكتبة البروتياز، باستخدام ظروف الدورة الحرارية في الجدول 2.
   6. قم بإعداد تفاعل PCR ثان باستخدام الأوليغوس الأمامية والعكسية الخارجية (الجدول 3) باستخدام أول منتج PCR المجمع كقالب. تضخيم المنتج كما هو موضح في الجدول 4.
   7. شغل المنتج الثاني PCR على جل أجاروز بنسبة 1٪ مع بروميد إيثيديوم (0.5 ميكروغرام/مل) بجهد 240 فولت لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة الشريط المقابل لطول الحمض النووي المتوقع.
      ملاحظة: تحذير: بروميد الإيثيديوم هو مادة متوفرة ويجب التعامل معه باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك معطف المختبر، وقفازات النيتريل ونظارات السلامة. تجنب ملامسة الجلد والاستنشاق. التخلص من الجل والمواد المخازلة والمواد الاستهلاكية التي تحتوي على بروميد الإيثيديوم كنفايات كيميائية خطرة وفقا لإرشادات السلامة المؤسسية.
   8. قم بتنقية باستخدام مجموعة استخراج هلامية. يتم الخروج في 50 ميكرولتر من_H2O.
   9. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس طياف فوتوميتر. خزن الحمض النووي عند −20 درجة مئوية.
      ملاحظة: كل تفاعل بحجم 50 ميكرولتر^{من التفاعل} الثاني سيعطي حوالي 0.5–1.0 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي. نظرا لأن كل عملية اقتراب كهربائية تتطلب 12 ميكروغرام من مكتبة البروتيازات (أي الإدراج)، قم بتوسيع التفاعلات وفقا لذلك.
2. مجموعة كاسيت الركيزة
   1. جهز ألواح LB-agar ووسائط LB-كلورامفينيكول. انظر الوصفات في الجدول 5.
   2. تصميم مجموعة من أوليغونوكليوتيدات 30 مير المتداخلة في الاتجاهين الأمامي والعكسي لتجميع كاسيت الركيزة. صمم نهايات 5′ لكل أوليغونيوكليوتيد عكسي وأوليغونيوكليوتيد أمامي للجزء التالي لتطابق بمقدار 4 نيوكليوتيدات.
   3. إعادة تعليق الأوليغو المحمية إلى 100 ميكرومولار باستخدام_H2O منزوع الأيون.
   4. خلط المواد الكيميائية كما في الجدول 6.
   5. استخدم برنامج الدراجات في الجدول 7 لتلدين وفسفورة خليط الأوليغو.
   6. تتحول أوليغوس الملونة المخففة إلى أربعة أطعاف في_H2O منزوع الأيونات لتصل إلى تركيز نهائي يبلغ 1.25 ميكرومول.
   7. اجمع خليط الأوليغو الملدين مع المتجه (مثلا، pDD1523)، وفقا للجدول 8.
   8. قم بتجميع البوابة الذهبية، وفقا لبرنامج ركوب الدراجات في الجدول 9.
      ملاحظة: على سبيل المثال، يحتوي بلازميد pDD1523 على موقع تقييد من النوع الثاني (BsmBI) أسفل محفز GAL1/10. يسمح التجميع الناجح بتحريض الكاسيت الركيزي^من الجالاكتوز.
   9. حول البلازميد الناتج إلى الإشريكية القولونية.
   10. خلايا الصفائح على LB Agar مع المضاد الحيوي المقابل. الحضانة لمدة 16–18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
   11. اختر مستعمرات معزولة وتلقيحها ب 5 مل من وسط LB. الحضانة طوال الليل (16–18 ساعة) عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز (220 دورة في الدقيقة).
   12. استخرج البلازميدات من الزراعة الليلية باستخدام مجموعة تحضير البلازميد.
   13. قس تركيز البلازميدات باستخدام مقياس طيفي، ثم أرسل للتسلسل.
3. خطية متجه عرض الخميرة
   1. خطي بلازميد عرض الخميرة، مثل هضم pDD1524 مع إنزيمات تقييد SphI و PstI لتحضير ناقل عرض الخميرة الذي يحتوي على شريط الركيزة للتقميم الكهربائي. اخلط المواد المذكورة في الجدول 10 وحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
   2. شغل منتج الهضم التقييدي على جل أغاروز بنسبة 1٪ بجهد 240 فولت لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة الشريط المطابق لطول الحمض النووي المتوقع وتنقيته باستخدام مجموعة استخراج الجل.
      ملاحظة: كل 50 ميكرولتر من هضم التقييد ستنتج حوالي 0.5–1.0 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي. نظرا لأن كل مسام كهربائية تتطلب 4 ميكروغرام من المتجه الخطي، قم بتوسيع تفاعلات الهضم وفقا لذلك.

2. التقميم الكهربائي

ملاحظة: اتبع إجراءات السلامة المؤسسية للتعامل مع المواد البيولوجية والكواشف، وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة، والتخلص من النفايات البيولوجية والكيميائية وفقا للإرشادات المؤسسية.

1. تحضير المخازن، الصفائح، والوسائط (قبل يومين من التثقيف الكهربائي)
   1. إعداد وسائل الإعلام النامية (1 × YPD؛ 2 × YPD؛ أحماض الكازامينو الديكستروز الصناعية، SDCAA+؛ وأحماض الكازامينو الصناعية من الجالاكتوز SGCAA+)، والأطباق (YPD وSDCAA)، ومخزن التعرض الكهربائي، والماء المعقم وفقا للوصفات في الجدول 5. تخزين عند 4 درجات مئوية.
2. تحضير صفيحة مخططة من EBY100.
   1. انثر خميرة EBY100 على أجار YPD من مخزون جليسرول. انمو عند 30 درجة مئوية لمدة يومين.
   2. تخزين الطبق عند 4 درجات مئوية بعد النمو.
      ملاحظة: يبقى الطبق المخطط صالحا للاستخدام لمدة تصل إلى شهر واحد؛ حدد تاريخ السلسلة على اللوحة.
3. تحضير الزراعة المسبق EBY100 (قبل يوم واحد من التسامح الكهربائي)
   1. جهز 125 مل من 1 × YPD في قارورة إرلنماير بسعة 500 مل.
   2. جهز 25 مل من 1 × YPD في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل. باستخدام رأس ميكروبايبت، اجمع خلايا EBY100 من الصفيحة الناتجة لمدة يومين. ثم انقل خلايا الخميرة من طرف الماصة إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على 1 × YPD.
      ملاحظة: يجب أن يشكل خط الخلايا مسحة بطول حوالي 1–2 مم.
   3. أزل طرف الماصة الدقيقة وقم بتدوير الأنبوب المخروطي لضمان الخلط الكافي.
   4. جهز مزرعة مسبقة بحجم 150 مل عن طريق نقل 25 مل من 1 × YPD تحتوي على خلايا الخميرة إلى قارورة 500 مل تحتوي على 125 مل من 1 × YPD. احركه لمزج الدور.
   5. باستخدام مقياس الطيف الضوئي، قم بقياس OD₆₀₀ بتحضير ميكروكوفيتين بطول مسار 1 سم: واحد يحتوي على 1 مل من 1 × YPD كضابط فارغ، وآخر يحتوي على 1 مل من الزراعة المسبقة
   6. ازرع 150 مل من الزراعة المسبقة خلال الليل (16–20 ساعة) عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز مداري عند 270 دورة في الدقيقة.
4. تحضير الزراعة الفرعية عند الكمية البالغة الجرعة المطلوبة₆₀₀ (في يوم الحفر الكهربائي)
   1. جهز المخزن التكييف ووسط النمو، كما هو موضح في الجدول 5.
   2. قس كمية الجرعة_{الزائدة 600} للزراعة السابقة الليلية (المعدل المتوقع للجرعة الخضراء هو 17–22). لكي تكون ضمن النطاق الخطي للمقياس الطيفي، قس تخفيفا بنسبة 1:20 للزراعة المسبقة.
   3. احسب حجم الزراعة المسبقة المطلوبة لتطعيم زراعة فرعية بحجم 100 مل. يوصى بزراعة فرعية أولية بمقدار_{OD 600} بمعدل 3.0–4.0.
   4. قم بتخفيف الزراعة إلى الكمية الأولية المطلوبة_{OD 600} في 100 مل من 2 × YPD في قارورة Erlenmeyer بسعة 500 مل.
   5. حضانة الزراعة الفرعية بسعة 100 مل عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز المدار عند 270 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعات.
5. تحضير الأوساط خلال فترة الحضانة التي تستمر 4 ساعات
   1. حافظ على مخزن التقشير الكهربائي البارد جدا والماء المعقم جاهزا (من الخطوة 2.1.1).
   2. حضر محلول التكييف (100 مل)، وفقا للوصفة في الجدول 5. استخدم 20 مل من مخزن التكييف لكل تحويل؛ قم بالتوسع وفقا لذلك. يخزن في درجة حرارة الغرفة (20–23 درجة مئوية).
      ملاحظة: تحذير: يحتوي محلول التكييف على ديثيوثرايتول (DTT) وأسيتات الليثيوم (LiAc)، وهما مهيجان كيميائيان قد يسببان تهيج الجلد والعين. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك معطف مختبر وقفازات نيتريل ونظارات أمان، وتعامل مع هذه المواد وفقا لإجراءات السلامة الكيميائية المؤسسية. التخلص من المحاليل غير المستخدمة والمخازن المستهلكة كنفايات كيميائية وفقا للإرشادات المؤسسية.
   3. تحضير وسائط النمو (50 مل): اخلط 25 مل من 2 × ينادي يوميا و25 مل من 1 متر سوربيتول معا. استخدم 8 مل من وسائط النمو الخارجي لكل تحويل. يخزن في درجة حرارة الغرفة (20–23 درجة مئوية).
6. تحضير خلايا الخميرة الكهربائية بعد حضانة لمدة 4 ساعات.
   1. قسم زراعة فرعية بحجم 100 مل إلى أنبوبين مخروطيين بسعة 50 مل. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية و1,500 × جرام لمدة 3 دقائق، ثم قم بتفريغ الوسط. احتفظ بالخلايا على التجميد حتى اكتمال الخطوة 2.6.4.
   2. أعد تعليق كل حبيبة خلوية بلطف بسعة 25 مل من الماء البارد المعقم جدا. قم بالطرد المركزي عند 4 درجات مئوية و1500 × جرام لمدة 3 دقائق، ثم قم بتفريغ الوسط.
   3. كرر الخطوة 2.6.2.
   4. أعد تعليق كل حبيبة خلية بلطف باستخدام 25 مل من مخزن التقميم الكهربائي البارد جدا. الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية و1500 × جرام لمدة 3 دقائق، ثم قم بفرغ الوسط.
   5. قم بإزالة الخلايا من الجليد وأعد تعليق كل حبيبة خلية بلطف باستخدام 10 مل من محلول التكييف بدرجة حرارة الغرفة (20–23 درجة مئوية). ثم تجمع في قارورة إيرلنماير واحدة بسعة 125 مل وتحتضن عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز مداري بسرعة 270 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
   6. اسكب الخلايا في أنبوب بسعة 50 مل. الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية و1500 × جرام لمدة 3 دقائق. تخلص من الإعلام.
   7. أعد تعليق حبيبة الخلية بلطف باستخدام 50 مل من مخزن الكهروبية البارد جدا. الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية و1,500 × جرام لمدة 3 دقائق، ثم تفريغ الوسط.
   8. أعد تعليق حبيبة الخلية إلى حجم نهائي يبلغ 1 مل عن طريق إضافة حوالي 100–200 ميكرولتر من مخزن الحفر الكهربائي. احتفظ بالخلايا على الثلج حتى التعرض الكهربائي.
      ملاحظة: يمكن تجميد الخلايا الكهربائية (أي وضعها في فريزر بدرجة حرارة –80 درجة مئوية) واستخدامها لاحقا دون فقدان كبير في كفاءة التقميم الكهربائي.
7. التثقيف الكهربائي، النمو، والطلاء
   1. كوفيت الحفر الكهربائية قبل التبريد بحجم فجوة 0.2 سم على الجليد.
   2. نقل 380 ميكرولتر من الحبيبة المعلقة إلى أنبوب معقم بسعة 1.5 مل. اخلط مع 4 ميكروغرام من حمض البلازميد النووي أو مع 4 ميكروغرام من ناقل البلازميد الخطي و12 ميكروغرام من الإدخال. اخلط بلطف عن طريق التوصيل بالماصة.
      ملاحظة: لتعظيم عدد الخلايا الكهربائية، يجب أن تكون تركيزات الحمض النووي في الناقل والإدخال من 700 إلى 800 نانوغرام/ميكرولتر. إذا كانت التركيزات أقل من ذلك، استخدم مكثف فراغ.
   3. نقل التعليق إلى الكوفيت المبردة مسبقا في الكهرباء المبردة. أبق على الثلاجة لمدة 5 دقائق.
   4. امسح جوانب الكوفيت بعد 5 دقائق بمسح مخبري خال من الوبر للتخلص من الرطوبة المتبقية، والتي قد تؤدي إلى القوس أثناء الحفر الكهربائي. تجنب أي فقاعات أو خلايا فوق الصفائح المعدنية في الكوفيت، لأنها قد تؤدي أيضا إلى القوس. للحفاظ على درجة حرارة الكوفيت الباردة، لا تلمس أقطاب اللوحة.
   5. جهز 8 مل من وسط النمو في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل.
   6. قم بتوصيل الخلايا بالإعدادات التالية: جهد 2.5 كيلوفولت، سعة 25 ميكروفاراتى، ومقاومة 200 Ω⁹. النطاق الثابت الزمني المقبول هو 2.8–4.5 مللي ثانية.
      ملاحظة: تحذير: يتضمن التربية الكهربائية نبضات كهربائية عالية الجهد. تأكد من أن الكوفيتات موضوعة بشكل صحيح واتبع تعليمات التشغيل من الشركة المصنعة. تخلص من الفوات الكهربائية المستخدمة كنفايات خطرة بيولوجيا وفقا للإرشادات المؤسسية.
   7. أغمر الكوفيت فورا بحوالي 200 ميكرولتر من وسط النمو من الأنبوب المخروطي وانقل الخلايا الكهربائية إلى أنبوب مخروطي بحجم 50 مل. أضف 200–350 ميكرولتر من وسط النمو حتى لا يبقى سائل مرئي في الكوفيت.
   8. حضن أنبوب مخروطي بحجم 50 مل من الخلايا الكهربائية في 8 مل من وسط نمو عند 30 درجة مئوية دون هز لمدة ساعة. اقلب الأنبوب كل 15 دقيقة ليتم خلطه.
   9. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 1,500 × جرام، 25 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. ثم تفريغ الإعلام.
   10. أعد تعليق الخلايا في وسط تساقط الخميرة المناسبة للحفاظ على الانتقائية للخلايا المتحولة. بالنسبة للبلازميدات التي تحتوي على علامة اختيار TRP1، يتم إعادة تعليق الخلايا في 250 مل من SDCAA+ (التي تفتقر إلى التريبتوفان) لاستعادة الخميرة التي احتفظت بالبلازميد.
   11. حضانا طوال الليل (16–20 ساعة) عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز مداري عند 270 دورة في الدقيقة.

3. الحث، التلوين، والفرز الخلوي بالتدفق لخلايا الخميرة

1. إدخال مكتبة البروتيازات وشريط الركيزة (قبل يوم واحد من الفرز)
   1. قم بقياس OD₆₀₀ كما في الخطوة 2.4.2 بعد نمو المحولات بين الليل في وسائط التوقف عن الاستخدام.
   2. أليكوت 12 مل من محولات الخميرة وجهاز الطرد المركزي عند 3,200 × جرام لمدة 5 دقائق.
   3. قم بإزالة المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبات الخلوية في وسط الحث SGCAA+ إلى OD₆₀₀ بقيمة 0.5. احسب حجم إعادة التعليق المطلوب باستخدام معادلة التخفيف، C_{1V 1} = C₂V₂.
   4. انتقل إلى قارورة إيرلينماير بسعة 125 مل وننمو طوال الليل لمدة 18–24 ساعة عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز مداري عند 270 دورة في الدقيقة.
2. صبغة الأجسام المضادة الفلورية (في يوم الفرز)
   1. قس جرعة زائدة₆₀₀ للخلايا بعد التحفيز. استخدم كوفيتين: أحدهما يحتوي على 1 مل من SGCAA+، والآخر يحتوي على 950 ميكرولتر من SGCAA+ ممزوج مع 50 ميكرولتر من الخلايا. اضرب قيمة OD₆₀₀ المقاسة في 20 للحصول على OD₆₀₀ الحقيقي لخلايا ما بعد الحث.
   2. قم بتطبيع كل عينة إلى 3 × 10^{إلى 7} خلايا لتلوين الأجسام المضادة وفرز FACS. استخدم C₁V₁ = C₂V₂ لحساب حجم الخلايا التي سيتم نقلها من قارورة الحث.
      ملاحظة: بالنسبة لطفرات التشبع NNS ذات المواقع الأربعة، حجم المكتبة النظرية هو 10^{إلى 6} متغيرات مختلفة. للحصول على عينات كافية من المكتبة، قم بفحص حجم المكتبة بمقدار 10 أضعاف حجم المكتبة على الأقل، أو 10^{أو 7} خلايا. مثال: إذا كان المطلوب C₁V₁ = 3 × 10⁷ خلايا وC₂ = OD بعد الحث₆₀₀ من 6 (أي 6 ×^{10 7} خلايا/مل)، فإذا أضيف 500 ميكرولتر من الخلايا المستحثة (أي V₂ = 3 × 10⁷ خلايا / 6 × 10⁷ خلايا/مل = 500 ميكرولتر).
   3. نقل حجم الخلايا المحسوب إلى أنبوب 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 5000 × جرام لمدة 5 دقائق.
   4. قم بإزالة الفائق الفائق وأعد تعليقه في 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) + 0.5٪ ألبومين مصل البقري (BSA).
   5. الطرد المركزي عند 5000 × جرام لمدة 5 دقائق وكرر الخطوة 3.2.4.
   6. استخدم الطرد المركزي عند 5,000 × جرام لمدة 5 دقائق، وفي هذه الأثناء، أكمل الخطوة 3.2.7.
   7. حضر خليط صبغة الأجسام المضادة في أنبوب بحجم 1.5 مل يحتوي على مضاد HA فلوريسين إيزوثيوسيانات (FITC) (0.5 ميكروغرام/10⁷ خلايا)، ومضاد FLAG فيكوإيريثرين (PE) (0.05 ميكروغرام/10⁷ خلايا)، وPBS + 0.5٪ BSA (100 ميكرولتر/10⁷ خلايا). أبق الأنبوب على الثلج.
   8. أزل المادة الفائقة وأعد تعليقها مع خليط البقع. استخدم 300 ميكرولتر من خليط الصبغة لكل 3 × 10⁷ خلايا. لا تدور في الأنبوب؛ فقط الانقلاب أو الضرب.
   9. احتفظ بالخلايا على التجميد في الظلام لمدة ساعة بعد إعادة التعليق.
3. غسل ما بعد التلوين
   1. قام جهاز الطرد المركزي بصبغ الخلايا بحرارة 5,000 × جرام لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في PBS التي تحتوي على 0.5٪ BSA باستخدام 0.5 مل لكل 1 × 10⁷ خلايا (مثلا، 500 ميكرولتر ل 1 × 10⁷ خلايا أو 1.5 مل ل3 × 10⁷ خلايا).
   2. الطرد المركزي عند 5,000 × جرام، 5 دقائق. أزل السوبرناتانت، وأعد تعليقه في 750 ميكرولتر من PBS + 0.5٪ BSA.
   3. نقل 750 ميكرولتر أخرى من PBS + 0.5٪ BSA إلى أنبوب تجميع بسعة 10 مل.
4. FACS
   1. قم بتشغيل وتحضير جهاز قياس الخلية لتجربة جديدة.
   2. أنشئ ثلاث مخططات نقطية. في أول مخطط نقطي، اختر اسم المحور X لعرض قناة منطقة التشتت الأمامية (FSC-A) واسم المحور Y لعرض قناة منطقة التشتت الجانبية (SSC-A).
      ملاحظة: سيسهل ذلك اختيار الخلايا الحية.
   3. احتفظ باسم المحور X لعرض قناة FSC-A مع تغيير قناة محور Y لعرض ارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H) على مخطط النقطة الثاني.
      ملاحظة: هذا سيسهل اختيار السينغلتس.
   4. اختر اسم المحور X لعرض قناة PE واسم المحور Y لعرض قناة FITC على المخطط النقطي الثالث.
   5. شغل التحكم السلبي على جهاز قياس الخلايا باستخدام قنوات 530/30 نانومتر (FITC) و585/42 نانومتر (PE). قم بالفرز باستخدام فوهة 70 ميكرومتر عند ضغط غمد 70 psi. جمع عينات بسرعة تتراوح بين 4000–5000 حدث/ثانية.
   6. ارسم بوابة متعددة الأضلاع حول المجموعة الرئيسية من خلايا الخميرة السليمة لاستبعاد الحطام والجسيمات الصغيرة ذات إشارات منخفضة ل FSC-A و SSC-A على أول مخطط نقطي (FSC-A مقابل SSC-A).
   7. الشرائح المنفردة للبوابة على مخطط FSC-H مقابل FSC-A داخل هذه البوابة، من خلال اختيار السكان الخطيين الذين يظهرون علاقة نسبية بين FSC-H و FSC-A. استبعد الأحداث التي تنحرف عن التوزيع الخطي وتتوافق مع الدوبلتات وتجميعات الخلايا.
      ملاحظة: المخطط النقطي الثالث ل PE مقابل FITC سيعرض مجموعة قطرية من النقاط للتحكم السلبي (أي خلايا الخميرة التي تعبر عن شريط الركيزة السليم).
   8. قم بتشغيل عينات وفرز خلايا الخميرة بناء على قيم PE/FITC المطلوبة في أنبوب جمع (أنبوب). تحليل عدد إجمالي من الخلايا يعادل على الأقل 10 أضعاف حجم المكتبة النظرية لضمان تمثيل كاف لجميع المتغيرات (مثلا، تحليل ~1 ×^{10 7} خلايا لمكتبة ذات تنوع نظري ~1 × 10⁶ ).
   9. ضع بوابة الفرز أسفل قطر PE/FITC للمجموعة الضابطة السلبية.
      ملاحظة: البوابات الأكثر صرامة تحسن إثراء المتغيرات المرغوبة لكنها تقلل من تعافي الخلية.
5. ما بعد FACS
   1. أنابيب جمع الطرد المركزي عند 3,200 × جرام لمدة 5 دقائق. أزل السوبرناتانت بحذر، مع ترك 1 مل، وأعد تعليقه في 5 مل من PBS.
      ملاحظة: اترك 1 مل من السوبرناتانت، لأن الحبيبات الخلوية في الأسفل لن تكون مرئية بعد الطرد المركزي.
   2. استخدمت خلايا الطرد المركزي مرة أخرى عند 3,200 × جرام لمدة 5 دقائق. أزل السوبرناتان، تاركا 1 مل. أعد تعليق القرص بسعة 4 مل من SDCAA+.
   3. في قارورة إيرلنماير بسعة 250 مل، أضف 15 مل من SDCAA+. انقل الخلايا المعلقة من الخطوة 3.5.2 إلى هذه القارورة.
   4. الحضانة طوال الليل لمدة 18–24 ساعة عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز مداري عند 270 دورة في الدقيقة.
   5. كرر الخطوات 3.1، 3.2، 3.3، و3.4 لكل جولة من التطور الموجه.

4. استعادة البلازميدات وتسلسل النسخ الفردية

1. زراعة مستعمرات فردية
   1. قم بصنع مخزون جلسيرول بخلط 500 ميكرولتر من الزراعة السائلة بعد الخطوة 3.5.4 و500 ميكرولتر من الجليسرول المعقم بنسبة 50٪، مما ينتج عنه محلول جليسرول 25٪. دوامة لخلط الخلايا جيدا.
   2. احتفظ به في الفريزر بدرجة حرارة –80 درجة مئوية طوال الليل. للتخزين طويل الأمد، انتقل إلى النيتروجين السائل.
   3. اكشط مخزن الجلسرول باستخدام رأس معقم بسعة 1000 ميكرولتر وامزجه مع 100 ميكرولتر من SDCAA+. قم بتغليف هذا الخليط على طبق SDCAA وحضنه مقلوبا عند درجة حرارة 30 درجة مئوية.
   4. اقطف المستعمرات بعد 3 أيام، وازرعها طوال الليل في 1.5 مل من SDCAA+ في أنابيب بحجم 14 مل.
2. قم بتحضير الخميرة لاستخراج البلازميدات
   1. قم بعمل حبيبات الزراعة الليلية عن طريق الطرد المركزي بحرارة 16,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة وأعد تعليقها في 200 ميكرولتر من محلول 1 من مجموعة تنقية بلازميدات الخميرة.
   2. أضف 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم اللائق (5 U/μL).
   3. احتضن في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على خلاط من طرف إلى طرف.
   4. قم بدورة تجميد وإذابة عن طريق التجميد عند -80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وإذابة التجميد عند 42 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في حمام ماء.
   5. أضف 200 ميكرولتر من محلول 2 من مجموعة تنقية بلازميدات الخميرة، وامزج بالعكس 2–3 مرات، واتركه لمدة 5 دقائق.
   6. أضف 400 ميكرولتر من محلول 3 من مجموعة تنقية بلازميدات الخميرة وامزج بعكس 2–3 مرات. الطرد المركزي عند 16,000 × جرام لمدة 5 دقائق.
   7. تنقية حمض نووي البلازميد باستخدام مجموعة تنقية ذات عمود عالي الارتباط بالحمض النووي.
      ملاحظة: بسبب الكمية الكبيرة من حمض خميرة الحمض النووي الجيني المقطوع القادم من الخلايا المتحللة، يجب استخدام عمود قائم على السيليكا بقدرة ارتباط أعلى (35 ميكروغرام) بدلا من عمود تنقية حمض نووي بلازميد خميرة منخفض السعة (5 ميكروغرام)¹⁵.
   8. قس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس طياف. إنتاجية الحمض النووي تتراوح بين 10–30 نانوغرام/ميكرولتر.
3. تحويل البلازميدات المنقاة إلى خلايا إشريكية قولونية ذات كفاءة كيميائية
   1. حضر وسائط SOC وفقا للوصفة في الجدول 5، وأطباق LB-كلورامفينيكول. أيضا، سخن حمام الماء إلى 42 درجة مئوية.
   2. سخن صفيحة LB-كلورامفينيكول لكل بلازميد على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
   3. أخرج أنبوبا من الخلايا الكيميائية من الفريزر بدرجة حرارة –80 درجة مئوية واذابته على الثلج.
   4. أليكوت 30 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة لكل بلازميد في أنبوب بحجم 1.5 مل على الجليد.
   5. مبتة 3 ميكرولتر من البلازميد إلى خلايا كفاءة. اقلب الخليط واتركه على الثلج لمدة 5 دقائق.
   6. قم بإجراء صدمة حرارية عن طريق حضانة الخلايا لفترة وجيزة في حمام الماء عند درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 40 ثانية.
   7. احتضن الوضع على الثلج لمدة دقيقتين.
   8. أضف 300 ميكرولتر من وسائط SOC إلى الخلايا وحضن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية عند 220 دورة في الدقيقة.
   9. ألواح بحجم 50–100 ميكرولتر من الخلايا المتحولة القادرة على ألواح مدفأة مسبقا.
   10. حضن الصفائح عند 37 درجة مئوية مقلوبة لمدة 18 ساعة.
4. اختيار المستعمرات
   1. أضف 5 مل من وسط LB-كلورامفينيكول السائل إلى أنابيب زراعة دائرية القاع بحجم 14 مل.
   2. اختر مستعمرة باستخدام رأس معقم بسعة 1000 ميكرولتر، وأدخله في أنبوب زراعة.
   3. ضع الأنابيب في هزاز (220 دورة في الدقيقة، زاوية 30°–45° لتعظيم التهوية) عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
5. استخراج البلازميدات من زراعة البكتيريا السائلة
   1. قم بالطرد المركزي بزراعة السائل بحرارة 3,200 × جرام لمدة 4 دقائق. إذاعة السوبرناتانت.
   2. استخرج البلازميدات من الزراعة الليلية باستخدام مجموعة تنقية البلازميدات.
   3. قياس تركيز البلازميدات المنقاة باستخدام مقياس طياف.
6. تقديم البلازميدات للتسلسل
   ملاحظة: استخدم خدمات مثل تسلسل النانوسام الكامل للبلازميد، أو بدلا من ذلك، تسلسل سانجر مع وجود برايمر يحيط بالمنطقة المتحولة.

النتائج

يعد بناء مكتبة فعال أمرا بالغ الأهمية لضمان تغطية كافية للمساحة الطفرية. لتجنب فقدان المتغيرات الوظيفية النادرة، يجب أن يصل عدد المحولات إلى ما لا يقل عن 10× إلى 100× وهو حجم المكتبة النظرية. نظرا لأن كفاءة التحول في S. cerevisiae تتأثر بتركيز الخلايا وتكون الأعلى في الخلايا اللوغاريتمية^{المبكرة والمتوسطة 16}، قمنا بتحسين كثافة الخلايا الأولية قبل التعرض الكهربائي. تم زراعة زراعة الخميرة الفرعية عند قيم OD₆₀₀ الأولية تتراوح بين 1.0–4.0 وحضنتها لمدة 4 ساعات (n = 2–4 تجارب بيولوجية مستقلة)، وبعد ذلك تم رسم القيم النهائية_{ل OD 600} على منحنى نمو S. cerevisiae لتأكيد أن الخلايا لا تزال ضمن مرحلة النمو المتوسطة (الشكل 5A، الشكل التكميلي 1).

أظهر التسامح الكهربائي لهذه المزارع باستخدام حمض نووي بلازميدي بوزن 4 ميكروغرام (n = 2 تجربة بيولوجية مستقلة) أن كفاءة التحويل اختلفت بشكل كبير عبر ظروف OD₆₀₀ الأولية (ANO أحادي الاتجاه، p = 8.92 × 10⁻⁷). مقارنة بالزراعات التي بدأت عند OD₆₀₀ = 1.0، جميع كثافات الخلايا الابتدائية الأعلى أنتجت كفاءة تحول أعلى بشكل ملحوظ (اختبار Dunnett للمقارنات المتعددة؛ OD₆₀₀ = 1.5، p معدل = 0.0020؛ OD₆₀₀ ≥ 2.0، معدل p < 0.0001)، مع أعلى كفاءة تحويل لوحظت عند OD₆₀₀ في البداية 4.0. للاستفادة من قدرة خلايا الخميرة الطبيعية على إجراء إعادة التركيب المتماثل، قمنا أيضا بتحويل 4 ميكروغرام من متجه البلازميد الخطي و12 ميكروغرام من الإدخال (أي مكتبة البروتياز) إلى خلايا الخميرة (n = 2 تجربة بيولوجية مستقلة). اختلفت كفاءة التحويل بشكل كبير بين الظروف الأولية للاختبار في OD₆₀₀ (ANVA أحادي الاتجاه، p = 0.0023). مقارنة بالزراعات التي بدأت عند OD₆₀₀ = 1.0، كانت كفاءة التحويل أعلى بشكل ملحوظ عند OD₆₀₀ = 3.0 ( p معدل = 0.0018)، 3.5 ( p معدل = 0.0062)، و4.0 ( p معدل = 0.0024) (اختبار دانيت للمقارنات المتعددة). لاحظنا أعلى كفاءة تحويل عند كثافة زراعة فرعية أولية معتدلة (OD₆₀₀ = 3.0)، مما يشير إلى توازن مثالي بين كفاءة الخلية وكفاءة إعادة التركيب تحت هذه الظروف (الشكل 5B). مقارنة بالتحويل بالبلازميدات فقط، أدى التداخل الكهربائي المشترك لإدخال متجه خطي ومكتبة بروتياز (n = 2 نسخ بيولوجية مستقلة) إلى كفاءة تحويل أعلى بشكل ملحوظ عبر شروط OD₆₀₀ الأولية المختبرة (ANOVA ثنائي الاتجاه على كفاءة التحويل المحولة log10، p = 9.40 × 10⁻¹²). في المتوسط، أنتج التسامح الكهربائي المشترك زيادة متوسطة قدرها 121 مرة في كفاءة التحويل (95٪ CI، 63–233 مرة) مقارنة بالتحول البلازمي فقط (الشكل 5B).

خلال تشغيل FACS لخلايا الخميرة التي تحتوي على مكتبة البروتيز الطفرة وشريط اختيار الركيزة (الشكل 6A)، ستعرض الخلايا إما كاسيت مقطوع أو بروتياز لا يزال يقطع ركيزة الاختيار المضادة (Q1)، أو تعبر عن متغيرات بروتياز غير وظيفية (Q2)، أو تعبر عن متغيرات بروتياز تقطع ركيزة الانتقاء فقط بنجاح (Q3). ظهرت خلايا الخميرة التي تعبر عن متغيرات غير وظيفية كمجموعة سائدة موزعة على طول القطر في مخططات PE مقابل FITC، مما يعكس احتفاظ مشترك بكلا الإشارتين (الشكل 6A، Q2). على النقيض من ذلك، شكلت المتغيرات الوظيفية التي شقت ركيزة الانتقاء مع الحفاظ على الركيزة الأصلية (المضادة للانتقاء المضاد) مجموعة مميزة خارج القطر تتميز بكثافة إشارة FITC عالية ومتوسطة إلى منخفضة (الشكل 6A، Q3). أدى تطبيق استراتيجية بوابات صارمة لعزل هذه المجموعة خارج القطر إلى إثراء تدريجي للمتغيرات الوظيفية عبر جولات متتالية من الفرز¹⁰. يلاحظ هذا الإثراء بصريا كمجموعة خلايا أكثر تحديدا منفصلة عن العنقود القطري (الشكل 6B، من اليسار إلى اليمين). إذا لم يلاحظ وجود مجموعة سكانية مميزة خارج القطر، فقد يشير ذلك إلى انخفاض جودة المكتبة، أو ضعف التعبير، أو ظروف تلوين غير مثالية. كدليل سلبي، يظهر الشكل 6C,D خلايا الخميرة غير المصبوغة بالكهروبورية، المستحثة، وغير المصبوغة، بالإضافة إلى مخططات الفلورة FITC و PE المقابلة.

داخل السكان المثقبين خارج القطر الكثيف، يمكن تحديد المجموعات الفرعية بشكل أكبر بناء على شدة FITC. الخلايا التي تظهر إشارة FITC متوسطة يمكن فرزها بشكل منفصل عن تلك التي لديها إشارة FITC منخفضة. كشف تسلسل هذه التجمعات المختلفة عن ملفات طفرة فريدة (الجدول 11)، مما يشير إلى أن اختلاف كفاءة الانقسام مرتبط بأنواع مختلفة من البروتياز.

الشكل 1: تحضير المتجه والإدخال. (أ) توليد مكتبات بروتياز الفيروسي عبر طفرات تشبع المواقع. (ب) تجميع كاسيت الركيزة ودمجها في متجه عرض الخميرة (pDD1523). (ج) خطية ناقل عرض الخميرة (pDD1524) عبر الهضم التقييدي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: التقشير الكهربائي لكاسيت الركيزة ومكتبة البروتيز الطفرة المضخمة بواسطة PCR إلى خلايا EBY100 الفعالة. (صندوق متقطع) التدوير الدائري في الجسم الحي للبلازميد الذي يحتوي على كل من البروتيازات وشريط الركيزة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: الحث، التلوين، والفرز الخلوي التدفق لخلايا الخميرة. (أ) تحفيز مكتبة البروتيز وكاسيت الركيزة. (ب) صبغة الأجسام المضادة الفلورية: التلوين بالأجسام المضادة المضادة لفلوريسين إيزوثيوسيانات (FITC) ومضادة لفاج فيكوإيريثرين (PE). (ج) يتم فرز الخلايا المصبوغة باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورية (FACS). (د) استعادة الخلايا الفرزة في FACS في وسط الانتقائ. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: استعادة البلازميدات وتسلسل خلايا الخميرة المصنفة. (أ) طلاء خلايا الخميرة المفترضة. (ب) استخراج البلازميدات من مستعمرات الخميرة الفردية. (ج) تحويل الإشريكية القولونية للبلازميدات المستخرجة. (د) استخراج البلازميدات من مستعمرات الإشريكية القولونية الفردية. (ه) تسلسل النانو للبلازميدات المستخرجة. أيقونات القوارير والأنابيب تم تعديلها من DBCLS وHelicase 11 على التوالي عبر Bioicons (https://bioicons.com) وتم تكييفها بموجب رخصة المشاع الإبداعي 4.0 الدولية (CC BY 4.0). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: منحنيات نمو الخميرة في وسط نمو مختلف وتأثير الكثافة البصرية الأولية عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) من الزراعة الفرعية على كفاءة الحفر الكهربائية للخميرة. (أ) منحنيات نمو الخميرة في 1 × ببتون ديكستروز مستخلص الخميرة (YPD)، 2 × YPD، أحماض الكازامينو الصناعية أجار بدون مضادات حيوية (SDCAA-)، وأحماض الكازامينو الاصطناعية مع مضادات حيوية (SDCAA+). (ب) كفاءة التحويل للخميرة الكهربائية بمتجه بلازميد 4 ميكروغرام عند مجموعة OD₆₀₀ ابتدائية مختلفة من الزراعة الفرعية، وكفاءة التحويل باستخدام المتجه الخطي (4 ميكروغرام) وإدخال مكتبة البروتيز (12 ميكروغرام) عند نفس قيم OD₆₀₀ الأولية. تعرض البيانات في (A) كOD₆₀₀ ± SD من تجربتين بيولوجيتين مستقلتين (n = 2). تعرض البيانات في (B) كمتوسط عدد المحولات لكل تثقيف كهربائي على محور y لوغاريتمي، مع عرض النسخ البيولوجية الفردية كدوائر (n = 2). تم تحديد الدلالة الإحصائية لتجارب تحسين التقشير الكهربائي باستخدام تحليل النوفاع أحادي الاتجاه على كفاءة التقشير الكهربائي المحولة لوغارتيوم 10، تلاها اختبار دانيت للمقارنات المتعددة باستخدام OD₆₀₀ = 1.0 كضابط. ns، غير مهم؛ p < 0.01 (**); p < 0.0001 (****). تم تحديد الدلالة الإحصائية للفرق بين كفاءة تحويل البلازميدات فقط وكفاءة تحويل المتجه زائد الإدخال باستخدام تحليل التنفس النوفي ثنائي الاتجاه على كفاءة التحويل المحولة لولوغارت10. ص < 0.0001 (****). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: إثراء الخلايا المستنسخة من الخميرة باستخدام الفرز الفلوري (FACS). (أ) تمثيل تخطيطي لاستراتيجية البوابة. تم تقسيم الخلايا إلى ثلاث مناطق: Q1، فيكوإيريثرين (PE) - الخلايا المنخفضة؛ Q2، خلايا عالية من PE عالية / فلوريسيين إيزوثيوسيانات (FITC)؛ وQ3، خلايا عالية من PE مع فلورة FITC منخفضة إلى متوسطة. تم جمع الخلايا داخل Q3 للتخصيب. (ب) مخططات FACS تمثيلية لحملة تطورية مستقلة واحدة تظهر جولات متتالية من الفرز مع صرامة متزايدة في بوابات FITC. تم جمع خلايا FITC متوسطة ومنخفضة بشكل منفصل للتسلسل. تشير النسب إلى نسبة الخلايا الحية المفردة داخل المجموعة المحاطة. (ج) مخطط FACS التمثيلي يظهر خلايا الخميرة الكهربائية غير المصبوغة كمادة تحكم سلبية. (د) مخططات الفلورة FITC-A (اليسار) وPE-A (اليمين) المتوافقة مع البيانات المعروضة في (C). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: خليط التفاعل لتضخيم PCR في الجولة الأولى لمكتبة البروتياز. تركيب تفاعل PCR المستخدم في تضخيم الجولة الأولى لمكتبة البروتياز، بما في ذلك التركيز والكميات النهائية لكل كاشف في تفاعل بحجم 50 ميكرولتر. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: ظروف الدورة لتضخيم PCR في الجولة الأولى لمكتبة البروتياز. تم استخدام برنامج الدورة الحرارية لتضخيم PCR في الجولة الأولى لمكتبة البروتياز. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 3: خليط التفاعل لتضخيم PCR للجولة الثانية لمكتبة البروتياز. تركيب تفاعل PCR المستخدم في تضخيم الجولة الثانية لمكتبة البروتياز، بما في ذلك التركيزات النهائية والكميات لكل كاشف في تفاعل بسعة 50 ميكرولتر. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 4: ظروف الدورة لتضخيم PCR في الجولة الثانية لمكتبة البروتياز. تم استخدام برنامج الدورة الحرارية لتضخيم PCR في الجولة الثانية لمكتبة البروتياز. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 5: الوسائط والكواشف لعملية التغذية الكهربائية للخميرة ونموها. وصف جدولي للكتلة المطلوبة من كل مكون كيميائي لتكوين كميات محددة من 1 × و2 × مستخلص الخميرة ببتون ديكستروز (YPD)، ومخزن التعرض الكهربائي، ومخزن التكييف، ووسط النمو، وأحماض الكازامينو الديكستروز الصناعية مع المضادات الحيوية (SDCAA+)، وأحماض كاسامين الجالاكتوز الصناعية مع المضادات الحيوية (SGCAA+)، ووسط مرق الليسوجيني (LB)، ووسط LB-كلورامفينيكول، ووسط مرق سوبر أمثلي (SOB)، ومرق سوبر أوبتيمال مع وسط كبت كاتابولايت (SOC). تتضمن تعليمات تحضير المحاليل المخزنة، مثل 2 M سوربيتول، 1 M ثنائي ثيوثرايتول (DTT)، و2 M أسيتات الليثيوم (LiAc). تم توفير تعليمات إضافية لتحضير ألواح الأجار SDCAA وLB وYPD. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 6: خليط التفاعل للتلدين والفسفرة للأوليغو. تركيب خليط التفاعل المستخدم في التلدين والفسفرة المتزامنة للأوليغونوكليوتيدات لتجميع كاسيت الركيزة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 7: ظروف الدورة للتلدين والفسفرة للأوليغو. برنامج درجة الحرارة المستخدم في تلدين الأوليجونوكليوتيدات وفسفرة لتجميع كاسيت الركيزة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 8: خليط التفاعل لتجميع بوابة الذهب من كاسيت الركيزة والبلازميد المتجه. تركيب تفاعل تجميع البوابة الذهبية المستخدم لربط شريط الركيزة مع البلازميد المتجه. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 9: ظروف الدورة لتجميع كاسيت الركيزة والبلازميد المتجه في Golden Gate. برنامج التدوير الحراري المستخدم لتجميع غولدن غيت. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 10: خليط التفاعل لخطية البلازميد المتجه. تركيب تفاعل الهضم التقييدي المستخدم لخطية البلازميد المتجه قبل بناء المكتبة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 11: نتائج تسلسل النانوبور لمتغيرات TEVp التي تقطع ENLYFES. تم استخراج البلازميدات من خلايا الخميرة بعد الجلسة الرابعة والأخيرة من FACS. تظهر الطفرات في كل نسخة مستنسخة بالنسبة لتسلسل النوع البري. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الشكل الإضافي 1: العلاقة بين كثافة الزراعة الأولية والنهائية ل EBY100 خلال الزراعة الفرعية. تم زراعة مزارع EBY100 الفرعية بقيم OD₆₀₀ الأولية المختلفة، وتم قياس OD₆₀₀ النهائي بعد الحضانة تحت ظروف نمو متطابقة (30 درجة مئوية، 220 دورة في الدقيقة). زادت كثافة الزراعة النهائية خطيا مع زيادة OD_{الأولية 600} (R² = 0.969، p = 5.77 × 10⁻⁵). تمثل نقاط البيانات المتوسط ± SD ل (n = 2–4) النسخ البيولوجية المستقلة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: التصميم العقلاني لمكتبة TEVp للطفرات. تمثيل كرتوني ل TEVp (معرف PDB: 1LVB) مع أربعة بقايا (ذهبية) <5Å بعيدا عن بقايا P1 (البنفسجي) المستهدفة لطفرات التشبع الموقعي. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

التطور الموجه هو طريقة عالية الإنتاج تستخدم دورات تكرارية من التنويع والاختيار لتحديد البروتينات ذات الوظائف الكيميائية الحيوية المحسنة^{أو الجديدة 17}. في هذا البروتوكول، نستعرض سير عمل محسن لتطوير التعرف على ركيزة البروتيز باستخدام نظام عرض سطح الخلية في S. cerevisiae. يقوم نظام عرض السطح بربط نشاط البروتيازات إلى نمط ظاهري قائم على الفلورة قابل للكشف، مما يمكن من إثراء النسخ المرغوبة باستخدام FACS. نقدم الخطوات التفصيلية لتجميع كاسيت مكتبة البروتيز والركيزة، والحفر الكهربائية عالية الكفاءة، وتحديد وتصنيف FACS، والتسلسل النهائي لأنواع البروتياز.

واحدة من أهم الخطوات في التطور الموجه هي ضمان تنوع كاف في المكتبات وتغطية الطفرات المحتملة. تظهر تجاربنا في كفاءة الحفر الكهربائي أن الزراعة الفرعية الأولية OD₆₀₀ من 3.0 تعطي أعلى كفاءة تحويل، تتجاوز 10⁹ وحدة CFU. هذا المقياس، الذي تحقق باستخدام تحسين الحفر الكهربائي للخميرة، يتجاوز بشكل كبير طرق التحويل الكيميائي التقليدية ويتيح تغطية كافية للمكتبات التوافقية الكبيرة ^8,9. تعد البوابات والفرز الدقيق في FACS ضروريين لفصل الخلايا التي تظهر خصائص الانقسام المرغوبة عن تلك التي تظهر انقساما غير محدد. خلال عدة جولات من الاختيار القائم على FACS، تصبح استراتيجية البوابات أكثر صرامة لإثراء الأنواع المطلوبة من البروتياز بشكل انتقائي. إذا كان البوابة عريضا جدا، قد يتم فرز الخلايا غير المرغوب فيها مع المتغيرات المطلوبة. يسمح الإغلاق الصارم (مثل انخفاض العتبات تدريجيا لإشارة FITC عبر الجولات) بإثراء مجموعة الخلايا لمتغيرات البروتيز ذات الخصوصية والنشاط الأكبر نحو تسلسل الركيزة المستهدف الجديد¹⁰. تماشيا مع الحملات^{السابقة 7،18}، أجرينا طفرة NNS-codon لأربعة بقايا في جيب ارتباط الركيزة في TEVp تتفاعل مع بقايا الركيزة P1، Q (T146، D148، H167، S170) (الشكل التكميلي 2). تمثل مخططات FACS الموضحة في الشكل 6B تجربة فرز تمثيلية واحدة توضح استراتيجية البوابة وسير عمل الإثراء. ومن المثير للاهتمام أن نتائج حملتنا أنتجت متغيرات TEVp مع مجموعة مختلفة من طفرات الأحماض الأمينية (الجدول 11). تدعم هذه النتائج ميزة رئيسية في تطور البروتياز: يمكن أن تؤدي مسارات تطور متعددة إلى نفس الهدف.

قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات واستراتيجيات استكشاف الأعطال عند إجراء التجارب. على سبيل المثال، أثناء التسامية الكهربائية، العمل على الثلج عند الإشارة وإعادة تعليق حبيبات الخلايا بعناية في كل خطوة يضمن بقاء الخلايا حية وصحية قبل الحفر الكهربائي. تكون خلايا الخميرة حساسة طوال مراحل التسامح الكهربائي حتى مرحلة التعافي من النمو. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون هناك حاجة لتعديل سائل غمد FACS لمنع تقلب خلايا الخميرة. يستخدم سائل الغلاف بشكل شائع في أجهزة FACS وقد يحتوي على مواد حافظة تثبط نمو البكتيريا والفطريات. لذلك، يمكن استبدال سائل الغمد بزيت PBS نقي لمنع موت الخلايا أثناء الفرز.

يتطلب نظام عرض سطح الخميرة بروتينات مطوية بشكل صحيح لعبور مسار الإفرازات بنجاح. بعض متغيرات البروتياز قد تفقد نشاطها بسبب الطي الخاطئ، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة أثناء اختيار FACS ناتجة عن الانقسام غير النوع أو التألق الخلفي. مصادر الإيجابيات الكاذبة المميزة جديرة بالذكر في حملات تعتمد على البلازميدات مثل هذه. نظرا لأن الانقسام يقرأ كفقدان لعلامة الحابات في الطرف C، فإن أي طفرة تعطل تلك العلامة تعطي نفس النمط الظاهري منخفض FITC مثل حدث الانقسام الحقيقي؛ تظهر هذه الطفرات في الوسوم أثناء إعادة التركيب المتماثل واسعة النطاق ويمكن أن تثري عبر جولات الفرز المتتالية. لقد أظهر مؤخرا أن التكامل الكروموسومي لكاسيت الركيزة الثابتة يخفف من هذه المشكلة¹⁹. يعتمد البروتوكول على استخدام مكتبة إدخالات مع الحفاظ على ثابت المتجه (الذي يحتوي على شريط الركيزة). لذلك، هذا البروتوكول غير مناسب لمن يرغب في تطوير مكتبات كل من البروتيز والركائز.

كانت منصة YESS رائدة في مسار عام لإعادة برمجة خصوصية الركيزة البروتية¹⁸. تشمل التحسينات الأخيرة: إضافة التحكم في الإنزيم/الركيزة القابلة للتعقيم في YESS2.0⁷، والاقتران مع تسلسل الجيل القادم، وتمكين التوصيف عالي الدقة^{للخصوصية 20}، ودمج المراسلين كروموسوم لتقليل ضوضاء التعبير والإيجابيات الكاذبة¹⁹. كما تم تطبيق استراتيجيات متعامدة أخرى، مثل التطور المستمر بمساعدة الفاج، في هندسة خصوصية البروتاز للأهداف العلاجية²¹. وجدت هذه الأدوات تطبيقات تتجاوز هندسة بروتياز TEV، مثل التحليل التفصيلي عالي الدقة للبروتياز الرئيسي SARS-CoV-2 لتوجيه تصميم المثبط²². عامل حاسم في أي حملة من هذا النوع هو توليد عدد كاف من المحولات لتغطية مكتبات التركيبات الكبيرة (>10⁹)، والتي لم تكن محسنة بشكل منهجي في سلالة EBY100 S. cerevisiae. من خلال تعريف ظروف طور النمو والاحتراق الكهربائي التي تدفع تحول EBY100 فوق 10.9 وحدة CFU، يزيل هذا البروتوكول عنق الزجاجة هذا، مما يتيح فحصا شاملا معتمدا على FACS لملايين المتغيرات.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Reagents
10 mM dNTP Mix	NEB	N0447S	PCR reactions (Tables 1, 3)
10X PBS, pH 7.4	Fisher	BP3994	Staining buffer base (Steps 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction Buffer	NEB	B9027S	Sold separately; also included with Q5 polymerase
Agar, Bacto	BD Difco	281230-500g	SDCAA agar plates (Table 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500	Gel Electrophoresis
Anti-FLAG PE Antibody	BioLegend	637309	FACS staining; PE-conjugated anti-FLAG
Anti-HA Tag Antibody [FITC]	GenScript	A01621	FACS staining; FITC-conjugated anti-HA
Bacto Casamino Acids	BD Difco	223120	SDCAA+, SGCAA+, SCAA media (Table 5); 5 g/L
Bacto Peptone / Tryptone	RPI	T60060-10000.0	LB/SOB media preparation; 20 g/L in YPD (Table 5)
BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction V	Sigma-Aldrich	126575-10GM	0.5% in PBS; staining buffer (Steps 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)	NEB	R0739S	Golden Gate assembly of substrate cassette (Table 8)
Calcium chloride solution (1M)	Sigma-Aldrich	21115-100mL	Electroporation buffer: 1 mM final (Table 5)
ColiRollers® Plating Beads	Sigma-Aldrich	71013-3	Sterilize by putting in reagent bottles and autoclaving at 121ºC, 15 psi, for 15 mins.
D-Galactose	Thermo Fisher	A12813.30	250 g; 20% w/v stock for SGCAA+ induction (Table 5)
D-Sorbitol	Thermo Fisher	1327300.10	Electroporation buffer (1 M) and outgrowth media (Table 5)
Dextrose (D-Glucose), anhydrous	Sigma-Aldrich	G8270-1KG	YPD, SDCAA+, 20% w/v dextrose stock (Table 5)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	Sigma	Y0626-250G	6.7 g/L in SDCAA/SGCAA (Table 5)
Difco YPD Broth (pre-mixed)	BD	242820-500g	Pre-made YPD alternative; 500 g
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Conditioning buffer: 10 mM final; aliquot 250 μL, store −20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification Kit	Omega Bio-tek	D6492-02	PCR product cleanup
E.Z.N.A. Gel Extraction Kit	Omega Bio-tek	D2500-01	Gel purification post-PCR and restriction digest (Steps 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-tek	D6942-02	Plasmid purification (Step 4.2)
Glycerol (≥99%)	Fisher	BP229-4	50% v/v stock for glycerol stocks (Step 4.1.1)
Kanamycin Sulfate	Fisher	BP906-5	SDCAA+ and SGCAA+: 50 μg/mL final; replaces Sigma K0879-5G
KLD Enzyme Mix	NEB	M0554S	Kinase-Ligase-DpnI; site-directed mutagenesis
KLD Reaction Buffer	NEB	B0554A	Used with KLD Enzyme Mix
LB Broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	E. coli liquid culture
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc·2H2O)	Thermo Fisher	A17921.30	Conditioning buffer: 0.1 M final; add before DTT (Table 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)	RPI	L24020-2000.0	E. coli plating; replaces Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino Acids	Sigma	2240-500GM	Alternative casamino acids source
pDD1523	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI	SDCAA+, SGCAA+: 1X final
PstI-HF (5000 U)	NEB	R3140S	Vector linearization (Table 10); use HF version
Q5 HF DNA Polymerase	NEB	M0492S	High-fidelity polymerase; alternative to Q5 Hot Start
Q5 High GC Enhancer	NEB	B9028A	For high GC-content PCR reactions
Q5 Hot Start DNA Polymerase	NEB	M0491L	PCR assembly and amplification (Tables 1, 3)
rCutSmart Buffer (10X)	NEB	B6004S	Supplied with PstI-HF and SphI-HF (Table 10)
SalI-HF	NEB	R3138L	Additional restriction enzyme
SOC Medium	NEB	B9020S	Post-transformation recovery
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S271-1	LB / SOB media preparation
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500	Media pH adjustment
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S9763-500G	SDCAA plates, SCAA media: 38 mM (Table 5)
Sodium Phosphate Monobasic, anhydrous	VWR (BDH)	BDH4542-1KGP	SDCAA plates, SCAA media: 62 mM; replaces NaH2PO4·H2O monohydrate
SphI-HF (1000 U)	NEB	R3182S	Vector linearization in tandem with PstI-HF (Table 10)
Streptomycin	Life Technologies / Sigma	S6501-5g	Antibiotic
T4 DNA Ligase Buffer (10X)	NEB	B0202S	Table 6
T4 Polynucleotide Kinase (500 U)	NEB	M0201S	Table 6
T7 DNA Ligase (3000 U/mL)	NEB	M0318S	Table 8
Yeast Extract	RPI	Y20020-5000.0	YPD (10 g/L) and LB/SOB media
Zymolyase (1000 U)	Zymo Research	E1004-A	Yeast cell wall digestion for plasmid extraction (Step 4.2.2)
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II	Zymo Research	D2004	Yeast plasmid extraction; includes Solutions 1, 2, 3 (Step 4.2)
ZymoPURE II Plasmid Midi Kit	Zymo Research	D4201-B	Mid-scale plasmid prep; for larger-volume preparations
Equipment and Consumables
Disposable Cuvettes, 1.5 mL	Fisher	14-955-127	For measuring OD600 of liquid cultures
Erlenmeyer Flask, 125 mL	VWR	10536-912	Pre-culture and conditioning incubation
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	10536-914	Yeast subculture
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	75809-646	Wide-mouth variant
Erlenmeyer Flask, 500 mL	VWR	10536-926	Main pre-culture flask (Step 2.3.1, 2.4.3)
Falcon 50 mL Conical Tubes	Falcon	352070	Cell washes, centrifugation throughout protocol
Flow Cytometry Sorter: BD Fusion	BD Biosciences	FACSAria Fusion Flow Cytometer (catalog number not applicable)	For Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	Bio-Rad	1652086	For electroporation of electrocompetent EBY100
GenePulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	INSTRUMENT; 2.5 kV, 25 μF, 200 Ω (Step 2.7.6)
New Brunswick Innova 40R - Benchtop Orbital Shaker	Eppendorf	M12990084	For yeast liquid culture incubation
Petri Dishes, 100 mm	Fisher	FB0875712	YPD and SDCAA agar plates
SpectraMax QuickDrop UV-Vis Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax QuickDrop	For measuring OD600 of liquid cultures and DNA concentration
Vacufuge plus	Eppendorf	2231001204	For concentrating DNA
Software
BD FACSDiva (Version: 8.0)	BD Biosciences	https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software	Collection of tools for flow cytometer and application setup, data acquisition, and data analysis
Benchling (Version: Web-based platform, continuous release)	Benchling, Inc.	https://www.benchling.com/	Sequence design software
SnapGene (Version: 8.0.1)	SnapGene, Inc.	https://www.snapgene.com/	Sequence design software