مقالة منهجية

منصة حبر تضحيّ مطبوعة ثلاثية الأبعاد للتصوير عالي الدقة لوظيفة الخلايا البطانية في الأوعية الملتوية وأم الدم

57 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72574

⸱

سبتمبر 29, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cell and Tissue Morphodynamics, Cell Biology and Physiology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Biomedical Engineering and Physical Science Shared Resource, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 3Center for Biomedical Engineering Technology Acceleration, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 4Instrumentation Development and Engineering Application Solutions (IDEAS), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

في هذه المقالة

ملخص

يفصل هذا البروتوكول كيفية تصميم وتجميع أوعية دموية in vitro تحتوي على أجزاء ملتوية أو تمددات أوعية دموية، باستخدام إما طابعة بالبثق أو التطبيق اليدوي لحبر تضحية مبستر، وكيفية تحليل تدفق الديناميكا الدموية واستجابات الخلايا البطانية.

الملخص

يشكل التعرج الوعائي وتمدد الأوعية الدموية مخاطر صحية كبيرة عبر مجموعة متنوعة من الأنسجة البشرية وأنواع الأوعية الدموية. وتسبب هذه التغيرات في شكل الوعاء الدموي شذوذاً في ديناميكيات تدفق الدم، مما يؤثر بشكل كبير على الوظيفة البطانية. كانت النماذج الحيوانية لحالات الأمراض الوعائية هذه توضيحية في بعض الحالات، ولكنها مكلفة في إنشائها ومحدودة بفسيولوجيا الأنواع الحيوانية. واستجابة لذلك، أصبحت نماذج العضو على شريحة (OOC) ثلاثية الأبعاد in vitro مجموعة أدوات قوية لتقييم الوظيفة الوعائية والاستجابات البطانية في الخلايا البشرية. وبينما يتميز كل نموذج من نماذج OOC بنقاط قوة، تبرز الحاجة إلى نظام ميسر لدراسة نفاذية الأوعية، وهي مؤشر رئيسي للوظيفة الوعائية في الأوعية المنحنية وتمددات الأوعية تحت معدل قص وضغط فسيولوجيين. وهنا، تتيح المنهجية المعروضة دراسة استجابات الخلايا البطانية البشرية لشذوذ التدفق في نظام نموذج وعائي منحني واقتصادي باستخدام طابعة حيوية أساسية تنتج أوعية متوافقة مع معدلات تدفق السوائل الفسيولوجية، ودراسات النفاذية، والمجهر الضوئي عالي الدقة، ودعم المصفوفة خارج الخلوية بصلابة فسيولوجية.

المقدمة

يعد شكل الأوعية الدموية مؤشراً هاماً لوظيفة الأوعية، حيث يمثل تعرج الأوعية وتمدد الأوعية الدموية (aneurysms) سمات رئيسية لمجموعة متنوعة من الأمراض والمخاطر الصحية. يمكن أن يكون تعرج الأوعية خلقياً، كما هو الحال في متلازمات مثل متلازمة Marfan1 وTurner2 وLoeys-Dietz3، أو يتطور في مراحل لاحقة من الحياة كسمة لعدة أمراض، بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم، والسكري، والسرطان، وربما تصلب الشرايين4,5,6. وترتبط تمددات الأنسجة الشريانية، بما في ذلك الشرايين السباتية7 والتاجية8 والفخذية9 والأبهرية10 والدماغية11، بمعدلات المراضة والمخاطر الصحية بسبب التسلق أو التمزق التلقائي. وبالإضافة إلى التسبب في اضطرابات التدفق والالتهابات البطانية المرتبطة بها، يمكن أن يشير تعرج الأوعية وتمددها إلى وجود خلل وظيفي والتهاب في الأنسجة الكامنة. فعلى سبيل المثال، لدى حديثي الولادة والأطفال، تكون متلازمة تعرج الشرايين تنبؤية سريرياً بحدوث السكتة الدماغية في مرحلة الطفولة12، وارتفاع ضغط الدم الرئوي المستمر، وتسلق الشريان الأبهر4,13. أما لدى البالغين، فيظهر التهاب الأوعية الشبكية في شكل أوعية شبكية متعرجة تصبح أقل وضوحاً مع زوال الالتهاب الكامن14. ولا تزال كيفية استشعار التعرج وترجمته إلى إشارات شاذة تدفع بتطور المرض مجالاً نشطاً للدراسة. ويُعتقد أن الخلايا البطانية التي تبطن الأوعية الدموية تعمل كمستشعرات أولية في هذه العملية؛ حيث يؤدي التدفق المضطرب أو البطيء الناتج عن تعرج الأوعية أو تمددها إلى تغيير إجهاد القص (shear stress)، مما يؤدي إلى تغيرات بطانية في تأشير الالتهاب15 ووظيفة الحاجز16. وتتميز الخلايا البطانية بحساسية عالية لتدفق السوائل من خلال آليات تشمل الأهداب الأولية17، وبروتينات الالتصاق الحساسة ميكانيكياً18,19، والقنوات الأيونية20,21، والتي تحفز التأشير الذي يمكن أن ينشط التسرب والالتهاب وإعادة برمجة الخلايا البطانية22,23,24. وبناءً على ذلك، فإن طرق دراسة الاستجابات البطانية للهندسة الوعائية المتعرجة تكتسب أهمية كبيرة لتطوير العلاجات الوعائية.

لقد تمت نمذجة الوظائف البطانية في حالات الأمراض الوعائية باستخدام نماذج حيوانية in vivo، وأنظمة العضو على شريحة (OOC)، ومناهج الطباعة الحيوية. تتيح نماذج الفئران التحكم في تعبير الجينات المسببة للأمراض المعروفة وتدمج تعقيد البنية النسيجية والفسيولوجيا، بما في ذلك مشاركة الخلايا الجدارية والمناعية. وتوفر نماذج الفئران المصابة بتصلب الشرايين25، ومتلازمة مارفان26، وأنواع مختلفة من تمدد الأوعية الدموية27,28,29 رؤى حول الأمراض المرتبطة بالخلل الوظيفي الوعائي. وعلى الرغم من هذه المزايا، فإن الملاحظة المباشرة، والتلاعب التجريبي، والتقدير الكمي للخلايا البطانية يصعب تحقيقها، باستثناء الطرق الإجمالية مثل تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA sequencing). علاوة على ذلك، تفرض النماذج الحيوانية اعتبارات أخلاقية وتكاليف مادية، كما أنها محدودة بالفسيولوجيا الخاصة بكل نوع.

تم تطوير العديد من نهج in vitro للأعضاء على رقاقة (OOC) لدراسة استجابات الخلايا البطانية البشرية للتدفق الصفائحي والمضطرب30,31,32 في كل من الأنظمة ثنائية الأبعاد (2D)33,34 وثلاثية الأبعاد (3D)35,36,37. وقد كانت الأدبيات الواسعة حول OOC38 مدفوعة إلى حد كبير بالهندسة الطبية الحيوية، مع ميزات تصميمية تعالج أسئلة طبية حيوية محددة. وتستخدم العديد من نماذج OOC الوعائية دعامات من البوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) للتحكم في بنية الوعاء الدموي38. وتوفر هذه النماذج تحكماً عالي الدقة في الأشكال الهندسية المعقدة وتسمح بنمذجة التفاعلات الوعائية العضوية، بما في ذلك التفاعلات التي تشمل الكبد39، والدماغ40، والرئة41. ومع ذلك، لا تزال هناك قيود؛ حيث يمكن أن تؤدي النفاذية المنخفضة لـ PDMS والبوليمرات المماثلة للجزيئات الكبيرة إلى تقييد دراسات وظيفة الحاجز الوعائي. بالإضافة إلى ذلك، فإن معظم PDMS المعالج يمتلك صلابة تتراوح تقريباً بين 0.8–10 MPa42، على الرغم من أن التركيبات البديلة يمكن أن تحقق نطاقات أكثر فسيولوجية تتراوح بين 8–200 kPa43. وتتراوح تقديرات صلابة الغشاء القاعدي الوعائي من ~350 Pa44 إلى ~70 kPa45، اعتماداً على نوع الوعاء ومنهجية القياس، مع وجود معظم الأغشية القاعدية الوعائية السليمة في نطاق 2–3 kPa46. وبما أن الأمراض الوعائية مثل تصلب الشرايين وارتفاع ضغط الدم ترتبط جزئياً بزيادة صلابة المصفوفة خارج الخلية (ECM)47,48,49,50,51، وتستجيب الخلايا البطانية لصلابة ECM، فإن التحكم في الصلابة ضمن النطاقات الفسيولوجية يعد أمراً مهماً في نماذج in vitro. وتستخدم نهج OOC الأحدث ركائز فسيولوجية تسمح بأشكال هندسية معقدة52,53، أو تدمج أنواعاً متعددة من الخلايا لمحاكاة وظيفة العضو39,54,55,56,57، أو التفاعلات المناعية الوعائية58، أو تعمل على نمذجة بنيات وعائية خاصة بالمريض59,60، وتدعم تطوير الأدوية في المرحلة ما قبل السريرية61,62. وفي العديد من النماذج الوعائية الدقيقة التي تتضمن تفاعلات مع أنواع أخرى من الخلايا، تشكل الخلايا البطانية أوعية دموية بشكل تلقائي بأشكال هندسية غير متحكم بها نسبياً63. وعلى العكس من ذلك، فإن أنظمة OOC التي تسمح بأشكال هندسية وعائية محددة تحت تدفق متحكم به غالباً ما تتطلب بنية تحتية هندسية ومواد وخبرات كبيرة53,64. ولذلك، هناك حاجة إلى طرق قوية ومتاحة لغير المتخصصين لتسهيل دراسات سلوك الخلايا الوعائية في ظل ظروف ذات صلة فسيولوجياً.

توفر منصات الطباعة الحيوية المتوافقة مع هيدروجيلات المصفوفة خارج الخلوية (ECM) الفسيولوجية نماذج in vitro متعددة الاستخدامات لدراسة الوظائف البطانية عبر مختلف الأشكال الهندسية للأوعية الدموية65. تستخدم هذه المنهجيات إما الترسيب الموجه للهيدروجيلات المحتوية على خلايا بطانية بشكل وعاء دموي66، أو الحبر المضحّي لتوليد لومن أنبوبي مفتوح مدمج في المصفوفة خارج الخلوية (ECM) يمكن إذابته لاحقاً، مما يترك لومناً يمكن استزراعه بالخلايا البطانية54. ويمكن ضبط ركائز المصفوفة خارج الخلوية (ECM) المتوافقة بيولوجياً، بما في ذلك الجيلاتين والكولاجين والفيبرين، لتصل إلى مستويات صلابة تقارب تلك الموجودة في الغشاء القاعدي الوعائي (1–3 kPa67)، كما تسمح بإجراء مقايسات النفاذية الوعائية المماثلة لتلك المستخدمة in vivo. وعلى الرغم من أن هذه المنهجيات لا تحقق نفس دقة الشكل والحجم التي يوفرها تصنيع PDMS، إلا أنه يمكن توليد أوعية منحنية ومتفرعة ومتضيقة52,66,68. وبناءً على ذلك، تعد هذه المنصات مناسبة جداً لنمذجة الأشكال الهندسية الوعائية، بما في ذلك الأوعية المتعرجة والمتمددة (أم الدم).

تستخدم الطريقة المعروضة هنا نهج الطباعة ثلاثية الأبعاد القائم على البثق الهوائي، وتحديد المواقع ثلاثي الأبعاد بمقياس الميكرون، والتحكم في درجة حرارة سرير الطباعة ورأس الطباعة الذي يحتوي على الحبر، بالإضافة إلى حبر تضحيوي تم تطويره مسبقاً للتفاعلات الوعائية الكلوية على رقاقة67,69. يتم طباعة الحبر التضحيوي وفقاً للهندسة الوعائية المطلوبة ويُدمج فوراً في المادة الخلالية (ECM). بعد ذلك، تؤدي إزاحة درجة الحرارة إلى إزالة الحبر، مما يترك تجويفاً مفتوحاً في المادة الخلالية يتم استزراعه بخلايا بطانية بشرية. تتكون المادة الخلالية الأساسية من الجيلاتين والفيبرين، مما يسمح بالتجلط السريع وبلمرة الفيبرين بوساطة الثرومبين مع توفير صلابة ميكانيكية مناسبة للعديد من الأغشية القاعدية الوعائية. يمكن دمج مكونات إضافية من المادة الخلالية، بما في ذلك اللامينين أو الفيبرونيكتين، لمحاكاة تكوين الغشاء القاعدي الوعائي بشكل أفضل70,71,72وتعزيز الالتصاق البطاني. يتم تجميع النظام في غرف روز (Rose chambers) قابلة لإعادة الاستخدام73 تحتوي على دعامات معدنية، وحشوات من المطاط السيليكوني، وشريحة غطاء مجهر عالية الدقة، مما يسمح بالتوصيل بمضخة سوائل عبر إبر Luer-lock. بدلاً من ذلك، يمكن تصنيع الصفائح العلوية والسفلية عن طريق الطباعة ثلاثية الأبعاد باستخدام حمض البولي لاكتيك أو مادة مدعمة بألياف الكربون. يتحمل النظام المجمع الضغوط الناتجة عن معدلات تدفق السوائل الفسيولوجية. كما يعمل إجراء البسترة على تحسين تعقيم الحبر التضحيوي دون تغيير خصائصه الفيزيائية. بالإضافة إلى ذلك، يسمح نهج قالب الإبرة والحبر الحيوي بتصنيع أوعية مستقيمة تحتوي على تمدد شرياني (aneurysm) بدون طابعة حيوية. يمكن فحص الأوعية المبطنة بالخلايا البطانية والملتوية أو التي بها تمدد شرياني الناتجة تحت التدفق الفسيولوجي باستخدام المجهر الضوئي عالي الدقة لمدة أسبوع تقريباً، مما يتيح دراسة الاستجابات البطانية الحادة للهندسة الوعائية المتغيرة.

تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذا النظام في توافقه مع المجهر الضوئي. وتعد الأوعية التي يتم إنشاؤها In vitro باستخدام هذا البروتوكول قابلة للتطبيق في عدة أنماط للتصوير، وهي مناسبة بشكل خاص لمجهر الفلورسنت متحد البؤر بنظام القرص الدوار أو المسح الليزري. ويجب مراعاة الدقة المكانية والزمانية، والحساسية، ومسافة العمل للعدسة الشيئية عند اختيار ظروف التصوير. وبالنسبة لمعظم الأوعية التي يتم إنشاؤها باستخدام هذا النظام، يجب أن تمتلك العدسة الشيئية مسافة عمل كافية للوصول إلى حوالي 100–300 µm من غطاء الشريحة والتصوير عبر نقطة منتصف الوعاء. وتُطلب عدسات شيئية ذات فتحة عددية عالية للتصوير عالي الدقة للبنى البطانية، بما في ذلك العضيات والالتصاقات الخلوية، وللتصوير الحي الذي يتطلب دقة زمنية عالية، مثل تتبع الخرزات المرجعية تحت التدفق. أما بعض الاختبارات التي تتطلب التقاطاً أقل كفاءة للفوتونات، مثل قياسات الحاجز البطاني المعتمدة على الفلورسنت، فيمكن إجراؤها باستخدام عدسات شيئية ذات فتحة عددية أقل، مثل العدسات الهوائية 10–20×.

يصف البروتوكول طريقة توليد أوعية دموية ملتوية وتمددية مكونة من خلايا بطانية بشرية في نظام in vitro يدعم التدفق السوائلي الفسيولوجي والمجهر عالي الدقة. يتضمن سير العمل تصميم الأوعية، وتصنيع الغرفة، وتحضير الحبر المضحى به والطباعة ثلاثية الأبعاد، وتحضير المصفوفة خارج الخلوية (ECM) وإزالة الحبر، وزرع الخلايا البطانية واستزراعها تحت التدفق، وتقييم التسرب الوعائي، ورسم خرائط التدفق، والتلوين المناعي الفلوري (الشكل 1).

البروتوكول

1. تصميم الوعاء

  1. اختر جزءاً من الوعاء الدموي بحيث يتناسب مع الغرفة المتوافقة مع المجهر. وبالنسبة لغرفة Rose، يجب ألا تزيد المسافة بين خزاني المدخل والمخرج عن 1.6cm.
  2. استورد صورة تصوير الأوعية المقطعي المحوسب التبايني (الشكل 2A)، أو تصوير الأوعية بالرنين المغناطيسي، أو تصوير الأوعية بالتنظير التألقي في برنامج ImageJ/FIJI أو أي برنامج آخر لتحليل الصور.
  3. استخدم أداة قياس النقاط لتحديد إحداثيات XY على طول المركز المحوري للوعاء. ثم قم بتصدير الإحداثيات إلى برنامج جداول بيانات (الشكل 2B).
    ملاحظة: يمكن استيراد ملفات STL المستمدة من تصوير الأوعية المقطعي المحوسب مباشرة في معظم برامج الطابعات؛ ومع ذلك، قد تتطلب الطباعة القائمة على المضلعات تمريرات متعددة وتؤدي إلى إنتاج أوعية مضفرة (الشكل التكميلي 1). استخدم كود G-code المباشر للطباعة بتمريرة واحدة. لهذا السبب، يفضل تعيين الإحداثيات والتصميم باستخدام G-code. انظر مثال G-code في الملفات التكميلية.
  4. قم بتعديل إحداثيات XY في جدول البيانات لوضع مركز الوعاء عند نقطة الأصل الرسومية. استورد حدود الغرفة، إذا لزم الأمر، للتأكد من أن المطبوعة النهائية تتناسب مع الغرفة.
  5. استخدم إحداثيات XY الخاصة بالوعاء لتصميم الوعاء في طبقة الطباعة الأولى (الشكل 2C). اضبط ارتفاع الطبقة الأولى، بما في ذلك الوعاء وخزاني المدخل والمخرج المتصلين به، عند 200µm.
  6. صمم خزاني مدخل ومخرج يسمحان بإدخال الإبر بسهولة. استخدم خزانات على شكل معين عند الاقتضاء لتوجيه السائل بكفاءة نحو مدخل الوعاء، مما يقلل من اضطراب التدفق عند الدخول (الشكل 2).
  7. أدرج الخزانات في طبقة الطباعة الأولى بحيث تظل متصلة بالوعاء. أضف من 5–9 طبقات فوق الطبقة القاعدية لتوفير حجم كافٍ لوضع إبر المدخل والمخرج. بالنسبة لتصميم G-code، تعتبر التفاصيل التالية مهمة:
    1. اضبط رأس الطباعة وسرير الطباعة، في حال توفر التحكم في درجة الحرارة، على 37°C باستخدام برنامج الطابعة أو أوامر G-code المناسبة في بداية ملف الطباعة.
    2. حدد رأس الطباعة أو الباثق في G-code عند توفر رؤوس طباعة متعددة. قم بتكوين G-code لاستخدام الإحداثيات المطلقة ومسافات البثق.
    3. اضبط ارتفاع الطبقة بناءً على حجم الإبرة وشكلها، وضغط تدفق الحبر، وسرعة رأس الطباعة. استخدم ارتفاع طبقة 200µm لكل طبقة خزان فوق الطبقة الأولى في الأمثلة الموضحة هنا.
    4. استخدم ضغطاً عكسياً يتراوح بين 14–17psi وسرعة رأس طباعة تبلغ 6mm/s (G-code: F360) للخزانات. وزد سرعة رأس الطباعة إلى 15mm/s (G-code: F900) للوعاء.
  8. اختبر كل تصميم وعاء جديد على شريحة زجاجية بدون غرفة قبل طباعة الوعاء النهائي.

2. تحضير الحبر المضحّي

  1. أضف 2.1g من أكسيد البولي إيثيلين (PEO) إلى 60mL من الماء المعقم البارد لتحضير محلول بتركيز 3.5% w/v في وعاء معقم مغطى يحتوي على قضيب تحريك معقم. قم بالتحريك عند 4°C لمدة 48h على الأقل، وتحقق بشكل دوري من ذوبان كامل المسحوق.
    ملاحظة: يُحفظ محلول PEO في وعاء محكم الإغلاق عند 4°C لمدة تصل إلى شهر واحد.
  2. أضف 17.5g من Pluronic F-127 إلى 50mL من الماء المعقم البارد لتحضير محلول بتركيز 35% في وعاء معقم مغطى يحتوي على قضيب تحريك معقم. قم بالتحريك عند 4°C لمدة 48h على الأقل وتحقق بشكل دوري من الاندماج الكامل للمسحوق.
  3. اجمع 11.4mL من PEO بتركيز 3.5% البارد مع 28.6mL من Pluronic F-127 بتركيز 35% البارد في أنبوب مخروطي معقم سعة 50mL. اخلط المزيج لمدة 24h على الأقل عند 4°C باستخدام خلاط دوراني.
  4. ضع الأنبوب في وضع رأسي عند 4°C طوال الليل للسماح للفقاعات بالصعود خارج المحلول.
  5. ضع الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على الحبر في حمام مائي وحضنه عند 63°C لمدة 3h. اترك الغطاء مفتوحاً قليلاً أثناء التسخين للسماح للهواء المتمدد بالخروج.
  6. أخرج الأنبوب من الحمام المائي واتركه يبرد تدريجياً حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. أحكم إغلاق الغطاء بعد تبرد المحلول.
  7. ضع الحبر المبستر على الثلج لمدة 2، مع الرج الخفيف من حين لآخر دون إدخال فقاعات.
  8. قم بإزالة مكبس المحقنة، وغطِّ منفذ الإبرة، واملأ المحقنة إلى 60%–70% من سعتها. أدخل المكبس، واقلب المحقنة، ثم أزل غطاء منفذ الإبرة، واطرد كل الهواء المحبوس.
    ملاحظة: تُحفظ المحاقن المملوءة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى شهر واحد.

3. تصنيع غرفة Rose وتجهيز التمديدات الصحية

  1. قم بتصنيع لوحي التثبيت العلوي والسفلي من الألومنيوم أو طباعتهما ثلاثياً باستخدام ملفات CAD/STL المرفقة (الشكل 2). يجب أن يتضمن اللوح السفلي فتحة مشطوفة كبيرة بما يكفي للسماح بوصول العدسة الشيئية ذات الفتحة العددية العالية، مع وجود إطار دعم للمسامير التي تضغط أغطية الشرائح بإحكام مقابل الحاشية.
    ملاحظة: يوفر الألومنيوم انتقالاً حرارياً أفضل أثناء الفحص المجهري باستخدام المنصة المسخنة. أما الأجزاء المطبوعة ثلاثياً من مادة PLA أو المعززة بألياف الكربون فهي مناسبة للنماذج الأولية، ولكنها قد توفر انتقالاً حرارياً أقل كفاءة وقد تتعرض للالتواء أثناء التسخين المتكرار.
  2. قص ورقة السيليكون لتناسب لوحي التثبيت بمقاس 38mm × 51mm. قم بعمل نافذة الرؤية المركزية باستخدام ثاقبة ثقوب بقطر 18mm.
  3. احفر ثقوباً مناسبة لقطر المسامير المختارة. اشطف الحاشية المكتملة جيداً بالماء لإزالة بقايا السيليكون.
  4. قم بتعقيم لوحي التثبيت المعدنيين والمسامير والصواميل وحاشيات السيليكون باستخدام الموصدة (Autoclave) في كيس مغلق من رقائق الألومنيوم باستخدام دورة تجفيف لمدة 20min.
  5. اغمر الألواح المطبوعة ثلاثياً في إيثانول بتركيز 70% لمدة 1min، ثم جفف الألواح في منطقة معقمة.
  6. جهز أنابيب بأطوال تتراوح بين 10–30cm مزودة بوصلات Luer-lock ومشابك أنابيب مدمجة، وأنابيب مناسبة للمضخة التمعجية، وصمام إيقاف ثلاثي الاتجاهات، ومخمد نبضات، وخزان وسائط بفتحتين (الشكل 3).
  7. عقم الأنابيب ومكونات الخزان المتوافقة مع الحرارة باستخدام الموصدة. أما المكونات التي لا يمكن تعقيمها بالموصدة، فقم بتعقيمها عن طريق تعريضها للإيثانول.

4. تحضير كواشف المصفوفة خارج الخلية

  1. أضف 12.5mL من محلول PBS الدافئ عند 37°C إلى 1g من فيبرينوجين البلازما البشرية لتحضير محلول مركز بتركيز 80mg/mL. يتم التحضين عند 37°C مع الرج اللطيف من حين لآخر دون استخدام جهاز المزيج الدوامي (vortexing).
  2. اترك الفيبرينوجين لمدة 1–2h حتى يذوب، مكوناً محلولاً عكراً. قسم المحلول إلى حصص في أنابيب معقمة واحفظها عند −20°C لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  3. أضف 22.5g من الجيلاتين إلى 135mL من محلول PBS المعقم في زجاجة معقمة تحتوي على قضيب تقليب مغناطيسي. يتم التقليب لمدة 16h عند 70°C، مع رج الزجاجة بشكل دوري لضمان الذوبان الكامل.
  4. اضبط الرقم الهيدروجيني (pH) لمحلول الجيلاتين إلى pH 7.5 باستخدام 1M NaOH. قم بترشيح المحلول باستخدام الفلترة الفراغية وهو ساخن، ثم قسمه إلى حصص واحفظه عند 4°C لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    ملاحظة: اترك الجيلاتين ليرتوي (bloom) لمدة 16h على الأقل قبل الترشيح. حافظ على المحلول وجهاز الترشيح عند 37°C أثناء الترشيح الفراغي لتقليل انسداد المرشح.
  5. أذب ثرومبين البلازما البشرية في محلول PBS معقم ليصل التركيز إلى 1,000 U/mL. اخلط المزيج بلطف، ثم قسمه إلى حصص واحفظه عند −20 °C لمدة تصل إلى سنة واحدة.
  6. أذب 300mg من ترانس جلوتاميناز في 5 mL من محلول PBS وحضنه عند 37°C لمدة 1 h مع الخلط من حين لآخر. قم بترشيح المحلول تعقيمياً في أنبوب جديد واحفظه في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يتم تحضير محلول الترانس جلوتاميناز طازجاً كل يوم. يحفظ مسحوق الترانس جلوتاميناز مجففاً عند 4°C.
  7. أذب كلوريد الكالسيوم في الماء لتحضير محلول بتركيز 1M. قم بترشيح المحلول تعقيمياً واحفظه في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى سنة واحدة.

5. تحضير وتنشيط شرائح التغطية

  1. اغمس أغطية الشرائح النظيفة في الإيثانول، ثم مررها بعناية فوق لهب موقد بنسن لتبخير الإيثانول.
    تنبيه: الإيثانول مادة قابلة للاشتعال. احتفظ بكميات الإيثانول الكبيرة بعيداً عن اللهب المكشوف، وقم بإجراء التعقيم باللهب باستخدام إجراءات السلامة من الحرائق المختبرية المناسبة.
  2. ضع أغطية الشرائح في حامل من الفولاذ المقاوم للصدأ مع مراعاة عدم كسر أو تشظي الزجاج.
  3. اغمر أغطية الشرائح في محلول 0.5% من (3-aminopropyl) trimethoxysilane المخفف في الماء لمدة 30–60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بالرج اللطيف أثناء فترة الحضن.
    تنبيه: تعامل مع (3-aminopropyl) trimethoxysilane باستخدام معدات الوقاية الكيميائية والضوابط الهندسية المناسبة.
  4. اغسل أغطية الشرائح من خلال ست تغييرات من الماء مع الرج اللطيف. تأكد من عدم تحرك أغطية الشرائح من مكانها أثناء نقل الحامل.
  5. أخرج الحامل من الماء، وجفف الماء الزائد بالتربيت، ثم جففها عند 50°C لمدة 30 دقيقة.
  6. اترك أغطية الشرائح لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة أثناء تحضير محلول 0.5% من الجلوتارالدهيد في PBS.
    تنبيه: الجلوتارالدهيد مادة سامة ومخرشة. قم بتحضير المحلول والتعامل معه في خزانة استخلاص كيميائية مناسبة مع ارتداء معدات الوقاية الشخصية الملائمة.
  7. احضن أغطية الشرائح في محلول 0.5% جلوتارالدهيد لمدة 60 دقيقة مع الرج اللطيف لتقليل تراكم الفقاعات وتعزيز التنشيط الموحد.
  8. اشطف أغطية الشرائح من خلال ثلاث تغييرات من الماء المعقم واتركها تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: تُخزن أغطية الشرائح المنشطة تحت تجفيف فراغي لمدة تصل إلى شهرين.

6. تغطية شرائح الغطاء بطبقة أساس من المصفوفة خارج الخلوية

  1. يتم تدفئة 1× PBS، ومخزون الجيلاتين، ومخزون الفيبرينوجين عند 37°C لمدة 30–60 دقيقة.
  2. تُبطن أطباق بتري معقمة بحجم 15 سم بفيلم بارافيلم نظيف، ويُرش السطح بإيثانول 70%، ثم يُصرف الفائض، ويُترك السطح ليجف في الهواء داخل كابينة السلامة البيولوجية.
  3. يُضاف 1.68 mL من PBS الدافئ، و2.5mL من مخزون الجيلاتين، و12.5µL من 1M CaCl₂، و625µL من مخزون الفيبرينوجين، و167µL من محلول الترانسجلوتاميناز بالتتابع إلى أنبوب مخروطي سعة 15mL.
  4. يُوضع خليط المصفوفة خارج الخلوية (ECM) في حمام مائي عند 37°C لمدة 30 دقيقة.
  5. يُجهز أنبوب واحد سعة 1.7mL يحتوي على 5µL من مخزون الثرومبين لكل شريحة غطاء.
  6. يُضاف 400µL من تحضير ECM إلى أنبوب الثرومبين ويُخلط بواسطة الماصة لمرة واحدة مع تقليل تكوّن الفقاعات إلى أدنى حد.
  7. يتم توزيع 200µL من الخليط فوراً على البارافيلم المعقم، وتوضع شريحة غطاء منشطة واحدة فوق القطرة باستخدام ملقط. تُضغط الشريحة برفق لضمان التغطية الكاملة.
    ملاحظة: يجب إكمال هذه الخطوة في غضون 20 ثانية تقريباً بعد دمج خليط ECM مع الثرومبين.
  8. يُغطى طبق بتري وتُحضن شرائح الغطاء المطلية لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، تليها ساعتان عند 37°C في حاضنة رطبة.
  9. تُنزع كل شريحة غطاء برفق من البارافيلم عن طريق ثني البارافيلم بعيداً عن الشريحة.
  10. توضع شرائح الغطاء المطلية حديثاً بحيث يكون جانب الهلام للأعلى في طبق بتري نظيف داخل حاضنة رطبة، وتُستخدم في غضون يوم واحد.
  11. بدلاً من ذلك، تُحضن شرائح الغطاء المطلية طوال الليل في حاضنة غير رطبة وتُستخدم في غضون يومين.

7. الطباعة الحيوية للحبر المضحّي وتغليفه في المصفوفة خارج الخلوية (ECM)

  1. أجرِ عمليات طباعة تجريبية قبل طباعة الوعاء للتأكد من أن الحبر ومعلمات الطباعة تنتج أبعاد الوعاء المطلوبة. قم بتحميل ملف الطباعة في برنامج الطابعة.
    ملاحظة: تنتج إبرة توزيع مستدقة بقياس 32 G مع حبر 25% Pluronic F127/1% PEO بشكل موثوق أقطار أوعية تصل إلى 150µm تقريباً تحت الظروف الموضحة هنا. قم بتحسين سرعة رأس الطباعة والضغط الخلفي باستخدام طباعة خطوط بسيطة على الزجاج.
  2. قم بتجميع لوحة التثبيت السفلية، وغطاء الشريحة السفلي المطلي بـ ECM، والحشية السيليكونية، ولوحة التثبيت العلوية بدون غطاء شريحة علوي، ومسمارين. ضع المجموعة في طبق بتري مغطى سعة 100 mm وحافظ عليها عند 37 °C حتى موعد الاستخدام في اليوم نفسه.
  3. قم بتثبيت إبرة الطباعة في سرنجة الحبر وتركيب السرنجة في طابعة البثق الهوائية. قم بتسخين منصة الطباعة ورأس الطباعة ولوحة تسخين مجاورة مسبقاً إلى 37 °C.
  4. جهز مصفوفة ECM كما هو موضح في القسم 6 وحافظ عليها في حمام مائي بدرجة 37 °C. جهز 1.5 mL من المصفوفة لكل غرفة Rose في دفعات سعة 5 mL.
  5. ضع 5 µL من مخزون thrombin في أنبوب معقم سعة 1.7 أو 2 mL لكل غرفة. احتفظ بأغطية شرائح منشطة وغير مطلية إضافية متاحة في كابينة السلامة البيولوجية.
  6. ضع الغرفة التي تحتوي على غطاء الشريحة المطلي بـ ECM على منصة الطابعة وقم بتوسيطها عند نقطة الأصل XY. اخفض الإبرة حتى تلامس سطح ECM أو الزجاج في مركز نافذة الغرفة، وحدد هذا الموضع كنقطة الأصل XYZ.
  7. ارفع الإبرة وطبق أقصى ضغط لملئها بالكامل بالحبر وطرد أي فقاعات مرئية. امسح طرف الإبرة بمنديل مختبري معقم.
  8. اطبع هندسة الوعاء والخزان باستخدام ملف G-code المرفوع. ارفع الإبرة فوراً وأزل الغرفة بعد الطباعة.
  9. افحص الوعاء المطبوع بحثاً عن فقاعات أو انقطاعات. تخلص من أي بنية تحتوي على أي من هذه العيوب وأعد طباعتها.
  10. ضع الغرفة على لوحة التسخين بدرجة 37 °C، وأزل المسامير ولوحة التثبيت العلوية، واخلط 1 mL من مصفوفة ECM المجهزة مع حصة thrombin عن طريق السحب بالماصة لمرة واحدة.
  11. انقل خليط ECM المنشط إلى غرفة الوعاء دون إدخال فقاعات، وضع فوراً غطاء شريحة منشط ووجهه لأسفل فوق ECM. أعد تركيب لوحة التثبيت العلوية وأحكم ربط المسامير حتى تثبت دون إفراط في الربط.
  12. ضع الغرفة المكتملة في طبق بتري مغطى سعة 100 mm واحضنها عند 37 °C لمدة 2 h.

8. تكوين تمدد أوعية دموية باستخدام قالب سلكي

  1. أدخل إبرًا بقياس 21-gauge من خلال الجانبين المتقابلين للحاشية السيليكونية وقم بمحاذاتهما.
  2. قم بمعالجة سلك مندريل طبي من الفولاذ المقاوم للصدأ 304 بقطر 0.0190 بوصة باستخدام الموجات فوق الصوتية في محلول PBS يحتوي على 1% BSA داخل أنبوب مخروطي سعة 15 mL. أخرج السلك واتركه ليجف في الهواء داخل طبق بتري معقم داخل كابينة السلامة البيولوجية.
  3. مرر السلك المغطى بـ BSA عبر كلتا الإبرتين في الحاشية (الشكل 2). قم بثني أحد الطرفين البارزين قليلاً لتسهيل عملية التدوير اللاحقة.
  4. قم بتعقيم الحاشية والإبرة والسلك ومجموعة لوحة التثبيت باستخدام الأوتوكلاف داخل كيس من الرقائق المعدنية.
  5. ضع مجموعة الإبرة/الحاشية فوق شريحة تغطية منشطة ومطلية بـ ECM.
  6. قم بتوصيل إبرة بقياس 21 G بمحقنة تحتوي على حبر Pluronic/PEO مبستر.
  7. ضع قطرة صغيرة من الحبر المضحّي على جانب السلك في مركز الغرفة. ضع قطرة صغيرة من الحبر عند كل نقطة التقاء بين الإبرة والسلك لإنشاء سدادة محكمة.
  8. قم بتحضير خليط ECM وتجميع الغرفة كما هو موضح في الأقسام 7.10-7.12.
  9. بعد أن يتجمد ECM، قم بتدوير الطرف المثني من السلك برفق لتحريره من ECM والحبر المضحّي. اسحب السلك ببطء من الجهاز.
  10. املأ إبرة المدخل بمحلول PBS باستخدام ماصة سعة 200 µL واترك محلول PBS يتدفق عبر اللمعة. كرر العملية مرة واحدة ثم انتقل إلى القسم 9.

9. غسل الحبر التضحي من حجرة الوعاء

  1. قُم بتوصيل الأنابيب بخزان يحتوي على محلول PBS بارد (4 °C) مُدعم بالمضادات الحيوية، وأدخل صمام إيقاف ثلاثي الاتجاهات، وأنهِ الأنابيب بوصلة Luer-lock ذكرية وإبرة معقمة قياس 23 G.
  2. املأ أنابيب الإمداد بمحلول PBS البارد باستخدام سرنجة صمام الإيقاف حتى يخرج محلول PBS من تجويف الإبرة. ثم قُم بتثبيت الأنابيب بمشبك.
  3. املأ طولاً ثانياً من الأنابيب بمحلول PBS وأنهِ الطرف بإبرة قياس 23-G. قُم بتثبيت الأنابيب بمشبك وأزل سرنجة الملء.
  4. أدخل إبرة الإمداد عبر الحاشية إلى خزان المدخل، وإبرة التصريف إلى خزان المخرج. تحقق من دقة الوضع باستخدام مجهر مقلوب أو مجهر ستيريو.
  5. انقل المجموعة إلى درجة حرارة 4 °C وضع خزان الإمداد على ارتفاع 30 cm فوق المدخل. وضع المخرج على ارتفاع 5–10 cm أسفل إبرة مخرج الوعاء فوق حاوية النفايات.
  6. حرر المشابك وقم بتمرير 250 mL على الأقل من محلول PBS البارد عبر الغرفة. افحص النظام بحثاً عن أي تسريبات أو فقاعات أثناء عملية الشطف.

10. تغليف ومعالجة تجويف الوعاء مسبقاً بمكونات إضافية من المصفوفة خارج الخلية (ECM)

  1. قم بتخفيف الفبرونيكتين (fibronectin) إلى 20 µg/mL، أو اللامينين (laminin) إلى 10 µg/mL، أو مصفوفة الغشاء القاعدي (basement membrane matrix) بنسبة تخفيف 1:30 في 3 mL من محلول PBS.
  2. أضف ترانسجلوتاميناز (transglutaminase) المُحضّر حديثاً إلى كاشف المصفوفة خارج الخلوية (ECM) المُخفف.
  3. اترك الأنابيب القريبة مباشرة من الوعاء متصلة بالمدخل والمخرج.
  4. احقن محلول المصفوفة خارج الخلوية/ترانسجلوتاميناز ببطء عبر الوعاء باستخدام حقنة سعة 1 mL. كرر العملية حتى يمر كامل حجم الـ 3 mL عبر الوعاء.
  5. أغلق الموصلات بالمشابك، وسد المدخل والمخرج بأغطية لوير (Luer caps) معقمة، ثم حضّن الوعاء عند 37 °C لمدة تتراوح من ساعة واحدة إلى ليلة كاملة.
  6. اغسل الوعاء بـ 100 mL من الوسط البطاني الكامل المحتوي على بنسيلين/ستربتوميسين. أغلق موصلات الأنابيب بالمشابك وسد المخارج.
    ملاحظة: يُحفظ الوعاء المملوء بالوسط عند 4 °C لمدة تصل إلى أسبوع واحد. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل التجويف.

11. استزراع الوعاء بالخلايا

  1. يتم تحضين الغرفة التي تحتوي على قالب وعاء ECM عند 37 °C لمدة 2 h. يتم تدفئة الوسط البطاني الكامل المحتوي على penicillin/streptomycin إلى 37 °C.
  2. تجرى عملية trypsinize للخلايا البطانية من طبق زرع واحد مقاس 10-cm أو قارورة T75 واحدة، ويتم تحييد trypsin باستخدام الوسط الكامل. ينقل المعلق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL وتؤخذ عينة لعد الخلايا.
  3. يتم طرد الخلايا مركزياً عند 1,000 × g لمدة 5 min. يتم إعادة تعليق الراسب لتحضير 150 µL من معلق الخلايا بتركيز 5 × 106 cells/mL.
  4. يتم توصيل أنبوب المخرج بخزان نفايات معقم مع إبقاء مشبك الأنبوب مغلقاً.
  5. يتم فصل أنبوب المدخل وإزالة الوسط المتبقي من محور إبرة المدخل. يمسك الوعاء بشكل رأسي ويُنقل معلق الخلايا بواسطة الماصة إلى محور الإبرة.
  6. يتم تحرير مشبك المخرج للسماح لمعلق الخلايا بدخول الوعاء. يعاد إغلاق مشبك المخرج بعد دخول المعلق بالكامل إلى التجويف.
  7. يضاف الوسط الكامل الدافئ إلى محور إبرة المدخل، ثم يغلق باستخدام غطاء Luer معقم. يتم فصل المخرج وتغطيته.
  8. يتم تحضين الغرفة في وضعها الصحيح عند 37 °C لمدة 3 h.
  9. تكرر الأقسام 11.5–11.8 ويتم تحضين الغرفة في وضع مقلوب عند 37 °C لمدة 3 h.
  10. يتم غسل الوعاء بلطف باستخدام 1 mL من الوسط الكامل ويحضن عند 37 °C لمدة 3 h.
  11. يتم التأكد من التصاق الخلايا البطانية بواسطة المجهر، وتُشطف الخلايا المتبقية غير الملتصقة بلطف باستخدام وسط جديد، ثم تحضن عند 37 °C لمدة 12–24 h.

12. استزراع الوعاء تحت التدفق

  1. قم بتدفئة 200 mL من الوسط الغذائي الكامل لمدة 1 h وتخلص من الغازات الموجودة فيه تحت تفريغ الهواء باستخدام وحدة ترشيح معقمة. أعد تدفئة الوسط في حاضنة CO₂ رطبة.
  2. داخل كابينة سلامة بيولوجية معقمة، قم بتوصيل مخرج خزان الوسط، والصمام ثلاثي الاتجاهات، وأنابيب المضخة، ومخمد النبضات، ومصيدة الفقاعات (اختيارية)، وأنابيب المدخل، وحجرة الوعاء، وأنابيب المخرج، وأنابيب العودة إلى خزان الوسط بالتتابع (الشكل 3).
  3. قم بتجهيز دائرة التدفق بأكملها بالوسط الغذائي وتأكد من عدم بقاء أي فقاعات أو جيوب هوائية.
    ملاحظة: املأ الموصلات ومراكز الإبر بالسائل قبل إعادة التوصيل. فقد يؤدي دخول فقاعات الهواء إلى وعاء مستزرع بالخلايا إلى فقدان الخلايا البطانية بسبب قوى القص المفاجئة.
  4. انقل المجموعة إلى حاضنة درجة حرارتها 37 °C وابدأ بمعدل تدفق قدره 1 dyn/cm2 في الوعاء. حافظ على هذا التدفق لمدة 12 h.
  5. قم بزيادة التدفق لإنتاج 12–16 dyn/cm2 وحافظ عليه لمدة 18–24 h قبل إجراء المقايسات اللاحقة. لحساب معدل التدفق المطلوب لوعائك، حدد طول الوعاء المطبوع ومتوسط قطره. وباستخدام حاسبة عبر الإنترنت، استخدم المعايير المحددة وأدخل مقطعاً عرضياً دائرياً، ووسطاً غذائياً يحتوي على 10% serum، ومقاومة أنابيب مهملة (حيث أن قطر الأنابيب أكبر بكثير من قطر الوعاء المطبوع).
    ملاحظة: استخدم الوعاء في أقرب وقت ممكن بعد تهيئة التدفق. قد يؤدي الاستزراع لأكثر من 1 week إلى حدوث فجوات بين الخلايا البطانية، وهو ما قد يرتبط بفقدان الخلايا أو تعديل المصفوفة خارج الخلوية (ECM) بواسطة البروتياز البطاني.

13. إجراء مقايسة التسرب الوعائي

  1. أضف BSA المسمى بـ Alexa 647 أو ديكستران Alexa 647 بوزن 10 kDa إلى 35 mL من الوسط الكامل للحصول على تركيز نهائي قدره 5 mg/mL. قم بتدفئة المحلول حتى 37 °C.
  2. قم بحضانة الوعاء مسبقاً مع العامل الاختباري، مثل 250 ng/mL من TNFα، لمدة 1–2 h مع إضافة العامل نفسه إلى وسط المقايسة.
  3. قم بتجهيز حمام مائي بدرجة حرارة 37 °C وضع المضخة بالقرب من المجهر. قم بتشغيل المجهر وبرمجيات الاستحواذ ونظام تسخين المنصة، واترك المنصة لتصل إلى حالة الاتزان عند 37 °C لمدة 30 min قبل التصوير.
  4. أوقف التدفق في الحاضنة، وافصل خزان وسط المزرعة، وانقل الحجرة والأنابيب المرتبطة بها إلى منصة المجهر التي تم تدفئتها مسبقاً.
  5. قم بتوصيل المضخة بطول 20 cm تقريباً من الأنابيب المزودة بماصة زجاجية دقيقة تحتوي على وسط غير مسمى. أدخل أنبوب الماصة الدقيقة في وسط التقرير الفلوري وضع أنبوب المخرج في وعاء تجميع.
  6. اضبط المضخة لتقديم معدل تدفق يعادل 0.2 mL/min، ولا تبدأ التدفق حتى يكون التصوير جاهزاً.
  7. قم بضبط التركيز على خط منتصف الوعاء باستخدام تصوير تباين الطور وانتقل إلى قناة الفلورة 647. ابدأ التدفق بالمعدل المحدد في القسم 13.6 واستحوذ على الصور كل 1–5 min وفقاً لوقت الاستجابة المتوقع.
  8. أنشئ مخططات kymographs من الصور المستحوذ عليها وطبق منحدراً خطياً على قيم الكثافة التي تتجاوز العتبة. سجل التسرب كمسافة مقاسة بـ µm يقطعها المؤشر من السطح الخارجي للوعاء لكل min.

14. رسم خريطة تدفق السوائل

  1. رجّ باستخدام جهاز المرجّ الدوامي الـ 10 µm الخرزات الفلورية لمدة دقيقة واحدة، ثم قم بمعالجتها بالموجات فوق الصوتية في حمام سونيكاتور لمدة دقيقة واحدة. خفف الخرزات إلى 1.8 × 105خرزة/مل في 10 مل من الوسط الغذائي الكامل.
  2. قم بتكوين نظام التدفق على منصة المجهر كما هو موضح في القسم 13 لإجراء مقايسة التسرب الوعائي. قم بتضمين وعاء تجميع للتصريف واضبط معدل التدفق على 0.2 مل/دقيقة.
  3. ركز على المستوى المركزي للوعاء باستخدام عدسة شيئية ذات مسافة عمل مناسبة. التقط الصور بأقصى تردد عملي تسمح به مدة التعرض، وحساسية الكاشف، وشدة الاستثارة، وكفاءة تجميع الضوء.
  4. حلل تسلسل الصور المتقطعة زمنياً (time-lapse) باستخدام برنامج قياس سرعة الصور الجسيمية (particle image velocimetry).

15. تثبيت وتلوين الوعاء الدموي المبطن بالخلايا البطانية مناعياً

  1. قم بتحضير 40 mL من بارافورمالدهيد بتركيز 4% في محلول PBS يحتوي على 10 mM CaCl₂ و10 mM MgCl₂.
    تحذير: البارافورمالدهيد مادة سامة. يتم تحضير وتداول المحاليل التي تحتوي على البارافورمالدهيد في خزانة أبخرة كيميائية مناسبة مع ارتداء معدات الوقاية الشخصية الملائمة.
  2. أوقف التدفق، وأغلق أنبوب الإدخال بالمشبك، وافصله عن المضخة، ثم صله بأنبوب السحب المستخدم في مقايسة التسرب الوعائي. أدخل أنبوب السحب في المثبت واسمح لـ 35 mL بالمرور عبر الوعاء عن طريق الجاذبية.
  3. أغلق الأنبوب بالمشبك واترك الوعاء في المثبت في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  4. اغسل الوعاء عن طريق الجاذبية بـ 25 mL من محلول نفاذية يحتوي على 0.4% Triton و20 mM PIPES عند pH 6.1 و138 mM NaCl و5 mM KCl و2 mM MgCl₂ و2 mM EGTA و5.5 mM glucose. أغلق الأنبوب بالمشبك واتركه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. اغسل الوعاء بمحلول حجب يحتوي على 1% BSA و0.05% Tween 20 و20 mM Tris عند pH 7.4 و140 mM NaCl و5 mM KCl. اترك الوعاء لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 °C.
  6. خفف الجسم المضاد الأولي المختار بنسبة 1:50–1:500 في 100–500 µL من محلول الحجب. قم بإزالة أنبوب الإدخال وأدخل محلول الجسم المضاد باستخدام الإجراء الموضح في القسم 11 الخاص بزراعة الخلايا.
  7. اترك الوعاء طوال الليل عند 4 °C.
  8. أعد توصيل أنبوب الإدخال واغسل الوعاء بـ 20 mL من محلول PBS.
  9. خفف الأجسام المضادة الثانوية المناسبة بنسبة 1:200–1:1,000 في محلول الحجب، وعند الحاجة، أضف فالويدين الفلوري بنسبة 1:250. أدخل المحلول باستخدام الإجراء الموضح في القسم 15.6 واتركه لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
  10. اغسل الوعاء بـ 40 mL من محلول PBS، وأغلق مشابك الأنابيب، ثم قم بتغطية الأنابيب.
    ملاحظة: يتم تخزين الوعاء المصبوغ عند 4 °C ويتم تصويره خلال أسبوعين.
  11. قم بصبغ F-actin باستخدام فالويدين الفلوري، وجهاز جولجي باستخدام anti-GM130، والنوى باستخدام DAPI.
  12. حلل صور الفالويدين باستخدام FibrilTool74 لتحديد متوسط اتجاه ألياف الإجهاد لـ F-actin.
  13. حدد المحور بين مراكز الكتلة لكل نواة وجهاز جولجي. قم بتحليل ورسم الاتجاهات الناتجة في برنامج حوسبة عددية كما وصف سابقاً75.

النتائج

لقد أثبتت عدة مجموعات بحثية جدوى استخدام الحبر التضحي (sacrificial ink) لطباعة أنسجة أنبوبية متنوعة، ولا سيما مختبر Lewis الذي قام بتصنيع أنابيب كلوية إلى جانب أوعية دموية.67,76وقد استُخدمت مقاربات مماثلة لطباعة الهياكل السنخية.77 والأورام الموعاة78وهنا، تم تطويع هذه المنهجيات لإنشاء هندسات وعائية من أجل استقصاء الاستجابات البطانية تحت تأثير التدفق السائلي الفسيولوجي (الشكل 2تم تحويل هندسات الأوعية من صورة وعائية إلى خريطة إحداثيات، ومن ثم إلى رمز G-code لتحديد مسار الطباعة (الشكل 2أ–Cأتاح النهج الناتج تصنيع قوالب للأوعية الدموية لدراسة كيفية تغير الوظيفة البطانية وتنظيم الهيكل الخلوي بفعل الأوعية المتعرجة وتمدد الأوعية الدموية (الشكل 2D–Gكما تم دمج تصميم لغرفة روز (Rose chamber) قابلة للطباعة ثلاثية الأبعاد للقضاء على الحاجة إلى الاستعانة بخدمات الفنيين المختصين بالآلات (الشكل 2H). ويتوفر مثال لملف G-code الخاص بطباعة الوعاء في الملف التكميلي 1، كما تتوفر ملفات التصميم بمساعدة الحاسوب (CAD) المقابلة لغرفة Rose وقاعدة التثبيت في الملف التكميلي 2 و الملف التكميلي 3، على التوالي. قد تتطلب الطباعة القائمة على ملفات STL تمريرات متعددة لرأس الطباعة، مما يؤدي إلى تكوين أوعية ذات هندسة مضفرة ذات تجاويف منفصلة (الشكل التوضيحي الإضافي 1صُممت المنصة الناتجة لتكون متاحة لبيولوجيي الخلايا الوعائية الذين لديهم حد أدنى من الخبرة في الهندسة الحيوية، مع دعم معدلات الضغط والتدفق الفسيولوجية وتوفير إمكانية الوصول إلى المجهر عالي الدقة (الشكل 2I).

بعد تصنيع الوعاء الدموي وعملية الخلوية، تم دمج جهاز الوعاء في نظام تروية مغلق الحلقة لتمكين تدوير الوسط الغذائي بشكل محكم (الشكل 3). تألف النظام من مضخة 연دية، وصنبور إيقاف ثلاثي الاتجاهات متصل بمحقنة تحضير، ومصيدة فقاعات، ومخمد نبضات، وجهاز الوعاء، وخزان للوسط الغذائي، مرتبة بالتتابع داخل دائرة التدفق (الشكل 3A). سمح هذا التكوين بتدوير الوسط الغذائي باستمرار عبر الوعاء المهندس مع دمج مكونات لتحضير النظام، وإزالة الفقاعات، وتخميد النبضات الناتجة عن المضخة 연دية. يمكن تشغيل النظام المجمع مع وضع جهاز الوعاء ضمن الإعداد التجريبي، كما هو موضح في الشكل 3B، مما يوفر تكويناً عملياً لعمليات التروية اللاحقة للأوعية الخلوية تحت ظروف تدفق محكومة.

تَمثّل أحد التعديلات التي أُدخلت على مناهج الحبر التضحوي الموصوفة سابقاً في بسترة الحبر قبل الطباعة. كان هذا التعديل ضرورياً لأن تطبيق بروتوكولات تحضير الحبر المنشورة أدى إلى ظهور مستنبتات ملوثة بالعفن. وكما هو الحال مع أحبار Pluronic الأخرى المستخدمة في هذا التطبيق، يظل حبر 25% Pluronic F127/1% PEO سائلاً في درجات الحرارة المنخفضة ويتحول إلى هلام ميسيلار متراص مع ارتفاع درجة الحرارة. تبلغ درجة حرارة التحول لهذه التركيبة 15°C، وهو أمر ملائم لتشكيل الهياكل في درجات حرارة الحاضنة وإزالة الحبر عند 4°C. وعلى غرار Pluronic النقي، تظهر هذه المادة أيضاً تسييلاً قصياً كبيراً عند درجة حرارة الطباعة (الشكل 4A). ومع ذلك، حتى في درجات الحرارة المنخفضة، يكون الحبر لزجاً جداً بحيث يتعذر تعقيمه بالترشيح باستخدام مرشحات زراعة الأنسجة القياسية والمفرغة من الهواء. ورغم إمكانية تعقيم الحبر عن طريق البسترة عند 70°C أو أعلى لمدة 20s، إلا أن درجات الحرارة هذه تغير خصائص الحبر بشكل غير قابل للانعكاس وتقلل من لزوجته عند درجة حرارة الطباعة (البيانات غير موضحة). وتعمل البسترة عند درجة حرارة أقل ولمدة أطول (63°C لمدة >1 h) على تقليل التلوث بالفطريات والكائنات الدقيقة الأخرى دون تغيير اللزوجة المعقدة للحبر عند درجات الحرارة المناسبة للطباعة. وأظهر التوصيف الريولوجي باستخدام مقياس الريومتر المزود بهندسة مخروط ولوحة بحجم 25 mm أن الحبر الخام والمبستر يمتلكان لزوجات متشابهة عبر مجموعة من سرعات التشوه عند درجات حرارة الطباعة (الشكل 4B)، مما يثبت أن البسترة لا تؤثر سلباً على القابلية للطباعة. كما يتيح الحبر المبستر زراعة الأوعية لفترات أطول دون الحاجة إلى الأدوية المضادة للفطريات، والتي يمكن أن تغير الوظيفة البطانية.

بمجرد إتمام عملية استزراع الخلايا في الوعاء، يجب أن تغطي الخلايا البطانية الملتصقة والناضجة الوعاء بالكامل، كما هو موضح في الشكل 5، مع استخدام الإسقاط ذي الكثافة القصوى في الشكل 5أ والمقطع العرضي في الشكل 5Bويمكن بعد ذلك زيادة تدفق الوسط ليصل إلى معدلات قص فسيولوجية، والتي يمكن تقديرها للأوعية الدائرية تقريباً باستخدام معادلة هاغن-بوازيل (Hagen-Poiseuille).79عملياً، يمكن تقدير معدل التدفق المطلوب لتحقيق إجهاد قص محدد من خلال أخذ لزوجة الوسط والمقاومة الموائعية الدقيقة في الاعتبار. وفي حالة الزرع ثنائي الأبعاد النموذجي في المختبر، وتدفق الوسط بمعدل 12 دين/سم²2يُحفز معظم أنواع الخلايا البطانية على التوجه على طول محور التدفق. ويمكن تصور هذه الاستجابة عن طريق صبغ F-actin بالفالويدين الفلوري (الشكل 5D،إي) أو عن طريق تحليل المحور الغولجي-النووي (الشكل 5D،إف)، وكلاهما يظهر توجهاً متباين الخواص يتفق مع الاستقطاب البطاني، كما تم وصفه سابقاً18على الرغم من أن إجهادات القص التي تتجاوز 40 داين/سم²2 يحدث في الجسم الحي، ولم يتم نمذجة مثل هذه الظروف هنا.

تتمثل إحدى النتائج الرئيسية لتغير هندسة الأوعية في تغير تدفق السوائل، وهو ما تستجيب له الخلايا البطانية من خلال عدة مسارات تأشير80,81. وتتوفر طرق متعددة لمراقبة سرعة تدفق الدم، بما في ذلك الموجات فوق الصوتية بدوبلر رباعية الأبعاد (4D Doppler ultrasound)82، والتصوير بالرنين المغناطيسي لتدفق الدم رباعي الأبعاد (4D flow MRI)83، وتصوير تتبع بقع الليزر (laser speckle imaging)84. وعلى الرغم من أن هذه التقنيات توفر مزايا هامة in vivo، إلا أن تحديد الفروق المحلية في التدفق عبر وعاء واحد قد يكون أمراً صعباً. تتيح قدرة التصوير ذات الفتحة العددية العالية لهذه المنصة تتبع الجسيمات الفلورية المباشر (الشكل 6B) ورسم خرائط عالية الدقة المكانية لشذوذ التدفق الناجم عن انحناء الوعاء باستخدام قياس سرعة الصور الجسيمية (particle image velocimetry) (الشكل 6C). على سبيل المثال، يُلاحظ تدفق أبطأ على طول الانحناء الداخلي للوعاء مقارنة بالانحناء الخارجي (الشكل 6C)، وهو ما قد يسهم في تغيير الاستجابات البطانية85.

بمجرد تكوين وعاء دموي متصل (confluent)، يمكن تقييم النفاذية ووظيفة الحاجز عن طريق تروية جزيئات كبيرة ذات علامات فلورية، مثل الديكسترانات أو البروتينات، عبر التجويف. وتقاوم الأوعية النافذة المبطنة بـ HUVECs مرور الديكسترانات ذات العلامات الفلورية (الشكل 6D,F). وفي المقابل، يؤدي التعرض للمحفزات التي تؤدي إلى تعطيل الحاجز، مثل TNFα، إلى زيادة تسرب الوعاء الدموي (الشكل 6H, J). ويمكن تصور معدلات التسرب الموضعية باستخدام تحليل الكيموغراف (kymograph analysis) (الشكل 6E,G,I,K). وبما أن الكيموغراف يمثل المسافة على المحور X والزمن على المحور Y، يمكن مقارنة معدلات التسرب النسبية عن طريق قياس منحدرات الخطوط المجهزة لشدة الفلورة المقسمة (الشكل 6E,G,I,K). تتيح هذه التحليلات تقييم كيفية تأثير هندسة الوعاء الدموي الموضعية على وظيفة الحاجز البطاني استجابةً لمحفزات محددة.

تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذه المنصة في تحسين إمكانية الوصول المجهري مقارنة بما هو ممكن in vivo. كما يسهل النظام التحليل الكيميائي النسيجي المناعي للتنظيم الجزيئي البطاني، لا سيما الهيكل الخلوي للأكتين. وتكون الخلايا البطانية رقيقة جداً ومحاطة بخلايا العضلات الملساء in vivo، مما قد يعقد عملية تحديد موقع هياكل الهيكل الخلوي خصيصاً داخل البطانة. وتتيح هذه المنصة صبغ وتصوير جزيئات الالتصاق والأكتين الخيطي في الخلايا البطانية بشكل مباشر (الشكل 5)، وتدعم التحليلات متعددة المكونات التي يصعب إجراؤها in vivo، بما في ذلك تقييم الاستقطاب والانقسام البطاني تحت تدفق فسيولوجي (الشكل 5D–F). إن الجمع بين هذه المقاييس في منصة واحدة يتيح الفحص المباشر للعلاقات بين هندسة الوعاء الدموي، والتدفق المتغير، ووظيفة الحاجز، والتنظيم الجزيئي البطاني، والالتصاق بين الخلايا.

figure-results-1
الشكل 1: سير عمل طباعة واستخدام الأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد على شريحة. مخطط انسيابي للبروتوكولات الخاصة بإنشاء واستخدام الأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد على شريحة. تشير الدوائر السوداء إلى أرقام البروتوكولات المقابلة. وتشير ألوان الصناديق إلى درجة الحرارة التي يتم عندها تنفيذ كل بروتوكول أو تحضين العينة. يتضمن سير العمل نمذجة شكل الوعاء، وتحضير الحبر، وتحضير المصفوفة خارج الخلية (ECM)، وتحضير الغرفة، وطباعة الوعاء، وغسل الوعاء وطلاؤه، والخلوية، والزراعة التدفقية، والمقاييس الوظيفية، والتحليل النسيجي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: طباعة الأوعية وتصميم الغرفة. يمكن تصميم الأوعية بناءً على صور وعائية in vivo لإعادة إنتاج هندسة وعائية خاصة بالمريض. (A) وعاء تاجي صغير تم تصويره بواسطة التصوير المقطعي المحوسب (CT) المعزز بالتباين، أُعيد إنتاجه بإذن من Parekh et al.86 شريط المقياس = 2 mm. (B) خريطة إحداثيات لنقاط مرجعية من جزء من الوعاء الموضح في اللوحة A، تم إنشاؤها عن طريق تسجيل النقاط في FIJI. (C) مخرجات G-code تم إنشاؤها من خريطة الإحداثيات باستخدام برنامج التحكم في الطابعة. يشار إلى إحداثيات X و Y و Z في أسفل اليمين. (D) مخطط لغرفة Rose تحتوي على وعاء مطبوع حيوياً. التصميم المزود بصواميل إبهام علوية متوافق مع غرفة حمض البولي لاكتيك (PLA) المطبوعة ثلاثية الأبعاد. (E) غرفة Rose تحتوي على وعاء وخزانات مطبوعة بحبر حيوي تضحي به على غطاء شريحة مغطى بـ ECM. شريط المقياس = 9 mm. (F) مخطط لغرفة Rose مهيأة لنموذج تمدد الأوعية الدموية (aneurysm). يعمل سلك ممرر عبر إبر المدخل والمخرج كقالب للوعاء، ويعمل الحبر الحيوي التضحي المترسب على السلك كقالب لتمدد الأوعية الدموية. (G) غرفة Rose تحتوي على السلك وقالب الحبر الحيوي التضحي على غطاء شريحة مغطى بـ ECM. (H) محول منصة مجهر مصنوع من PLA مطبوع ثلاثي الأبعاد (يسار) وغرفة Rose (يمين)، مما يوفر بدائل للمكونات المصنوعة من الألومنيوم الآلي. يتم تثبيت المشابك المعدنية الموجودة على محول المنصة بلوحة المحول. شريط المقياس = 30 mm. (I) وعاء مطبوع ومغسول في غرفة Rose من الألومنيوم مثبتة على منصة مجهر مع إبر أنابيب المدخل والمخرج المتصلة. شريط المقياس = 20 mm. الاختصارات: CT = التصوير المقطعي المحوسب؛ ECM = المصفوفة خارج الخلية؛ PLA = حمض البولي لاكتيك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: نظام تدفق السوائل لوعاء خلوي في غرفة روز (Rose chamber). (A) مخطط لتكوين الأنابيب المستخدم لإنشاء تدفق للسوائل عبر غرفة روز تحتوي على وعاء خلوي. تشير الأسهم إلى اتجاه التدفق. المكونات المرقمة هي: (1) مضخة 연동ية (peristaltic pump)، (2) صنبور إيقاف ثلاثي الاتجاهات مع حقنة تحضير، (3) مصيدة فقاعات، (4) مخمد نبضات، (5) جهاز الوعاء، و(6) خزان الوسط. يتم تعقيم جميع المكونات التي تلامس وسط الزرع قبل الاستخدام. (B) نظام تدفق السوائل الذي يحتوي على وعاء خلوي في غرفة روز داخل حاضنة زراعة الأنسجة. تتوافق الأرقام مع المكونات الموضحة في اللوحة A. تم تثبيت إبر الدخول والخروج بشريط لاصق لضمان الاستقرار. شريط المقياس = 40 mm. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: التوصيف الريولوجي للحبر الحيوي المضحى به. (A) لزوجة القص لحبر Pluronic F127 بنسبة 25% / polyethylene oxide (PEO) بنسبة 1% غير المبستر كدالة لمعدل القص عند 5 °C و10 °C و14.4 °C و15 °C و23 °C. (B) اللزوجة المركبة كدالة للتردد الزاوي لحبر Pluronic F127/PEO غير المبستر والمبستر عند 25 °C و37 °C. الاختصار: PEO = polyethylene oxide. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: التصوير والتحليل الكمي للأوعية المبطنة بالخلايا المبطنة والمثبتة والمصبوغة. (A) إسقاط الكثافة القصوى لصور مجهر الفلورسنس البؤري ذو القرص الدوار وعاء مكتمل التخليل الخلوي بعد الزرع الأولي والاستزراع تحت إجهاد قص منخفض (1 dyn/cm2). صبغ الوعاء لـ VE-cadherin (أخضر)، و F-actin (أحمر)، و DNA باستخدام DAPI (أزرق). شريط المقياس = 50 µm. (B) مقطع عرضي xz مُعاد بناؤه لمجموعة صور z-stack من مجهر الفلورسنس البؤري ذو القرص الدوار لوعاء مكتمل التخليل الخلوي مصبوغ بـ phalloidin الفلوري لوسم F-actin (أحمر). شريط المقياس = 50 µm. (C) إسقاط الكثافة القصوى لمجموعة صور z-stack من مجهر الفلورسنس البؤري ذو القرص الدوار لوعاء مكتمل التخليل الخلوي بعد 24 h من التدفق عند 12 dyn/cm2. وُسم F-actin بـ phalloidin الفلوري (أحمر). شريط المقياس = 100 µm. (D) صورة مجهر الفلورسنس البؤري ذو القرص الدوار لمنطقة في الوعاء بعد 24 h من الاستزراع تحت إجهاد قص قدره 16 dyn/cm2. صبغ الوعاء لـ VE-cadherin (أصفر)، و F-actin (أرجواني)، ووسم جهاز جولجي GM130 (أخضر)، و DNA باستخدام DAPI (أزرق). يشير السهم إلى اتجاه التدفق. شريط المقياس = 30 µm. (E) تقدير كمي ممثل لمتوسط توجيه ألياف الإجهاد من قناة F-actin في اللوحة D باستخدام FibrilTool74. تم تحليل شبكة مكونة من 45 منطقة، مساحة كل منها 1,600 µm2، وتظهر متوسطات توجيه الألياف كمدرج تكراري شعاعي بالنسبة لاتجاه التدفق. (F) تقدير كمي ممثل لمحور النواة-جهاز جولجي من اللوحة D كمقياس لاستقطاب الخلايا المبطنة. تُرسم المتجهات من مركز كل نواة إلى مركز جهاز جولجي المقابل كمدرج تكراري شعاعي بالنسبة لاتجاه التدفق؛ n = 75 متجهاً. الاختصار: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6: تحليل تدفق السوائل والتسرب الوعائي. (A) مخطط لهندسة الوعاء المستخدمة في التحليلات في اللوحات B–K. تشير الحروف إلى مناطق الأوعية التقريبية المقابلة للوحات المعنية. (B) إسقاط زمني مشفر بالألوان لتسلسل صور فلورية مجهرية بؤرية ذات قرص دوار بنظام التصوير الزمني، يوضح حبيبات فلورية تتحرك تحت التدفق عبر منطقة وعائية منحنية. يشير اللون إلى رقم الإطار من 1 إلى 100؛ كما تم تحديد الانحناءات الخارجية والداخلية. (C) تحليل قياس سرعة الصور الجسيمية (PIV) يوضح سرعة التدفق النسبية عبر منطقة الوعاء المنحنية. تمثل الألوان السرعة النسبية، وتشير الأسهم إلى اتجاه التدفق ومقداره. شريط المقياس = 50 µm. (D–G) مقايسة تمثيلية للحاجز الوعائي لوعاء غير معالج تم ترويته بـ dextran بوزن 10 kDa موسوم بـ Alexa 647. (D,D′,D″) صور لمنطقة وعائية مستقيمة تم الحصول عليها عند 0 و70 و150 min، على التوالي. يشير الخط الأبيض إلى المنطقة المستخدمة في المخطط الزمني (kymograph) في اللوحة E. (E) مخطط زمني (kymograph) للمنطقة المستقيمة في اللوحة D يظهر معدل تسرب قدره 0.39 µm/min، وهو يمثل ميل الخط المتقطع. (F,F′,F″) صور لمنطقة وعائية منحنية تم الحصول عليها عند 0 و70 و150 min. يشير الخط الأبيض إلى المنطقة المستخدمة في المخطط الزمني في اللوحة G. شريط المقياس = 150 µm. (G) مخطط زمني (kymograph) للمنطقة المنحنية في اللوحة F يظهر معدل تسرب قدره 1.01 µm/min، وهو يمثل ميل الخط المتقطع. (H–K) مقايسة تمثيلية للحاجز الوعائي بعد التحضين المسبق مع 250 ng/mL من عامل نخر الورم ألفا (TNFα). (H,H′,H″) صور لمنطقة وعائية مستقيمة تم الحصول عليها عند 0 و200 و400 min، على التوالي. يشير الخط الأبيض إلى المنطقة المستخدمة في المخطط الزمني في اللوحة I. شريط المقياس = 250 µm. (I) تحليل المخطط الزمني (kymograph) للمنطقة الوعائية المستقيمة في اللوحة H يظهر معدل تسرب قدره 2.1 µm/min، وهو يمثل ميل الخط المتقطع. (J,J′,J″) صور لمنطقة وعائية منحنية تم الحصول عليها عند 0 و200 و400 min. يشير الخط الأبيض إلى المنطقة المستخدمة في المخطط الزمني في اللوحة K. شريط المقياس = 250 µm. (K) تحليل المخطط الزمني (kymograph) للمنطقة الوعائية المنحنية في اللوحة J يظهر معدل تسرب قدره 6.7 µm/min، وهو يمثل ميل الخط المتقطع. تحدد النجوم في اللوحات D–K النهايات المقابلة للخطوط المستخدمة لإنشاء المخططات الزمنية. الاختصارات: PIV = قياس سرعة الصور الجسيمية؛ TNFα = عامل نخر الورم ألفا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: طباعة الأوعية باستخدام برمجة الطابعة القائمة على STL. (A) صورة تباين التداخل التفاضلي لوعاء مطبوع تم إنتاجه باستخدام برمجة الطابعة القائمة على STL، والتي توجه رأس الطابعة لإجراء ممرين، مما ينتج عنه بنية وعائية مجدولة. شريط المقياس = 250 µm. (B) تصيير ثلاثي الأبعاد للوعاء المجدول المغسول والمليء بالألبومين المصل البقري (BSA) المسمى بـ Alexa 647. تظهر فجوة بين تجاويف الخصلتين المجدولتين. شريط المقياس = 100 µm. الاختصارات: BSA = bovine serum albumin؛ STL = standard tessellation language. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: رمز G لطباعة الوعاء. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: رسم CAD لغرفة Rose. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: رسم CAD لمهايئ تثبيت المسرح. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

يتم وصف نظام قوي لنمذجة الأشكال الهندسية للأوعية الدموية المرتبطة بالتدفق المضطرب، بما في ذلك الأوعية المتعرجة، وتمدد الأوعية الدموية، ونقاط التفرع. تدعم هذه الطريقة التصوير عالي الدقة، ورسم خرائط التدفق، وتقييم وظيفة الحاجز الوعائي ضمن منصة متاحة لعلماء بيولوجيا الخلية ذوي الخبرة المحدودة في الهندسة الحيوية. ورغم أن النهج الأساسي يتطلب طابعة حيوية، إلا أن الطابعات القائمة على البثق والمتاحة تجارياً تتراوح من الأنظمة مفتوحة المصدر إلى منصات أكثر تقدماً تحتوي على رؤوس طباعة متعددة. وتشمل القدرات الرئيسية للطابعة التحكم في درجة حرارة رأس الطباعة والحبر، والتنظيم الدقيق للضغط، ودرجة حرارة سرير الطباعة. وبالإضافة إلى الأوعية المتعرجة والمتفرعة المطبوعة حيوياً، تتضمن الطريقة أيضاً نموذجاً لتمدد الأوعية الدموية يمكن إنشاؤه بدون طابعة حيوية. وتسهل هذه المناهج مجتمعة استقصاء وظيفة الخلايا البطانية في الأوعية المتعرجة باستخدام طرق المجهر المتوفرة عادةً في مختبرات بيولوجيا الخلية.

تتوفر العديد من أنظمة النماذج in vitro لدراسة الوظائف الوعائية87,88، ولكل منها نقاط قوة وقيود متميزة. ويُعد النظام الموصوف هنا، والمقتبس من أعمال سابقة54,67,69، مناسباً بشكل خاص لاستقصاء تأثيرات التعرج الوعائي على الوظيفة البطانية؛ لأنه يسمح بالنمذجة المباشرة لهندسة الأوعية المستمدة من المرضى والتغيير المنهجي لانحناء الأوعية داخل جهاز واحد. وقد اعتمدت مقاربات أخرى نمذجة الأوعية التاجية للمرضى باستخدام ميثاكريلات الجيلاتين القابلة للبلمرة الضوئية لإنشاء هياكل وعائية مصغرة تحت تدفق فسيولوجي60. وتوفر هذه الأنظمة نمذجة دقيقة للأوعية، وتحليلاً للتدفق، وإمكانية دمج طبقات الغلالة المتوسطة. ومع ذلك، فإن حجمها الإجمالي ومتطلبات الدعم الزجاجي قد تحد من التصوير عالي الدقة واختبارات التسرب الموضعية. وفي المقابل، تتيح الأنظمة الأصغر حجماً القائمة على التجميع الذاتي للخلايا البطانية المشتقة من iPSC التصوير عالي الدقة ويمكنها دمج كل من الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء الوعائية89. بيد أن هذه النماذج توفر تحكماً أقل في هندسة الأوعية، وقد يكون من الصعب تحقيق معدلات تدفق وقص عالية. وبناءً على ذلك، يمثل النظام الحالي نهجاً وسطياً عملياً يجمع بين هندسة وعائية محددة والتصوير عالي الدقة للتعرج الوعائي.

تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذه المنصة في القدرة على إنشاء أوعية تحتوي على مناطق منحنية ومستقيمة على حد سواء، مما يتيح المقارنة المباشرة لهندسة الأوعية المحلية داخل العينة نفسها بينما تظل المتغيرات التجريبية الأخرى ثابتة، كما هو موضح في الشكل 6. وميزة أخرى هي القدرة على استخدام صور أوعية مستمدة من المرضى تم الحصول عليها عبر تصوير الأوعية أو التصوير المقطعي المحوسب المعزز بالصبغة. ويكمن القيد الأساسي في إعادة إنتاج أوعية المرضى في الحجم؛ حيث يصعب طباعة الأوعية التي يقل قطرها عن 150µm بشكل متكرر، بينما تتطلب قطع الأوعية التي يمتد طولها لأكثر من عدة سنتيمترات غرف تثبيت أكبر. كما يجب أن تظل قطع الأوعية مسطحة نسبيًا في البعد الثالث بحيث يمكن طباعتها على طبقة المصفوفة الأساسية والحفاظ عليها ضمن مسافة العمل لعدسة الشيئية أثناء التصوير المجهري.

في الأعمال المستقبلية، يمكن تعديل النظام الموصوف هنا بشكل أكبر لنمذجة أمراض مثل تصلب الشرايين، حيث قد تساهم هندسة الأوعية في الفزيولوجيا المرضية. ويمكن دمج خلايا بطانية معدلة وراثياً أو أنواع خلايا إضافية، بما في ذلك خلايا العضلات الملساء والخلايا المناعية، لزيادة التعقيد الفزيولوجي. كما أن دمج خلايا العضلات الملساء أسفل الطبقة البطانية، كما تم توضيحه في أنظمة أبسط، قد يوفر رؤى إضافية حول التفاعلات بين العضلات الملساء والخلايا البطانية في التواء الأوعية الدموية والأمراض90. وقد تشمل التعديلات الإضافية دمج خلايا ورمية للتحقيق في عملية الغزو الوعائي (intravasation)68,91، وتأثير التواء الأوعية على هذه العملية. كما يمكن استخدام المنصة لفحص كيفية قيام التدفق المضطرب بتغيير الاستجابات الالتهابية92,93 والمساهمة المحتملة في المضاعفات الوعائية المرتبطة بالعدوى مثل COVID-1994. ونظراً للمشاركة الواسعة للأوعية الدموية في صحة الإنسان وأمراضه، فإن الأنظمة المتاحة مثل هذا النظام قد تسهل إجراء المزيد من الاستقصاءات حول الوظيفة البطانية في سياقات مرضية متنوعة.

الإفصاحات

يتحمل المؤلفون وحدهم مسؤولية المحتوى، ولا يمثل هذا المحتوى بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. ويعلن المؤلفون عدم وجود أي تضارب في المصالح المالية.

شكر وتقدير

يود المؤلفون تقديم الشكر لأعضاء مختبر Jennifer Lewis في جامعة هارفارد على مشورتهم في بعض الاستكشافات الأولية لهذا العمل، وأعضاء مختبر Waterman على ملاحظاتهم ومشورتهم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane (APTMS), 97%Sigma-Aldrich281778يُستخدم لعملية السيلنة وتنشيط أغطية الشرائح الزجاجية قبل تثبيت المكونات الخارجية للخلايا (ECM).
سرنجة معقمة سعة 1mLFisher Scientific14-823-434تُستخدم لإيصال الكواشف، وطلاء الأوعية، ومناولة السوائل.
1xPhosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher ScientificJ61196.APيُستخدم لتحضير الكواشف، والغسل، وشطف الأوعية.
سرنجة معقمة سعة 10mLFisher Scientific14-955-459تُستخدم لتحضير الكواشف ونقل السوائل.
أنابيب مخروطية سعة 15mL مع غطاءFisher Scientific05-538-59Aتُستخدم لتحضير الكواشف، ومناولة الخلايا، وتخزين المحاليل.
طبق بتري من البوليسترين بقطر 150mmFisher ScientificFB0875714يُستخدم كحاوية معقمة للعمل أو للتحضين.
إبرة 21GFisher Scientific14-817-227تُستخدم لتحضير قالب الوعاء والوصول إلى الغرفة.
إبرة 23GFisher Scientific14-817-237تُستخدم لتوصيلات مدخل ومخرج الوعاء أثناء الشطف والتروية.
إبرة توزيع مستدقة شفافة 27GNordson7018417تُستخدم لبث الحبر المضحى به ومراقبة الفقاعات الهوائية أثناء الطباعة.
سرنجة معقمة سعة 3mLFisher Scientific14-955-459تُستخدم لنقل السوائل وإيصال الكواشف. يرجى التأكد من رقم الكتالوج لأن الرقم المذكور مدرج أيضاً لسرنجة 10 mL.
سلك ماندريل طبي من الفولاذ المقاوم للصدأ 304، بقطر 0.0190 inComponent SupplyGWX-0190-36يُستخدم كقالب قابل للإزالة للتجويف المستقيم في نموذج تمدد الأوعية الدموية القائم على الأسلاك.
أنابيب مخروطية سعة 50mL مع غطاءFisher Scientific05-526Bتُستخدم لتحضير الكواشف، وخلطها، وبسترتها، وتخزينها.
Alexa 488 anti-mouse secondary antibodyThermo Fisher ScientificA32723TRجسم مضاد ثانوي فلوري يُستخدم في التلوين المناعي.
Alexa 555 anti-rabbit secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-21428جسم مضاد ثانوي فلوري يُستخدم في التلوين المناعي.
Alexa 647-labeled bovine serum albuminThermo Fisher ScientificA34785كاشف تتبع جزيئي ضخم فلوري يُستخدم في مقايسات الحاجز الوعائي/التسريب.
Alexa 647-labeled dextran, 10 kDaThermo Fisher ScientificD22914كاشف تتبع فلوري يُستخدم لتقييم وظيفة الحاجز البطاني والتسريب الوعائي.
Alexa 647-phalloidinThermo Fisher ScientificA22287يُستخدم لوسم F-actin فلورياً لتصوير الهيكل الخلوي وتحليل التوجه.
Albumin, bovine serum, Fraction V, fatty acid-freeSigma-Aldrich126575-10GMيُستخدم للحجب وتحضير المحاليل التي تحتوي على البروتين.
Antibiotic-Antimycotic, 100xThermo Fisher Scientific15240062مكمل مضاد للميكروبات اختياري للمكونات الخارجية للخلايا (ECM) ووسط الزرع.
Anti-GM130 antibody, clone 4A3Sigma-AldrichMABT1363جسم مضاد أولي يُستخدم لوسم جهاز جولجي لتحليل القطبية البطانية.
Anti-VE-cadherin rabbit monoclonal antibody, D87F2Abcam65707جسم مضاد أولي يُستخدم لتصوير الوصلات بين الخلايا البطانية.
Calcium chlorideSigma-AldrichC7902يُستخدم في تحضير المكونات الخارجية للخلايا (ECM) ومحاليل التثبيت. يرجى التحقق مما إذا كان الكاشف المطلوب هو كلوريد الكالسيوم اللامائي أو المميأ.
طقم موصلاتWorld Precision Instruments504954موصلات من نوع Luer إلى الأنابيب تُستخدم لتجميع دائرة التروية الموائعية الدقيقة.
رف تلوين أغطية الشرائح الزجاجيةElectron Microscopy Sciences72240يُستخدم لتثبيت أغطية الشرائح أثناء التنظيف، والسيلنة، والتنشيط، والغسل.
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021-100Gمكون من محلول النفاذية المستخدم أثناء التلوين المناعي.
DAPIThermo Fisher Scientific62248صبغة نووية فلورية تُستخدم في تصوير الخلايا وتحليل القطبية.
لوح تسخين رقميFisher Scientific11-475-028يُستخدم للحفاظ على غرفة الوعاء والكواشف عند درجة حرارة 37 °C تقريباً أثناء التجميع.
EGTA tetrasodium saltSigma-AldrichE8145-10Gعامل مخلبي يُستخدم في محلول النفاذية.
موصل Luer مسنن أنثوي لأنبوب بقطر داخلي 1/16 inScientific Commodities Inc.BB330Aيُستخدم لتوصيل الأنابيب داخل الدائرة الموائعية الدقيقة.
موصل Luer أنثوي مع مسنن بقطر داخلي 1/16 in, CrystalVu QCFisher Scientific01-000-123يُستخدم لتوصيلات الأنابيب وغرفة الوعاء.
FibrinogenSigma-AldrichF8630مكون من المكونات الخارجية للخلايا (ECM) يُستخدم مع الجيلاتين والثرومبين لتكوين الهيدروجيل الداعم للوعاء. يرجى التحقق من المصدر: تصف المخطوطة فيبرينوجين بلازما بشرية، بينما يذكر الجدول المرفق بلازما بقريّة.
مخمد نبضات السوائلDarwin MicrofluidicsSE-D1606-3NB-PC-31يُستخدم لتقليل التقلبات النبضية الناتجة عن المضخة 연動ية (peristaltic pump).
شريط مطاط سيليكوني عالي الحرارة مخصص للصناعات الغذائيةMcMaster-Carr8417K51يُستخدم لتصنيع الحشوة (gasket) لغرفة Rose.
Gelatin from porcine skin, gel strength 300, Type ASigma-AldrichG2500مكون رئيسي في المكونات الخارجية للخلايا (ECM) يُستخدم لتكوين الهيدروجيل المحيط بتجويف الوعاء.
غطاء شريحة زجاجي، رقم 1.5VWREN-MAS-25X25-1-5-CSركيزة مجهرية عالية الدقة وسطح للغرفة.
Glutaraldehyde, 25%Electron Microscopy Sciences16220يُخفف لتنشيط غطاء الشريحة قبل تثبيت المكونات الخارجية للخلايا (ECM).
Growth Kit-BBEATCCPCS-100-040طقم مكملات يُستخدم مع الوسط الأساسي للخلايا الوعائية لزراعة الخلايا البطانية.
Growth Kit-VEGFATCCPCS-100-041مكمل نمو بطاني يُستخدم مع الوسط الأساسي للخلايا الوعائية عند الحاجة.
Human plasma fibronectinSigma-AldrichFC010طلاء اختياري للمكونات الخارجية للخلايا (ECM) في التجويف يُستخدم لتعزيز الالتصاق البطاني.
مشبك أنابيب داخليSigma-AldrichZ503371-1PAKيُستخدم لإيقاف وتنظيم التدفق عبر الأنابيب أثناء التعامل مع الغرفة والتحضين.
مضخة Ismatec Reglo Digital 연동يةMasterflex78018-12تُستخدم لتوليد تدفق سوائل محكوم عبر الأوعية المأهولة بالخلايا.
LamininSigma-AldrichL2020-1MGطلاء اختياري للمكونات الخارجية للخلايا (ECM) في التجويف لتعديل الالتصاق والقطبية البطانية.
طقم متنوع من قارنات Luer إلى الأنابيبWorld Precision Instruments504954يُستخدم لتوصيل الأنابيب، والسرنجات، ومكونات مدخل/مخرج الغرفة. هذا تكرار لرقم كتالوج طقم الموصلات؛ يرجى الإبقاء على إدخال واحد إذا كانا متطابقين.
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM2393-100Gمكون في محاليل التثبيت والنفاذية.
موصل Luer مسنن ذكري منزلق لأنبوب بقطر داخلي 1/16 inScientific Commodities Inc.BB329Aيُستخدم لتوصيلات الأنابيب الموائعية الدقيقة.
وصلة Luer ذكرية، بقطر داخلي 1/16 inWorld Precision Instruments13160-100تُستخدم لتوصيل الأنابيب بالسرنجات ومكونات الغرفة.
MatrigelSigma-AldrichCLS356234-1EAطلاء اختياري للمكونات الخارجية للخلايا (ECM) في التجويف يُستخدم للالتصاق البطاني.
أغطية زجاجات الأوساطFisher Scientific05-719-310أغطية ذات منفذين تُستخدم لإنشاء خزانات أوساط زرع معقمة لدائرة التدفق.
أنابيب سيليكون Nalgene Pharma-Grade، بقطر داخلي 1/16 inThermo Fisher Scientific8600-0020أنابيب مرنة تُستخدم في دوائر التروية والشطف الموائعية الدقيقة.
ParafilmElectron Microscopy Sciences70990-125يُستخدم كسطح غير لاصق أثناء بلمرة طلاءات المكونات الخارجية للخلايا (ECM) على أغطية الشرائح.
PBS, 10x, pH 7.4Thermo Fisher Scientific70011044محلول منظم مركز يُستخدم لتحضير محاليل PBS العاملة.
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122مكمل مضاد حيوي يُستخدم في وسط زراعة الخلايا البطانية ومحاليل الشطف.
PIPESSigma-AldrichP1851-25Gمكون منظم في محلول النفاذية.
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443مكون مستجيب للحرارة في حبر الطباعة المضحى به.
صمام إيقاف ثلاثي من البولي كربونات مع Luer ذكريFisher ScientificNC9593742يُستخدم للتجهيز، والتبديل، والتحكم في مسارات السوائل في دائرة التروية.
Polyethylene oxide (PEO)Sigma-Aldrich372781مكون بوليمري في تركيبة الحبر المضحى به.
خلاط دورانيFisher Scientific88861050يُستخدم لخلط حبر PEO/Pluronic المضحى به عند درجة حرارة 4 °C.
طبق تلوين لوحدات الشرائحMSE SuppliesDWK90020يُستخدم لغسل أغطية الشرائح، أو تلوينها، أو تحضينها في الكواشف.
غطاء زجاجي مربع، رقم 2، 25mm x 25mmSigma-AldrichCLS285525-1000EAغطاء شريحة للغرفة؛ يوفر الزجاج رقم 2 الأكثر سمكاً مقاومة أكبر للكسر ومتوافق مع العدسات الشيئية الهوائية أو المائية المناسبة.
إبرة توزيع غير حادة من الفولاذ المقاوم للصدأ، 21 G، 1 inComponent SupplyNE-212PLتُستخدم لإيصال السوائل أو بناء نموذج الوعاء القائم على قالب السلك.
وحدات ترشيح Steriflip بالتفريغMilliporeSigmaSE1M179M6تُستخدم لترشيح الجيلاتين الدافئ والمحاليل المتوافقة الأخرى تعقيماً.
سرنجات بلاستيكية معقمة سعة 5mLAlleviPSYR5-Sتُستخدم لتعبئة الحبر المضحى به لطباعة البث الهوائي.
Thrombin, human plasma, high activitySigma-Aldrich605195يُستخدم لبدء بلمرة الفيبرين أثناء تكوين جل المكونات الخارجية للخلايا (ECM).
TransglutaminaseMoo Gloo1201إنزيم ربط متقاطع يُستخدم أثناء تحضير وتعديل المكونات الخارجية للخلايا (ECM) من الجيلاتين/الفيبرين.
Triton X-100Sigma-Aldrich648466منظف يُستخدم لنفاذية الخلايا البطانية قبل التلوين المناعي.
TrypLE Express Enzyme, 1x, phenol redThermo Fisher Scientific12605010كاشف تفكيك الخلايا يُستخدم لحصاد الخلايا البطانية قبل استزراع الوعاء.
Tween 20Sigma-Aldrich11332465001مكون منظف في محلول الحجب الخاص بالتلوين المناعي.
Vascular Cell Basal MediumATCCPCS-100-030وسط أساسي يُستخدم لزراعة الخلايا البطانية وتجارب التروية.

المراجع

  1. Franken R, et al. Increased aortic tortuosity indicates a more severe aortic phenotype in adults with Marfan syndrome. Int J Cardiol. 2015;194:7-12.
  2. Morris SA, et al. Vertebral artery tortuosity in Turner syndrome: is tortuosity a component of the aortopathy phenotype J Cardiovasc Magn Reson. 2014;16(Suppl 1):P115.
  3. Morris SA. Arterial tortuosity in genetic arteriopathies. Curr Opin Cardiol. 2015;30(6):587-593.
  4. Ciurică S, et al. Arterial tortuosity. Hypertension. 2019;73(5):951-960.
  5. Penta R, Ambrosi D. The role of the microvascular tortuosity in tumor transport phenomena. J Theor Biol. 2015;364:80-97.
  6. Bullitt E, et al. Abnormal vessel tortuosity as a marker of treatment response of malignant gliomas: preliminary report. Technol Cancer Res Treat. 2004;3(6):577-584.
  7. Fattahi M, et al. Influence of parent vessel feature on the risk of internal carotid artery aneurysm rupture via computational method. Sci Rep. 2023;13(1):1-12.
  8. Kawsara A, et al. Management of coronary artery aneurysms. JACC Cardiovasc Interv. 2018;11(13):1211-1223.
  9. Sokhal BS, Ma Y, Rajagopalan S. Femoral artery aneurysms. Br J Hosp Med. 2022;83(12).
  10. Golledge J. Abdominal aortic aneurysm: update on pathogenesis and medical treatments. Nat Rev Cardiol. 2019;16(4):225-242.
  11. Toader C, et al. Cerebral aneurysm: filling the gap between pathophysiology and nanocarriers. Int J Mol Sci. 2024;25(22):11874.
  12. Wei F, et al. Arterial tortuosity: an imaging biomarker of childhood stroke pathogenesis Stroke. 2016;47(5):1265-1270.
  13. Moceri P, et al. Arterial tortuosity syndrome: early diagnosis and association with venous tortuosity. J Am Coll Cardiol. 2013;61(7):783.
  14. Zhang X, et al. The relationship between retinal vascular tortuosity and retinal vasculitis. J Ophthalmic Inflamm Infect. 2025;15:65.
  15. Cuhlmann S, et al. Disturbed blood flow induces RelA expression via c-Jun N-terminal kinase 1: a novel mode of NF-κB regulation that promotes arterial inflammation. Circ Res. 2011;108(8):950-959.
  16. Sunderland K, Jiang J, Zhao F. Disturbed flow's impact on cellular changes indicative of vascular aneurysm initiation, expansion, and rupture: a pathological and methodological review. J Cell Physiol. 2022;237(1):278-300.
  17. Luu V, et al. Role of endothelial primary cilia as fluid mechanosensors on vascular health. Atherosclerosis. 2018;275.
  18. Vion AC, et al. Endothelial cell orientation and polarity are controlled by shear stress and VEGF through distinct signaling pathways. Front Physiol. 2021;11:623769.
  19. Petzold T, et al. Focal adhesion kinase modulates activation of NF-kappaB by flow in endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 2009;297(4):C814-C822.
  20. Thodeti CK, et al. TRPV4 channels mediate cyclic strain-induced endothelial cell reorientation through integrin-to-integrin signaling. Circ Res. 2009;104(9):1123-1130.
  21. Beech DJ. PIEZO force sensing in vascular biology: an explosion of new knowledge, concepts and opportunity. Adv Sci (Weinh). 2025;12(41):e11774.
  22. Tamargo IA, et al. Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis. Nat Rev Cardiol. 2023;20(11):738-753.
  23. Chiu JJ, Chien S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiol Rev. 2011;91(1):327-387.
  24. Nakajima H, Mochizuki N. Flow pattern-dependent endothelial cell responses through transcriptional regulation. Cell Cycle. 2017;16(20):1893-1901.
  25. Zhao Y, et al. Small rodent models of atherosclerosis. Biomed Pharmacother. 2020;129:110426.
  26. Curry-Koski T, Curtin LP, Esfandiarei M, Thomas TC. Cerebral microvascular density, blood-brain barrier permeability, and support for neuroinflammation indicate early aging in a Marfan syndrome mouse model. Front Physiol. 2024;15:1457034.
  27. Thompson JW, et al. In vivo cerebral aneurysm models. Neurosurg Focus. 2019;47(1).
  28. Golledge J, Krishna SM, Wang Y. Mouse models for abdominal aortic aneurysm. Br J Pharmacol. 2022;179(5):792-810.
  29. Noval Rivas M, Arditi M. Kawasaki disease: pathophysiology and insights from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 2020;16(7):391-405.
  30. He L, et al. Endothelial shear stress signal transduction and atherogenesis: from mechanisms to therapeutics. Pharmacol Ther. 2022;235:108152.
  31. Wang X, et al. Endothelial mechanobiology in atherosclerosis. Cardiovasc Res. 2023;119(8):1656-1675.
  32. Humphrey JD, Schwartz MA. Vascular mechanobiology: homeostasis, adaptation, and disease. Annu Rev Biomed Eng. 2021;23:1-27.
  33. Wang C, Lu H, Schwartz MA. A novel in vitro flow system for changing flow direction on endothelial cells. J Biomech. 2012;45(7):1212-1218.
  34. Sedlak J, Clyne A. Application of shear stress to endothelial cells using a parallel plate flow chamber. Methods Mol Biol. 2023;2600:81-90.
  35. Zhu J, et al. Advances in tissue engineering of vasculature through three-dimensional bioprinting. Dev Dyn. 2021;250(12):1717-1738.
  36. Kinstlinger IS, Miller JS. 3D-printed fluidic networks as vasculature for engineered tissue. Lab Chip. 2016;16(11):2025-2043.
  37. Werschler N, Quintard C, Nguyen S, Penninger J. Engineering next generation vascularized organoids. Atherosclerosis. 2024;398:118529.
  38. Shakeri A, et al. Engineering organ-on-a-chip systems for vascular diseases. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023;43(12):2241-2255.
  39. Xie X, et al. Customizable microfluidic origami liver-on-a-chip (oLOC). Adv Mater Technol. 2022;7(5):2100677.
  40. Kawakita S, et al. Organ-on-a-chip models of the blood-brain barrier: recent advances and future prospects. Small. 2022;18(39):e2201401.
  41. Bai H, Ingber DE. What can an organ-on-a-chip teach us about human lung pathophysiology Physiology. 2022;37(5).
  42. Seghir R, Arscott S. Extended PDMS stiffness range for flexible systems. Sens Actuators A Phys. 2015;230:33-39.
  43. Hasler J, et al. Development and characterization of a tunable PDMS substrate model for investigating elastic properties and mechanical stretching in intervertebral disc cells. JOR Spine. 2025;8(4):e70140.
  44. Uroz M, et al. Differential stiffness between brain vasculature and parenchyma promotes metastatic infiltration through vessel co-option. Nat Cell Biol. 2024;26(12):2144-2153.
  45. Wood JA, Liliensiek SJ, Russell P, Nealey PF, Murphy CJ. Biophysical cueing and vascular endothelial cell behavior. Materials. 2010;3(3):1620-1639.
  46. Peloquin J, Huynh J, Williams RM, Reinhart-King CA. Indentation measurements of the subendothelial matrix in bovine carotid arteries. J Biomech. 2011;44(5):815-821.
  47. McQueen A, Warboys CM. Mechanosignalling pathways that regulate endothelial barrier function. Curr Opin Cell Biol. 2023;84:102213.
  48. Hahn C, Orr AW, Sanders JM, Jhaveri KA, Schwartz MA. The subendothelial extracellular matrix modulates JNK activation by flow. Circ Res. 2009;104(8):995-1003.
  49. Xu Z, et al. Matrix stiffness, endothelial dysfunction and atherosclerosis. Mol Biol Rep. 2023;50(8):7027-7041.
  50. Lemarié CA, Tharaux PL, Lehoux S. Extracellular matrix alterations in hypertensive vascular remodeling. J Mol Cell Cardiol. 2010;48(3):433-439.
  51. Huveneers S, Daemen MJAP, Hordijk PL. Between Rho(k) and a hard place: the relation between vessel wall stiffness, endothelial contractility, and cardiovascular disease. Circ Res. 2015;116(5):895-908.
  52. Stankey PP, et al. Embedding biomimetic vascular networks via coaxial sacrificial writing into functional tissue. Adv Mater. 2024;36(36):e2401528.
  53. Sundaram S, et al. Sacrificial capillary pumps to engineer multiscalar biological forms. Nature. 2024;636(8042):361-367.
  54. Kroll KT, et al. A perfusable, vascularized kidney organoid-on-chip model. Biofabrication. 2024;16(4).
  55. Strobel HA, Moss SM, Hoying JB. Vascularized tissue organoids. Bioengineering. 2023;10(2):124.
  56. Servais B, et al. Engineering brain-on-a-chip platforms. Nat Rev Bioeng. 2024;2(8):691-709.
  57. Osaki T, Sivathanu V, Kamm RD. Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform. Sci Rep. 2018;8(1):5168.
  58. Maharjan S, Cecen B, Zhang YS. 3D immunocompetent organ-on-a-chip models. Small Methods. 2020;4(9):2000235.
  59. Fang JS, et al. A microphysiological system HHT-on-a-chip platform recapitulates patient vascular lesions. Nat Commun. 2026.
  60. Catano JA, et al. A patient-specific 3D printed carotid artery model integrating vascular structure, flow, and endothelium responses. Adv Healthc Mater. 2026;15(4):e02478.
  61. Li Z, Hui J, Yang P, Mao H. Microfluidic organ-on-a-chip system for disease modeling and drug development. Biosensors. 2022;12(6):370.
  62. Leung CM, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2(1):33.
  63. Campisi M, et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 2018;180:117-129.
  64. Miller JS, et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nat Mater. 2012;11(9):768-774.
  65. Kong Z, Wang X. Bioprinting technologies and bioinks for vascular model establishment. Int J Mol Sci. 2023;24(1):891.
  66. Kolesky DB, et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 2014;26(19):3124-3130.
  67. Lin NYC, et al. Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116(12):5399-5404.
  68. Park W, et al. 3D bioprinted multilayered cerebrovascular conduits to study cancer extravasation mechanism related with vascular geometry. Nat Commun. 2023;14(1):7696.
  69. Kolesky DB, Homan KA, Skylar-Scott MA, Lewis JA. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(12):3179-3184.
  70. Xiao Y, Liu Q, Han HC. Buckling reduces eNOS production and stimulates extracellular matrix remodeling in arteries in organ culture. Ann Biomed Eng. 2016;44(9):2840-2850.
  71. Arnaoutova I, George J, Kleinman HK, Benton G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 2009;12(3):267-274.
  72. Qiu Y, et al. Microvasculature-on-a-chip for the long-term study of endothelial barrier dysfunction and microvascular obstruction in disease. Nat Biomed Eng. 2018;2(6):453-463.
  73. Rose GG, Pomerat CM, Shindler TO, Trunnell JB. A cellophane-strip technique for culturing tissue in multipurpose culture chambers. J Biophys Biochem Cytol. 1958;4(6):761-764.
  74. Boudaoud A, et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 2014;9(2):457-463.
  75. Fischer RS, et al. Contractility, focal adhesion orientation, and stress fiber orientation drive cancer cell polarity and migration along wavy ECM substrates. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118(22):e2021135118.
  76. Wolf KJ, et al. Perfusable 3D models of ureteric bud and collecting duct tubules. Cell Biomater. 2026;2(3):100297.
  77. Ren B, et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Appl Phys Rev. 2022;9(1).
  78. Hynes WF, et al. Examining metastatic behavior within 3D bioprinted vasculature for the validation of a 3D computational flow model. Sci Adv. 2020;6(35):eabb3308.
  79. Pisano A. From tubes and catheters to the basis of hemodynamics: viscosity and Hagen-Poiseuille equation. In: Physics for Anesthesiologists and Intensivists: From Daily Life to Clinical Practice. Springer; 2021:89-98.
  80. Gerhardt H, Betsholtz C. How do endothelial cells orientate EXS. 2005;(94):3-15.
  81. Baeyens N, et al. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. J Clin Invest. 2016;126(3):821-828.
  82. Lee J. Hemodynamics in Doppler ultrasonography. Ultrasonography. 2024;43(6):413.
  83. Kamada H, et al. Blood flow analysis with computational fluid dynamics and 4D-flow MRI for vascular diseases. J Cardiol. 2022;80(5):386-396.
  84. Postnov DD, Tuchin VV, Sosnovtseva O. Estimation of vessel diameter and blood flow dynamics from laser speckle images. Biomed Opt Express. 2016;7(7):2759.
  85. Dessalles CA, Leclech C, Castagnino A, Barakat AI. Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology. Commun Biol. 2021;4:764.
  86. Parekh P, Agrawal N, Vasavada A, Vinchurkar M. Extreme coronary artery tortuosity in association with tortuosity of the systemic arteries: a rare and challenging situation for the interventionist. BMJ Case Rep. 2014;2014:bcr2014204725.
  87. Vetter J, Palagi I, Waisman A, Blaeser A. Recent advances in blood-brain barrier-on-a-chip models. Acta Biomater. 2025;197:1-28.
  88. Liu Y, Lin L, Qiao L. Recent developments in organ-on-a-chip technology for cardiovascular disease research. Anal Bioanal Chem. 2023;415(18):3911-3925.
  89. Cuenca MV, et al. Engineered 3D vessel-on-chip using hiPSC-derived endothelial- and vascular smooth muscle cells. Stem Cell Reports. 2021;16(9):2159-2168.
  90. van Engeland NCA, et al. A biomimetic microfluidic model to study signalling between endothelial and vascular smooth muscle cells under hemodynamic conditions. Lab Chip. 2018;18(11):1607-1620.
  91. Sobrino A, et al. A tissue-engineered 3D microvessel model reveals the dynamics of mosaic vessel formation in breast cancer. Cancer Res. 2020;80(19).
  92. Riddle RB, Jennbacken K, Hansson KM, Harper MT. A multicellular vessel-on-a-chip model reveals context-dependent roles for platelets in inflammation and inflammatory hemostasis. Blood Vessels Thromb Hemost. 2024;1(2):100007.
  93. Rickman M, et al. Disturbed flow increases endothelial inflammation and permeability via a Frizzled-4-β-catenin-dependent pathway. J Cell Sci. 2023;136(6):jcs260449.
  94. Shevchuk O, et al. Vessel-on-a-chip: a powerful tool for investigating endothelial COVID-19 fingerprints. Cells. 2023;12(9):1297.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

أوعية مطبوعة ثلاثية الأبعادالتواء الأوعية الدمويةتمدد الأوعية الدمويةالعضو على شريحةنفاذية الأوعيةمعدل القص الفسيولوجيالمجهر الضوئي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.