يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التنشيط الميكانيكي للخلايا البلعمية الناجم عن الحركة الدودية

104 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72607

⸱

أغسطس 18, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هذا البروتوكول كيفية إعداد وتشغيل مفاعل حيوي حاصل على براءة اختراع لدراسات التعديل المناعي الميكانيكي. وهنا، وباستخدام مفاعل حيوي مخصص يعيد إنتاج القوى الفسيولوجية، نوضح أن الخلايا البلعمية تظهر استجابة مؤيدة للالتهابات بشكل واضح نتيجة للتحفيز الميكانيكي.

الملخص

يعد الالتهاب عملية معقدة تدفع الأمراض الحادة والمزمنة على حد سواء، ويتم تنظيمه بواسطة إشارات كيميائية حيوية وفيزيائية حيوية متسلسلة تؤدي إلى تنشيط الخلايا المناعية. وتعتبر البلاعم (Macrophages) نوعاً رئيسياً من الخلايا المناعية التي تشارك في حالات التهابية متعددة، بما في ذلك السرطان والتليف وأمراض المناعة الذاتية. تتضمن الطرق التقليدية لاستقصاء تنشيط البلاعم التحفيز الكيميائي الحيوي بإشارات محددة من السيتوكينات أو الكيموكينات، مما ينشط البلاعم لتدخل في حالات محفزة للالتهاب أو مضادة له. وتشير الأدلة الناشئة إلى أن الإشارات الفيزيائية الحيوية تلعب أيضاً دوراً في تنشيط البلاعم، بالإضافة إلى الإشارات الكيميائية الحيوية داخل الأنسجة. ومن هذه الإشارات الميكانيكية الشائعة الحركة الدودية (peristalsis)، التي تتكون من انفعال متعدد المحاور وإجهاد قص، وتحدث في الجهاز الهضمي والرحم والمجاري التنفسية النامية والحالبين. هنا، اختبرنا الفرضية القائلة بأن الحركة الدودية قد تنشط البلاعم. يصف هذا البروتوكول استخدام مفاعل حيوي دودِي لاستقصاء التنشيط الميكانيكي للبلاعم. تم طلاء أغشية البولي ديميثيل سيلوكسان بالفبرونكتين لتعزيز التصاق البلاعم. تم استزراع بلاعم مشتقة من نخاع العظم للفئران مخلدة (iBMDM) على أغشية مطلية بالفبرونكتين، وحُفظت كمجموعات ضابطة ساكنة أو عُرّضت للحركة الدودية لمدة 4 h. أدت الحركة الدودية إلى تنشيط البلاعم، مع وجود فروق ذات دلالة إحصائية في التعبير الجيني لـ Il6 (بزيادة 50.9 ضعفاً مقارنة بالمجموعات الضابطة الساكنة؛ p < 0.0001، t-test) و Nos2 (بزيادة 19.8 ضعفاً مقارنة بالمجموعات الضابطة الساكنة؛ p = 0.0046). ومن المثير للاهتمام أنه لم تُلاحظ تغيرات ذات دلالة إحصائية في Chil3 (بزيادة 1.22 ضعفاً مقارنة بالمجموعات الضابطة الساكنة؛ p = 0.9726) أو Mrc1 (بزيادة 1.16 ضعفاً مقارنة بالمجموعات الضابطة الساكنة؛ p = 0.9810) مقارنة بالمجموعات الضابطة الساكنة، مما يشير إلى أن العوامل الميكانيكية دفعت بشكل أساسي نحو التنشيط المحفز للالتهاب. وتدعم النتائج الحالية مفهوم التعديل المناعي الميكانيكي للبلاعم، خاصة استجابةً لميكانيكا الحركة الدودية المنتشرة في العديد من الأنسجة القائمة على العضلات الملساء.

المقدمة

تُعد الخلايا البلعمية (Macrophages) خلايا مناعية فطرية تؤدي أدواراً أساسية في الدفاع عن المضيف، وإعادة تشكيل الأنسجة، وتنظيم الالتهابات من خلال عملية البلعمة وإفراز السيتوكينات1,2,3,4. وبناءً على المحفزات الموجودة في البيئة الدقيقة in vivo، يمكن للخلايا البلعمية غير المتمايزة (M0) أن تتشكل بمرونة نحو أنماط ظاهرية محفزة للالتهاب (M1) أو مضادة للالتهاب/محفزة للتجديد (M2)5,6. وعادةً ما تُستخدم النماذج in vitro لعزل هذه المحفزات المختلفة، وذلك لفهم الآليات المعقدة التي تدفع استقطاب الخلايا البلعمية بشكل أفضل. يتم تحفيز الخلايا البلعمية M1 المنشطة كلاسيكياً عادةً in vitro بواسطة محفزات كيميائية حيوية مثل عديد السكاريد الشحمي (LPS) وإنترفيرون غاما (IFN-γ)، مما يؤدي إلى زيادة تعبير الوسائط الالتهابية بما في ذلك سينثاز أكسيد النيتريك المحفز (iNOS)، وإنترلوكين-6 (IL6)، وعامل نخر الورم ألفا (TNF-α)7,8. أما الخلايا البلعمية M2 المنشطة بدلاً من ذلك، فيتم تحفيزها عادةً من خلال التعرض لإنترلوكين-4 (IL-4) وإنترلوكين-13 (IL-13)، مما يعزز استجابات إعادة تشكيل الأنسجة والتئام الجروح8,9. وتُصنف الخلايا البلعمية M2 لاحقاً إلى أنماط ظاهرية M2a و M2b و M2c بناءً على مسارات تنشيط متميزة وملفات تعبير لعلامات السطح10,11. وبينما تم توصيف التنظيم الكيميائي الحيوي لاستقطاب الخلايا البلعمية بشكل مكثف في أنظمة in vivo و in vitro على حد سواء، إلا أن الخلايا البلعمية تستقر ضمن بيئات دقيقة ديناميكية للغاية تحتوي أيضاً على محفزات فيزيائية حيوية جوهرية12. فبالإضافة إلى السيتوكينات والكيموكينات الذائبة، تتعرض الخلايا البلعمية للمصفوفة خارج الخلية والتفاعلات بين الخلايا، وصلابة الركيزة، وإجهاد القص السائلي، والضغط الهيدروستاتيكي، وتشويه الأنسجة الدوري12,13,14. وباعتبارها خلايا حساسة ميكانيكياً، يمكن للخلايا البلعمية تغيير أنماطها الظاهرية الالتهابية استجابة لهذه الإشارات الفيزيائية، مما يسلط الضوء على أهمية البيولوجيا الميكانيكية في التنظيم المناعي.

أظهرت مجموعة متزايدة من الدراسات أن المحفزات الميكانيكية المعزولة in vitro يمكن أن تؤثر بشكل كبير على حالات تنشيط الخلايا البلعمية (الشكل 1). فقد أدى التعرض للركائز الأكثر صلابة إلى زيادة استقطاب M1 وإنتاج السيتوكينات الالتهابية مقارنة بالركائز الأكثر ليونة، والتي حفزت نمطاً ظاهرياً مؤيداً للتجدد15,16,17,18,19,20. وبالمثل، يقوم إجهاد القص السائلي بتعديل النمط الظاهري للخلايا البلعمية بطريقة تعتمد على المقدار، حيث أن المستويات المنخفضة من تدفق السائل الخلالي غالباً ما تعزز التنشيط المؤيد للتجدد21,22، بينما قد تؤدي إجهادات القص الأعلى المشابهة للقيم الموجودة في الشرايين إلى استجابات مؤيدة للالتهابات23,24,25,26,27,28. كما أظهرت نماذج التمدد الدوري in vitro المصممة لمحاكاة ميكانيكا الأنسجة العضلية الهيكلية، وعضلة القلب، والرئوية، والمعوية زيادة في تعبير الوسائط الالتهابية، رغم أن النتائج تختلف اعتماداً على مقدار ومدة وتكرار وأبعاد القوة المطبقة29,30,31,32. علاوة على ذلك، تختلف الحساسية الميكانيكية للخلايا البلعمية باختلاف الأنواع ومصادر الخلايا، مما يؤكد أهمية اختيار النماذج التجريبية المناسبة لدراسات البيولوجيا الميكانيكية13,14.

مخطط لتنشيط الخلايا البلعمية؛ محفزات كيميائية حيوية وفيزيائية حيوية؛ تغيرات نمطية؛ عوامل الإجهاد.
الشكل 1: مخطط يوضح المحفزات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية in vitro لتنشيط الخلايا البلعمية نحو حالات إما محفزة للالتهاب أو محفزة للتجدد. يمكن تحفيز الخلايا البلعمية للانتقال إلى حالة محفزة للالتهاب in vitro عن طريق إضافة محفزات كيميائية، مثل Lipopolysaccharide (LPS)، أو Interferon γ (IFN-γ)، أو التعرض لمحفزات ميكانيكية، بما في ذلك إجهاد القص، وزيادة الصلابة، والانفعال الناجم عن التمدد أحادي المحور الساكن والدوري العالي، والضغط، والانفعال الناجم عن الضغط متعدد المحاور. ويمكن تحفيز الخلايا البلعمية للانتقال إلى حالة محفزة للتجدد عن طريق إضافة محفزات كيميائية in vitro، مثل Interleukin-13 (IL-13) و IL-4. كما يمكن أن تصبح محفزة للتجدد عند تعرضها لمحفزات ميكانيكية في شكل إجهاد قص تذبذبي، أو تدفق خلالي، أو ركائز لينة، أو مستويات منخفضة من الانفعال الدوري أحادي المحور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

بالإضافة إلى استقصاء المحفزات الميكانيكية المنعزلة بشكل مستقل، من المهم البناء على هذا العمل للبدء في دراسة تأثير القوى الفيزيائية المركبة، نظراً لأن الخلايا البلعمية in vivo تتعرض عادةً لمجموعات من القوى المتزامنة. وتمثل الحركة الدودية إحدى هذه البيئات الميكانيكية المعقدة، حيث تتكون من إجهاد دوري متعدد المحاور وقوة قص سائلة متزامنة ناتجة عن انقباض العضلات الملساء33. وتتواجد هذه الميكانيكيات في أنظمة أعضاء متعددة، بما في ذلك القناة الهضمية، والمجاري التنفسية النامية، والأوعية الدموية، والرحم، والحالب34,35,36. ومن الأهمية بمكان أن وظيفة الحركة الدودية غالباً ما تكون مختلة في الأمراض الالتهابية، بما في ذلك التليف، ومرض التهاب الأمعاء، والسرطان، واضطرابات إعادة تشكيل المجاري التنفسية، والتي تشتمل جميعها على التهابات كبيرة تتوسطها الخلايا البلعمية33,37,38,39. وعلى الرغم من الدور المعروف للخلايا البلعمية في هذه الأمراض، لا تزال هناك فجوة حرجة في فهم كيفية تأثير القوى الميكانيكية للحركة الدودية بشكل مباشر على تنشيط الخلايا البلعمية.

يصف هذا البروتوكول استخدام نظام مفاعل حيوي تموجي لاستقصاء التعديل المناعي الميكانيكي للبلاعم تحت ظروف ميكانيكية ذات صلة فسيولوجياً. وبالمقارنة مع أنظمة الزراعة الساكنة التقليدية أو منصات التحفيز الميكانيكي أحادية القوة، تتيح هذه الطريقة التطبيق المتزامن للانفعال الدوري متعدد المحاور وإجهاد القص المائعي، مما يحاكي بشكل أدق البيئة الميكانيكية الدقيقة in vivo للأنسجة القائمة على العضلات الملساء. وفي هذا البروتوكول، أظهرت البلاعم المشتقة من نخاع العظم الفأري المخلدة (iBMDMs) والمستزرعة في مفاعلات حيوية تحت ظروف تموجية زيادة في علامات تنشيط M1، بينما لم تظهر أي اتجاهات نحو تنشيط M2. وتثبت هذه النتائج أن الميكانيكا التموجية كافية لتعديل السلوك الالتهابي للبلاعم وتدعم المفهوم الأوسع للتعديل المناعي الميكانيكي في الأنسجة المعرضة لقوى ديناميكية مدفوعة بالعضلات الملساء. وتعد هذه الطريقة قابلة للتطبيق بشكل خاص للباحثين الذين يدرسون البيولوجيا الميكانيكية، والالتهاب، وهندسة الأنسجة، وفسيولوجيا الجهاز الهضمي، والتطور الرئوي، والتليف، والأمراض الأخرى التي تتعرض فيها البلاعم لبيئات ميكانيكية دقيقة ومعقدة. ومن خلال التجميع الدقيق، والمعايرة المستمرة، والمراقبة المتواصلة، يمكن للمستخدمين ضمان أداء قابل للتكرار للمفاعل الحيوي وتجنب القيود الشائعة لهذه التقنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يصف البروتوكول عملية تجميع وتشغيل جهاز حاصل على براءة اختراع40 نظام مفاعل حيوي لدراسات التعديل المناعي الميكانيكي. الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في الـ جدول المواد.

1. زراعة الخلايا

  1. يتم استزراع البلاعم المشتقة من نخاع العظم للفئران والمخلدة (iBMDMs) في وسط RPMI 1640 كامل مضاف إليه 10% من مصل الجنين البقري (FBS) المعطل حرارياً، و1% من منظم HEPES، و1% من بيروفات الصوديوم، و1% من البنسلين-ستريبتوميسين عند درجة حرارة 37 °C في حضانة مجهزة بـ 5% CO2.

2. تصنيع بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS)

  1. قم بوزن وخلط القاعدة وعامل المعالجة من مجموعة مطاط السيليكون بنسبة 10:1 (وزن/وزن).
  2. قلب الخليط لمدة 5 min لضمان التجانس.
  3. صب الـ PDMS المخلوط بعناية في طبق بتري مربع مقاس 100 mm x 15 mm حتى يصل ارتفاع الـ PDMS إلى 3mm.
  4. ضع أطباق بتري التي تحتوي على الـ PDMS في مجفف.
  5. قم بإزالة الغازات تحت تفريغ هوائي لمدة 1 h للتخلص من فقاعات الهواء.
  6. أخرج الـ PDMS من المجفف وتأكد من عدم بقاء أي فقاعات هوائية.
  7. انقل أغشية الـ PDMS غير المعالجة إلى فرن مسخن مسبقًا عند 60 ˚ C، واتركها للمعالجة لمدة 4 h.
  8. أخرج أغشية الـ PDMS من الفرن واتركها لتبرد على طاولة المختبر طوال الليل.
  9. بعد مرور 18–24 h، افصل أغشية الـ PDMS المعالجة بعناية من أطباق بتري وقم بقصها لإنشاء أغشية PDMS بمقاس 70 mm x 40 mm x 3 mm.

3. تعقيم غشاء PDMS

  1. داخل كابينة السلامة البيولوجية، اشطف أغشية PDMS بـ 70% ethanol وضعها مباشرة على سطح كابينة السلامة البيولوجية (BSC) (الشكل التكميلي 1).
  2. عقم الأغشية باستخدام الأشعة فوق البنفسجية UV لمدة 10 min، ثم انقل غشاء PDMS إلى طبق زراعة بقطر 90 mm غير معالج لزراعة الأنسجة، بحيث يكون الجانب المعرض للأشعة فوق البنفسجية متجهًا للأعلى.
    ملاحظة: تأكد من إمساك PDMS من الجوانب وعدم تمرير اليدين أبدًا فوق الجزء العلوي من PDMS لتقليل مخاطر التلوث.
  3. بالنسبة لتجارب الحركة الدودية، استخدم أغشية PDMS بأبعادها الأصلية.
  4. بالنسبة لظروف الزراعة الساكنة، قص كل غشاء PDMS مقاس 70 mm x 40 mm إلى نصفين متساويين مقاس كل منهما 35 mm x 40 mm.

4. طلاء أغشية PDMS بالفيبرونيكتين

  1. داخل كابينة السلامة البيولوجية (BSC)، قم بتحضير حجم كافٍ من محلول fibronectin المعقم بتركيز 0.5 mg/mL في محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) لإضافة 100 µL لكل غشاء.
  2. قم بتوزيع 100 µL من محلول الطلاء هذا في مركز كل غشاء PDMS، مع التأكد من محاذاة المنطقة المطلية بدقة مع منطقة تلامس الغشاء بين PDMS والبرغي.
    ملاحظة: استخدم رأس الماصة لتوزيع المحلول برفق في طبقة رقيقة ومتساوية.
  3. اترك أغشية PDMS المطلية في طبق الزرع، مع إبقاء الغطاء مفتوحاً، لمدة 45 min للسماح بالامتزاز.
    ملاحظة: أبقِ نافذة كابينة السلامة البيولوجية (BSC) مفتوحة للحفاظ على تدفق الهواء المستمر.
  4. بعد مرور 45 min، قم بشفط محلول fibronectin المتبقي من كل غشاء.
  5. اشطف الأغشية برفق باستخدام 1 mL من محلول PBS المعقم.

5. استزراع خلايا iBMDM على غشاء PDMS

  1. عند وصول الخلايا إلى درجة تلاقي تتراوح بين 70%–80%، قم بمعالجة خلايا iBMDM المستزرعة في قارورة T25 بالتريبسين لفصلها عن السطح.
  2. حدد تركيز الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) وقم بتحضير كثافة خلوية تبلغ 100,000 cells/mL في الوسط الغذائي.
  3. قم بتوزيع 1 mL من معلق الخلايا المحضر على كل غشاء PDMS مطلي بالفبرونكتين.
  4. في كل تجربة، قم بتوزيع الخلايا على غشاء استاتيكي واحد على الأقل وغشاء تموجي واحد على الأقل لضمان المقارنة المتوازية بين الظروف المختلفة.
  5. ضع أغشية PDMS المزروعة في حاضنة رطبة عند درجة حرارة 37 °C مع 5% CO2 لمدة 24 h على الأقل للسماح بالتصاق الخلايا في كل من الظروف الاستاتيكية والتموجية (الملحق الشكل 1B).

6. المفاعل الحيوي

  1. قم بتصنيع المفاعل الحيوي باستخدام ملفات التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) والمواصفات الواردة في براءة اختراع المفاعل الحيوي (US12522795)40 أو احصل على وحدة مجمعة مسبقاً من المؤلفين.

7. تجميع ومعايرة دائرة Arduino

  1. بناء الدائرة الكهربائية
    1. قم بتجميع دائرة التحكم على لوحة تجارب (breadboard) باستخدام مقاومات متغيرة، ومقاومات، وترانزستورات، وأسلاك توصيل كما هو موضح في ملحق الشكل 2.
    2. ثبّت بيئة التطوير المتكاملة Arduino IDE على جهاز الكمبيوتر، ثم افتح مخططاً (sketch) جديداً.
    3. اضبط سرعة المحرك على 5 دورات في الدقيقة (RPM) والمضخة 연عجائية على 28 مل/دقيقة.
    4. قم بتوصيل لوحة Arduino بالكمبيوتر عن طريق منفذ USB وتحميل الكود الوارد في الملف التكميلي 1 باستخدام زر الرفع (Upload) في بيئة التطوير المتكاملة (IDE).
      ملاحظة: سيتحول لون مؤشر LED في Arduino إلى البرتقالي أثناء عملية الرفع، ثم يعود إلى الأخضر بمجرد أن يصبح جاهزاً للتشغيل. بعد اكتمال عملية الرفع، سيقوم Arduino بتنفيذ البرنامج تلقائياً عند توصيله بالطاقة.
  2. معايرة المحرك
    1. شغّل المحرك واحسب عدد الدورات لمدة دقيقة واحدة باستخدام ساعة إيقاف.
      ملاحظة: قم بتعديل معامل سرعة المحرك في كود Arduino حسب الحاجة لتحقيق 5 دورات في الدقيقة.
    2. أعِد تحميل الكود بعد كل تعديل حتى يتم الوصول إلى السرعة المطلوبة.
  3. معايرة المضخة
    1. قم بتشغيل المضخة لمدة 30 ثانية وقس الكتلة المجمعة للتحقق من أن معدل التدفق يبلغ 28 مل/دقيقة (حوالي 14 جم في 30 ثانية).
    2. اضبط مقياس الجهد وكرر العملية حتى تصبح القراءة الناتجة خلال 30 ثانية قريبة من 14 جم بشكل مستمر.
  4. بمجرد معايرة كل من المحرك والمضخة، قم بإقرانهما بوحدة مفاعل حيوي.
    ملاحظة: أصبحت مجموعة الموتور والمضخة والمفاعل الحيوي المُعايرة الآن جاهزة للاستخدام التجريبي (الشكل 2).

مخطط للمفاعل الحيوي لإعداد زراعة الخلايا البلعمية؛ وتصوير وتحليل PCR لنتائج دراسة الخلايا.
الشكل 2: مخطط لتجميع مفاعل حيوي تموجي والتحليلات اللاحقة. يتم استزراع خلايا iBMDM على غشاء PDMS مطلي بالفيبرونيكتين وموضع داخل المفاعل الحيوي. وبعد التعرض لمدة 4 h للتموج أو الحفاظ عليها كضوابط سكونية، يتم جمع الخلايا لإجراء التحليلات اللاحقة، بما في ذلك qPCR، والتلوين المناعي الفلوري، والتصوير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

8. تجميع وإعداد المفاعل الحيوي التمعجي

  1. تحضير المكونات
    1. اجمع كافة المكونات المطلوبة، بما في ذلك زجاجة الوسط الغذائي، وغطاء زجاجة الوسط، والجزء العلوي المطبوع ثلاثياً لزجاجة الوسط، والجزء العلوي المطبوع ثلاثياً للمفاعل الحيوي، والجزء السفلي المطبوع ثلاثياً للمفاعل الحيوي، والمحرك اللولبي المطبوع ثلاثياً، وأربطة تثبيت بلاستيكية (ثلاثة لكل مفاعل حيوي)، وكماشة مفصلية منزلقة، وكماشة قطرية، وأطباق زراعة أنسجة مقاس 150 ملم، وشحم سيليكون، ودعامة محرك مطبوعة ثلاثياً. رش كل قطعة بإيثانول بتركيز 70% قبل وضعها داخل كابينة السلامة البيولوجية (BSC).
    2. ضع محرك التيار المستمر (DC motor)، والمضخة 연تمية (peristaltic pump)، وطولاً إضافياً من أنابيب المضخة داخل كابينة السلامة البيولوجية (BSC).
    3. أغلق غطاء كابينة السلامة البيولوجية (BSC) وقم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 10 دقائق لتعقيم جميع المكونات (الشكل التكميلي 1ج).
  2. التحقق من التزام الخلايا وحيويتها
    1. افحص كلاً من أغشية PDMS الساكنة والمتحركة تموجياً (peristalsis) والمستزرعة بالخلايا تحت المجهر. تأكد من >التصاق الخلايا بنسبة 80% على أسطح PDMS المطلية بالفبرونكتين، وفحص مورفولوجيا الخلايا للتحقق من حيويتها.
    2. التقط صوراً تمثيلية للخلايا قبل التجميع حسب الحاجة.
  3. تحضير الضوابط الساكنة
    1. اسحب 1 مل من وسط RPMI الكامل من كل غشاء ساكن.
    2. أضف 1 مل من وسط RPMI الكامل والطازج إلى كل غشاء.
    3. ضع علامة "ساكنة" (static) على الأطباق وأعدها إلى الحاضنة.
  4. تجميع المفاعل الحيوي التمعجي
    1. أضف 15 مل من الوسط الغذائي إلى كل زجاجة وسط مخصصة للاستخدام في المفاعل الحيوي.
    2. قم بتركيب أغطية الوسائط المزودة بسدادات الزجاجات المطبوعة ثلاثية الأبعاد (والتي تحتوي على منافذ دخول/خروج) على زجاجات الوسائط. ضع هذه الزجاجات جانبًا (تكميلي الشكل 1د).
    3. قم بتجميع قاعدة المفاعل الحيوي.
      1. أدخل محرك اللولب المطبوع ثلاثي الأبعاد في البئر المركزي لقاعدة المفاعل الحيوي.
      2. أدخل محرك التيار المستمر (DC motor) في فتحة المحرك الموجودة في قاعدة المفاعل الحيوي.
      3. تأكد من استقرار عمود دوران المحرك بإحكام في الثقب المركزي لمسّمار الدفع المطبوع بتقنية ثلاثية الأبعاد.
      4. مرر حامل المحرك إلى الموضع المحدد لتثبيت المحرك.
  5. ضع المفاعل الحيوي المجمع جزئياً في طبق زراعة أنسجة مقاس 150 مم لتسهيل عملية نقله من خزانة السلامة البيولوجية (BSC) إلى الحاضنة بمجرد اكتمال تجميعه (ملحق الشكل 1E).
  6. ضع طبقة رقيقة من شحم السيليكون على أخاديد محرك اللولب حيث سيتلامس غشاء PDMS مع محرك اللولب؛ وذلك للسماح للولب بالدوران بسهولة، مما يقلل من الاحتكاك.
  7. تحميل غشاء PDMS المستزرع بالخلايا
    1. انقل أغشية PDMS الخاصة بالتموج المعوي والمستزرعة بالخلايا بعناية من الحاضنة إلى كبينة السلامة البيولوجية (BSC).
    2. قم بسحب الوسط من كل غشاء، ثم ضع الغشاء في المفاعل الحيوي بحيث يكون السطح المزروع بالخلايا متجهاً للأعلى، في الجهة المقابلة لواجهة مسمار الدفع المزيّت.
    3. ضع الجزء العلوي من المفاعل الحيوي بحيث يتماشى تجويف حجرة الخلايا مع غشاء PDMS. ثم قم بتمرير الجزء العلوي داخل أخاديد التوجيه الموجودة في الجزء السفلي من المفاعل الحيوي.
  8. تثبيت المفاعل الحيوي
    1. ثبّت الجزء العلوي والسفلي من المفاعل الحيوي باستخدام أربطة تثبيت بلاستيكية وكماشة قطرية.
    2. قم بقص الجزء الزائد من رباط التربيط البلاستيكي باستخدام الكماشات.
  9. التوصيلات المائعية وإعداد النظام
    1. قم بمحاذاة المضخة 연دية (peristaltic pump) بحيث يكون موصلها المعدني في نفس اتجاه موصل المحرك.
    2. قم بتوصيل أنبوب المضخة الأقرب إلى المفاعل الحيوي بفتحة المدخل الأقرب إلى المحرك في الجزء العلوي من المفاعل الحيوي. ادفع الأنبوب بالكامل فوق فوهة المدخل.
    3. اغمر الطرف المقابل لهذا الأنبوب داخل زجاجة الوسط الغذائي.
    4. باستخدام قطعة إضافية من أنابيب المضخة، قم بتوصيل أحد طرفيها بفوهة المخرج في الجزء العلوي من المفاعل الحيوي، وضع الطرف الآخر داخل زجاجة الوسط أعلى مستوى السائل للسماح بإعادة التدوير دون حدوث تدفق عكسي (ملحق الشكل 1F).
  10. الحضانة والتشغيل
    1. ضع تجميعة المفاعل الحيوي بأكملها (داخل طبق قطر 150 ملم) داخل الحاضنة (ملحقات الشكل 1G) مع إبقاء لوحة الدوائر المطبوعة/Arduino في الخارج، متصلة بمصدر الطاقة.
    2. قم بتوصيل مشابك التمساح
      1. المضخة: القطب الموجب بالموجب، والقطب السالب بالسالب.
      2. المحرك: تعكس القطبية وفقاً لتصميم الدائرة.
    3. ضع أطباق بتري معقمة وفارغة في الحضانة لجمع العينات لاحقاً.
    4. اترك نظام المفاعل الحيوي التمعجي يعمل لمدة 4 ساعات (أو المدة الزمنية المطلوبة) (ملحقات الشكل 1H) تحت ظروف استنبات قياسية في الحاضنة.

9. تفكيك المفاعل الحيوي

  1. افتح الحاضنة وارفع أنبوب الإدخال من زجاجة الوسط للسماح للهواء بالدخول إلى النظام وتصريف الوسط المتبقي من المفاعل الحيوي بالكامل.
  2. بمجرد توقف تدفق الوسط، افصل أسلاك المحرك و/أو المضخة من لوحة الدارات لوقف الحركة الميكانيكية.
  3. انقل مجموعة المفاعل الحيوي بأكملها إلى كابينة السلامة البيولوجية (BSC)، ثم قم بإزالة الأنابيب، وقص الأربطة البلاستيكية، وارفع الغطاء العلوي للمفاعل الحيوي.
  4. اشفط الوسط المتبقي من غشاء PDMS وانقل الغشاء مرة أخرى إلى طبق بتري نفسه المستخدم أثناء التحضير.
  5. تحقق من التصاق الخلايا وحيويتها من خلال تقييم مورفومترية الخلايا تحت مجهر زراعة الخلايا، ثم تابع التحليلات اللاحقة حسب الاقتضاء.

10. التحليل اللاحق

  1. جمع عينات qPCR
    1. داخل كابينة السلامة البيولوجية (BSC)، ضع ملصقات على أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 mL تتضمن معرفات العينات، بما في ذلك نوع الخلايا والظروف التجريبية.
    2. تحقق من استمرار وجود الخلايا على غشاء PDMS باستخدام مجهر زراعة الخلايا لكل من ظروف السكون والتموج.
    3. اشفط الوسائط المتبقية من كل غشاء PDMS.
    4. قم بتحضير محلول تحلل RNA حديثاً عن طريق إضافة β‑mercaptoethanol إلى Buffer RLT بنسبة 1:100.
    5. أضف 370 µL من Buffer RLT + β-mercaptoethanol إلى كل غشاء PDMS لتحليل الخلايا.
    6. باستخدام كاشطة خلايا معقمة، اكشط المنطقة المزروعة بالخلايا على PDMS بقوة لفصل جميع الخلايا.
    7. انقل ~350 µL من ناتج التحلل إلى الأنبوب سعة 1.5 mL المقابل.
    8. باشر بعملية استخلاص RNA أو خزن العينات عند -80 °C حتى حين الحاجة لاستخدامها.
    9. قم بتطهير كابينة السلامة البيولوجية (BSC).
      ملاحظة: يجب التعامل مع Buffer RLT و β-mercaptoethanol وفقاً لصحائف بيانات السلامة (SDS) الخاصة بكل منهما والتخلص منهما في حاويات النفايات المناسبة.
  2. التصبيغ المناعي الفلوري
    1. أضف 1 mL من البارافورمالدهيد (PFA) بتركيز 4% إلى كل غشاء واحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 min.
    2. اشفط PFA وتخلص منه في حاوية النفايات الخطرة المخصصة.
    3. أضف 1 mL من PBS إلى كل غشاء لإزالة المثبت المتبقي.
    4. استكمل بروتوكول التصبيغ المناعي الفلوري المناسب للمؤشرات المستهدفة.

11. تنظيف المفاعلات الحيوية والمكونات المرتبطة بها

  1. رش جميع مكونات المفاعل الحيوي التي تلامس الأوساط أو الخلايا أو أغشية PDMS باستخدام إيثانول 70%، بما في ذلك منافذ الدخول والخروج في المفاعل الحيوي.
  2. اشفط أي أوساط متبقية من زجاجة الأوساط، ثم اشطف الجزء الداخلي عن طريق رش إيثانول 70% بوفرة والشفط مرة أخرى.
  3. انقل جميع المكونات التي تم تعقيمها من كبينة السلامة البيولوجية (BSC) وخزنها في منطقة نظيفة مخصصة.
  4. بالنسبة لزجاجات الأوساط:
    1. نظفها بمبيض بتركيز 20%، وقم بتحريك السائل بشكل دائري، ثم تخلص من المحتويات في الحوض مع تشغيل المياه.
    2. افركها بخل مخفف بنسبة 1:10 واغسلها بالصابون والمياه فائقة النقاء، ثم اشطفها بإيثانول 70% وجففها بوضعها مقلوبة.
    3. نظف أغطية الأوساط وقطع المضخة الملحقة باستخدام إيثانول 70%.
  5. تنظيف المضخات 연동ية (peristaltic pumps)
    1. جهز كؤوس مدرجة سعة 250 mL تحتوي إما على (1) إيثانول 70%، أو (2) مياه فائقة النقاء، أو (3) حاوية نفايات فارغة.
    2. قم بتوصيل المضخة بالأنابيب في مسار تدفق مغلق وتشغيلها باستخدام لوحة الدوائر التي يتم التحكم فيها بواسطة Arduino.
    3. شغل المضخة باستخدام إيثانول 70% لمدة 1 min، ثم باستخدام مياه فائقة النقاء لمدة 1 min للتفريغ في كأس النفايات الفارغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يهدف هذا البروتوكول إلى إظهار طريقة قابلة للتكرار لتحديد كيفية تأثير القوى الميكانيكية التمعجية مباشرةً على تنظيم تفعيل البلاعم. قبل إجراء تجارب المفاعل الحيوي، تم التأكد من أن الخلايا البلعمية المستنبطة من نخاع العظم المحفزة داخليًا (iBMDMs) تستقطب بشكل مناسب استجابةً لظروف التحفيز الكيميائي الحيوي القياسية. بعد اتباع هذا البروتوكول، تم طلاء أغشية البولي دايميثيل سيلوكسان (PDMS) بالفيبرونكتين وبذرها بالخلايا البلعمية المستنبطة من نخاع العظم المحفزة داخليًا (iBMDMs). تم ترك الخلايا لتلتصق لمدة 24 ساعة قبل الفحص البصري لل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لا يزال الفهم الحالي لكيفية تأثير قوى الحركة الدودية على وظيفة الخلايا البلعمية محدوداً، على الرغم من انتشار خلل الحركة الدودية في الأمراض الالتهابية. وبينما من المعروف أن المحفزات الميكانيكية الفردية، مثل إجهاد القص والانفعال الدوري، تعمل على تعديل تنشيط الخلايا البلعمية، إلا أن تأثيرات الانفعال متعدد المحاور وتدفق السوائل المتزامنين، واللذين يشكلان معاً الحركة الدودية، لم يتم استقصاؤهما بشكل مكثف في سياق البيولوجيا الميكانيكية للخلايا البلعمية. يوفر البروتوكول الموضح هنا منصة قابلة للتكرار لدراسة كيفية تنظيم هذه القوى ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية بموجب منحة رقم 2440798. تم إنشاء الشكل 1 و الشكل 2 باستخدام نسخة مرخصة من BioRender.com.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Trypsin- EDTA بنسبة 0.25%Fisher25200056
أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mLUSA Scientific1615-5510
أطباق بتري 100 mm x 15 mmFisher50-190-0276
أطباق زراعة 150 mmFisherFB012925
بارافورمالدهيد 4%Santa Cruzsc-281692
أطباق زراعة 90 mmFisherFB012923
جسم مضاد Alexa Fluor 488 Anti-F4/80Abcamab204266
جسم مضاد Alexa Fluor 647 Anti-CD40Abcamab275158
Arduino UnoAmazonB008GRTSV6
لوحة تجارب (Breadboard)Amazon
محلول منظم RLTQiagen79216
كاشطة خلاياFisher353087
DAPIMilliporeSigma50-874-10001
مجففMilliporeSigmaZ119008
كماشة قطريةAmazon
مصل جنين البقرInnovative Biosciences11-01-500
فيبرونيكتينMilliporeSigmaF1141-1MG
محلول HEPES المنظمFisher (Gibco)15630080
iBMDMApplied Biological Materials Inc. (abm)T0673
محرك RobotshopFT-SPARK16-360
جسم مضاد PE Anti-Ym-1 + Ym-2Abcamab211621
بنسلين-ستريبتومايسينFisher15140122
مضخة 연ديةDigiKey1150
محلول ملحي منظم بالفوسفاتFisher14190250
خيط PLAAmazonB0D7ZYCVTY
مقياس جهد B1K 1K OhmAmazon‎B0CZ747F6F
RPMI 1640Fisher11875085
شحم سيليكونAmazonB000XBH9HI
كماشة مفصليةAmazon
بيروفات الصوديومCytiva HycloneSH3023901
طقم إيلاستومر السيليكون Sylgard 184FisherNC9285739
دورق زراعة T-25Fisher229331
ترانزستورDigiKeyIRF520NPBF-ND
أسلاك/مشابك تمساحAmazon
أربطة بلاستيكية 18 بوصةAmazon
β-mercaptoethanolFisherAC125472500

المراجع

  1. Mass E, Nimmerjahn F, Kierdorf K, Schlitzer A. Tissue-specific macrophages: how they develop and choreograph tissue biology. Nat Rev Immunol. 2023;23(9):563-579.
  2. Kumar V, Kumar V. Macrophages: the potent immunoregulatory innate immune cells. In: Macrophage Activation - Biology and Disease. London: IntechOpen; 2019. doi:10.5772/intechopen.88013.
  3. Ross EA, Devitt A, Johnson JR. Macrophages: the good, the bad, and the gluttony. Front Immunol. 2021;12:708186.
  4. Sreejit G, Fleetwood AJ, Murphy AJ, Nagareddy PR. Origins and diversity of macrophages in health and disease. Clin Transl Immunology. 2020;9(12):e1222.
  5. Locati M, et al. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity. Annu Rev Pathol. 2020;15:123-147.
  6. Mosser DM, Edwards JP. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 2008;8(12):958-969.
  7. Boutilier AJ, Elsawa SF. Macrophage polarization states in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 2021;22(13):6995.
  8. Orecchioni M, Ghosheh Y, Pramod AB, Ley K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1 (LPS+) versus classically and M2 (LPS−) versus alternatively activated macrophages. Front Immunol. 2019;10:1084.
  9. Huang X, Li Y, Fu M, Xin HB. Polarizing macrophages in vitro. Methods Mol Biol. 2018;1784:119-126.
  10. Gharavi AT, et al. The role of macrophage subtypes and exosomes in immunomodulation. Cell Mol Biol Lett. 2022;27(1):83.
  11. Peng Y, et al. Regulatory mechanism of M1/M2 macrophage polarization in the development of autoimmune diseases. Mediators Inflamm. 2023;2023:8821610.
  12. Clevenger AJ, Jha A, Moore E, Raghavan SA. Manipulating immune activity of macrophages: a materials and mechanics perspective. Trends Biotechnol. 2025;43(1):33-49.
  13. Khanmohammadi M, Mirzaalikhan Y, Baratchi S. Immunity in motion: the role of mechanics in macrophage biology. Cell Chem Biol. 2025;32(12). doi:10.1016/j.chembiol.2025.11.004.
  14. Adams S, et al. Mechano-immunomodulation: mechanoresponsive changes in macrophage activity and polarization. Ann Biomed Eng. 2019;47(11):2213-2231.
  15. Meizlish ML, et al. Mechanosensing regulates tissue repair program in macrophages. Sci Adv. 2024;10(11):adk6906.
  16. Lee M, Du H, Winer DA, Clemente-Casares X, Tsai S. Mechanosensing in macrophages and dendritic cells in steady-state and disease. Front Cell Dev Biol. 2022;10:1044729.
  17. Chen M, et al. Substrate stiffness modulates bone marrow-derived macrophage polarization through NF-κB signaling pathway. Bioact Mater. 2020;5(4):880-890.
  18. Blakney AK, Swartzlander MD, Bryant SJ. The effects of substrate stiffness on the in vitro activation of macrophages and in vivo host response to poly(ethylene glycol)-based hydrogels. J Biomed Mater Res A. 2012;100A(6):1375-1386.
  19. Sridharan R, Cavanagh B, Cameron AR, Kelly DJ, O'Brien FJ. Material stiffness influences the polarization state, function and migration mode of macrophages. Acta Biomater. 2019;89:47-59.
  20. Previtera ML, Sengupta A. Substrate stiffness regulates proinflammatory mediator production through TLR4 activity in macrophages. PLoS One. 2015;10(12):e0145813.
  21. Song C, et al. Microfluidic three-dimensional biomimetic tumor model for studying breast cancer cell migration and invasion in the presence of interstitial flow. Chin Chem Lett. 2019;30(5):1038-1042.
  22. Li R, et al. Interstitial flow promotes macrophage polarization toward an M2 phenotype. Mol Biol Cell. 2018;29(16):1927-1940.
  23. Son H, et al. Shear stress induces monocyte/macrophage-mediated inflammation by upregulating cell-surface expression of heat shock proteins. Biomed Pharmacother. 2023;161:114566.
  24. Zhou H, Scatena M, Tu LN, Giachelli CM, Nigam V. Monocyte adhesion to and transmigration through endothelium following cardiopulmonary bypass shearing is mediated by IL-8 signaling. Front Cardiovasc Med. 2024;11:1454302.
  25. Jui E, et al. Shear stress induces a time-dependent inflammatory response in human monocyte-derived macrophages. Ann Biomed Eng. 2024;52(11):2690-2705.
  26. Castro-Núñez L, Dienava-Verdooold I, Herczenik E, Mertens K, Meijer AB. Shear stress is required for the endocytic uptake of the factor VIII-von Willebrand factor complex by macrophages. J Thromb Haemost. 2012;10(9):1929-1937.
  27. Cheng C, et al. Atherosclerotic lesion size and vulnerability are determined by patterns of fluid shear stress. Circulation. 2006;113(23):2744-2753.
  28. Seneviratne AN, et al. Low shear stress induces M1 macrophage polarization in murine thin-cap atherosclerotic plaques. J Mol Cell Cardiol. 2015;89(Pt B):168-172.
  29. Bonito V, de Kort BJ, Bouten CVC, Smits AIPM. Cyclic strain affects macrophage cytokine secretion and extracellular matrix turnover in electrospun scaffolds. Tissue Eng Part A. 2019;25(17-18):1312-1325.
  30. Ballotta V, Driessen-Mol A, Bouten CVC, Baaijens FPT. Strain-dependent modulation of macrophage polarization within scaffolds. Biomaterials. 2014;35(18):4919-4928.
  31. Dziki JL, et al. The effect of mechanical loading upon extracellular matrix bioscaffold-mediated skeletal muscle remodeling. Tissue Eng Part A. 2018;24(1-2):128-139.
  32. Wehner S, et al. Mechanical strain and TLR4 synergistically induce cell-specific inflammatory gene expression in intestinal smooth muscle cells and peritoneal macrophages. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2010;299(5):G1187-G1197.
  33. Clevenger AJ, et al. Rapid prototypable biomimetic peristalsis bioreactor capable of concurrent shear and multiaxial strain. Cells Tissues Organs. 2023;212(1):57-72.
  34. Huizinga JD. Gastrointestinal peristalsis: joint action of enteric nerves, smooth muscle, and interstitial cells of Cajal. Microsc Res Tech. 1999;47(4):239-247.
  35. Kunz G, Leyendecker G. Uterine peristaltic activity during the menstrual cycle: characterization, regulation, function and dysfunction. Reprod Biomed Online. 2002;4(Suppl 3):5-9.
  36. Hosseini G, et al. A computational model of ureteral peristalsis and an investigation into ureteral reflux. Biomed Eng Lett. 2018;8(1):91-101.
  37. Clevenger AJ, et al. Peristalsis-associated mechanotransduction drives malignant progression of colorectal cancer. Cell Mol Bioeng. 2023;16(4):315-330.
  38. Leyendecker G, Kunz G, Wildt L, Beil D, Deininger H. Uterine hyperperistalsis and dysperistalsis as dysfunctions of the mechanism of rapid sperm transport in patients with endometriosis and infertility. Hum Reprod. 1996;11(7):1542-1551.
  39. Iwakiri K, et al. Mechanisms underlying excessive esophageal acid exposure in patients with gastroesophageal reflux disease. Esophagus. 2017;14(3):213-218.
  40. Raghavan S, Crawford LZ. 3D rapid prototypable tunable peristalsis bioreactor. United States patent. 2022: US12522795.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تنشيط البلاعمميكانيكا الحركة الدوديةتنشيط الخلايا المناعيةالإشارات الفيزيائية الحيويةمفاعل حيوي للحركة الدوديةبلاعم نخاع العظمطلاء الفيبرونيكتينالتعبير الجينيالتعديل المناعي الميكانيكي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.