يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

دراسة أترابية استرجاعية لمستويات miR-486-3p في الدم المحيطي لدى المرضى المصابين باحتشاء دماغي حاد ومتلازمة انقطاع التنفس النومى الانسدادي

42 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72643

⸱

أغسطس 28, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, 2The Second Clinical Medical College, Xuzhou Medical University

في هذه المقالة

ملخص

ينخفض مستوى miR‑486‑3p لدى مرضى الاحتشاء الدماغي الحاد المصابين بمتلازمة انقطاع التنفس النومى الانسدادي، ويرتبط سلبًا بشدة المرض والمؤشرات الالتهابية، كما يتنبأ بسوء الإنذار المرضي على مدى عام واحد، مما يدعم إمكانية استخدامه كعلامة بيولوجية تشخيصية وتنبؤية.

الملخص

ينطوي احتشاء الدماغ الحاد (ACI) المصحوب بمتلازمة انقطاع التنفس sleep apnea obstructive syndrome (OSAS) على مخاطر عالية لتكرار السكتة الدماغية والوفاة، ومع ذلك لا تزال المؤشرات الحيوية الفعالة لهذه الحالة المرضية المشتركة محدودة. شملت هذه الدراسة الأترابية الاستعادية 270 مريضاً مصاباً باحتشاء الدماغ الحاد بين نوفمبر 2020 وديسمبر 2023، تم تصنيفهم إلى مجموعة ACI (العدد = 100، مؤشر انقطاع التنفس ونقص التنفس [AHI] < 5) ومجموعة ACI المصحوبة بـ OSAS (العدد = 170، AHI ≥ 5)، مع تقسيم المجموعة الأخيرة إلى مجموعات فرعية: خفيفة (5 ≤ AHI < 15، العدد = 60)، ومتوسطة (15 ≤ AHI < 30، العدد = 75)، وشديدة (AHI ≥ 30، العدد = 35). تم قياس تعبير miR-486-3p في المصل بواسطة RT-qPCR، كما تم تقدير المؤشرات الالتهابية، بما في ذلك عامل نخر الورم ألفا (TNF-α)، والبروتين التفاعلي C (CRP)، والعامل 1-ألفا المحث بنقص الأكسجين (HIF-1α)، باستخدام تقنية ELISA. تم تقييم القيمة التشخيصية لـ miR-486-3p باستخدام تحليل منحنى خصائص التشغيل للمستقبل، وتم تقييم أهميته الإنذارية من خلال تحليل البقاء لـ Kaplan-Meier ونماذج انحدار Cox. كان تعبير miR-486-3p أقل بشكل ملحوظ في المجموعة المصابة بالمرضين معاً، وأظهر قدرة تشخيصية قوية (AUC = 0.927). ومن الملاحظ وجود اتجاه واضح يعتمد على الجرعة عبر المجموعات الفرعية لشدة OSAS، حيث انخفض miR-486-3p تدريجياً بينما زاد TNF-α و CRP تدريجياً من الحالات الخفيفة إلى الشديدة من OSAS. وأظهرت تحليلات ارتباط Spearman أن miR-486-3p يرتبط ارتباطاً عكسياً مع AHI، ودرجة NIHSS، و TNF-α، و CRP. عند المتابعة لمدة عام واحد، أظهر المرضى الذين يعانون من تعبير منخفض لـ miR-486-3p نتائج وظيفية أسوأ بكثير مقارنة بمن لديهم تعبير مرتفع. وأكد تحليل انحدار Cox متعدد المتغيرات أن miR-486-3p يمثل عاملاً وقائياً مستقلاً للإنذار لمدة عام واحد. تشير هذه النتائج إلى أن miR-486-3p قد يعمل كمؤشر حيوي تشخيصي وإنذاري جديد لمرضى ACI المصابين بـ OSAS، ربما من خلال دوره التنظيمي في الالتهاب الجهازي، وهو ما يستدعي مزيداً من التحقق في مجموعات استشرافية أكبر.

المقدمة

تعد متلازمة انقطاع التنفس الانسدادي النومي (OSAS) حالة شائعة تتميز بانقطاعات متكررة في التنفس أثناء النوم1. وغالباً ما ترتبط هذه المتلازمة بأمراض مصاحبة مثل الاضطرابات الأيضية، والقلبية الوعائية، والكلوية، والرئوية، والعصبية النفسية2. وعلاوة على ارتباطاتها العامة بأمراض القلب والأوعية الدموية والأمراض الأيضية، تشكل متلازمة OSAS تهديداً محدداً وخطيراً في حالات السكتة الدماغية الإقفارية الحادة، حيث تضاعف تعقيد ما يصل إلى 70% من الحالات وتزيد من مخاطر التدهور العصبي، والوفاة، وتكرار السكتة الدماغية3,4,5. ويشكل الاحتشاء الدماغي الحاد (ACI) الشكل الأكثر شيوعاً للسكتة الدماغية. ورغم تحقيق تقدم كبير في علاج الاحتشاء الدماغي الحاد في السنوات الأخيرة، إلا أن معظم المرضى لا يزالون يعانون من إعاقة شديدة أو حتى الوفاة6. ويؤدي التفاعل التآزري بين الاحتشاء الدماغي الحاد ومتلازمة OSAS إلى تفاقم التلف الإقفاري والالتهاب الجهازى، مما يرفع بشكل كبير من مخاطر تكرار السكتة الدماغية والإعاقة والوفاة. وبناءً على ذلك، تبرز أهمية قصوى لتحديد مؤشرات حيوية موثوقة للتشخيص المبكر وإدارة هذه الحالة المرضية المصاحبة عالية المخاطر.

أظهرت جزيئات الحمض النووي الريبي الميكروي (miRNAs) وعوداً كبيرة كعلامات بيولوجية في السنوات الأخيرة. ومن بين هذه الجزيئات، يكتسب miR-486-3p أهمية كبيرة في الأمراض الوعائية العصبية. وقد أظهرت الأبحاث السابقة أن تعبير miR-486-3p يكون مثبطاً في حالات انقطاع التنفس الانسدادي النومي (OSA)7. بالإضافة إلى ذلك، فإن العلاج باستخدام الإكسوسومات المحملة بـ miR-486-3p والبروتين السكري لفيروس داء الكلب يمكن أن يخفف من الاضطرابات السلوكية العصبية، والوذمة الدماغية، وتلف الحاجز الدموي الدماغي، والتنكس العصبي8، مما يشير إلى أن miR-486-3p يلعب دوراً في إصابة الدماغ. بعد حدوث الاحتشاء الدماغي الحاد (ACI)، يتم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في أنسجة الدماغ التالفة، مما يعزز إفراز السيتوكينات الالتهابية5. وتسبب متلازمة انقطاع التنفس الانسدادي النومي (OSAS) أعراض نقص الأكسجة المتقطع، مما يؤدي إلى تنشيط الجهاز العصبي الودي والإجهاد التأكسدي، وبالتالي تحفيز سلسلة تفاعلات التهابية جهازية9. ويرتبط miR-486-3p ارتباطاً وثيقاً بالالتهابات10. وتشير هذه الأدلة إلى أن miR-486-3p قد يعمل كحلقة وصل جزيئية بين نقص الأكسجة المرتبط بـ OSAS، والالتهاب الجهازي، والتعافي بعد السكتة الدماغية.

ومع ذلك، لم يتم استقصاء ملف تعبيره، ودقته التشخيصية، وأهميته الإنذارية بشكل منهجي لدى مرضى ACI المصابين بـ OSAS، كما لا يزال من غير المعروف ما إذا كان يرتبط بشدة OSAS أو الوسطاء الالتهابيين بطريقة تعتمد على الجرعة. ولمعالجة هذه الفجوات، قيمت هذه الدراسة القيمة التشخيصية لـ miR-486-3p لمرض OSAS لدى مرضى ACI، وفحصت علاقته المعتمدة على الجرعة مع شدة OSAS والمؤشرات الالتهابية (TNF-α و CRP و HIF-1α)، وقيمت فائدته الإنذارية للنتائج الوظيفية لمدة عام واحد. وعلى حد علمنا، هذه هي الدراسة الشاملة الأولى التي تثبت أن miR-486-3p قد يعمل كعلامة بيولوجية تشخيصية وإنذارية جديدة للمراضة المشتركة ACI-OSAS، ربما من خلال تنظيم الالتهاب الجهازي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في المستشفى التابع لجامعة Xuzhou الطبية. (رقم الموافقة: XYFY2024-KL238-01) وقد أُعفيت من شرط الحصول على موافقة مستنيرة إضافية من المرضى. وترد الكواشف والمعدات المستخدمة في الـ جدول المواد.

المرضى والعينات
كانت هذه الدراسة دراسة أتراب استرجاعية. في الفترة من نوفمبر 2020 إلى ديسمبر 2023، تم استقطاب ما مجموعه 270 مريضاً خضعوا لعلاج ACI من المستشفى التابع لجامعة Xuzhou الطبية بشكل متتابع. وتلخص الشكل التكميلي 1 عملية اختيار المرضى. تم تحديد المرضى المؤهلين من خلال الفحص اليومي لجميع الحالات الجديدة التي أُدخلت إلى وحدة السكتة الدماغية. وتم التحقق من بدء ظهور الأعراض خلال 72 h قبل الإدخال من خلال مراجعة السجلات الطبية للطوارئ، وأكد ذلك طبيب أعصاب معتمد من خلال التاريخ المرضي والمقابلة مع الأسرة. تم حساب حجم العينة بناءً على القدرة على اكتشاف فرق معنوي في مستويات miR-486-3p بين المجموعات. وبافتراض حجم تأثير قدره 0.5، وقيمة α ثنائية الجانب قدرها 0.05، وقوة (1-β) تبلغ 0.80، كانت هناك حاجة إلى 64 مريضاً كحد أدنى لكل مجموعة. وتعكس أحجام المجموعات النهائية عمليات الاستقطاب الفعلية والانتشار الأعلى لـ OSAS بين مرضى السكتة الدماغية، وليس تخصيصاً محدداً مسبقاً. تمت متابعة المرضى المصابين بـ ACI المصاحب بـ OSAS من حيث مآل المرض لمدة عام واحد.

كانت معايير الاشتمال هي: (1) السكتة الدماغية الإقفارية الحادة مع ظهور الأعراض خلال 72 ساعة قبل الدخول إلى المستشفى، مؤكدة بالتصوير بالرنين المغناطيسي. (2) القدرة على فهم وإكمال استبيانات الدراسة والتقييمات العصبية. (3) تم تقييم شدة الإصابة بالسكتة الدماغية الإقفارية الحادة (ACI) باستخدام مقياس المعهد الوطني للصحة للسكتة الدماغية (NIHSS) عند الدخول. عندما تكون درجة مقياس NIHSS <٥، فيُصنف على أنه قصور دماغي حاد (ACI) خفيف؛ وعندما تكون درجة مقياس المعهد الوطني للسكتات الدماغية (NIHSS) بين ٥ و٢٠، يُعتبر القصور الدماغي الحاد متوسطاً. وشملت معايير الاستبعاد الرئيسية وجود تاريخ من الأورام الخبيثة، أو إعاقة جسدية شديدة سابقة أو اضطرابات نفسية، أو قصور شديد في القلب أو الرئة أو الكلى، أو خضوع المريض لجراحة كبرى أو تعرضه لصدمة خلال الأشهر الثلاثة السابقة، أو وجود عدوى نشطة أو أمراض مناعية ذاتية؛ أو إصابة بسكتة دماغية سابقة خلال ٦ أشهر؛ أو تلقي علاج مثبط للمناعة؛ أو تشخيص مسبق أو علاج لمتلازمة انقطاع التنفس الانسدادي النومي (OSAS) (بما في ذلك العلاج بضغط المجرى الهوائي الإيجابي المستمر).

للتأكيد عبر التصوير بالرنين المغناطيسي، خضع جميع المرضى لتصوير رنين مغناطيسي قياسي للدماغ باستخدام نظام 3.0-T، بما في ذلك التسلسلات التالية: التوزين T1، والتوزين T2، والاسترداد الانعكاسي بتوهين السوائل (FLAIR)، والتصوير الموزون بالانتشار (DWI)، وتخطيط معامل الانتشار الظاهري (ADC). وقد عُرِّفت الاحتشاءات الحادة بوجود إشارة عالية الكثافة في تصوير DWI مع إشارة منخفضة الكثافة مقابلة لها في تخطيط ADC. قام اثنان من أطباء الأشعة العصبية ذوي الخبرة بتفسير جميع صور الرنين المغناطيسي، وكانوا غير مطلعين على البيانات السريرية، مع حل أي تعارضات عن طريق التوافق. كما تم إجراء تقييم NIHSS عند الدخول من قبل أطباء أعصاب معتمدين قبل أي علاج مذيب للجلطات أو علاج داخل الأوعية الدموية.

جُمعت عينات دم وريدية في حالة صيام بعد مرور 24 ساعة إلى 48 ساعة من بداية السكتة الدماغية، وذلك بعد صيام ليلة كاملة لمدة 8 h على الأقل. وقد أُجري سحب الدم بين الساعة 6:00 صباحاً و8:00 صباحاً لتقليل التباين اليوماوي. جُمع إجمالي 5 mL من الدم الوريدي الطرفي في أنابيب تفريغ مطلية بمادة EDTA. وفي غضون ساعتين من الجمع، تم طرد عينات الدم مركزياً عند 1,500 × g لمدة 15 min عند 4 °C باستخدام جهاز طرد مركزي مبرد. ثم نُقل المزيج الطافي من المصل بعناية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL خالية من RNase، وخُزنت فوراً عند −80 °C حتى استخلاص RNA. تم تجنب دورات التجميد والإذابة المتكررة بدقة؛ حيث خضعت جميع العينات الموزعة لدورة تجميد وإذابة واحدة كحد أقصى قبل التحليل.

تجميع المرضى
تم تجميع المشاركين بناءً على درجات مؤشر توقف التنفس ونقص الأكسجين (AHI) المستمدة من تخطيط النوم. أُجريت جميع التسجيلات في مختبر النوم بالمستشفى بين الساعة 10:00 مساءً و6:00 صباحاً ولمدة لا تقل عن 7 h. شملت القنوات الفسيولوجية المراقبة ما يلي: تخطيط كهربائية الدماغ (EEG؛ ست قنوات)، وتخطيط كهربائية العين (EOG؛ قناتان)، وتخطيط كهربائية العضلات (EMG؛ الذقن والعضلات الظنبوبية الأمامية الثنائية)، وتخطيط كهربائية القلب (ECG؛ طرف واحد)، وتدفق الهواء الأنفي (المقاوم الحراري ومحول الضغط)، والجهد التنفسي الصدري والبطني (تخطيط تحريض التنفس)، وقياس تأكسج النبض (SpO2). قام فني دراسة النوم بحساب AHI. تم تقييم مراحل النوم والأحداث التنفسية يدوياً بواسطة فني نوم معتمد وفقاً لدليل تسجيل الأكاديمية الأمريكية لطب النوم (AASM) لعام 2012، باستخدام برنامج Somnolyzer 24×7. وفقاً للمعايير التشخيصية المقبولة على نطاق واسع من الأكاديمية الأمريكية لطب النوم، فإن قيمة AHI التي تبلغ 5 أحداث أو أكثر في الساعة هي العتبة القياسية لتشخيص انقطاع التنفس الانسدادي أثناء النوم (OSA). وبناءً على ذلك، صُنِّف المشاركون الذين لديهم AHI < 5 ضمن مجموعة ACI (العدد = 100)، بينما صُنِّف الذين لديهم AHI ≥ 5 ضمن مجموعة ACI المصابة بـ OSAS (العدد = 170). ومن بين أولئك الذين لديهم AHI ≥ 5 (مجموعة ACI المصابة بـ OSAS، العدد = 170)، تم تقسيم المرضى إلى ثلاث مجموعات فرعية حسب شدة الحالة بناءً على المعايير المعتمدة: OSAS خفيف (5 ≤ AHI < 15، العدد = 60)، وOSAS متوسط (15 ≤ AHI < 30، العدد = 75)، وOSAS شديد (AHI ≥ 30، العدد = 35). مكّن هذا التقسيم من تقييم العلاقة المعتمدة على الجرعة بين عبء نقص الأكسجة، وتعبير miR‑486‑3p، والمؤشرات الالتهابية. لم يتم إدراج المرضى الذين خضعوا لعلاج سابق لـ OSAS (مثل CPAP) في الدراسة لتجنب تداخل النتائج في قياس AHI الأساسي.

تقييم الإنذار المرضي
تتيح النقطة الزمنية عند مرور سنة واحدة تلاشي التأثيرات الحادة وظهور العبء التراكمي لنقص الأكسجة الناتج عن OSAS، مما يوفر نافذة قوية لتقييم تأثيره الإنذاري. تم تقييم الإنذار السريري للمرضى الذين يعانون من ACI المصاحب لـ OSAS باستخدام مقياس رانكين المعدل (mRS) بعد ظهور المرض. أجرى جميع تقييمات mRS أطباء أعصاب معتمدون خضعوا لتدريب معياري قبل الدراسة، وذلك باستخدام نموذج مقابلة mRS المهيكل. تم تقييم الموثوقية بين المقيمين باستخدام معامل كابا >0.85. أُجري تقييم المتابعة من خلال زيارة مجدولة للعيادات الخارجية. أما بالنسبة للمرضى غير القادرين على الحضور شخصيًا، فقد أجرت ممرضة أبحاث مدربة مقابلة هاتفية مهيكلة باستخدام نص معياري. كان جميع المقيمين عميانيين تجاه مستويات miR-486-3p وحالة OSAS لدى المرضى. وللحفاظ على الاتساق بين تقييمات العيادات الخارجية والتقييمات الهاتفية، استخدم كلا التنسيقين نفس الاستبيان المهيكل، وأكمل جميع المقيمين تمرين معايرة قبل الدراسة. تم وضع المرضى الذين سجلوا درجات من 0 إلى 2 في مجموعة الإنذار الجيد، وأولئك الذين سجلوا درجات من 3 إلى 6 في مجموعة الإنذار السيئ. لم يتم فقدان أي مريض أثناء المتابعة. تم تقييم SAQLI وESS وTNF-α وHIF-1α كمتغيرات إنذارية بدلاً من استخدامها لتحديد مجموعات الإنذار. تم إجراء NIHSS وSAQLI وESS من قبل موظفي أبحاث مدربين. كما أُجري SAQLI وESS كاستبيانات يديرها القائم بالمقابلة في غرفة هادئة.

مؤشر التقييم
يعد NIHSS مقياساً كمياً للسكتة الدماغية11، حيث تشير الدرجات الأعلى إلى شدة أكبر في ACI. أما SAQLI فهو استبيان لجودة الحياة لمرضى OSA على مقياس من 1 إلى 7، وتشير الدرجات الأعلى إلى جودة حياة أسوأ، وهو يغطي الأنشطة اليومية، والتفاعلات الاجتماعية، والحالات العاطفية، والأعراض، والأعراض المرتبطة بالعلاج12. ويُستخدم ESS لفحص النعاس النهاري المبلغ عنه ذاتياً من قبل المرضى، وتتراوح درجاته من 0 إلى 24، وتشير الدرجة > 10 إلى وجود نعاس نهاري13.

استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) والنسخ العكسي
تم استخلاص الـ RNA الكلي من 200 µL من المصل باستخدام كاشف TRIzol. وباختصار، خُلطت عينات المصل مع 800 µL من TRIzol، وحُضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 min، ثم وُضعت في جهاز الطرد المركزي عند 12,000 × g لمدة 15 min عند 4 °C. أُضيف الكلوروفورم (200 µL)، ورُج الخليط بقوة لمدة 15 s، ثم حُضن لمدة 3 min، ووُضع في جهاز الطرد المركزي عند 12,000 × g لمدة 15 min عند 4 °C. نُقلت الطور المائي إلى أنبوب جديد، ورُسب الـ RNA باستخدام 500 µL من الإيزوبروبانول، وحُضن عند −20 °C لمدة 1 h، ثم وُضع في جهاز الطرد المركزي عند 12,000 × g لمدة 10 min عند 4 °C. غُسلت كتلة الـ RNA المترسبة بإيثانول 75%، وجُففت بالهواء، ثم أُذيبت في 20 µL من ماء خالٍ من RNase. تم تقييم تركيز ونقاء الـ RNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي للميكرو-حجم، مع قبول نسبة A260/A280 التي تتراوح بين 1.8 و 2.0 للتحليلات اللاحقة. كما تم التحقق من سلامة الـ RNA عن طريق الفصل الكهربائي لهلام الأجاروز.

أُجري النسخ العكسي باستخدام 500 ng من إجمالي RNA باستخدام Reverse Transcription Kit في حجم تفاعل كلي قدره 20 µL، مع استخدام بادئات سداسية عشوائية (random hexamer primers) وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. نُفذ تفاعل النسخ العكسي عند 25 °C لمدة 10 min، ثم عند 42 °C لمدة 60 min، وأخيراً عند 70 °C لمدة 5 min. حُفظ الـ cDNA الناتج عند −20 °C حتى وقت الاستخدام.

تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR)
تم الكشف عن تعبير miR-486-3p باستخدام طقم PCR في الوقت الحقيقي يعتمد على SYBR Green لتقدير كمية microRNA على نظام PCR كمي في الوقت الحقيقي (qPCR). احتوى مزيج التفاعل على 10 µL من 2× SYBR Green Master Mix، و2 µL من قالب cDNA (مخفف بنسبة 1:5)، و1 µL من كل بادئ (10 µM)، وماء خالٍ من النوكلياز حتى يصل الحجم النهائي إلى 20 µL. تسلسلات البادئات هي كما يلي (من 5'-3'): miR-486-3p-forward: TCGGCAGCGGGGCAGCUCAGU، وreverse: CTCAACTGGTGTCGTGGA؛ وU6-forward: CTCGCTTCGGCAGCACA، وreverse: AACGCTTCACGAATTTGCGT. كانت ظروف دورات qPCR كالتالي: 95 °C لمدة 2 min، تليها 40 دورة من 95 °C لمدة 30 s، و60 °C لمدة 30 s، و72 °C لمدة 60 s. تم تشغيل كل عينة في ثلاث مكررات، وتم تضمين ضابط خالي من القالب في كل تشغيلة. تم تأكيد خصوصية التضخيم من خلال تحليل منحنى الانصهار من 60 °C إلى 95 °C. تم تحديد عتبة الدورة (Ct) تلقائياً بواسطة برنامج QuantStudio 6 Pro (v1.5) باستخدام إعداد العتبة الافتراضي. حُسب مستوى miR-486-3p باستخدام طريقة 2-ΔΔCT وتمت معايرته بالنسبة إلى U6. تم التحقق من U6 كجين مرجعي مستقر في عينات المصل الخاصة بنا باستخدام خوارزمية NormFinder لضمان الاتساق عبر المجموعات. كانت معاملات الاختلاف بين المقاييس وداخل المقياس الواحد <5%.

مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)
تم قياس تركيزات البروتين التفاعلي C (CRP)، وTNF-α، وHIF-1α في المصل باستخدام مجموعة أدوات ELISA. وقد نُفذت الإجراءات التجريبية وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. وباختصار، تم إذابة عينات المصل على الجليد وتخفيفها بنسبة 1:2 باستخدام محلول التخفيف المرفق. أضيفت العينات والمعايير إلى ألواح ذات 96 بئراً مطلية مسبقاً (100 µL/بئر) وحُضنت لمدة 2 h عند 37°C. وبعد الغسل أربع مرات باستخدام 300 µL من محلول الغسل، أضيف 100 µL من الجسم المضاد للكشف المقترن بالبيوتين وحُضن لمدة 1 h عند 37°C. وعقب خطوة غسل أخرى، أضيف 100 µL من الستريبت افيدين المقترن ببيروكسيداز الفجل (horseradish peroxidase) وحُضن لمدة 30 min عند 37°C في الظلام. ثم أضيفت المادة التفاعل اللونية (tetramethylbenzidine، 100 µL) وحُضنت لمدة 15 min عند 37°C مع الحماية من الضوء. أوقف التفاعل بإضافة 50 µL من محلول الإيقاف، وقِيست الامتصاصية عند 450 nm باستخدام قارئ الألواح الدقيقة (microplate reader). حُسبت التركيزات من منحنيات قياسية أُنتجت باستخدام تركيزات معروفة من البروتينات المؤشبة. قِيست كل عينة في مكررات، واستُخدمت القيمة المتوسطة للتحليل. كما تضمنت كل لوحة عينات ضبط الجودة المقدمة من الشركة المصنعة؛ ولم تُقبل النتائج إلا عندما وقعت قيم ضبط الجودة (QC) ضمن النطاق المحدد من قبل الشركة المصنعة.

ضبط الجودة وقابلية التكرار
أُجريت جميع المقايسات المختبرية وفقًا لإرشادات MIQE (الحد الأدنى من المعلومات لنشر تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي) الخاصة بـ RT-qPCR ومعايير التقارير المناسبة لتقنية ELISA. وقد تمت معايرة الأجهزة الرئيسية وفقًا لجداول الشركة المصنعة. كما شملت كل مجموعة من تشغيلات RT-qPCR وELISA عينات ضابطة سالبة وموجبة لمراقبة التباين بين الأطباق. سُجلت جميع البيانات وأُديرت باستخدام برنامج Microsoft Excel، وسيقوم المؤلف المسؤول بتوفير البروتوكولات التجريبية التفصيلية والبيانات الخام بناءً على طلب معقول.

التحليل الإحصائي
تم تحليل البيانات باستخدام برنامج SPSS 23.0 وبرنامج آخر للإحصاء والرسم البياني. وقُيِّم التوزيع الطبيعي باستخدام اختبار شابيرو-ويلك (Shapiro–Wilk). وتُعرض المتغيرات المستمرة في صورة متوسط حسابي. ± الانحراف المعياري أو الوسيط (المدى الرباعي)، وتمت مقارنتها باستخدام اختبار t أو اختبار مان-ويتني U، حسبما كان مناسباً. أما المتغيرات الفئوية فقد قورنت بواسطة χ2 الاختبار. تم فحص الارتباطات باستخدام تحليلات بيرسون أو سبيرمان بناءً على توزيع البيانات. كما تم تحديد القيمة التنبؤية باستخدام منحنى خصائص تشغيل المستقبل (ROC)، وتم التحقق منها من خلال التحقق المتقاطع خماسي الطيات (5-fold cross-validation). وتحددت قيمة القطع المثلى لـ miR-486-3p من خلال تعظيم مؤشر يودن (Youden index). واستُخدمت تحليلات ارتباط بيرسون وسبيرمان لتقييم الارتباطات. وفيما يخص تحليل الإنذار، تم تقسيم المرضى إلى طبقات بناءً على القيمة الوسيطة للتعبير عن miR‑486‑3p؛ واستُخدمت منحنيات كابلان-ماير مع اختبار رتبة السجلات (log‑rank test) لمقارنة نتائج البقاء على قيد الحياة بين المجموعات. أما المتغيرات ذات... P < أُدخلت المتغيرات التي كانت قيمة p لها 0.1 أو أقل في تحليل ريجريشن كوكس أحادي المتغير إلى نموذج كوكس متعدد المتغيرات. P < اعتُبرت القيمة 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الخصائص الأساسية في مجموعة ACI ومجموعة ACI المصابة بـ OSAS مجتمعة
كما هو موضح في الجدول 1، تكونت مجموعة ACI من 68 ذكراً و32 أنثى، بمتوسط عمر بلغ 62.84 ± 12.65 سنة، بينما شملت مجموعة ACI المصابة بـ OSAS مجتمعة 16 ذكراً و54 أنثى، بمتوسط عمر بلغ 61.31 ± 1.25 سنة. أظهرت مجموعة ACI المصابة بـ OSAS مجتمعة ارتفاعاً ملحوظاً في قيمة AHI، ودرجات NIHSS، ومستويات CRP. ومع ذلك، أظهرت المجموعتان توزيعات متقاربة من حيث العمر، والجنس، وBMI، وارتفاع ضغط الدم، وDM، وأمراض القلب، وعسر شحوم الدم، والتدخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعاني المرضى المصابون بـ OSAS من انهيار وانسداد متكرر في الممرات الهوائية، مما يؤدي إلى نقص الأكسجة المتقطع (IH) والنعاس المفرط أثناء النهار (EDS)، وهو ما قد يتسبب في تلف عصبي14. وينتشر OSA بشكل كبير بعد ACI، حيث يؤثر على ما يقرب من 72% من المرضى، ويزيد بشكل ملحوظ من المخاطر القلبية الوعائية15. ويشكل ACI طيفًا من العجز العصبي الناتج عن نقص تروية ونقص أكسجة دماغي موضعي ثانوي لعدم كفاية التروية‌16. ومن المرجح أن نقص الأكسجة المتقطع الذي يعد أساسيًا في ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

تم تمويل هذه الدراسة من قبل "أبحاث تقنيات الوقاية من السكتة الدماغية وعلاجها" (رقم WKZX2023CZ0143).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
جهاز التصوير بالرنين المغناطيسي بقوة 3.0 تسلاسيمنز هيلثينيرز، ألمانياMAGNETOM Skyraتصوير الدماغ لتأكيد الاحتشاء الدماغي الحاد
أطباق ميكرو-إليسا (ELISA) ذات 96 بئراًشركة شينزين شينبوشينغ البيولوجية المحدودة، الصينلوحة XBS-PLATEتفاعل المستضد والأجسام المضادة للكشف بواسطة مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)
إرشادات الممارسة السريرية لجمعية طب النوم الأمريكية (AASM) بشأن التنفس المضطرب أثناء النومالأكاديمية الأمريكية لطب النومالدليل الإرشادي الكامل لعام 2020معايير تشخيص مؤشر توقف التنفس ونقص التأكسج (AHI) الموحدة ومعايير تصنيف شدة متلازمة انقطاع التنفس الانسدادي أثناء النوم (OSAS)
النسخة المعتمدة باللغة الصينية من مؤشر كالغاري لجودة الحياة لدى مرضى انقطاع التنفس أثناء النوم (SAQLI)جامعة كالغاريطبعة مترجمة لعام ٢٠٢١تقييم جودة الحياة للمرضى الذين يعانون من السكتة الدماغية الإقفارية المصحوبة بانقطاع التنفس الانسدادي أثناء النوم
أنابيب جمع الدم بالتفريغ سعة 5 مل تحتوي على EDTA-K2BD Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكية367863جمع الدم الوريدي الطرفي لفصل المصل
نسخة مصادق عليها باللغة الصينية من مقياس إيبورث للنعاس (ESS)جامعة جونز هوبكنزطبعة منقحة لعام 2018تقييم النعاس النهاري لدى مرضى السكتة الدماغية
GraphPad Prism 9GraphPad Software، الولايات المتحدة الأمريكيةالإصدار 9.4.1مخططات التشتت، والمخططات الصندوقية، وتصوير منحنى خصائص التشغيل للمستقبل (ROC)
طقم مقايسة الممتزة المناعية المرتبطة بالإنزيم لبروتين سي التفاعلي البشري (CRP ELISA Kit)شركة شينزين شينبوشينج البيولوجية المحدودة، شينزين، الصينXBS-H001الكشف الكمي عن البروتين التفاعلي C في المصل
العامل المحفز لنقص الأكسجة-1 البشري (Human HIF-1)α طقم مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)شركة شينزين شينبوشينغ البيولوجية المحدودة، شينزين، الصينXBS-H007الكشف الكمي عن العامل 1 المحث بنقص التأكسج في المصلα
عامل نخر الورم البشري-ألفا (Human TNF-α)α طقم مقايسة الممتزة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA Kit)شركة شينزين شينبوشينغ البيولوجية المحدودة (Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd.)، شينزين، الصينXBS-H003الكشف الكمي عن عامل نخر الورم ألفا (TNF-α) في المصلα عامل التهاب
IBM SPSS Statistics 23.0IBM، أرمونك، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكيةالإصدار 23.0جميع التحليلات الإحصائية (اختبار t، والارتباط، ومنحنى خصائص تشغيل المستقبل ROC، وكابلان-ماير)–(تحليل ماير-كابلان، وانحدار كوكس)
مقياس الطيف الضوئي للأطباق الدقيقةThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)Multiskan FCقراءة الامتصاصية لأطباق مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) عند 450 نانومتر
miR-486-3p & بادئات qPCR لـ U6Sangon Biotech، شنغهاي، الصينالتخليق المخصصتضخيم الجينات المستهدفة والمرجعية من أجل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)
طقم miScript SYBR Green PCRQiagen GmbH، هيلدن، ألمانيا218073تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي لـ miR-486-3p وU6
النسخة الصينية المعتمدة من مقياس معاهد الصحة الوطنية للسكتة الدماغية (NIHSS)المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS)، الولايات المتحدة الأمريكيةالإصدار السريري القياسيتقييم شدة الحالة العصبية عند خط الأساس لمرضى الإصابة الدماغية الحادة (ACI)
برنامج تسجيل درجات نوم تخطيط النوم (PSG)شركة BMC Medical المحدودة، الصينالإصدار 3.2التقييم الأولي الآلي لأحداث الجهاز التنفسي أثناء النوم
نظام QuantStudio 6 Pro لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (Real-Time PCR)Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)QuantStudio 6 Proتضخيم RT-qPCR، الحصول على منحنى الانصهار، تسجيل قيمة Ct
برنامج QuantStudio لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (Real-Time PCR)Applied Biosystems, الولايات المتحدة الأمريكيةإصدار 1.7تصدير البيانات الخام لـ qPCR، تحليل قيمة Ct
جهاز طرد مركزي مخبري مبرد لسطح المختبرشركة شيانغيي لأجهزة الطرد المركزي المحدودة، هونان، الصينTDZ5-WSفصل المصل من الدم الكامل (2700 × جم، 4 °C)
طقم RevertAid RT للنسخ العكسيThermo Fisher Scientific، والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكيةK1691النسخ العكسي لـ miRNA في المصل إلى cDNA
أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل خالية من RNaseAxygen، الولايات المتحدة الأمريكيةMCT-150-Cتجزئة وتخزين المصل المفصول
كاشف TRIzol لعزل الحمض النووي الريبوزي (RNA)Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15596026استخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي (Total RNA) من عينات مصل الدم البشري
مجمد بدرجة حرارة منخفضة للغايةHaier Biomedical، شاندونغ، الصينDW-86L388تخزين عينات المصل لفترات طويلة في −80 °C
جهاز مراقبة polysomnography طراز YH-600Bشركة BMC Medical المحدودة، بكين، الصينYH-600Bمراقبة النوم طوال الليل وحساب مؤشر انقطاع التنفس ونقص التأكسج (AHI) لتشخيص متلازمة انقطاع التنفس الانسدادي أثناء النوم (OSAS)

المراجع

  1. Lv R, et al. Pathophysiological mechanisms and therapeutic approaches in obstructive sleep apnea syndrome. Signal Transduct Target Ther. 2023;8(1):218.
  2. Gleeson M, McNicholas WT. Bidirectional relationships of comorbidity with obstructive sleep apnoea. Eur Respir Rev. 2022;31(164):210256.
  3. Seiler A, et al. Prevalence of sleep-disordered breathing after stroke and TIA: a meta-analysis. Neurology. 2019;92(7):e648-e654.
  4. Zhou Y, et al. Correlation between obstructive sleep apnea and hypoperfusion in patients with acute cerebral infarction. Front Neurol. 2024;15:1363053.
  5. Du W, Fan L, Du J. Neuroinflammation-associated miR-106a-5p serves as a biomarker for the diagnosis and prognosis of acute cerebral infarction. BMC Neurol. 2023;23(1):248.
  6. Tang Y, et al. Analysis of carotid vulnerable plaque MRI high-risk features and clinical risk factors associated with concomitant acute cerebral infarction. BMC Cardiovasc Disord. 2023;23(1):173.
  7. Santamaria-Martos F, et al. Circulating microRNA profile as a potential biomarker for obstructive sleep apnea diagnosis. Sci Rep. 2019;9(1):13456.
  8. Sheng B, et al. Exosome-mediated delivery of miR-486-3p alleviates neuroinflammation via. SIRT2-mediated inhibition of mitophagy after subarachnoid hemorrhage. Stroke Vasc Neurol. 2025;10(3):335-346.
  9. May AM, Mehra R. Obstructive sleep apnea: role of intermittent hypoxia and inflammation. Semin Respir Crit Care Med. 2014;35(5):531-544.
  10. Verjans R, et al. Functional screening identifies microRNAs as multicellular regulators of heart failure. Sci Rep. 2019;9(1):6055.
  11. Kwah LK, Diong J. National Institutes of Health Stroke Scale (NIHSS). J Physiother. 2014;60(1):61.
  12. Tanellari O, et al. Study on quality of life of patients with obstructive sleep apnea: pilot study. Medicina (Kaunas). 2025;61(7):1234.
  13. Hajikarim-Hamedani A, Rassa S, Tarjoman T, Shafiei M. Assessment of sleep patterns in migraine sufferers using the Epworth Sleepiness Scale. J Headache Pain. 2025;26(1):58.
  14. Liu X, et al. The relationship between inflammation and neurocognitive dysfunction in obstructive sleep apnea syndrome. J Neuroinflammation. 2020;17(1):229.
  15. Dharmakulaseelan L, Boulos MI. Sleep apnea and stroke: a narrative review. Chest. 2024;166(4):857-866.
  16. Song XD, Li SX, Zhu M. Plasma miR-409-3p promotes acute cerebral infarction via. suppressing CTRP3. Kaohsiung J Med Sci. 2021;37(4):324-333.
  17. Wu Z, et al. Integrated analysis of competitive endogenous RNA networks in acute ischemic stroke. Front Genet. 2022;13:833545.
  18. Li K, Wei P, Qin Y, Wei Y. MicroRNA expression profiling and bioinformatics analysis of dysregulated microRNAs in obstructive sleep apnea patients. Medicine (Baltimore). 2017;96(34):e7917.
  19. Sriram S, Mehkri Y, Quintin S, Lucke-Wold B. Shared pathophysiology: understanding stroke and Alzheimer's disease. Clin Neurol Neurosurg. 2022;218:107306.
  20. Small C, Mehkri Y, Panther E, Felisma P, Lucke-Wold B. Coronavirus disease 2019 and stroke: pathophysiology and management. Can J Neurol Sci. 2023;50(4):495-502.
  21. Tamin S, et al. Association between laryngopharyngeal reflux and obstructive sleep apnea in adults. PeerJ. 2022;10:e13303.
  22. Fabbri M, et al. Measuring subjective sleep quality: a review. Int J Environ Res Public Health. 2021;18(3):1082.
  23. Song R, Baker TL, Watters JJ, Kumar S. Obstructive sleep apnea-associated intermittent hypoxia-induced immune responses in males, pregnancies, and offspring. Int J Mol Sci. 2024;25(3):1852.
  24. Liu X, et al. Effects of Kudiezi injection on serum inflammatory biomarkers in patients with acute cerebral infarction. Dis Markers. 2018;2018:7936736.
  25. Liang Z, et al. Effects of remote ischemic postconditioning on the proinflammatory neutrophils of peripheral blood in acute cerebral infarction. Aging (Albany NY). 2023;15(10):4481-4497.
  26. Imani MM, et al. Serum and plasma tumor necrosis factor alpha levels in individuals with obstructive sleep apnea syndrome: a meta-analysis and meta-regression. Life (Basel). 2020;10(6):87.
  27. Bian F, Kang S, Cui H, Wang F, Luan T. The clinical efficacy of compound Danshen injection on acute cerebral infarction and on the changes in the CRP, D-dimer, and IL-6 levels. Am J Transl Res. 2021;13(7):8126-8133.
  28. Tie YX, Fu YY, Xu Z, Peng Y. Relationship between C-reactive protein levels and obstructive sleep apnea syndrome. Genet Mol Res. 2016;15(2): DOI:10.4238/gmr.15027808.
  29. Dutt N, Janmeja AK, Mohapatra PR, Singh AK. Quality of life impairment in patients of obstructive sleep apnea and its relation with the severity of disease. Lung India. 2013;30(4):289-294.
  30. Feng X, et al. Test-retest reliability of Epworth Sleepiness Scale score in patients with untreated obstructive sleep apnea. Nat Sci Sleep. 2024;16:2299-2309.
  31. Lapin BR, Bena JF, Walia HK, Moul DE. The Epworth Sleepiness Scale: validation of one-dimensional factor structure in a large clinical sample. J Clin Sleep Med. 2018;14(8):1293-1301.
  32. Zolotoff C, et al. Obstructive sleep apnea, hypercoagulability, and the blood-brain barrier. J Clin Med. 2021;10(14):3099.
  33. Meliante PG, et al. Molecular pathology, oxidative stress, and biomarkers in obstructive sleep apnea. Int J Mol Sci. 2023;24(6):5478.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

المؤشرات الالتهابيةتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR)مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)مؤشر حيوي إنذاريتكرار السكتة الدماغيةالالتهاب الجهازي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.