مقالة بحثية

زيادة الحساسية من خلال التضخيم الحلقي باستخدام الكربون المنشط والبنتونيت للكشف عن أنواع Vibrio في المنتجات السمكية

32 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72887

⸱

سبتمبر 8, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Microbiología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, 2Departamento de Biotecnología, División de Ciencias Biológicas y de la Salud

في هذه المقالة

ملخص

تعمل هذه الدراسة على تحسين مقايسة التضخيم isothermal المتوسط بالحلقة (LAMP) باستخدام الكربون المنشط والبنتونيت للكشف عن أنواع Vibrio الممرضة في المأكولات البحرية. تعمل هذه المعالجة الأولية على إزالة مثبطات التفاعل بفعالية، مما يؤدي إلى تشخيصات أسرع وأكثر حساسية وأقل تكلفة بشكل ملحوظ مقارنة بالطرق التقليدية.

الملخص

الـ ضمة (Vibrio) يضم هذا الجنس أكثر من 100 نوع، يُعتبر 12 منها ممرضة للبشر؛ أما الأنواع التي يتم عزلها بشكل متكرر في الأغذية فهي V. cholerae، V. parahaemolyticus, *V. vulnificus*، و *V. alginolyticus*تكمن المشكلة الرئيسية في تحديدها من خلال الطرق الميكروبيولوجية التقليدية في التكاليف الباهظة وطول فترة التشخيص. وقد استُخدم تضخيم الحمض النووي isothermal بوساطة الحلقة (LAMP) لتحديد... V. cholerae، وV. parahaemolyticus، وV. vulnificus، و *V. alginolyticus*استُخدم الكربون المنشط مع البنتونيت (ACB) لإزالة المثبطات، مما أدى إلى تحسين حساسية الاختبار؛ واختُبرت قيم الرقم الهيدروجيني 6 و7 و9، بالإضافة إلى فترات تلامس مختلفة بين العينة وACB. وقد تحسنت طريقة حساسية LAMP عند استخدام الكربون المنشط والبنتونيت لإزالة مثبطات التفاعل في عينات الروبيان والأسماك والمحار. وكانت حساسية LAMP، والقيمة التنبؤية السلبية، والقيمة التنبؤية الإيجابية، ونوعية LAMP مساوية لـ 90% أو أعلى من ذلك لجميع العينات التي تم اختبارها. ويمكن أن تكون طريقة LAMP بديلًا لتحديد V. cholerae، V. parahaemolyticus, *V. vulnificus*، و *V. alginolyticus* في المنتجات السمكية، وذلك نظراً لسرعة التطبيق، والحساسية العالية، والتكاليف المنخفضة مقارنة بالطريقة القياسية.

المقدمة

تنتشر أنواع جنس Vibrio على نطاق واسع في البيئات البحرية، وقد ترتبط بالأسماك أو الرخويات أو القشريات بطريقة قد تكون ممرضة أو تعايشية. وقد أُفيد بأن 12 نوعاً يمكن أن تكون ممرضة للبشر، حيث أظهرت أنواع Vibrio cholerae وV. parahaemolyticus وV. vulnificus وV. alginolyticus تكراراً أعلى في العزل من المنتجات السمكية. وفي الولايات المتحدة، تقدر السلطات الصحية أن أنواع Vibrio تسبب أكثر من 80,000 عدوى سنوياً1,2,3,4,5. ويتم تحقيق عزل أنواع Vibrio من خلال الطرق التقليدية التي تتضمن الإثراء المسبق، والزراعة في أوساط انتقائية، والتأكيد عن طريق الاختبارات البيوكيميائية والمصلية6,7. وتتقيد هذه الطرق التقليدية بالوقت الطويل المطلوب لعزل الممرض (ما يصل إلى 5 أيام) وافتقارها إلى القدرة التحليلية، مما يؤدي غالباً إلى الفشل في التمييز الدقيق بين الأنواع المتقاربة داخل جنس Vibrio بسبب تشابه السمات المظهرية والبيوكيميائية6,7,8.

بدلاً من ذلك، تم وصف التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) بأنه تقنية جزيئية سريعة ودقيقة وغير مكلفة لتحديد المسببات المرضية9,10. وتعتبر هذه الطريقة ذات فعالية عالية من حيث التكلفة وأسرع من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التقليدي، حيث إنها لا تتطلب معدات متطورة مثل أجهزة التدوير الحراري9. تتيح طريقة LAMP، في خطوة واحدة، الكشف عن الجين المستهدف من خلال ملاحظة العكارة في أنبوب التفاعل الناتجة عن ترسب بيروفوسفات المغنيسيوم، كونه منتج تفاعل مستقر عند 65 °C، وهي درجة الحرارة المستخدمة في تقنية LAMP، وبذلك يرتبط تزايد العكارة بكمية DNA المصنعة، مما يغني عن استخدام هلام الأجاروز وأجهزة التصوير الضوئي11,12,13,14,15.

يمكن تحسين حساسية الكشف عن هذه الممرضات من خلال إزالة مثبطات التفاعل مثل البروتياز وأيونات الكالسيوم والجليكوجين والليبيدات التي يمكن أن تثبط بوليميراز Bst أو ترتبط بالحمض النووي المستهدف، مما يمنع عملية التضخيم13,16,17,18,19,20. وقد أفيد بأن مزيج الكربون المنشط مع البنتونيت (ACB) يتمتع بكفاءة عالية في إزالة مثبطات التضخيم، مما يزيد من حساسية الكشف عن Escherichia coli في عينات المحار، ويقلل التكاليف لأن ACB أقل تكلفة من استخدام الأطقم التجارية21.

نقترح في هذا العمل تحسين طريقة LAMP باستخدام الكربون المنشط والبنتونيت لزيادة الحساسية في الكشف عن V. cholerae و V. parahaemolyticus و V. vulnificus و V. alginolyticus مباشرة من المنتجات السمكية. وتوفر هذه الطريقة المحسنة إرشادات عملية للمراقبة الروتينية وضبط الجودة في الصناعات الغذائية، حيث أنها قابلة للتطبيق بشكل كبير في التشخيص السريع لمسببات الأمراض، مما يغني عن مراحل الإثراء المسبق الطويلة. وفيما يتعلق بالأداء المتوقع، تُظهر الطريقة حساسية ممتازة (أكثر من 98%) ونوعية (100%) في مصفوفات مثل الأسماك والروبيان. ومع ذلك، فإن هناك قيداً رئيسياً يجب مراعاته وهو أنه في العينات عالية التلوث من المصدر، مثل المحار، لا يمكن لنظام ACB إزالة جميع المواد العضوية المتداخلة تماماً، مما قد يؤدي إلى انخفاض طفيف في حساسية المقايسة (94%–98%).

البروتوكول

لم تتضمن هذه الدراسة مشاركين من البشر أو الحيوانات الفقارية؛ ولذلك، لم يتطلب الأمر الحصول على موافقة أخلاقية مؤسسية. تدرج الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. السلالات البكتيرية المستخدمة واستخلاص الحمض النووي DNA

تمت زراعة سلالات Vibrio cholerae no O1 CECT 55، و V. parahaemolyticus ATCC 17802، و V. vulnificus ATCC 29037، و V. alginolyticus ATCC 17749 في مرق تغذية القلب والدماغ (BHI) مع 2% NaCl عند 37 °C لمدة 24 h. بينما تم استزراع سلالات Escherichia coli ATCC 25922، و Cronobacter sakazakii ATCC 12868، و Listeria monocytogenes ATCC 49594، و Salmonella Typhimurium ATCC 14028 في مرق BHI بدون كلوريد الصوديوم عند 37 °C لمدة 24 h لاستخدامها كضوابط سلبية في الاختبارات. ولاستخلاص الـ DNA، تم طرد المزرعة التي نمت طوال الليل مركزياً عند 16,000 x g لمدة 6 min عند 25 °C في جهاز طرد مركزي. تم سكب السائل الطافي بعناية لتجنب تعكير كتلة الخلايا، ثم أُعيد تعليق الكتلة جيداً عن طريق السحب بالماصة في 500 μL من محلول منظم TAE (حمض التريس-أسيتيك-EDTA، pH 8). تم غلي المعلق لمدة 6 min لتحليل الخلايا، ثم بُرِّد فوراً على الثلج لمدة 5 min. أُجريت عملية طرد مركزي نهائية لترسيب الحطام الخلوي، مما نتج عنه سائل طافي رائق يحتوي على الـ DNA المستخلص، والذي استُخدم لاحقاً كقالب للتضخيم بواسطة تقنية LAMP22,23.

2. إجراء LAMP

تم اختبار البادئات المستخدمة في تقنية LAMP (الجدول 1) لتأكيد النوعية في تحديد أنواع V. cholerae وV. parahaemolyticus وV. vulnificus وV. alginolyticus. أُجري تحديد كل نوع من أنواع Vibrio باستخدام تقنية LAMP في أنابيب تفاعل عن طريق تحضير حجم نهائي قدره 25 μL من الخليط الذي يحتوي على: 1.6 μM من كل بادئ، و1.4 mM من خليط dNTP، و6 mM من MgSO4، و800 mM من betaine، و8 U من Bst DNA polymerase، و5 μL من الحمض النووي القالب (template DNA). خُلط مزيج التفاعل برفق وحُضن في حمام مائي عند 65 °C لمدة 60 min. وبعد انتهاء وقت التحضين، فُصلت نواتج التضخيم على هلام أغاروز بنسبة 1.5%. ثم صُبغت نواتج التضخيم باستخدام 1 μL من صبغة DNA فلورية مخففة بنسبة 1:100 وكُشفت باستخدام جهاز إضاءة خلفية (transilluminator) بضوء أزرق. وتضمنت تقنية أخرى لتحديد ما إذا كان الاختبار إيجابياً في التعرف على الممرض إضافة 4 μL من hydroxynaphthol blue (HNB, 125 μM) إلى أنابيب التفاعل وملاحظة تغير اللون بالعين المجردة. وقد أشارت النتيجة الإيجابية إلى تكون لون أزرق، بينما أشارت النتيجة السلبية إلى لون بنفسجي24. استُخدمت سلالات Escherichia coli ATCC 25922 وCronobacter sakazakii ATCC 12868 وListeria monocytogenes ATCC 49594 وSalmonella Typhimurium ATCC 14028 كضوابط سلبية لطريقة LAMP. فُصلت عمليات التضخيم التي تم الحصول عليها في LAMP على هلام أغاروز وفُحصت باستخدام جهاز الإضاءة الخلفية. ثم تم الحصول على الصور الناتجة ورقمنتها باستخدام برنامج MS 1D Analysis Software.

3. معالجة عينات المحار والروبيان والأسماك للتخلص من أنواع Vibrio الموجودة طبيعياً في العينات

تم الحصول على عشر عينات من المحار، وعشر عينات من الروبيان، وعشر عينات من الأسماك بوزن تقريبي يبلغ 200 g لكل منها. ولإزالة خلايا Vibrio الموجودة طبيعياً، تم اتباع المنهجية المنشورة سابقاً21. وُزن خمسون غراماً (50 g) من كل عينة وجرى تجانسها ميكانيكياً في خلاط ريشي بسرعة 260 rpm لمدة 1 min، مما أنتج معلقاً نسيجياً متجانساً، خُزن بعد ذلك في درجة حرارة -70 °C لمدة 72 h. لاحقاً، أُذيبت العينات تماماً باستخدام حمام مائي بدرجة حرارة 40 °C، وغُسلت العينات بـ 300 mL من محلول منظم الفوسفات الملحي (0.85% NaCl, pH 9). وللتأكد من أن الإجراء السابق قد نجح في القضاء على Vibrio في العينات، تم إجراء منهجية الإثراء المسبق الموضحة في الفصل التاسع من الدليل التحليلي البكتيري التابع لإدارة الغذاء والدواء7. استُبدل المحلول الملحي الذي يحتوي على العينة بـ 450 mL من ماء الببتون القلوي (APW, pH 9). ثم حُضرت تخفيفات تسلسلية بدقة في APW حتى تخفيف 10⁻3 وحُضنت لمدة 24 h. وأخيراً، تم تخطيط جزء من كل أنبوب على وسط انتقائي من أغار الثيوسلفات والسترات وأملاح الصفراء والسكروز (TCBS) وحُضنت لمدة 24 h عند 37 °C للتأكيد البصري على عدم وجود مستعمرات Vibrio المميزة. نُفذت جميع الاختبارات في ثلاث مكررات.

4. تحضير الكربون المنشط مع البنتونيت (ACB) وتقييم الاسترداد الخلوي

لتحديد الظروف التي يكون فيها ACB أكثر كفاءة في امتصاص المثبطات الموجودة في عينات المنتجات السمكية مع الحفاظ على الحد الأدنى من امتصاص الخلايا المستهدفة، تم اتباع المنهجية المنشورة21 لتحديد الرقم الهيدروجيني (pH) ووقت التلامس الأمثل بين ACB وعينات الطعام. غُسل الكربون المنشط جيداً بالماء المقطر وجُفف عند 55 °C. بعد ذلك، تم خلط 32.6 g من الكربون المنشط مع 3.04 g من البنتونيت، مع التقليب المستمر بسرعة 150 rpm لمدة 24 h لضمان التوزيع المتجانس، ثم جُفف المزيج عند 55 °C وعُقم، مما نتج عنه مسحوق ACB جاف وناعم ومتجانس. ولتقييم استعادة الخلايا بعد خلط خلايا Vibrio مع مزيج الكربون المنشط والبنتونيت (ACB)، تم تنمية السلالات بشكل منفصل في مرق BHI مع 2% NaCl حتى وصلت كثافة الخلايا إلى 1.5 x 104 CFU/mL. ثم تم تلقيح 1 mL من كل سلالة Vibrio بشكل منفصل في 100 mL من محلول الفوسفات المنظم (PBS, 0.85% NaCl، مع ضبط pH عند 4 و6 و9). بعد ذلك، دُمج المعلق البكتيري مع 4.6 g من ACB المُجهز مسبقاً وتُرك للتقليب بسرعة 150 rpm لمدة 15 و30 و60 min لتسهيل التلامس. وبعد كل فترة تلامس محددة، تم فصل أليكوت بحجم 0.1 mL بعناية، ونشره على أطباق آغار TCBS، وحضنه عند 37 °C لمدة 24 h قبل إجراء عد المستعمرات.

5. تقييم حد الكشف عن V. cholerae و V. parahaemolyticus و V. vulnificus و V. alginolyticus في عينات المحار والروبيان والأسماك المعالجة بالكربون المنشط والبنتونيت

تم استزراع كل نوع من أنواع Vibrio المستخدمة في هذه الدراسة في مرق BHI، وضُبطت كثافات الخلايا بدقة لتكون 1.5 x 104 و7.5 x 103 و3.8 x 103 و1.5 x 103 و7.5 x 102 و3 x 102 و1.5 x 102 و76 CFU/mL (A600 nm ~0.25) كما تم قياسها باستخدام مقياس الطيف الضوئي. لاحقاً، استُخدم 1 mL من كل مزرعة Vibrio لتلقيح 50 g من كل عينة (المحار، والأسماك، والروبيان) التي عولجت مسبقاً للقضاء على أي وجود لبكتيريا Vibrio. تم تجانس العينات الملقحة في خلاط ريشي عند 360 rpm لمدة 30 s وخُففت بـ 450 mL من APW (pH 6). ثم تم طرد الخليط مركزياً عند 260 x g لمدة 5 min عند 4 °C لفصل الحطام الكبير. صُب السائل العلوي الناتج في دوارق تحتوي على 23 g من ACB، وحُرّك عند 150 rpm لمدة 15 min لامتصاص المثبطات، ثم رُشح باستخدام ورق الترشيح، مما أنتج رشاحة صافية خالية من الجسيمات الكبيرة. ثم طُردت هذه الرشاحة مركزياً عند 16,000 x g لمدة 10 min عند 4 °C، مما أدى إلى تكون كتلة خلوية مرئية في قاع الأنبوب، والتي استُخدمت لاحقاً لاستخلاص DNA. تم تحديد كل نوع من أنواع Vibrio بطريقة LAMP. تضمنت الضوابط السالبة عينات ملقحة بسلالات من Escherichia coli ATCC 25922 وCronobacter sakazakii ATCC 12868 وListeria monocytogenes ATCC 49594 وSalmonella Typhimurium ATCC 14028. حُضن خليط التفاعل في حمام مائي عند 65 °C لمدة 60 min. بعد وقت التحضين، فُصلت نواتج التضخيم على هلام أغاروز بتركيز 1.5% وصُبغت بصبغة DNA فلورية. وكُشف عن الهلام باستخدام جهاز عرض الضوء الأزرق. وأخيراً، أُضيف 4 μL من هيدروكسي نافثول الأزرق (125 μM) إلى كل أنبوب للكشف بالعين المجردة24.

6. تحديد القيمة التنبؤية الإيجابية والقيمة التنبؤية السلبية والخصوصية والحساسية لطريقة LAMP

تم تحديد الحساسية والنوعية والقيم التنبؤية لطريقة LAMP باستخدام 30 عينة (10 من الروبيان، و10 من المحار، و10 من الأسماك). تم تلقيح كل عينة بأدنى تركيز يمكن الكشف عنه تم تحديده لكل نوع من أنواع Vibrio. ولتحديد نسبة الحساسية والنوعية، بالإضافة إلى القيمة التنبؤية السلبية (NPV) والقيمة التنبؤية الإيجابية25، استُخدم جدول تباين لتلخيص الإيجابيات الحقيقية (TP)، والسلبيات الحقيقية (TN)، والإيجابيات الكاذبة (FP)، والسلبيات الكاذبة (FN) التي تم الحصول عليها خلال التجارب. (الجدول 2). وبناءً على هذه البيانات، تم تطبيق الصيغ التالية:

صيغ الحساسية والنوعية؛ التحليل الإحصائي؛ تقييم الاختبار التشخيصي.

صيغة القيمة التنبؤية الإيجابية؛ TP/(TP+FP)؛ التحليل الإحصائي؛ تقييم بيانات الرعاية الصحية

صيغة القيمة التنبؤية السلبية: TN/(TN+FN)، طريقة التحليل الإحصائي.

النتائج

السلالات البكتيرية المستخدمة واستخلاص الحمض النووي DNA
تم استخلاص الحمض النووي DNA بنجاح من جميع السلالات الممرضة وسلالات التحكم السلبية لاستخدامها كقوالب في اختبارات LAMP اللاحقة.

إجراء تقنية LAMP
كانت البادئات المستخدمة في هذا العمل متخصصة في تضخيم الهدف الجزيئي لكل نوع من أنواع الـ Vibrio. وقد أظهرت نواتج التضخيم التي تم الحصول عليها بواسطة تقنية LAMP عند استخدام سلالات Vibrio أن كل بادئة كانت متخصصة في تضخيم الجين المستهدف لكل نوع من أنواع الـ Vibrio (الشكل 1).

معالجة عينات المحار والروبيان والأسماك للقضاء على أنواع Vibrio الموجودة طبيعيًا في العينات
كانت المعالجة للقضاء على أنواع Vibrio الموجودة طبيعيًا في العينات كافية، مما أدى إلى خفض أنواع Vibrio بنسبة 100%. لم يحدث أي نمو لأنواع Vibrio عند اتباع طريقة BAM7.

تحضير الكربون المنشط مع البنتونيت (ACB) وتقييم الاسترداد الخلوي
أدت إزالة مثبطات التفاعل باستخدام الكربون المنشط-بنتونيت إلى زيادة الحساسية في الكشف عن الممرض باستخدام طريقة LAMP. ويرجع ذلك إلى قدرة الكربون المنشط-بنتونيت على امتصاص المواد المثبطة التي يمكن أن تؤثر على إنزيم البوليميراز أثناء إجراء التضخيم، بالإضافة إلى الاحتفاظ المحدود بالخلايا البكتيرية (الشكل 2). وأظهرت نسبة استرداد Vibrio باستخدام قيم pH وأوقات تلامس مختلفة استرداداً خلوياً أكبر (93.4% ± 2.9%) عندما كانت قيمة pH 6 مع وقت تلامس قدره 15 min. وعند استخدام pH 4، لم يحدث أي نمو لبكتيريا Vibrio، وكانت النسب عند pH 7 و 9 هي 33.4% ± 7.6% و 67.2% ± 5.8% على التوالي. ويقترح هذا العمل استخدام pH 6 لتحسين حساسية الكشف في هذه الطريقة.

تقييم حد الكشف عن V. cholerae و V. parahaemolyticus و V. vulnificus و V. alginolyticus في عينات من المحار والروبيان والأسماك المعالجة بالكربون المنشط والبنتونيت
في عينات المحار، كان حد الكشف عن V. cholerae هو 150 CFU/g، بينما كان حد الكشف عن V. alginolyticus و V. vulnificus و V. parahaemolyticus هو 3 x 102 CFU/g؛ أما في عينات الروبيان والأسماك، فقد تم الكشف عن V. cholerae عند تركيز أدنى قدره 150 CFU/g، في حين كان حد الكشف عن V. alginolyticus و V. vulnificus و V. parahaemolyticus هو 76 CFU/g. وأظهرت النتائج التي تم الحصول عليها بواسطة طريقة LAMP أن استخدام hydroxinaphthol blue، مقارنة بحساسية LAMP، أدى إلى إزالة مثبطات التفاعل في العينات التي لم تُعالج بـ ACB (الشكل 3). وقد لاحظنا أن حساسية LAMP كانت أعلى عندما عولجت العينات بـ ACB.

تحديد القيمة التنبؤية الإيجابية، والقيمة التنبؤية السلبية، والخصوصية، والحساسية لطريقة LAMP
تم تقييم الأداء التشخيصي لطريقة التضخيم isothermal المتوسط الحلقة (LAMP) المحسنة، مع وبدون المعالجة المسبقة بالكربون النشط والبنتونيت (ACB)، بشكل منهجي عبر 150 تجربة لتقييم متانتها (الجدول 3). أدى التخلص من مثبطات الأغذية الطبيعية باستخدام نظام ACB إلى تحسين جميع المعايير التشخيصية بشكل ملحوظ (الحساسية، والخصوصية، والقيمة التنبؤية الإيجابية (PPV)، والقيمة التنبؤية السلبية (NPV)) لتصل إلى قيم تساوي أو تزيد عن 90% في جميع المصفوفات، مقارنة بالعينات غير المعالجة.

في عينات الأسماك والروبيان المعالجة بـ ACB، أظهر الاختبار أقصى أداء تشخيصي، حيث حقق حساسية ونوعية وقيمة تنبؤية إيجابية (PPV) وقيمة تنبؤية سلبية (NPV) بلغت 100% (الشكل 4). وعلى العكس من ذلك، في عينات الأسماك والروبيان غير المعالجة، أدى وجود المثبطات المشتقة من المصفوفة إلى إضعاف الاختبار بشكل كبير، مما قلل من حساسية الكشف إلى 62.5% و 52.5% على التوالي. أما بالنسبة لمصفوفة المحار شديدة التعقيد، فقد نجحت المعالجة بـ ACB في تخفيف التداخلات الرئيسية، مما أدى إلى حساسية إجمالية عالية بلغت 95.0% وقيمة تنبؤية سلبية (NPV) بلغت 71.4% (الشكل 5). وفي المقابل، أظهرت عينات المحار غير المعالجة انخفاضاً حاداً في حساسية الكشف إلى 32.5% وقيمة تنبؤية سلبية (NPV) بلغت 15.6% بسبب الوجود الكثيف للمركبات العضوية مثل الجليكوجين والدهون التي تثبط إنزيم البوليميراز.

ظلت النوعية التشخيصية لطريقة LAMP بنسبة 100% عبر جميع التجارب البالغ عددها 150 تجربة، بغض النظر عن نوع المصفوفة أو المعالجة المسبقة، مع تسجيل صفر من النتائج الإيجابية الكاذبة. وتُعزى هذه النوعية المطلقة إلى التصميم عالي الانتقائية لمجموعات البادئات التي تستهدف جينات خاصة بكل نوع (gyrB لبكتيريا V. alginolyticus، وompW لبكتيريا V. cholerae، وtlh لبكتيريا V. parahaemolyticus، وvvhA لبكتيريا V. vulnificus). وتثبت هذه النتائج الإحصائية أن طريقة ACB-LAMP المحسنة هي أداة موثوقة وقوية للغاية للكشف السريع والخالي من المزارع عن أنواع Vibrio الممرضة في المنتجات السمكية المتنوعة.

أخيرًا، نرى أن استخدام طريقة LAMP بالتزامن مع معالجة أولية للتخلص من مثبطات التفاعل يمكن أن يزيد من حساسية الكشف عن الممرضات في الأغذية باستخدام طريقة LAMP. وبناءً على ذلك، فإن تطبيق هذه التقنية في البحث عن V. cholerae وV. parahaemolyticus وV. alginolyticus وV. vulnificus سيكون مفيدًا في عمليات الرصد للوقاية من العدوى التي تسببها هذه الكائنات الدقيقة.

توافر البيانات:
جميع البيانات الخام التي تدعم نتائج هذه الدراسة، بما في ذلك التعدادات العددية لمستعمرات البكتيريا المستعادة (CFU/g) تحت قيم pH وأزمنة تلامس مختلفة، بالإضافة إلى نتائج أداء التشخيص الكاملة لجميع تجارب التحقق الـ 150، متاحة للعامة في مستودع Zenodo على الرابط https://doi.org/10.5281/zenodo.21799272. وتحتوي مجموعة البيانات المرتبطة على ملف جدول البيانات الكامل (الملحق 1).

هلام الرحلان الكهربائي للحمض النووي، ست عينات، ومؤشر الحجم، يوضح فصل الحزم للتحليل.
الشكل 1: تحليل نوعية نواتج تضخيم LAMP على هلام أغاروز بتركيز 1.5%. المسار M، مؤشر الحجم الجزيئي 100 bp؛ المسار 1، ضابط سلبي (Escherichia coli ATCC 25922)؛ المسار 2، ضابط سلبي (Listeria monocytogenes ATCC 49594)؛ المسار 3، V. alginolyticus ATCC 17749؛ المسار 4، V. cholerae no O1 CECT 557؛ المسار 5، V. parahaemolyticus ATCC 7802؛ المسار 6، V. vulnificus ATCC 29037. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

استعادة البكتيريا مقابل الوقت عند مستويات pH مختلفة، رسم بياني خطي، دراسة كفاءة الامتزاز.
الشكل 2: نسبة استعادة سلالات Vibrio باستخدام ظروف pH وأوقات تلامس مختلفة مع خليط الكربون المنشط والبنتونيت (ACB). تم تحديد نسبة استعادة الخلايا (%) بعد تلقيح سلالات Vibrio بتركيز 1.5 × 104 CFU/mL في محلول PBS تم ضبطه عند pH 4.0 و6.0 و7.0 و9.0، والمعالجة بـ 4.6 g من ACB لمدة 15 min و30 min و60 min. تظهر نقطة البيانات عند pH 6.0 وزمن تلامس 15 min الاستعادة الخلوية المثلى (93.4% ± 2.9%)، مما يشير إلى أن وقت التلامس القصير كافٍ لاستعادة الخلايا المستهدفة مع الحفاظ على كفاءة عالية في إزالة المثبطات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

نتائج المقايسة اللونية؛ مقارنة صبغة HNB-MGA في أنابيب PCR؛ مخطط التحليل النوعي.
الشكل 3: حد الكشف عن نواتج تضخيم LAMP في عينات مأكولات بحرية مدعمة صناعياً. نتائج التضخيم في عينات (A) المحار، و(B) الروبيان، و(C) الأسماك المدعمة بتخفيفات متسلسلة من أنواع Vibrio والمعالجة مسبقاً بـ ACB. الأنابيب: (1) ضابط سلبي؛ (2) V. alginolyticus؛ (3) V. parahaemolyticus؛ (4) V. vulnificus؛ (5) V. cholerae no O1؛ و(6) V. mimicus (استُخدم كضابط مستهدف). اللوحة العلوية: الكشف اللوني البصري باستخدام 4 μL من هيدروكسي نافثول بلو (HNB, 125 μM) تحت الفحص بالعين المجردة، حيث تظهر التفاعلات الإيجابية باللون الأزرق وتبقى التفاعلات السلبية باللون البنفسجي. اللوحة السفلية: الكشف القائم على الفلورة باستخدام صبغة Midori Green Advanced (MGA) التي تم تصورها تحت جهاز إضاءة خلفية بضوء أزرق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تعريف Vibrio بواسطة LAMP؛ مخطط شريطي للقيم التنبؤية والحساسية والخصوصية؛ تأثيرات المثبطات.
الشكل 4: معايير أداء التشخيص المقارنة لطريقة LAMP مع وبدون إزالة المثبطات. مقارنة للحساسية الإجمالية، والخصوصية، والقيمة التنبؤية الإيجابية (PPV)، والقيمة التنبؤية السلبية (NPV) في عينات الأسماك والروبيان والمحار الملقحة عند أدنى حدود الكشف (n = 10 تجارب لكل مزيج من الأنواع/المصفوفة، بإجمالي 150 تجربة). تقارن الأعمدة العينات التي تمت معالجتها مسبقاً بخليط الكربون المنشط-بنتونيت (ACB) المحسن مقابل عينات ضابطة غير معالجة (بدون إزالة المثبطات). تم تحديد مستويات التلقيح عند 150 CFU/g لبكتيريا V. cholerae في جميع المصفوفات؛ و300 CFU/g لبكتيريا V. parahaemolyticus وV. alginolyticus وV. vulnificus في المحار؛ و76 CFU/g في الأسماك والروبيان. نجحت المعالجة المسبقة باستخدام ACB في استعادة جميع معايير التشخيص إلى ≥90% في جميع المصفوفات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخطط بياني شريطي يقارن نسب الحساسية والنوعية للكائنات الحية الدقيقة في الأسماك والمحار والروبيان.
الشكل 5الحساسية والنوعية المحددة للهدف لطريقة ACB-LAMP المحسّنة عبر مصفوفات مأكولات بحرية مختلفة. الأداء التشخيصي الفردي لـ *V. alginolyticus*, V. cholerae, V. parahaemolyticusو، و V. vulnificus في عينات الأسماك والروبيان والمحار (عدد الاختبارات = 10 اختبارات لكل مزيج من الهدف/الغذاء) المعالجة مسبقاً بطريقة ACB. وبلغت النوعية 100% لجميع الأهداف بفضل تصميم بادئات نوعية لكل نوع تستهدف الـ gyrB, ompW, يرجى تزويد النص المراد ترجمته.، و vvhA الجينات. وقد بلغت الحساسية ١٠٠٪ في مصفوفات الأسماك والروبيان، مع ملاحظة انخفاض طفيف إلى ٩٠٪ في المحار بسبب التعقيد المرتفع للمستوى الأساسي للمصفوفة العضوية الذي أدى إلى التداخل مع التفاعل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: البادئات المستخدمة في فحوصات التضخيم المتماثل بوساطة الحلقة (LAMP). وصف للبادئات الداخلية الأمامية والعكسية (FIP, BIP)، والبادئات الخارجية (F3, B3)، وبادئات الحلقة (LF, LB) المصممة لاستهداف أنواع محددة من V. alginolyticus (gyrB)، وV. parahaemolyticus (tlh)، وV. vulnificus (vvhA)، وV. cholerae (ompW). يرجى النقر هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: جدول تلازمي لتقييم معايير أداء التشخيص لطريقة LAMP. إعداد مصفوفة 2×2 قياسية تُستخدم لتصنيف وتلخيص الحالات الإيجابية الحقيقية (TP)، والحالات السلبية الحقيقية (TN)، والحالات الإيجابية الكاذبة (FP)، والحالات السلبية الكاذبة (FN) لحساب الحساسية، والنوعية، والقيمة التنبؤية الإيجابية (PPV)، والقيمة التنبؤية السلبية (NPV) في عينات مأكولات بحرية ملقحة وغير ملقحة. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1: مجموعات البيانات الخام التي تدعم نتائج هذه الدراسة. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

تحدد هذه الدراسة الظروف المثلى لتعزيز حساسية تضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) للكشف عن V. cholerae و V. parahaemolyticus و V. alginolyticus و V. vulnificus في عينات المأكولات البحرية الملوثة. ومن خلال تجنب مرحلة الإثراء المسبق التقليدية، يتم تقليل وقت التشخيص بشكل كبير، مما يوفر نهجاً سريعاً وعالي الكفاءة لتحديد المسببات المرضية مباشرة من المنتجات السمكية.

يتمثل التحسين المنهجي الرئيسي في هذه الدراسة في تحسين خطوة إزالة المثبطات؛ حيث اعتمدت المنهجيات السابقة درجة حموضة (pH) تبلغ 4 قبل عملية التضخيم.21؛ ومع ذلك، أدى ذلك إلى عدم استعادة أي سلالات من بكتيريا Vibrio، ويرجع ذلك أساساً إلى ضمّات (Vibrio) تتسم الأنواع بحساسية عالية تجاه البيئات الحمضية26ولمعالجة ذلك، تم تعديل الظروف بشكل منهجي لتحسين الاستعادة الخلوية والقضاء على مثبطات التفاعل الموجودة طبيعياً في آن واحد. وقد ثبت أن إعادة تعليق الكربون المنشط مع البنتونيت (ACB) في محلول منظم عند درجة حموضة (pH) 6، يليه الرج مع العينة لمدة 15 دقيقة، يمثل الظرف الأمثل. ويعمل هذا التعديل على زيادة التنافر الإلكتروستاتيكي بين البكتيريا وACB إلى أقصى حد من خلال الاقتراب من نقطة التعادل الكهربائي لغشاء البكتيريا.21,27,28وبذلك يتم تقليل فقدان الخلايا المستهدفة إلى أدنى حد. ونتيجة لذلك، حقق هذا التحسين المنهجي حساسية كشف تزيد بمقدار 2-50 مرة عن تلك الموجودة في العينات التي تمت معالجتها بدون استخدام ACB.

وبعيداً عن هذه التحسينات المنهجية، قد يتطلب التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول استكشافاً صريحاً للأخطاء في حال ظهور مشكلات شائعة. ومن المشكلات المتكررة التي يتم مواجهتها أثناء التنفيذ الإزالة غير الكاملة للمواد العضوية، والتي يمكن أن تتداخل مع إنزيم البوليميراز وتقلل من حساسية LAMP، خاصة في المصفوفات شديدة التلوث. وإذا فشل التضخيم أو انخفضت الحساسية، يجب أن يبدأ استكشاف الأخطاء بالتحقق من قيمة pH لخليط عينة ACB؛ حيث إن الانحرافات عن pH 6 قد تؤدي إلى موت الخلايا (إذا كان الوسط حمضياً جداً) أو عدم امتصاص المثبطات بشكل كافٍ. بالإضافة إلى ذلك، في حال حدوث نتائج سلبية خاطئة رغم المعالجة السليمة بـ ACB، يجب على الباحثين التأكد من أن وقت التلامس لا يتجاوز 15 min، حيث إن التعرض المطول يمكن أن يؤدي إلى احتجاز غير مقصود للخلايا المستهدفة بواسطة المصفوفة. أما بالنسبة للكشف بالعين المجردة، فيمكن معالجة التغيرات اللونية الغامضة من خلال ضمان الإزالة الكاملة لأيونات الكالسيوم من المصفوفة، والتي قد تتداخل بخلاف ذلك مع ترسيب بيروفوسفات المغنيسيوم في مقايسة LAMP.

يُقدم هذا العمل، لأول مرة، تحديد أنواع Vibrio في عينات الأسماك باستخدام طريقة LAMP بالتزامن مع المعالجة المسبقة بـ ACB. ويعزز هذا البحث المجال العلمي من خلال تأسيس طريقة تحديد سريعة وموثوقة ومنخفضة التكلفة للمنتجات السمكية13,19,23,29. وبينما يمثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التقليدي نهجاً بديلاً لاختبار هذه الفرضية، فإن الخصوصية القوية والقيم التنبؤية التي تم الحصول عليها هنا تثبت أن مقايسة ACB-LAMP هي الخيار الأفضل. وتتمثل الميزة المنهجية الحاسمة لهذه التقنية في عدم اعتمادها على معدات متطورة وباهظة الثمن، مثل أجهزة التدوير الحراري، وغرف الرحلان الكهربائي، وأجهزة الإضاءة فوق البنفسجية9,30. علاوة على ذلك، فإن الكشف البصري عن النتائج عبر هيدروكسي نافثول الأزرق يبسط تفسير البيانات بشكل كبير.

على الرغم من الحساسية والنوعية العاليتين اللتين تم تحقيقهما، لوحظ وجود قيد ملموس في الدراسة عند التعامل مع المصفوفات ذات التلوث الأساسي المرتفع، مثل عينات المحار. في هذه الحالات، لا يستطيع نظام ACB إزالة جميع المواد العضوية المتداخلة بشكل كامل، مما يقلل قليلاً من حساسية المقايسة مقارنة بعينات الأسماك أو الروبيان. وأخيراً، تسلط التطبيقات المحتملة لهذه الطريقة الضوء على فائدتها في المراقبة الروتينية عالية الإنتاجية في الصناعات الغذائية للوقاية من العدوى المرتبطة بـ Vibrio. ويجب أن تعطي التوجهات المستقبلية الأولوية لأتمتة خطوات استخلاص DNA وإزالة المثبطات باستخدام ACB. إن أتمتة هذه الميزات المنهجية الرئيسية تمثل ميزة حاسمة من شأنها أن تقلل بشكل كبير من وقت العمل اليدوي، وتحد من الخطأ البشري، وتوحيد متغيرات استكشاف الأخطاء وإصلاحها، مما يسهل تطبيق هذه التقنية على نطاق واسع في مختبرات مراقبة الجودة الصناعية.

الإفصاحات

يقر المؤلفون بعدم وجود أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكربون المُنشَّطسايجمـا-ألدريتشC2764
البنتونيتسايجمـا-ألدريتش682659
بيتينسايجمـا-ألدريتشب0300
نظام التصوير البيولوجي مع مصدِر إضاءة خلفيأنظمة الصور الحيويةMBE-CP-01
بوليمراس الحمض النووي بستنيو إنغلاند بيولابسM0374
طرد مركزي (الطراز J2-HS)بيكمان كولتر<أ هريف="https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri">https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri
كرونوبيكتر ساكازاكييATCC12868
مزيج دي إن تي بيثيرمو فيشر ساينتفيكر0241
إيشيريشيا كولايATCC25922
هيدروكسي نفثول الأزرقسايجمـا-ألدريتش219916
ليستيريا المستوحدةATCC49594
ميديوري جرين أدفانسدنيبون جينيتكسMG01
برنامج تحليل MS 1DماJOR ساينسMBE-IMG-SW
سالمونيلا تايفيموريومATCC14028
مطياف ضوئي (الطراز 6300)جينواي630531
ستوماتشر سيركيولاتر (الموديل 400)سوارد0400/000/AJ
Vibrio alginolyticusATCC17749
فيبريو كوليرا غير المجموعة O1CECT55
فيبريو باراهيموليتيكوسATCC17802
فيبريو فولنيفيكوسATCC29037
ورق واتمانواتمان1001-055

المراجع

  1. Baker GL. Food safety impacts from post-harvest processing procedures of molluscan shellfish. Foods. 2016;5(2):29.
  2. Kim HJ et al. Multiplex PCR for detection of the Vibrio genus and five pathogenic Vibrio species with primer sets designed using comparative genomics. BMC Microbiol. 2015;15(1):239.
  3. CDC. Cholera and Other Vibrio Illness Surveillance (COVIS). Cdc.gov; 2022. Available from: http://www.cdc.gov/vibrio/surveillance.html
  4. Robert-Pillot A et al. Occurrence of the three major Vibrio species pathogenic for human in seafood products consumed in France using real-time PCR. Int J Food Microbiol. 2014;189:75-81.
  5. Brands DA et al. Prevalence of Salmonella spp. in oysters in the United States. Appl Environ Microbiol. 2005;71(2):893-897.
  6. Gxalo O et al. Virulence and antibiotic resistance characteristics of Vibrio isolates from rustic environmental freshwaters. Front Cell Infect Microbiol. 2021;11:732001.
  7. De Paola A, Kaysner CA. Bacteriological Analytical Manual, Vibrio. Food and Drug ENTER
  8. Chahorm K, Prakitchaiwattana C. Application of Reverse Transcriptase-PCR-DGGE as a rapid method for routine determination of Vibrio spp. in foods. Int J Food Microbiol. 2018;264:46-52.
  9. Anupama KP et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification assay along with conventional and real-time PCR assay for sensitive detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus from seafood sample without enrichment. Mol Biol Rep. 2021;48(1):1009-1016.
  10. Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
  11. Sridapan T et al. Rapid detection of Clostridium perfringens in food by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow biosensor. PLoS One. 2021;16(1):e0245144.
  12. Notomi T, Mori Y, Tomita N, Kanda H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. J Microbiol. 2015;53(1):1-5.
  13. Yamazaki W, Ishibashi M, Kawahara R, Inoue K. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus. BMC Microbiol. 2008;8:163.
  14. Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 2002;16(3):223-229.
  15. Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 2001;289(1):150-154.
  16. Yamazaki W et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of the tdh and trh genes of Vibrio parahaemolyticus and related Vibrio species. Appl Environ Microbiol. 2010;76(3):820-828.
  17. Di H et al. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay combined with enrichment culture for rapid detection of very low numbers of Vibrio parahaemolyticus in seafood samples. Biol Pharm Bull. 2015;38(1):82-87.
  18. Cai SH et al. Loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of Vibrio alginolyticus, the causative agent of vibriosis in mariculture fish. Lett Appl Microbiol. 2010;50(5):480-485.
  19. Han F, Ge B. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for detecting Vibrio vulnificus in raw oysters. Foodborne Pathog Dis. 2008;5(3):311-320.
  20. Zhang L et al. Rapid, specific and sensitive detection of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification targeted to vvhA gene. Hai Yang Xue Bao. 2018;37(4):83-88.
  21. Luan C, Levin RE. Use of activated carbon coated with bentonite for increasing the sensitivity of PCR detection of Escherichia coli O157:H7 in Canadian oyster (Crassostrea gigas) tissue. J Microbiol Methods. 2008;72(1):67-72.
  22. Ren C-H, Hu C-Q, Luo P, Wang Q-B. Sensitive and rapid identification of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification. Microbiol Res. 2009;164(5):514–21.
  23. Srisuk C et al. Rapid and sensitive detection of Vibrio cholerae by loop-mediated isothermal amplification targeted to the gene of outer membrane protein ompW: Detection of Vibrio cholerae by LAMP. Lett Appl Microbiol. 2010;50(1):36-42.
  24. Goto M et al. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 2009;46(3):167-172.
  25. Parikh R et al. Understanding and using sensitivity, specificity and predictive values. Indian J Ophthalmol. 2008;56(1):45-50.
  26. Yung CM et al. Insensitivity of diverse and temporally variable particle-associated microbial communities to bulk seawater environmental parameters. Appl Environ Microbiol. 2016;82(11):3431-3437.
  27. Abolmaaty A, Gu W, Witkowsky R, Levin RE. The use of activated charcoal for the removal of PCR inhibitors from oyster samples. J Microbiol Methods. 2007;68(2):349-352.
  28. Lee JL, Levin RE. Detection of 5 CFU/g of Escherichia coli O157:H7 on lettuce using activated charcoal and real-time PCR without enrichment. Food Microbiol. 2011;28(3):562-567.
  29. Tian CD et al. Study on detection of Vibrio parahaemolyticus in shellfish by use of loop-mediated isothermal amplification method: V. Parahaemolyticus in shellfish. J Food Saf. 2011;31(3):371-378.
  30. Niessen L, Luo J, Denschlag C, Vogel RF. The application of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in food testing for bacterial pathogens and fungal contaminants. Food Microbiol. 2013;36(2):191-206.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

LAMP
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.