تعمل هذه الدراسة على تحسين مقايسة التضخيم isothermal المتوسط بالحلقة (LAMP) باستخدام الكربون المنشط والبنتونيت للكشف عن أنواع Vibrio الممرضة في المأكولات البحرية. تعمل هذه المعالجة الأولية على إزالة مثبطات التفاعل بفعالية، مما يؤدي إلى تشخيصات أسرع وأكثر حساسية وأقل تكلفة بشكل ملحوظ مقارنة بالطرق التقليدية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة بحثية
زيادة الحساسية من خلال التضخيم الحلقي باستخدام الكربون المنشط والبنتونيت للكشف عن أنواع Vibrio في المنتجات السمكية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الـ ضمة (Vibrio) يضم هذا الجنس أكثر من 100 نوع، يُعتبر 12 منها ممرضة للبشر؛ أما الأنواع التي يتم عزلها بشكل متكرر في الأغذية فهي V. cholerae، V. parahaemolyticus, *V. vulnificus*، و *V. alginolyticus*تكمن المشكلة الرئيسية في تحديدها من خلال الطرق الميكروبيولوجية التقليدية في التكاليف الباهظة وطول فترة التشخيص. وقد استُخدم تضخيم الحمض النووي isothermal بوساطة الحلقة (LAMP) لتحديد... V. cholerae، وV. parahaemolyticus، وV. vulnificus، و *V. alginolyticus*استُخدم الكربون المنشط مع البنتونيت (ACB) لإزالة المثبطات، مما أدى إلى تحسين حساسية الاختبار؛ واختُبرت قيم الرقم الهيدروجيني 6 و7 و9، بالإضافة إلى فترات تلامس مختلفة بين العينة وACB. وقد تحسنت طريقة حساسية LAMP عند استخدام الكربون المنشط والبنتونيت لإزالة مثبطات التفاعل في عينات الروبيان والأسماك والمحار. وكانت حساسية LAMP، والقيمة التنبؤية السلبية، والقيمة التنبؤية الإيجابية، ونوعية LAMP مساوية لـ 90% أو أعلى من ذلك لجميع العينات التي تم اختبارها. ويمكن أن تكون طريقة LAMP بديلًا لتحديد V. cholerae، V. parahaemolyticus, *V. vulnificus*، و *V. alginolyticus* في المنتجات السمكية، وذلك نظراً لسرعة التطبيق، والحساسية العالية، والتكاليف المنخفضة مقارنة بالطريقة القياسية.
المقدمة
تنتشر أنواع جنس Vibrio على نطاق واسع في البيئات البحرية، وقد ترتبط بالأسماك أو الرخويات أو القشريات بطريقة قد تكون ممرضة أو تعايشية. وقد أُفيد بأن 12 نوعاً يمكن أن تكون ممرضة للبشر، حيث أظهرت أنواع Vibrio cholerae وV. parahaemolyticus وV. vulnificus وV. alginolyticus تكراراً أعلى في العزل من المنتجات السمكية. وفي الولايات المتحدة، تقدر السلطات الصحية أن أنواع Vibrio تسبب أكثر من 80,000 عدوى سنوياً1,2,3,4,5. ويتم تحقيق عزل أنواع Vibrio من خلال الطرق التقليدية التي تتضمن الإثراء المسبق، والزراعة في أوساط انتقائية، والتأكيد عن طريق الاختبارات البيوكيميائية والمصلية6,7. وتتقيد هذه الطرق التقليدية بالوقت الطويل المطلوب لعزل الممرض (ما يصل إلى 5 أيام) وافتقارها إلى القدرة التحليلية، مما يؤدي غالباً إلى الفشل في التمييز الدقيق بين الأنواع المتقاربة داخل جنس Vibrio بسبب تشابه السمات المظهرية والبيوكيميائية6,7,8.
بدلاً من ذلك، تم وصف التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) بأنه تقنية جزيئية سريعة ودقيقة وغير مكلفة لتحديد المسببات المرضية9,10. وتعتبر هذه الطريقة ذات فعالية عالية من حيث التكلفة وأسرع من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التقليدي، حيث إنها لا تتطلب معدات متطورة مثل أجهزة التدوير الحراري9. تتيح طريقة LAMP، في خطوة واحدة، الكشف عن الجين المستهدف من خلال ملاحظة العكارة في أنبوب التفاعل الناتجة عن ترسب بيروفوسفات المغنيسيوم، كونه منتج تفاعل مستقر عند 65 °C، وهي درجة الحرارة المستخدمة في تقنية LAMP، وبذلك يرتبط تزايد العكارة بكمية DNA المصنعة، مما يغني عن استخدام هلام الأجاروز وأجهزة التصوير الضوئي11,12,13,14,15.
يمكن تحسين حساسية الكشف عن هذه الممرضات من خلال إزالة مثبطات التفاعل مثل البروتياز وأيونات الكالسيوم والجليكوجين والليبيدات التي يمكن أن تثبط بوليميراز Bst أو ترتبط بالحمض النووي المستهدف، مما يمنع عملية التضخيم13,16,17,18,19,20. وقد أفيد بأن مزيج الكربون المنشط مع البنتونيت (ACB) يتمتع بكفاءة عالية في إزالة مثبطات التضخيم، مما يزيد من حساسية الكشف عن Escherichia coli في عينات المحار، ويقلل التكاليف لأن ACB أقل تكلفة من استخدام الأطقم التجارية21.
نقترح في هذا العمل تحسين طريقة LAMP باستخدام الكربون المنشط والبنتونيت لزيادة الحساسية في الكشف عن V. cholerae و V. parahaemolyticus و V. vulnificus و V. alginolyticus مباشرة من المنتجات السمكية. وتوفر هذه الطريقة المحسنة إرشادات عملية للمراقبة الروتينية وضبط الجودة في الصناعات الغذائية، حيث أنها قابلة للتطبيق بشكل كبير في التشخيص السريع لمسببات الأمراض، مما يغني عن مراحل الإثراء المسبق الطويلة. وفيما يتعلق بالأداء المتوقع، تُظهر الطريقة حساسية ممتازة (أكثر من 98%) ونوعية (100%) في مصفوفات مثل الأسماك والروبيان. ومع ذلك، فإن هناك قيداً رئيسياً يجب مراعاته وهو أنه في العينات عالية التلوث من المصدر، مثل المحار، لا يمكن لنظام ACB إزالة جميع المواد العضوية المتداخلة تماماً، مما قد يؤدي إلى انخفاض طفيف في حساسية المقايسة (94%–98%).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
لم تتضمن هذه الدراسة مشاركين من البشر أو الحيوانات الفقارية؛ ولذلك، لم يتطلب الأمر الحصول على موافقة أخلاقية مؤسسية. تدرج الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.
1. السلالات البكتيرية المستخدمة واستخلاص الحمض النووي DNA
تمت زراعة سلالات Vibrio cholerae no O1 CECT 55، و V. parahaemolyticus ATCC 17802، و V. vulnificus ATCC 29037، و V. alginolyticus ATCC 17749 في مرق تغذية القلب والدماغ (BHI) مع 2% NaCl عند 37 °C لمدة 24 h. بينما تم استزراع سلالات Escherichia coli ATCC 25922، و Cronobacter sakazakii ATCC 12868، و Listeria monocytogenes ATCC 49594، و Salmonella Typhimurium ATCC 14028 في مرق BHI بدون كلوريد الصوديوم عند 37 °C لمدة 24 h لاستخدامها كضوابط سلبية في الاختبارات. ولاستخلاص الـ DNA، تم طرد المزرعة التي نمت طوال الليل مركزياً عند 16,000 x g لمدة 6 min عند 25 °C في جهاز طرد مركزي. تم سكب السائل الطافي بعناية لتجنب تعكير كتلة الخلايا، ثم أُعيد تعليق الكتلة جيداً عن طريق السحب بالماصة في 500 μL من محلول منظم TAE (حمض التريس-أسيتيك-EDTA، pH 8). تم غلي المعلق لمدة 6 min لتحليل الخلايا، ثم بُرِّد فوراً على الثلج لمدة 5 min. أُجريت عملية طرد مركزي نهائية لترسيب الحطام الخلوي، مما نتج عنه سائل طافي رائق يحتوي على الـ DNA المستخلص، والذي استُخدم لاحقاً كقالب للتضخيم بواسطة تقنية LAMP22,23.
2. إجراء LAMP
تم اختبار البادئات المستخدمة في تقنية LAMP (الجدول 1) لتأكيد النوعية في تحديد أنواع V. cholerae وV. parahaemolyticus وV. vulnificus وV. alginolyticus. أُجري تحديد كل نوع من أنواع Vibrio باستخدام تقنية LAMP في أنابيب تفاعل عن طريق تحضير حجم نهائي قدره 25 μL من الخليط الذي يحتوي على: 1.6 μM من كل بادئ، و1.4 mM من خليط dNTP، و6 mM من MgSO4، و800 mM من betaine، و8 U من Bst DNA polymerase، و5 μL من الحمض النووي القالب (template DNA). خُلط مزيج التفاعل برفق وحُضن في حمام مائي عند 65 °C لمدة 60 min. وبعد انتهاء وقت التحضين، فُصلت نواتج التضخيم على هلام أغاروز بنسبة 1.5%. ثم صُبغت نواتج التضخيم باستخدام 1 μL من صبغة DNA فلورية مخففة بنسبة 1:100 وكُشفت باستخدام جهاز إضاءة خلفية (transilluminator) بضوء أزرق. وتضمنت تقنية أخرى لتحديد ما إذا كان الاختبار إيجابياً في التعرف على الممرض إضافة 4 μL من hydroxynaphthol blue (HNB, 125 μM) إلى أنابيب التفاعل وملاحظة تغير اللون بالعين المجردة. وقد أشارت النتيجة الإيجابية إلى تكون لون أزرق، بينما أشارت النتيجة السلبية إلى لون بنفسجي24. استُخدمت سلالات Escherichia coli ATCC 25922 وCronobacter sakazakii ATCC 12868 وListeria monocytogenes ATCC 49594 وSalmonella Typhimurium ATCC 14028 كضوابط سلبية لطريقة LAMP. فُصلت عمليات التضخيم التي تم الحصول عليها في LAMP على هلام أغاروز وفُحصت باستخدام جهاز الإضاءة الخلفية. ثم تم الحصول على الصور الناتجة ورقمنتها باستخدام برنامج MS 1D Analysis Software.
3. معالجة عينات المحار والروبيان والأسماك للتخلص من أنواع Vibrio الموجودة طبيعياً في العينات
تم الحصول على عشر عينات من المحار، وعشر عينات من الروبيان، وعشر عينات من الأسماك بوزن تقريبي يبلغ 200 g لكل منها. ولإزالة خلايا Vibrio الموجودة طبيعياً، تم اتباع المنهجية المنشورة سابقاً21. وُزن خمسون غراماً (50 g) من كل عينة وجرى تجانسها ميكانيكياً في خلاط ريشي بسرعة 260 rpm لمدة 1 min، مما أنتج معلقاً نسيجياً متجانساً، خُزن بعد ذلك في درجة حرارة -70 °C لمدة 72 h. لاحقاً، أُذيبت العينات تماماً باستخدام حمام مائي بدرجة حرارة 40 °C، وغُسلت العينات بـ 300 mL من محلول منظم الفوسفات الملحي (0.85% NaCl, pH 9). وللتأكد من أن الإجراء السابق قد نجح في القضاء على Vibrio في العينات، تم إجراء منهجية الإثراء المسبق الموضحة في الفصل التاسع من الدليل التحليلي البكتيري التابع لإدارة الغذاء والدواء7. استُبدل المحلول الملحي الذي يحتوي على العينة بـ 450 mL من ماء الببتون القلوي (APW, pH 9). ثم حُضرت تخفيفات تسلسلية بدقة في APW حتى تخفيف 10⁻3 وحُضنت لمدة 24 h. وأخيراً، تم تخطيط جزء من كل أنبوب على وسط انتقائي من أغار الثيوسلفات والسترات وأملاح الصفراء والسكروز (TCBS) وحُضنت لمدة 24 h عند 37 °C للتأكيد البصري على عدم وجود مستعمرات Vibrio المميزة. نُفذت جميع الاختبارات في ثلاث مكررات.
4. تحضير الكربون المنشط مع البنتونيت (ACB) وتقييم الاسترداد الخلوي
لتحديد الظروف التي يكون فيها ACB أكثر كفاءة في امتصاص المثبطات الموجودة في عينات المنتجات السمكية مع الحفاظ على الحد الأدنى من امتصاص الخلايا المستهدفة، تم اتباع المنهجية المنشورة21 لتحديد الرقم الهيدروجيني (pH) ووقت التلامس الأمثل بين ACB وعينات الطعام. غُسل الكربون المنشط جيداً بالماء المقطر وجُفف عند 55 °C. بعد ذلك، تم خلط 32.6 g من الكربون المنشط مع 3.04 g من البنتونيت، مع التقليب المستمر بسرعة 150 rpm لمدة 24 h لضمان التوزيع المتجانس، ثم جُفف المزيج عند 55 °C وعُقم، مما نتج عنه مسحوق ACB جاف وناعم ومتجانس. ولتقييم استعادة الخلايا بعد خلط خلايا Vibrio مع مزيج الكربون المنشط والبنتونيت (ACB)، تم تنمية السلالات بشكل منفصل في مرق BHI مع 2% NaCl حتى وصلت كثافة الخلايا إلى 1.5 x 104 CFU/mL. ثم تم تلقيح 1 mL من كل سلالة Vibrio بشكل منفصل في 100 mL من محلول الفوسفات المنظم (PBS, 0.85% NaCl، مع ضبط pH عند 4 و6 و9). بعد ذلك، دُمج المعلق البكتيري مع 4.6 g من ACB المُجهز مسبقاً وتُرك للتقليب بسرعة 150 rpm لمدة 15 و30 و60 min لتسهيل التلامس. وبعد كل فترة تلامس محددة، تم فصل أليكوت بحجم 0.1 mL بعناية، ونشره على أطباق آغار TCBS، وحضنه عند 37 °C لمدة 24 h قبل إجراء عد المستعمرات.
5. تقييم حد الكشف عن V. cholerae و V. parahaemolyticus و V. vulnificus و V. alginolyticus في عينات المحار والروبيان والأسماك المعالجة بالكربون المنشط والبنتونيت
تم استزراع كل نوع من أنواع Vibrio المستخدمة في هذه الدراسة في مرق BHI، وضُبطت كثافات الخلايا بدقة لتكون 1.5 x 104 و7.5 x 103 و3.8 x 103 و1.5 x 103 و7.5 x 102 و3 x 102 و1.5 x 102 و76 CFU/mL (A600 nm ~0.25) كما تم قياسها باستخدام مقياس الطيف الضوئي. لاحقاً، استُخدم 1 mL من كل مزرعة Vibrio لتلقيح 50 g من كل عينة (المحار، والأسماك، والروبيان) التي عولجت مسبقاً للقضاء على أي وجود لبكتيريا Vibrio. تم تجانس العينات الملقحة في خلاط ريشي عند 360 rpm لمدة 30 s وخُففت بـ 450 mL من APW (pH 6). ثم تم طرد الخليط مركزياً عند 260 x g لمدة 5 min عند 4 °C لفصل الحطام الكبير. صُب السائل العلوي الناتج في دوارق تحتوي على 23 g من ACB، وحُرّك عند 150 rpm لمدة 15 min لامتصاص المثبطات، ثم رُشح باستخدام ورق الترشيح، مما أنتج رشاحة صافية خالية من الجسيمات الكبيرة. ثم طُردت هذه الرشاحة مركزياً عند 16,000 x g لمدة 10 min عند 4 °C، مما أدى إلى تكون كتلة خلوية مرئية في قاع الأنبوب، والتي استُخدمت لاحقاً لاستخلاص DNA. تم تحديد كل نوع من أنواع Vibrio بطريقة LAMP. تضمنت الضوابط السالبة عينات ملقحة بسلالات من Escherichia coli ATCC 25922 وCronobacter sakazakii ATCC 12868 وListeria monocytogenes ATCC 49594 وSalmonella Typhimurium ATCC 14028. حُضن خليط التفاعل في حمام مائي عند 65 °C لمدة 60 min. بعد وقت التحضين، فُصلت نواتج التضخيم على هلام أغاروز بتركيز 1.5% وصُبغت بصبغة DNA فلورية. وكُشف عن الهلام باستخدام جهاز عرض الضوء الأزرق. وأخيراً، أُضيف 4 μL من هيدروكسي نافثول الأزرق (125 μM) إلى كل أنبوب للكشف بالعين المجردة24.
6. تحديد القيمة التنبؤية الإيجابية والقيمة التنبؤية السلبية والخصوصية والحساسية لطريقة LAMP
تم تحديد الحساسية والنوعية والقيم التنبؤية لطريقة LAMP باستخدام 30 عينة (10 من الروبيان، و10 من المحار، و10 من الأسماك). تم تلقيح كل عينة بأدنى تركيز يمكن الكشف عنه تم تحديده لكل نوع من أنواع Vibrio. ولتحديد نسبة الحساسية والنوعية، بالإضافة إلى القيمة التنبؤية السلبية (NPV) والقيمة التنبؤية الإيجابية25، استُخدم جدول تباين لتلخيص الإيجابيات الحقيقية (TP)، والسلبيات الحقيقية (TN)، والإيجابيات الكاذبة (FP)، والسلبيات الكاذبة (FN) التي تم الحصول عليها خلال التجارب. (الجدول 2). وبناءً على هذه البيانات، تم تطبيق الصيغ التالية:
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
السلالات البكتيرية المستخدمة واستخلاص الحمض النووي DNA
تم استخلاص الحمض النووي DNA بنجاح من جميع السلالات الممرضة وسلالات التحكم السلبية لاستخدامها كقوالب في اختبارات LAMP اللاحقة.
إجراء تقنية LAMP
كانت البادئات المستخدمة في هذا العمل متخصصة في تضخيم الهدف الجزيئي لكل نوع من أنواع الـ Vibrio. وقد أظهرت نواتج التضخيم التي تم الحصول عليها بواسطة تقنية LAMP عند استخدام سلالات Vibrio أن كل بادئة كانت متخصصة في تضخيم الجين المستهدف لكل نوع...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تحدد هذه الدراسة الظروف المثلى لتعزيز حساسية تضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) للكشف عن V. cholerae و V. parahaemolyticus و V. alginolyticus و V. vulnificus في عينات المأكولات البحرية الملوثة. ومن خلال تجنب مرحلة الإثراء المسبق التقليدية، يتم تقليل وقت التشخيص بشكل كبير، مما يوفر نهجاً سريعاً وعالي الكفاءة لتحديد المسببات المرضية مباشرة من المنتجات السمكية.
يتمثل التحسين المنهجي الرئيسي في هذه الدراسة في تحسين خطوة إزالة المثبطات؛ حيث اع...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يقر المؤلفون بعدم وجود أي تضارب في المصالح.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الكربون المُنشَّط | سايجمـا-ألدريتش | C2764 | |
| البنتونيت | سايجمـا-ألدريتش | 682659 | |
| بيتين | سايجمـا-ألدريتش | ب0300 | |
| نظام التصوير البيولوجي مع مصدِر إضاءة خلفي | أنظمة الصور الحيوية | MBE-CP-01 | |
| بوليمراس الحمض النووي بست | نيو إنغلاند بيولابس | M0374 | |
| طرد مركزي (الطراز J2-HS) | بيكمان كولتر | <أ هريف="https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri">https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri | |
| كرونوبيكتر ساكازاكيي | ATCC | 12868 | |
| مزيج دي إن تي بي | ثيرمو فيشر ساينتفيك | ر0241 | |
| إيشيريشيا كولاي | ATCC | 25922 | |
| هيدروكسي نفثول الأزرق | سايجمـا-ألدريتش | 219916 | |
| ليستيريا المستوحدة | ATCC | 49594 | |
| ميديوري جرين أدفانسد | نيبون جينيتكس | MG01 | |
| برنامج تحليل MS 1D | ماJOR ساينس | MBE-IMG-SW | |
| سالمونيلا تايفيموريوم | ATCC | 14028 | |
| مطياف ضوئي (الطراز 6300) | جينواي | 630531 | |
| ستوماتشر سيركيولاتر (الموديل 400) | سوارد | 0400/000/AJ | |
| Vibrio alginolyticus | ATCC | 17749 | |
| فيبريو كوليرا غير المجموعة O1 | CECT | 55 | |
| فيبريو باراهيموليتيكوس | ATCC | 17802 | |
| فيبريو فولنيفيكوس | ATCC | 29037 | |
| ورق واتمان | واتمان | 1001-055 |
المراجع
- Baker GL. Food safety impacts from post-harvest processing procedures of molluscan shellfish. Foods. 2016;5(2):29.
- Kim HJ et al. Multiplex PCR for detection of the Vibrio genus and five pathogenic Vibrio species with primer sets designed using comparative genomics. BMC Microbiol. 2015;15(1):239.
- CDC. Cholera and Other Vibrio Illness Surveillance (COVIS). Cdc.gov; 2022. Available from: http://www.cdc.gov/vibrio/surveillance.html
- Robert-Pillot A et al. Occurrence of the three major Vibrio species pathogenic for human in seafood products consumed in France using real-time PCR. Int J Food Microbiol. 2014;189:75-81.
- Brands DA et al. Prevalence of Salmonella spp. in oysters in the United States. Appl Environ Microbiol. 2005;71(2):893-897.
- Gxalo O et al. Virulence and antibiotic resistance characteristics of Vibrio isolates from rustic environmental freshwaters. Front Cell Infect Microbiol. 2021;11:732001.
- De Paola A, Kaysner CA. Bacteriological Analytical Manual, Vibrio. Food and Drug ENTER
- Chahorm K, Prakitchaiwattana C. Application of Reverse Transcriptase-PCR-DGGE as a rapid method for routine determination of Vibrio spp. in foods. Int J Food Microbiol. 2018;264:46-52.
- Anupama KP et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification assay along with conventional and real-time PCR assay for sensitive detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus from seafood sample without enrichment. Mol Biol Rep. 2021;48(1):1009-1016.
- Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
- Sridapan T et al. Rapid detection of Clostridium perfringens in food by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow biosensor. PLoS One. 2021;16(1):e0245144.
- Notomi T, Mori Y, Tomita N, Kanda H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. J Microbiol. 2015;53(1):1-5.
- Yamazaki W, Ishibashi M, Kawahara R, Inoue K. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus. BMC Microbiol. 2008;8:163.
- Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 2002;16(3):223-229.
- Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 2001;289(1):150-154.
- Yamazaki W et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of the tdh and trh genes of Vibrio parahaemolyticus and related Vibrio species. Appl Environ Microbiol. 2010;76(3):820-828.
- Di H et al. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay combined with enrichment culture for rapid detection of very low numbers of Vibrio parahaemolyticus in seafood samples. Biol Pharm Bull. 2015;38(1):82-87.
- Cai SH et al. Loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of Vibrio alginolyticus, the causative agent of vibriosis in mariculture fish. Lett Appl Microbiol. 2010;50(5):480-485.
- Han F, Ge B. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for detecting Vibrio vulnificus in raw oysters. Foodborne Pathog Dis. 2008;5(3):311-320.
- Zhang L et al. Rapid, specific and sensitive detection of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification targeted to vvhA gene. Hai Yang Xue Bao. 2018;37(4):83-88.
- Luan C, Levin RE. Use of activated carbon coated with bentonite for increasing the sensitivity of PCR detection of Escherichia coli O157:H7 in Canadian oyster (Crassostrea gigas) tissue. J Microbiol Methods. 2008;72(1):67-72.
- Ren C-H, Hu C-Q, Luo P, Wang Q-B. Sensitive and rapid identification of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification. Microbiol Res. 2009;164(5):514–21.
- Srisuk C et al. Rapid and sensitive detection of Vibrio cholerae by loop-mediated isothermal amplification targeted to the gene of outer membrane protein ompW: Detection of Vibrio cholerae by LAMP. Lett Appl Microbiol. 2010;50(1):36-42.
- Goto M et al. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 2009;46(3):167-172.
- Parikh R et al. Understanding and using sensitivity, specificity and predictive values. Indian J Ophthalmol. 2008;56(1):45-50.
- Yung CM et al. Insensitivity of diverse and temporally variable particle-associated microbial communities to bulk seawater environmental parameters. Appl Environ Microbiol. 2016;82(11):3431-3437.
- Abolmaaty A, Gu W, Witkowsky R, Levin RE. The use of activated charcoal for the removal of PCR inhibitors from oyster samples. J Microbiol Methods. 2007;68(2):349-352.
- Lee JL, Levin RE. Detection of 5 CFU/g of Escherichia coli O157:H7 on lettuce using activated charcoal and real-time PCR without enrichment. Food Microbiol. 2011;28(3):562-567.
- Tian CD et al. Study on detection of Vibrio parahaemolyticus in shellfish by use of loop-mediated isothermal amplification method: V. Parahaemolyticus in shellfish. J Food Saf. 2011;31(3):371-378.
- Niessen L, Luo J, Denschlag C, Vogel RF. The application of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in food testing for bacterial pathogens and fungal contaminants. Food Microbiol. 2013;36(2):191-206.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.