مقالة منهجية

منصة ميكروفلويدية لدراسة أدوار الضغط الميكانيكي في التفاعلات بين الخلايا الورمية والخلايا المناعية ضمن مصفوفة خارج خلوية ثلاثية الأبعاد

26 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/72929

⸱

أغسطس 28, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Department of Biological and Environmental Engineering, Cornell University, 3Translational Science and Therapeutics Division, Fred Hutchinson Cancer Center, 4Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكولاً لاستخدام منصة للموائع الدقيقة لنمذجة التفاعلات بين الورم والجهاز المناعي ضمن بيئة ثلاثية الأبعاد (3D). وقد كشفت نتائجنا أن الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cells) حافظت على نشاطها المضاد للأورام تحت تأثير الضغط الميكانيكي.

الملخص

تؤثر القوى الميكانيكية بشكل كبير على قدرة الخلايا المناعية على قتل الخلايا الورمية في سياق العلاج المناعي القائم على الخلايا. ولكي تقتل الخلايا المناعية الخلايا الورمية، يجب أن تسلط قوى على الخلية المستهدفة وتُشكل تشابكاً مناعياً، يتم من خلاله إرسال الجزيئات السامة للخلايا —بما في ذلك granzyme B. وعلى الرغم من أهميتها، لا يزال فهم كيفية الاستفادة من الإشارات الميكانيكية لتعزيز القتل بوساطة المناعة محدوداً. ويعود هذا النقص في المعرفة جزئياً إلى غياب الأدوات القادرة على توفير إجهاد ميكانيكي محكوم بدقة للمزارع الخلوية في بيئة واقعية من الناحية الفسيولوجية. هنا، نصف جهاز ضغط مائع دقيق يمكنه تطبيق ضغط استاتيكي أو ديناميكي على الكريات الورمية المدمجة في المصفوفة خارج الخلوية (ECM)، مع السماح بالتصوير في الوقت الحقيقي للتفاعلات بين الورم والمناعة عبر المجهر الضوئي.

تتكون المنصة الموائعية الدقيقة من 12 حجرة (6 حجرات تحكم و6 حجرات وظيفية). وتحتوي كل حجرة على غرفة خلوية تقع مباشرة أسفل وحدة التحكم في الضغط. يتم وضع الكريات الخلوية المضمنة في المادة الخلالية خارج الخلوية (ECM) داخل الغرفة الخلوية. وباستخدام هذه المنصة، بحثنا في كفاءة القتل للخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ضد كريات أورام الثدي (MCF-7) تحت ضغط ميكانيكي محدد. وأظهرت النتائج أن الخلايا القاتلة الطبيعية ظلت المحرك الأساسي لموت كريات الأورام بغض النظر عن الضغط الميكانيكي في كولاجين بتركيز 1.5 mg/mL. وهذا يشير إلى أن الخلايا القاتلة الطبيعية يمكنها الحفاظ على نشاطها المضاد للأورام تحت إجهاد الضغط. وتبرهن هذه النتائج على فائدة هذه المنصة في دراسة دور القوى الميكانيكية في التفاعلات بين الورم والجهاز المناعي. وتعمل الدراسات الجارية حالياً على تحديد الآليات الجزيئية التي تسمح للخلايا المناعية بالتكيف مع إجهاد الضغط. وقد تكشف الرؤى المكتسبة من هذه الدراسات عن مسار علاجي واعد.

المقدمة

يُعد العلاج المناعي للسرطان القائم على الخلايا نهجاً علاجياً يستخدم الخلايا المناعية لاستهداف الخلايا السرطانية1. وقد أظهرت هذه الاستراتيجية نجاحاً ملحوظاً في علاج سرطانات الدم2,3,4. ومع ذلك، فإن مستوى النجاح الملحوظ في سرطانات الدم لم يُنقل بالكامل بعد إلى علاج الأورام الصلبة5,6,7. وأحد الأسباب الرئيسية لهذا القصور هو البيئة الدقيقة المثبطة للمناعة في الورم (TME) والتي تميز الأورام الصلبة.

تتميز البيئة الدقيقة للورم (TME) بإشارات ميكانيكية مميزة يمكنها تنظيم السلوك الخلوي. ويتطلب القتل الفعال للخلايا الورمية بواسطة الخلايا المناعية أن تبذل هذه الأخيرة قوى على الخلايا المستهدفة وتنشئ مشبكًا مناعيًا يتم من خلاله إيصال الجزيئات السامة للخلايا8. لذا، فإن فهم كيفية تأثير القوى الميكانيكية على وظيفة الخلايا المناعية قد يكشف عن استراتيجيات علاجية جديدة لتحسين فعالية العلاجات المناعية القائمة على الخلايا ضد الأورام الصلبة.

تتمثل إحدى السمات الميكانيكية المحددة للبيئة الدقيقة للأورام الصلبة (TME) في إجهاد الضغط الذي تفرضه البيئة الدقيقة للورم على الورم النامي9,10. وحتى الآن، ركزت معظم دراسات الضغط على التأثيرات الواقعة على سلوك الخلايا الورمية10,11. ومؤخراً فقط، تحول الاهتمام نحو فهم كيفية تأثير الضغط على الخلايا المناعية داخل الـ TME12. ونتيجة لذلك، لا تزال الآليات التي يؤثر بها إجهاد الضغط على هجرة الخلايا القاتلة الطبيعية (NK)، وتكوين المشبك المناعي، ونشاط السمية الخلوية غير مفهومة جيداً وغير مقاسة بشكل كافٍ. وتمثل هذه الفجوة قصوراً حرجاً في فهمنا لكيفية الاستفادة من الإشارات الميكانيكية داخل الـ TME لتعزيز الاستهداف المناعي للأورام الصلبة.

تتمثل إحدى العقبات الرئيسية في معالجة هذا السؤال في نقص المنصات التجريبية القادرة على تطبيق ضغط محكوم وقابل للقياس ضمن بيئات مجهرية ثلاثية الأبعاد ذات صلة فسيولوجياً، مع تمكين التصوير في الوقت الفعلي للتفاعلات بين الورم والجهاز المناعي في آن واحد. تضمنت النهج التجريبية المبكرة لدراسة إجهاد الضغط دمج الكريات في هلام الأجاروز13. وبينما نجحت هذه الطريقة في محاكاة الحصر الفيزيائي، إلا أنها ألغت التفاعلات الطبيعية بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية (ECM). وقد طبق Dolega et al. الضغط الاسموزي لاستحثاث إجهاد الضغط؛ ومع ذلك، كانت الكريات معلقة في وسط زراعي وبالتالي ظلت مفتقرة إلى تفاعلات ECM9. واستخدم Pandey et al. غشاءً مسامياً (transwell insert) وأوزاناً لضغط الكريات المدمجة في الكولاجين، وهو ما حافظ على التفاعلات بين ECM والخلايا، ولكن ذلك حد من إمكانية التصوير عالي الدقة المطلوب لقياس حركة الخلايا المناعية والنشاط السام للخلايا14. وتؤكد هذه القيود مجتمعة الحاجة إلى منصات تجريبية تتيح التصوير في الوقت الفعلي للاستجابات المورفولوجية للخلايا تجاه الضغط ضمن البيئة المجهرية للورم (TME).

نقدم هنا بروتوكولاً لجهاز ضغط ميكروني15 يتيح التطبيق المتحكم فيه لإجهاد الضغط مع الحفاظ على التفاعلات ذات الصلة فسيولوجياً بين المصفوفة خارج الخلوية (ECM) والخلايا، ويدعم التصوير عالي الدقة للخلايا الحية لديناميكيات المناعة والأورام. يتكون البروتوكول من تحضير مكونات الجهاز (القسم 1)، وتجميع الجهاز (القسم 2)، وتصوير التفاعلات بين الورم والجهاز المناعي (القسم 3). ونوضح سير العمل باستخدام مقايسة قتل بواسطة خلايا NK ضد كرويات ورمية موسومة بالبروتين الفلوري الأخضر (GFP). وإلى جانب هذا التطبيق، يمكن تكييف هذه المنصة بسهولة لاستقصاء آثار القوى الميكانيكية على نطاق واسع من أنواع الخلايا والتفاعلات الخلوية في البيئات الميكرونية ثلاثية الأبعاد.

البروتوكول

1. تحضير مكونات الجهاز

  1. تنشيط سطح غرفة تحميل العينة
    1. ضع قناعاً فوق غرفة تحميل العينة (الطبقة 1، L1) بحيث لا تظل سوى الآبار مكشوفة.
    2. عرّض الطبقة 1 المقنعة لبلازما الأكسجين لمدة 15 ثانية باستخدام إعداد الطاقة العالية (45 وات).
    3. ضع الطبقة 1 في أطباق بتري، ثم تابع الخطوات التالية داخل كابينة السلامة الحيوية.
    4. عالج كل بئر بـ 10 µL بتركيز 1% من البولي إيثيلين إيمين (PEI) لمدة 10 دقائق.
    5. أزِل مادة PEI من الآبار عن طريق الشفط بالتفريغ من الزوايا الأربع لكل بئر لمنع خدش السطح الزجاجي.
    6. اغسل الآبار بـ 10 µL من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS)، ثم قم بإزالة سائل الغسل عن طريق الشفط الفراغي من الجانب.
    7. عالج الآبار بـ 10 µL من الغلوتارالدهيد (glutaraldehyde) بتركيز 0.1% لمدة 30 دقيقة، ثم إزالة الغلوتارالدهيد عن طريق الشفط بالتفريغ من الزوايا.
    8. اغسل الآبار بمحلول PBS ثلاث مرات، مع إزالة سائل الغسل من الزوايا بعد كل عملية غسل.
    9. غلف طبق بتري الذي يحتوي على الطبقة 1 بورق الألمنيوم، واتركه في كابينة السلامة الحيوية طوال الليل.
  2. التعقيم للهيكل المعدني
    1. اغمر الـ 38 مم × الإطار المعدني مقاس 88 مم والبراغي الاثني عشر ذات الرأس المسطح من طراز M2.5 في إيثانول بتركيز 70% طوال الليل.
  3. التهيئة لوحدة التحكم في الضغط
    1. عرض وحدة التحكم في الضغط لبلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية باستخدام إعداد الطاقة العالية (45 واط).
    2. اغمر وحدة التحكم في الضغط، بحيث تكون الميزات متجهة للأسفل، في ماء منزوع الأيونات (DI) طوال الليل لملء القنوات وغرف وحدة التحكم في الضغط.
    3. في اليوم التالي، أخرج وحدة التحكم في الضغط من المياه منزوعة الأيونات (DI water) التي كانت مغمورة فيها.
    4. املأ خزان الموائع الدقيقة بـ 50 مل من الماء منزوع الأيونات (DI water).
      ملاحظة: يتكون خزان الموائع الدقيقة من أنبوب مخروطي سعة 50 مل مزود بغطاء مخصص يحتوي على وصلتين للأنابيب: خط أنابيب هوائي وخط أنابيب لتوصيل السوائل.
    5. قم بتوصيل محقنة مملوءة بالهواء بخط الأنابيب الهوائية.
    6. اضغط مكبس المحقنة ببطء لزيادة الضغط داخل الخزان ودفع الماء منزوع الأيونات (DI water) عبر أنابيب توصيل السوائل حتى تمتلئ الأنابيب ويبدأ الماء في التنقيط من الأنبوب.
    7. قم بتوصيل أنبوب توصيل السوائل المعبأ مسبقاً والناقط عبر الموزع المصنوع من البوليكربونات، ثم إلى المدخل الذي يبلغ قطره 1.5 مم والموجود في الجزء الخلفي من وحدة التحكم في الضغط.
    8. اترك وحدة التحكم في الضغط ومجموعة الموزع لتجف في الهواء لمدة ساعتين. وبمجرد جفافهما تماماً، تصبح وحدة التحكم في الضغط ومجموعة الموزع جاهزتين للخطوة التالية.

2. تجميع الجهاز

  1. تحضير الكولاجين المدمج بالخلايا
    1. أخرج الإطار المعدني والبراغي من الإيثانول بتركيز 70% وجففهما.
    2. ضع ثلاثة في كابينة السلامة الحيوية، 600 µL أنابيب دقيقة على الثلج. قم بتسمية الأنابيب على النحو التالي: "ن" (التعادل)، "نوع (sp)" (كرويات MCF-7)، و "الخلايا التائية المتخصصة (sp) والخلايا القاتلة الطبيعية (NK)" (كرويات MCF-7 مع الخلايا القاتلة الطبيعية NK cells).
    3. قم بتحضير خليط التعادل عن طريق إضافة 10× الحجم المطلوب من الوسط الغذائي 199 (M199) وهيدروكسيد الصوديوم (NaOH) إلى الـ "ن" أنبوب.
    4. انقل الحجم المناسب من خليط M199:NaOH إلى "نوع" و "خلايا sp+NK" أنابيب للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1× التركيز.
    5. جمع الكريات الورمية وطردها مركزياً عند 141 × جـ لمدة 3 دقائق للسماح للكريات بالترسب في قاع الأنبوب.
      ملاحظة: الكريات الورمية تقريبًا 200 µm تم إنتاج آبار دقيقة من الأجاروز بقطر [أدخل القيمة] باستخدام منصة الآبار الدقيقة من الأجاروز الموصوفة سابقاً16وبإيجاز، 3 × 106 تم استزراع خلايا MCF-7 في طبق 36 × مصفوفة آغاروز ذات آبار دقيقة مكونة من 36 بئراً 200 µm في القطر و 200 µm بعمق، ثم زُرعت لمدة 7 أيام لإنتاج الكريات الورمية المستخدمة في التجارب.
    6. أزل السائل الطافي بعناية وأعد تعليق الكريات في 200 µL من الوسط الغذائي الكامل لـ MCF-7/NK بنسبة 50:50 (الجدول 1 و جدول 2).
    7. اجمع خلايا NK في أنبوب مخروطي سعة 50 مل، ثم قم بالطرد المركزي عند 141 × جـ لمدة 4 دقائق، ثم قم بعدّ الخلايا.
      ملاحظة: يجب أن تكون حيوية الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cells) >85% في يوم التجربة.
    8. أعد تعليق الراسب الناتج في 200 µL من وسط NK الكامل.
    9. أضف الحجم المناسب من المحلول المخزون للكولاجين إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق.
    10. أضف الحجم المناسب من معلق الخلايا إلى كل أنبوب للحصول على حجم نهائي قدره 200 µL يحتوي على 1.5 ملجم/مل من الكولاجين.
      ملاحظة: الـ "نوع" يحتوي المعلق على كرويات ورمية فقط، بينما... "الخلايا التائية القاتلة والخلايا القاتلة الطبيعية (sp+NK)" يحتوي المعلق على كريات ورمية و1.5 × 106 الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cells).
    11. امزج بلطف عن طريق السحب والضخ بالماصة لضمان التوزيع المتساوي للخلايا والكولاجين مع تقليل تكوّن الفقاعات.
  2. تجميع الجهاز وتحميل الخلايا
    1. ضع الطبقة 1 داخل الإطار المعدني المجفف.
    2. تحميل 9 µL من خليط الكولاجين في كل بئر.
    3. قم بمحاذاة وحدة التحكم في الضغط ومجموعة الموزع مع غرف الخلايا في الطبقة 1 باستخدام المجهر.
    4. أدخل البراغي المجففة عبر المجمّع وفي الإطار المعدني، مع تثبيت وحدة التحكم في الضغط والطبقة 1 (Layer 1) بين المجمّع والإطار المعدني.
    5. ضع الجهاز الذي تم تجميعه في 37 °C، 5% CO2₂ توضع في الحاضنة لمدة 45 دقيقة للسماح ببلمرة الكولاجين.
    6. أضف وسط زراعة الخلايا الكامل MCF-7/NK بنسبة 50:50 عبر منافذ الوسط الأربعة.

3. تصوير التفاعلات بين الورم والجهاز المناعي

  1. ضع الجهاز الذي تم تجميعه داخل حاضنة المنصة المثبتة على مجهر مضاد للفلورة مقلوب للتصوير الحي للخلايا.
    ملاحظة: حافظت حاضنة المنصة على درجة حرارة قدرها 37 °C ورطوبة تبلغ 50% تقريباً طوال فترة التصوير.
  2. ضع صندوق إيواء ثانوي فوق الجهاز المُجمَّع للحفاظ على البيئة الداخلية عند 37 °C، ورطوبة بنسبة 100%، و5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2)₂ طوال فترة التصوير.
  3. قم بتوصيل الجهاز بجهاز التحكم في الضغط باستخدام الأنابيب الهوائية.
  4. التقط صوراً بالحقل المضيء (brightfield) وصوراً بالبروتين الفلوري الأخضر (GFP) للكريات الورمية قبل تطبيق الضغط، وذلك لتمكين تقييم تشوه الكريات بعد عملية الضغط.
  5. طبق ضغطاً ثابتاً قدره 120 ميلي بار طوال فترة التصوير.
    ملاحظة: يتيح برنامج التحكم في الضغط للمستخدم تحديد مخطط الضغط ومقداره المطبق أثناء التجربة. الشكل التكميلي 1 يحتوي على مخطط لنظام التحكم في الضغط.
  6. ابدأ التصوير بالفاصل الزمني عن طريق التقاط صور بالمجال المضيء وصور لبروتين GFP كل 10 دقائق لمدة 18 ساعة.
    ملاحظة: تم الحصول على الصور عند المستوى Z المركزي لكل كروية ورمية باستخدام عدسة 20× عدسة شيئية في مجهر فلوري فوقي مقلوب. تم التقاط صور الحقل المضيء وصور فلورة GFP بأوقات تعريض بلغت 200.1 ملي ثانية و 298.9 ملي ثانية، على التوالي.

النتائج

في التجارب التالية، تم استخدام جهاز ضغط ميكروفلويديك15 لنمذجة التفاعلات بين الورم والجهاز المناعي ضمن بيئة ميكروية ثلاثية الأبعاد (3D) ذات صلة فسيولوجياً، وبإمكانه في الوقت ذاته تطبيق ضغوط استاتيكية وديناميكية على الكريات الورمية (الشكل 1). تظهر مكونات الجهاز (الشكل 1A1) وترتيب تجميعها (الشكل 1A2) في الشكل 1A. يعمل الإطار المعدني كقاعدة للجهاز، مع وضع طبقة حجرة الخلايا (L1) داخل الإطار. توضع وحدة التحكم في الضغط، المكونة من L2 و L3 المترابطتين بالبلازما، فوق L1، يليها المجمع (الشكل 1A2). تشكل L1 ووحدة التحكم في الضغط معاً جهاز الميكروفلويديك الوظيفي، ويتم تثبيتهما بين الإطار المعدني والمجمع بواسطة البراغي. يحتوي المجمع على منافذ دخول للأنابيب السائلة لتزويد الجهاز بالضغط، بالإضافة إلى خزانات أوساط تسهل تجارب تصوير الخلايا الحية طويلة المدى.

مكونات ومخطط الجهاز الموائع الدقيقة؛ ضغط غرفة الخلايا؛ نتائج تجربة خلايا GFP.
الشكل 1: جهاز ضغط موائع دقيقة لدراسة التفاعلات بين الخلايا المناعية والكريات الورمية تحت الضغط الميكانيكي. (A1) صورة للمكونات المطلوبة لتجميع الجهاز، موضحًا من اليسار إلى اليمين: المجمع (manifold)، وحدة التحكم في الضغط (L2 + L3)، طبقة غرفة الخلايا (L1)، والإطار المعدني. (A2) مخطط ثلاثي الأبعاد لمكونات الجهاز، موضحًا من الأعلى إلى الأسفل: المجمع، وحدة التحكم في الضغط (L2 + L3)، طبقة غرفة الخلايا (L1)، والإطار المعدني. يتم ربط طبقتي PDMS L2 و L3 بالبلازما لتشكيل وحدة التحكم في الضغط، والتي توضع فوق غرفة الخلايا. يقوم المجمع والإطار المعدني بتثبيت الجهاز المجمع. (B1) مخطط مقطعي لوحدة الضغط قبل وبعد الضغط. توضع الكريات الورمية المدمجة في مصفوفة ECM وخلايا NK في غرفة الخلايا. يُرمز للمسافة الأولية بين الجزء السفلي من L1 والجزء السفلي من L2 قبل الضغط بالرمز h. عند تطبيق الضغط على وحدة التحكم في الضغط، تنحرف L2 نحو الأسفل، مما يؤدي إلى ضغط مكبس PDMS للكرية الورمية. يُرمز للإزاحة نحو الأسفل لـ L2 بعد الضغط بالرمز Δh. (B2) صور مدمجة للمجال المضيء و GFP لكرية ورمية من نوع MCF-7 مع خلايا NK قبل الضغط (اليسار) وبعد الضغط (اليمين). خلايا MCF-7 موسومة بـ GFP، بينما خلايا NK غير موسومة. تم تحديد خلايا NK ممثلة بدوائر زرقاء، بينما تشير الخطوط الصفراء إلى محيط الكريات الورمية. شريط المقياس = 50 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

بمجرد تجميع جهاز الضغط الموائع الدقيقة، يمكن استخدامه لضغط الكريات الورمية كما هو موضح في الشكل 1B. هنا، يتم إدخال الكريات الورمية المدمجة في الكولاجين مع خلايا NK في حجرة الخلايا (L1). وعند تطبيق الضغط على حجرة الضغط (L3)، تنحرف طبقة الغشاء القابلة للتشوه (L2) إلى الأسفل، مما يجعل مكبس Polydimethylsiloxane (PDMS) ينقل قوى الضغط إلى الكرية الورمية. يتم التحكم في حجرة الضغط بواسطة مصدر ضغط خارجي. وقد نُشرت تفاصيل إضافية تتعلق بتصميم وتصنيع وتوصيف جهاز الضغط الموائع الدقيقة سابقاً في دراسة أخرى15.

نُعرّف المسافة بين قاع حجرة الخلية (L1) وقاع الغشاء القابل للتشوه (L2) بأنها h (الشكل 1B1، اللوحة اليسرى). وتكون هذه المسافة 200 µm قبل الضغط. وعند تسليط ضغط سائل على وحدة التحكم في الضغط، ينحني الغشاء القابل للتشوه لأسفل، مما يقلل المسافة h بمقدار Δh (Δh؛ الشكل 1B1، اللوحة اليمنى)، وبذلك يتم ضغط الكروية الورمية المدمجة في الكولاجين. وفي هذا النظام، يُعرَّف انفعال الضغط بأنه Δh/h، حيث تمثل h المسافة الأولية بين L1 و L2 قبل الضغط، وتمثل Δh الإزاحة السفلية لـ L2 بعد الضغط. وقد تم معايرة إزاحة الغشاء مسبقاً من خلال تصور حبيبات فلورية ملتصقة بقاع L2. ويمكن العثور على وصف تفصيلي لإجراء المعايرة وحسابات انفعال الضغط في دراسة سابقة17. ويمكن رؤية مثال لمنحنى المعايرة في الشكل التكميلي 2.

الشكل 1B2 يوضح صوراً ممثلة مدمجة للمجال المضيء وGFP لكروية MCF-7 مع خلايا NK مدمجة في كولاجين بتركيز 1.5 mg/mL قبل الضغط (اللوحة اليسرى) وبعد الضغط (اللوحة اليمنى). تم تحديد حدود الكروية الورمية باللون الأصفر. بعد الضغط، أظهرت الكروية زيادة في المساحة المسقطة، مما يشير إلى حدوث تشوه استجابةً للتطبيق الناجح للحمل الميكانيكي. لجميع التجارب المعروضة في هذه المخطوطة، استخدمنا انفعال ضغط قدره Δh/h = 50%. ونلاحظ أن قطر الكروية يتراوح من 140 µm إلى 200 µm. وهذا يعني أن انفعال الضغط الفعلي على الكروية أصغر قليلاً من 50%. يوضح الفيديو التكميلي 1 والفيديو التكميلي 2 مجموعات z-stacks ممثلة في المستوى X-Y تم الحصول عليها في قناة فلورة GFP لكروية MCF-7 مدمجة في كولاجين بتركيز 1.5 mg/mL قبل وبعد تطبيق انفعال ضغط بنسبة 50%، على التوالي.

استُخدم جهاز الضغط الموائع دقيقة (microfluidic) لاستقصاء تأثيرات خلايا NK، والضغط، والجمع بينهما على موت الكريات الورمية (الشكل 2). وقد أتاح تصميم الجهاز ذلك، حيث يحتوي على 12 بئراً للزرع؛ يمكن إخضاع ستة من هذه الآبار للضغط، بينما تعمل الآبار الستة المتبقية كضوابط غير مضغوطة. ويسمح هذا التكوين بأربع ظروف تجريبية (الشكل 2A): كريات بمفردها بدون ضغط (sp)، وكريات مع خلايا NK بدون ضغط (+NK)، وكريات خاضعة للضغط (+comp)، وكريات معرضة للضغط وخلايا NK معاً (+comp+NK).

المجهرية بفاصل زمني لشدة GFP؛ رسم بياني، مخطط تشتت لتحليل بيانات GFP المعيارية.
الشكل 2: الضغط الميكانيكي ينظم عملية قتل الكريات الورمية التي تتوسطها الخلايا NK. (A) صور فلورية بفاصل زمني لكريات MCF-7 مدمجة في كولاجين بتركيز 1.5 mg/mL تحت أربع حالات: ضابطة للكريات فقط (sp)، كريات مع خلايا NK (+NK)، كريات مع ضغط (+comp)، وكريات مع الضغط وخلايا NK معاً (+comp+NK). يحدد الفلور GFP الخلايا الورمية MCF-7 الحيوية. يشير الإطار الأصفر إلى المنطقة المستهدفة (ROI)، والتي تم تحديدها باستخدام صورة الـ 18-h وطُبقت على جميع النقاط الزمنية للتقدير الكمي للفلورة. تم قياس إجمالي شدة فلورة GFP داخل المنطقة المستهدفة واستُخدم للتحليل اللاحق. شريط المقياس = 50 µm. (B) إجمالي شدة فلورة GFP لكريّة واحدة بمرور الوقت تحت 4 حالات. يمثل كل خط ملون إجمالي شدة الفلورة لكريّة واحدة، معيارية وفقاً لشدتها الأولية عند t = 0. يمثل الخط الأسود ملاءمة متعددة الحدود من الدرجة الثانية لبيانات شدة الفلورة المجمعة من 7 كريات مستزرعة تحت الحالة الضابطة، واستُخدم كمرجع لحساب فقدان الخلايا الورمية في (C). (C) تم حساب فقدان GFP المعياري لحالات +comp و+NK و+comp+NK عن طريق طرح شدة GFP عند t = 18 h لكل كريّة من خط المرجع للكريات فقط (sp). وبالتالي، تمثل كل نقطة بيانات فقدان GFP المعياري لكريّة واحدة. تمثل أشرطة الخطأ SEM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يمكن تصور تأثيرات خلايا NK والضغط والجمع بينهما على الكريات الورمية في الصور التمثيلية لكريات MCF-7 في كولاجين بتركيز 1.5 mg/mL (الشكل 2A). ونظراً لأن خلايا MCF-7 المستخدمة في تكوين الكريات الورمية كانت موسومة ببروتين GFP، فقد أمكن مراقبة حيوية الورم من خلال التغيرات في فلورة GFP. تم الحصول على صور GFP والصور المجهرية ذات المجال المضيء كل 10 min لمدة 18 h باستخدام مجهر إبيفلوريسنس مقلوب. ومن الملاحظ أن الكريات التي خضعت للضغط أظهرت مساحة مسقطة أكبر من الكريات غير المضغوطة، مما يؤكد الانتقال الناجح للحمل الميكانيكي من الغشاء القابل للتشكيل إلى الكرية الورمية. وبمرور الوقت، لوحظ فقدان تدريجي لفلورة GFP في حالتي +NK و +comp+NK (الشكل 2A)، مما يشير إلى قتل الخلايا الورمية بوساطة خلايا NK.

نستخدم فقدان فلورة GFP كمقياس لموت الخلايا الورمية. وقد تم إنتاج خلايا MCF-7 المسمى بـ GFP المستخدمة في هذه الدراسة عن طريق ترانسدكشن فيروسي لينتي (lentiviral transduction). وباختصار، استُخدم ناقل لينتي لإدخال كاسيت تعبير للبروتين الفلوري الأخضر المحسن (eGFP) يتم تحفيزه بواسطة محفز عامل الاستطالة-1α (EF1α)، إلى جانب جين مقاومة البيوروميسين يتم تحفيزه بواسطة محفز فيروس الساركوما في الدجاج (RSV). وبعد العدوى، دُمجت كاسيتات التعبير اللينتية في الحمض النووي الجينومي لخلايا MCF-7، مما أدى إلى تعبير مستقر لـ GFP. استُخدم الاختيار بالبيوروميسين لاحقاً للتخلص من الخلايا غير المترنسدكة. وقد أتاح تسميم خلايا MCF-7 بـ GFP قياس حيوية الخلايا الورمية من خلال مراقبة التغيرات في كثافة فلورة GFP بمرور الوقت (الشكل 2B). وقد تم إثبات وجود ارتباط قوي سابقاً بين فقدان فلورة GFP والعلامات المعتمدة لموت الخلايا، بما في ذلك علامة الخلايا الحية/الميتة يوديد البروبيديوم (PI) وعلامة الموت الخلوي المبرمج annexin-V18، مما يؤكد أن فقدان فلورة GFP يعد مقياساً بديلاً لموت الخلايا الورمية.

لتقدير آثار الظروف التجريبية الأربعة على حيوية الورم، تم قياس إجمالي شدة فلورة GFP لكل كروي ورمي عند كل نقطة زمنية، وطرح قيمة الخلفية، ثم تطبيعها بالنسبة لقيمتها الأولية (الشكل 2B). تم حساب إجمالي فلورة الكروي الورمي ضمن منطقة اهتمام (ROI) محددة مسبقاً. تم الحصول على منطقة الاهتمام هذه عن طريق رسم حدود كروي الورم يدوياً في صورة الساعة 18 (المخطط الأصفر في لوحة 18 ساعة، الشكل 2A) باستخدام سكربت MATLAB مطور داخلياً. بعد ذلك، تم حساب إجمالي شدة الفلورة ضمن منطقة الاهتمام هذه لكل نقطة زمنية، وتصحيحها عن طريق طرح متوسط فلورة الخلفية المقاسة من منطقة اهتمام منفصلة تم اختيارها في مكان آخر من الصورة. ومن ثم تم تطبيع قيم الفلورة المصححة من الخلفية الناتجة بالنسبة لشدة الفلورة الأولية للكروي الورمي.

يمثل كل منحنى ملون شدة GFP المعيارية لكروية فردية تحت حالة تجريبية محددة في الشكل 2B. تم الحصول على المنحنى باستخدام ملاءمة متعددة الحدود من الدرجة الثانية للبيانات التجريبية. وتمثل المنحنيات الأرجوانية الكرويات التي خضعت للضغط وحده (+comp، الشكل 2B)، بينما تمثل المنحنيات الحمراء الكرويات مع خلايا NK (+NK، الشكل 2B)، وتمثل المنحنيات الزرقاء الكرويات المعرضة لكل من الضغط وخلايا NK (+comp+NK، الشكل 2B). وفي المقابل، يمثل المنحنى الأسود ملاءمة متعددة الحدود من الدرجة الثانية لبيانات سبع كرويات استزرعت تحت حالة الكرويات فقط والتي تعمل كمجموعة ضابطة (sp، الشكل 2B). وفي الشكل 2B، عُرضت البيانات الملاءمة بمتعددة الحدود فقط، وليس نقاط البيانات التجريبية، وذلك من أجل الوضوح. ومن الملاحظ أن شدة فلورة GFP في حالتي الكرويات فقط (sp) والكرويات + الضغط (+comp) أظهرت اتجاهاً تصاعدياً عاماً بمرور الوقت (الشكل 2B)، وهو ما يتوافق مع استمرار نمو الورم أو الحفاظ على الحيوية. وفي المقابل، أظهرت حالتا +NK و +comp+NK انخفاضاً تدريجياً في شدة فلورة GFP (الشكل 2B)، مما يشير إلى موت الخلايا الورمية.

تم قياس الفقد التراكمي للخلايا الورمية عن طريق طرح شدة فلورة GFP المعيرة والمطابقة لكل كروية تحت حالة معينة (+comp، أو +NK، أو +comp+NK) من حالة الضبط عند 18 h (الشكل 2C). ونتيجة لذلك، تمثل كل نقطة بيانات فقد GFP المعير لكروية فردية نسبة إلى مجموعة الضبط المكونة من الكرويات فقط (الشكل 2C). وبناءً على ذلك، تعكس حالة +comp فقد GFP الناتج عن الضغط وحده (باللون الأرجواني، الشكل 2C)، بينما تعكس حالة +NK فقد GFP الناتج عن خلايا NK وحدها (باللون الأحمر، الشكل 2C)، وتعكس حالة +comp+NK فقد GFP الناتج عن التأثيرات المشتركة للضغط وخلايا NK (باللون الأزرق، الشكل 2C). أظهرت حالة +comp أدنى درجة من فقد GFP (الشكل 2C)، مما يشير إلى أن الضغط وحده كان له تأثير ضئيل على حيوية الكرويات. وفي المقابل، أظهرت كل من حالتي +NK و +comp+NK فقد GFP أكبر بكثير مقارنة بحالة +comp (الشكل 2C)، مما يشير إلى أن خلايا NK هي المحرك الأساسي لموت الخلايا الورمية. وعلى الرغم من أن حالة +comp+NK أظهرت متوسط فقد GFP أكبر من حالة +NK، إلا أن هذا الفرق لم يصل إلى دلالة إحصائية (الشكل 2C). تشير هذه النتائج إلى أن الضغط لا يعيق عملية القتل التي تتوسطها خلايا NK للخلايا الورمية. وبشكل عام، تثبت هذه النتائج إمكانية استخدام جهاز الضغط ميكرومائع بنجاح لقياس التأثيرات المستقلة والمشتركة للضغط وخلايا NK على حيوية الكرويات الورمية ضمن بيئة ثلاثية الأبعاد ذات صلة فسيولوجياً.

في المقابل، قد تظهر نتائج غير مثالية عندما (1) تقع الكرويات خارج حدود المكبس، (2) أو عندما تكون الكرويات متموضعة بالقرب الشديد من حدود المكبس، و (3) عندما تقع كرويات متعددة ضمن مسافة تعادل قطر كروية واحدة من بعضها البعض (الشكل 3). وفي هذه الحالات، يجب استبعاد الحقول المقابلة من التحليل.

تأثير ضغط الخلايا؛ المجهر ذو المجال المضيء (BF)، وفلورية GFP؛ قبل وبعد؛ نتائج المجهر الزمني لمدة 18 ساعة.
الشكل 3: مثال نموذجي لسلسلة من الصور لكرات خلوية استُبعدت من التحليل. تظهر صور المجال المضيء (BF) والفلورية لبروتين GFP والصور المدمجة بنظام التصوير الزمني لكرات خلوية من خلايا MCF-7 مع خلايا NK في كولاجين بتركيز 1.5 mg/mL قبل الضغط (العمود الأيسر) وبعد الضغط (العمودان الأيمنان). تم التقاط صور ما قبل الضغط قبل 20 دقيقة من تطبيق الضغط و10 دقائق قبل بدء التصوير الزمني. بعد ذلك، جُمعت الصور كل 10 دقائق لمدة 18 h، حيث تمثل الساعة 0 h الصورة الأولى التي التُقطت مباشرة بعد الضغط، وتمثل الساعة 18 h نهاية التجربة. يشير السهم الأزرق إلى حافة مكبس PDMS ‏(L2). استُبعد حقل التصوير هذا من التحليل لوجود كرتين خليتين ضمن منطقة الضغط وكانتا تقعان على مسافة قريبة جداً من حدود المكبس. ونتيجة لذلك، تعذر قياس تشوه الكرات الخلوية وكثافة فلورية GFP بشكل موثوق أثناء الضغط. شريط القياس = 50 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

(1) لا تتعرض الكرويات الموجودة خارج حدود المكبس للضغط لأن الضغط يُطبق فقط داخل منطقة المكبس. لذا، يجب استبعاد هذه الكرويات من كل من ظروف الضغط والمجموعات الضابطة. (2) يجب استبعاد الكرويات المتمركزة على حدود المكبس أو بالقرب منها (الشكل 3، الكروية العلوية)، حيث تتعرض الكروية في هذه الحالة لتحميل ميكانيكي غير منتظم. (3) يجب استبعاد الكرويات التي تقع على مسافة تقل عن قطر كروية واحدة من الكرويات المجاورة (الشكل 3). إذ يؤدي التقارب الشديد بين الكرويات إلى تعقيد قياس شدة فلورة GFP لأن منطقة الاهتمام (ROI) يتم تحديدها بناءً على النقطة الزمنية النهائية. وبمرور الوقت، قد تصبح حدود الكرويات غير متمايزة، مما يجعل من الصعب تحديد منطقة اهتمام تشمل كروية واحدة فقط بدقة. يمكن تقليل هذه المشكلات من خلال ضمان تمركز الكرويات داخل منطقة الضغط أثناء تحميل الجهاز. إن الاهتمام الدقيق بتوزيع الكرويات، وموضعها، وإعداد الجهاز أمر ضروري لتحقيق ضغط منتظم وتوليد نتائج تجريبية موثوقة وقابلة للتكرار.

المكوناتالتركيز
وسط α-MEM
مصل جنين البقر (FBS)10%
بنسلين/ستريبتومايسين1%

الجدول 1: الوسط الغذائي الكامل لخلايا MCF-7.

المكوناتالتركيز
وسط α-MEM
Myo-inositol0.2 mM
2-mercaptoethanol0.1 mM
مصل جنين البقر (FBS)12.50%
حمض الفوليك0.02 mM
مصل الحصان (HS)12.50%
البنسلين/ستريبتومايسين1%

الجدول 2: الوسط الغذائي الكامل لخلايا NK.

الشكل التكميلي 1: مخطط لنظام التحكم في الضغط. يقوم ضاغط هواء بتزويد الهواء المضغوط (حتى 20 psi) إلى متحكم الضغط. يقوم متحكم الضغط بتنظيم ضغط الهواء الموجه إلى خزان الضغط بناءً على الإعدادات التي يحددها المستخدم. يتميز المتحكم بضغط تشغيل أقصى يبلغ 200 mbar، واستقرار في الضغط بنسبة 0.005% من المقياس الكامل (FS)، ودقة ضغط تبلغ 0.003% FS، وزمن استجابة يبلغ 9 ms، مما يتيح تحكماً دقيقاً وقابلاً للتكرار في الضغط. يتصل المتحكم بجهاز كمبيوتر عبر الناقل التسلسلي العام (USB)، مما يسمح للمستخدم ببرمجة مقدار ونمط الضغط المطبق باستخدام البرنامج المرفق. يدعم البرنامج أشكالاً موجية متعددة للضغط، بما في ذلك الضغط الثابت، والجيبِي، والمثلثي، والدوري. في هذا المخطط، تم ضبط الضغط على 120 mbar، ويتم توجيه الهواء المضغوط بهذا الضغط إلى الخزان المضغوط عبر أنبوب هوائي. يحتوي الخزان المضغوط على 50 mL من الماء منزوع الأيونات (DI) ويعمل على تحويل الضغط الهوائي إلى ضغط مائعي. وبمجرد ضغطه، يدفع الخزان السائل عبر أنابيب توصيل السوائل إلى وحدة التحكم في الضغط الخاصة بجهاز الضغط الموائع دقيقة القنوات (راجع الشكل 1 للحصول على تفاصيل الجهاز)، حيث يُستخدم الضغط المائعي لتطبيق الضغط على الكروية الورمية. يلاحظ أن الضغط المائعي يُستخدم لتجنب تكون فقاعات الهواء في جهاز PDMS. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: منحنى المعايرة لجهاز الضغط الموائع الدقيقة الذي يوضح العلاقة بين إزاحة المكبس (, µm) والضغط المطبق على غرفة التحكم في الضغط (KPa). تم تمثيل القياسات التجريبية بنقاط، بينما يمثل الخط المتصل محاكاة COMSOL. تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) من ثمانية قياسات تجريبية مستقلة، إلا أنها صغيرة جداً لدرجة لا يمكن رؤيتها. تم إعادة إنتاج هذا الشكل من Suh et al.15 بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 1: مجموعة صور z-stack للمحورين X-Y لكروية MCF-7 مُعلمة بـ GFP قبل الضغط. تم دمج الكروية في كولاجين بتركيز 1.5 mg/mL داخل جهاز الضغط الموائع دقيقية، وتم تصويرها باستخدام قناة فلورية GFP مع حجم خطوة z قدره 1 µm. بعد ذلك، استُخدم برنامج ImageJ لتحسين التباين. شريط المقياس = 50 µm. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 2: تم بعد ذلك تطبيق انفعال ضاغط بنسبة 50% (Δh/h = 50%) على كروية MCF-7 الموسومة ببروتين GFP والمدمجة في كولاجين بتركيز 1.5 mg/mL. وبعد الضغط، تم الحصول على مجموعة صور z-stack في المستوى X–Y عبر قناة فلورة GFP باستخدام حجم خطوة 1 µm، ثم تمت معالجتها في برنامج ImageJ لتحسين التباين. شريط المقياس = 50 µm. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

تصف هذه الطريقة استخدام جهاز ضغط ميكروفلويديك لاستقصاء آثار إجهاد الضغط على التفاعلات بين الورم والجهاز المناعي. ويستطيع هذا النظام تطبيق ضغط ميكانيكي محكوم على الكريات الورمية المدمجة داخل مصفوفة كولاجين ثلاثية الأبعاد (3D). وتتيح الركيزة الزجاجية التي تشكل قاعدة حجرة الخلايا (L1) تصويراً حياً عالي الدقة للخلايا، مما يجعل هذه المنصة مناسبة تماماً للدراسات التي تهدف إلى قياس حركة الخلايا المناعية، وتسللها، ونشاطها السام للخلايا. ومن المهم أن النظام يحافظ على التفاعلات بين الخلايا وبعضها وبين الخلايا والمصفوفة، مع السماح بالتحكم الدقيق في البيئة الميكانيكية. وفي المقابل، تتطلب العديد من المناهج التجريبية الحالية لدراسة إجهاد الضغط مفاضلة بين التفاعلات الخلوية التي تتوسطها المصفوفة خارج الخلوية (ECM)9,13 والتصوير عالي الدقة14.

في هذه الدراسة، تم استخدام خلايا NK وكريات MCF-7 السرطانية في الثدي كنظام نموذجي. ومع ذلك، فإن جهاز الضغط الموائع الدقيقة لا يقتصر على هذه الأنواع من الخلايا. وحتى الآن، تم تطبيق المنصة بنجاح على نماذج متعددة من خلايا الثدي، بما في ذلك كريات MDA-MB-231 السرطانية في الثدي وكريات MCF-10A في الثدي15,17. ويمكن تكييف المنصة بسهولة لاستقصاء التفاعلات بين الورم والجهاز المناعي في مجموعة متنوعة من نماذج الأورام الأخرى، بما في ذلك كريات أورام الدماغ والرئة. وبالمثل، تتوافق المنصة مع نطاق واسع من مجموعات الخلايا المناعية بخلاف خلايا NK، مما يسمح بدراسة تفاعلات متنوعة بين الورم والمناعة تحت تأثير الضغط الميكانيكي. علاوة على ذلك، لا يقتصر الجهاز على الدراسات القائمة على الكريات، بل يمكن تكييفه لإجراء تجارب الخلايا المفردة. وتجعل هذه الميزات مجتمعة من هذه المنصة أداة متعددة الاستخدامات لفحص كيفية تنظيم القوى الميكانيكية للسلوك الخلوي عبر مجموعة واسعة من السياقات البيولوجية والمرضية.

تتمثل ميزة أخرى لهذا النظام في التحكم الدقيق في مقدار ونمط الضغط المطبق على العينات. في الدراسة الحالية، تم تطبيق انفعال ضغطي استاتيكي بنسبة 50% طوال مدة التجربة. ومع ذلك، يمكن تعديل مستوى الانفعال بسهولة اعتماداً على الهدف التجريبي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق ضغط ديناميكي بأشكال موجية مختلفة، بما في ذلك الموجات المربعة والموجات الجيبية، على الكريات باستخدام نظام التحكم في الضغط الخارجي. يتضمن الضغط ذو الموجة المربعة فترات متبادلة من الضغط والتحرير17، بينما يتضمن الضغط الجيبي زيادات ونقصانات تدريجية في الضغط بمرور الوقت15. هذه الإمكانيات، عند دمجها مع التصوير الكمي والنمذجة التنبؤية، يمكن استخدامها لدراسة تأثير الضغط الديناميكي على كفاءة القتل المناعي.

نلاحظ أن جهاز الضغط هذا قد طُوّر في الأصل لتوصيف الخصائص الميكانيكية للأورام17. ومن خلال دمج مستشعر قوة in situ، وطبقة من هلام البولي أكريلاميد (PAA) أسفل الكروية الورمية، يمكن توصيف الخصائص الميكانيكية للكروية كمياً، مثل الصلابة واللزوجة المرنة15,17. ويوسع هذا التعديل من فائدة المنصة لتمتد إلى ما هو أبعد من نمذجة إجهاد الضغط لتشمل القياس المباشر للسلوك الميكانيكي للورم.

بشكل عام، يتمتع جهاز الضغط الموائع الدقيقة بنطاق واسع من التطبيقات، بدءاً من قياس الخواص الميكانيكية للكريات الخلوية وصولاً إلى استقصاء التفاعلات بين الورم والجهاز المناعي ضمن بيئة معدلة ميكانيكياً. ومع ذلك، هناك عدة خطوات حاسمة مطلوبة لضمان التشغيل الناجح للجهاز. يجب وضع الكريات الورمية بالقرب من مركز كل بئر لضمان تطبيق ضغط موحد. كما يجب محاذاة وحدة التحكم في الضغط بشكل صحيح مع طبقة غرفة الخلايا (L1) لضمان انتقال الضغط بدقة. قد تظهر فقاعات هوائية عند وضع وحدة التحكم في الضغط فوق L1، مما قد يؤثر سلباً على جودة التصوير ونتائج التجربة. ولمنع حدوث هذه المشكلة، يجب توخي الحذر لتجنب إدخال الفقاعات عند تحميل خليط الكولاجين، كما يجب إضافة 8 µL من خليط الكولاجين في كل بئر لملء الغرفة بشكل زائد قليلاً قبل وضع وحدة التحكم في الضغط؛ حيث يساعد ذلك في ضمان التلامس الكامل بين الطبقات ويقلل من احتمالية انحباس الهواء.

في الختام، يتيح هذا الجهاز نمذجة محكومة لإجهاد الضغط ضمن مصفوفة كولاجين ثلاثية الأبعاد ذات صلة فسيولوجية تدعم التفاعلات بين الورم والجهاز المناعي. توفر هذه المنصة أداة لاستقصاء كيفية تنظيم القوى الميكانيكية الساكنة والديناميكية لعملية القتل التي يتوسطها الجهاز المناعي وسلوك الورم داخل البيئة الدقيقة للورم. ونعمل حالياً على تحديد الآلية الجزيئية التي تكمن وراء التعديل الميكانيكي لعملية القتل المناعي للخلايا الورمية. وقد تؤدي هذه الدراسات إلى اكتشاف أهداف دوائية علاجية جديدة ومحتملة.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضاربات مصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منحة من المعهد الوطني للسرطان (المنحة R01CA221346)، وزمالة Lance R. Collins من كلية الهندسة بجامعة Cornell لـ FM، وصندوق عميد جامعة Cornell لمرونة الأبحاث لـ FM. أُجري هذا العمل جزئياً في Cornell NanoScale Facility، وهي عضو في البنية التحتية الوطنية المنسقة لتكنولوجيا النانو (NNCI)، والتي تدعمها المؤسسة الوطنية للعلوم (المنحة NNCI-2025233).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 عياري NaOHSigma-Aldrich797247 µL
10× وسط M199Sigma-AldrichM0650200 µL
2-مركابتويثانولThermoFisher313500100
ضاغط هواءElveflowضاغط الهواء Jun-Air Model 3
منصة مجهر آلية بمحورين X-Yالأجهزة العلمية التطبيقيةMS-2000
كاميرا CCDHamamatsu PhotonicsORCA-R2
مصل جنين البقر (FBS)GeminiBioS11150
أنابيب توصيل السوائلإليفلو (Eleveflow)لفافة احتياطية من أنابيب PTFE1/16 بوصة في القطر الخارجي
مصدر الضوء الفلوريExcelitas Technologies وحدة الحاسوب X-Cite series 120
حمض الفوليكسيجماF7876
غلوتارالدهيدعلوم المجهر الإلكتروني 160190.10%
منظف البلازما HarrickHarrick PlasmaPDC-001-HPإعداد الطاقة العالية (45 واط)
مصل الخيل (HS)ThermoFisher16050-122
مجهر فلوريسنتي انعكاسيOlympusIX81عدسة شيئية بقوة تكبير 20x (الفتحة العددية NA = 0.25)، تعمل باستخدام برنامج Olympus CellSens
قناعآرتوس (Artus)رقائق تسوية من الألومنيوم مكونة من 10 صفحاتالسُمك هو 0.0125" (٠.٧٥ مم)
خط خلوي مستقر من خلايا MCF-7/GFP (بورسيميسين)GenTarget IncSC050-G
إطار معدنيمُصنّع حسب الطلب مُصنّع حسب الطلب 
خزان الموائع الدقيقةإيليفلو (Eleveflow)خزان مائعيات دقيقة سعة 50 مل 
المجهر OlympusCKX41عدسة شيئية بقوة تكبير 4x              (NA = 0.1)
ميو-إينوزيتولسيجماI7508
NK-92 MIATCCCRL-2407
بنسلين/ستربتومايسينGibco 15140122
محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) ThermoFisher 10010072
أنابيب نيوماتيكيةإيليف فلو (Eleveflow)مدخل أنبوب بولي إيثر PUR شفاف4" القطر الخارجي بالـ ملم
بولي إيثيلين إيمين (PEI)Sigma-AldrichP31431%
منظم الضغطElveflowOB1 NK4يتم تشغيله باستخدام برنامج Elveflow Smart Interface
كولاجين النوع الأول من ذيل الجرذ Corning35424931.3 µL من محلول كولاجين مركز بتركيز 9.6 ملغم/ملل
البراغيفيليبسبرغي M2.5 برأس بان (Pan-head)١٢ برغيًا
حضانة المنصةالبلاستيك الدقيقمُصنَّع حسب الطلب
حقنةBecton Dickinson303134مقترن بقفل متكامل من نوع luer ذكوري بمقاس 3/32" وصلة شائكة ذات قطر خارجي (OD Barb) من Eleveflow
αوسط MEM الغذائيThermoFisher12561056

المراجع

  1. Cao J-Z, Zhao W, Xia X-J. Cell-based cancer immunotherapy: milestones, mechanistic insights, and emerging therapeutic directions. Acta Pharmacol Sin. 2026:https://doi.org/10.1038/s41401-026-01811-y.
  2. Yang R, Yang Y, Liu R, et al. Advances in CAR-NK cell therapy for hematological malignancies. Front Immunol. 2024;15:1414264.
  3. Neelapu SS, et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 2017;377(26):2531-44.
  4. Sheykhhasan M, Manoochehri H, Dama P. Use of CAR T-cell for acute lymphoblastic leukemia (ALL) treatment: a review study. Cancer Gene Ther. 2022;29(8-9):1080-96.
  5. Tan S, Li D, Zhu X. Cancer immunotherapy: Pros, cons and beyond. Biomed Pharmacother. 2020;124:109821.
  6. Chen T, Wang M, Chen Y, Liu Y. Current challenges and therapeutic advances of CAR-T cell therapy for solid tumors. Cancer Cell Int. 2024;24(1):133.
  7. Peng L, et al. CAR-T and CAR-NK as cellular cancer immunotherapy for solid tumors. Cell Mol Immunol. 2024;21(10):1089-108.
  8. Basu R, et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 2016;165(1):100-10.
  9. Dolega ME, et al. Cell-like pressure sensors reveal increase of mechanical stress towards the core of multicellular spheroids under compression. Nat Commun. 2017;8(1):14056.
  10. Linke JA, Munn LL, Jain RK. Compressive stresses in cancer: characterization and implications for tumour progression and treatment. Nat Rev Cancer. 2024;24(11):768-91.
  11. Luo M, Cai G, Ho KKY, et al. Compression enhances invasive phenotype and matrix degradation of breast cancer cells via Piezo1 activation. BMC Mol Cell Biol. 2022;23(1):1.
  12. Ren T, Sun L, Zheng Y, et al. Mechanical forces and immune cells in the tumor microenvironment: from regulation mechanisms to therapeutic strategies. Int J Surg. 2025;111(8):5420-34.
  13. Helmlinger G, Netti PA, Lichtenbeld HC, Melder RJ, Jain RK. Solid stress inhibits the growth of multicellular tumor spheroids. Nat Biotechnol. 1997;15(8):778-83.
  14. Pandey M, et al. Mechanical compression regulates tumor spheroid invasion into a 3D collagen matrix. Phys Biol. 2024;21(3):036003.
  15. Suh YJ, et al. A microfluidic rheometer for tumor mechanics and invasion studies. Lab Chip. 2025;25(22):6018-32.
  16. Song W, et al. Dynamic self-organization of microwell-aggregated cellular mixtures. Soft Matter. 2016;12(26):5739-46.
  17. Pandey M, et al. Viscoelastic properties of tumor spheroids revealed by a microfluidic compression device and a modified power law model. Soft Matter. 2026;22(7):1618-29.
  18. Steff A-M, Fortin M, Arguin C, Hugo P. Detection of a decrease in green fluorescent protein fluorescence for the monitoring of cell death: An assay amenable to high-throughput screening technologies. Cytometry. 2001;45(4):237-43.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Immunology and InfectionMicrofluidicsMechanobiologyCancer ImmunologyNatural Killer cellsImmune cellsCompression
الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.