يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تقييم موجه بالشبكة لمركب $\beta$-sitosterol في نماذج خلايا الميزانجيوم الالتهابية والمحفزة للتليف ذات الصلة بالتهاب كبيبات الكلى المزمن

107 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/73000

⸱

أغسطس 28, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Hemodialysis Room, Hospital of Traditional Chinese Medicine of Qiqihar, 2Department of Nephrology, Ezhou Central Hospital, 3Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, The First Hospital of Qiqihar, 4Department of Nephrology, Shanghai Minhang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تدمج هذه الدراسة بين علم الصيدلة الشبكي، والارتباط الجزيئي الذي تم التحقق من صحته، والتجارب in vitro لتقييم العلاقات المحتملة بين المركبات والأهداف بين مكونات Cordyceps sinensis والعمليات المرتبطة بالتهاب كبيبات الكلى المزمن. تم اختيار β-Sitosterol للتحقق من الصحة على مستوى المركب، ووُجد أنه يقلل من التنشيط الالتهابي والمحفز للتليف في نماذج الخلايا الميزانجيالية.

الملخص

يتميز التهاب كبيبات الكلى المزمن (CGN) بإصابة التهابية مستمرة وإعادة تشكيل تليفي تدريجي، ومع ذلك لا تزال العلاقات بين المركبات والأهداف الكامنة وراء التدخلات القائمة على المنتجات الطبيعية غير محددة بشكل كامل. دمجت هذه الدراسة بين علم الصيدلة الشبكي، والرسو الجزيئي الذي تم التحقق من صحته، وتجارب in vitro لتقييم المكونات المرشحة من فطر Cordyceps sinensis (C. sinensis) في العمليات المرضية المرتبطة بالتهاب كبيبات الكلى المزمن. تم فحص المكونات المرشحة لـ C. sinensis، وتم تقاطع الأهداف المرتبطة بالمركبات والمستمدة من "منصة تحليل وقاعدة بيانات علم الصيدلة النظمي للطب الصيني التقليدي" مع الجينات المرتبطة بـ CGN. واستُخدمت تحليلات الإثراء الوظيفي وتفاعل البروتين-بروتين لتحديد أولويات العمليات البيولوجية والأهداف المحورية. وتم تحديد PTGS2 كهدف مشترك رئيسي. أُجري الرسو الجزيئي باستخدام بنية COX-2 المرتبطة بـ celecoxib. وأدى إعادة رسو ليجاند celecoxib المشترك في البلورة إلى إعادة إنتاج الوضع البلوري بقيمة RMSD تبلغ 0.876 Å، مما يدعم بروتوكول الرسو. وأظهر كل من β-Sitosterol وlinoleyl acetate توافقاً متوقعاً مع منطقة رسو COX-2، بتقاربات ارتباط بلغت −7.2 و −7.5 kcal/mol على التوالي. تم اختيار β-Sitosterol للتحقق على مستوى المركب في خلايا ميزانجيوم كبيبات الكلى لجرذان HBZY-1. وعند تركيز 0.5–10 µM، لم يؤدِ β-sitosterol إلى خفض ملحوظ في حيوية الخلايا. وفي الخلايا المحفزة بـ Lipopolysaccharide (LPS)، خفض β-sitosterol تعبير Tnf و Il6 و Ptgs2، وقلل من إنتاج prostaglandin E2 (PGE2)، وخفض وفرة بروتين cyclooxygenase-2 (COX-2). وفي الخلايا المعالجة بـ transforming growth factor β1 (TGF-β1)، خفض β-sitosterol تعبير Col1a1 و Acta2 وقلل من وفرة بروتين alpha-smooth muscle actin (α-SMA). توفر هذه النتائج أدلة لتوليد الفرضيات بأن β-sitosterol ينظم التنشيط الالتهابي والمحفز للتليف في نماذج خلايا الميزانجيوم، ولكنها لا تثبت التثبيط الإنزيمي المباشر لـ COX-2 أو الفعالية العلاجية في CGN.

المقدمة

يشتمل التهاب كبيبات الكلى المزمن (CGN) على مجموعة غير متجانسة من اضطرابات الكبيبات التي يمكن أن تتطور إلى مرض الكلى المزمن ومرحلة الفشل الكلوي النهائي1. ويتميز هذا المرض بإصابة مستمرة في الكبيبات، وتنشيط التهابي، وإعادة تشكيل تليفية تصاعدية2,3. وعلى الرغم من استخدام الكورتيكوستيرويدات والعوامل المثبطة للمناعة في حالات مختارة من المرضى، إلا أن السيطرة على المرض على المدى الطويل تظل صعبة في كثير من الحالات، كما تشيع الآثار الجانبية المرتبطة بالعلاج1,4,5. يتضمن تطور التهاب كبيبات الكلى المزمن عمليات مرضية متفاعلة، بما في ذلك التنشيط المناعي، والخلل الوظيفي البطاني، والإجهاد التأكسدي، وتراكم المصفوفة خارج الخلية3,6,7. لذا، فإن تحديد العقد الجزيئية التي تربط بين الاستجابات الالتهابية والمحفزة للتليف قد يساعد في صياغة فرضيات قابلة للاختبار لاستراتيجيات التدخل ذات الصلة بالمرض.

Cordyceps sinensis (C. sinensis) استُخدم في سياقات سريرية وتجريبية متعلقة بالكلى، وأُفيد بأن له تأثيرات مضادة للالتهابات، ومضادة لموت الخلايا المبرمج، وواقية للخلايا في العديد من نماذج الأمراض8,9,10. ومع ذلك، لا تزال الأسس الجزيئية التي قد تتفاعل من خلالها مكوناته المرشحة مع الأهداف ذات الصلة بالتهاب كبيبات الكلى غير محددة بشكل كافٍ11. وبالنظر إلى الطبيعة متعددة المكونات لـ C. sinensis والتباين الميكانيكي لـ CGN، توفر علم الصيدلة الشبكي إطاراً مفيداً لتحديد أولويات العلاقات المرشحة بين المركب والهدف والمسار12,13.

في هذه الدراسة، تم دمج مسح المركبات، واسترجاع الأهداف، وتحليل التقاطع بين المرض والجين، والإثراء الوظيفي، وتحليل شبكة التفاعل بين البروتينات، والرسو الجزيئي، والتحقق in vitro لاستكشاف العلاقات الجزيئية المحتملة بين المكونات المرشحة لنبات C. sinensis والعمليات المرضية ذات الصلة بمرض CGN. تم تحديد سينثيز بروستاجلاندين-إندوبيروكسيد 2 (PTGS2) كهدف محوري من شبكة المركب-المرض، وتم تقييمه عن طريق الرسو الجزيئي باستخدام بنية سيكلوأكسجيناز-2 (COX-2) المرتبطة بمركب celecoxib مع التحقق من خلال إعادة الرسو. وبناءً على نتائج الشبكة، وتحليل الرسو، والأدلة السابقة على النشاط المضاد للالتهابات والمضاد للتليف، تم اختيار β-sitosterol كمركب مرشح ممثل للتحقق اللاحق14,15,16. استُخدمت الخلايا الميزانجيالية المحفزة بـ Lipopolysaccharide (LPS) لتقييم التنشيط الالتهابي والاستجابة المرتبطة بـ COX-2/prostaglandin E2 (PGE2)، بينما تم إدراج نموذج محفز بـ transforming growth factor β1 (TGF-β1) لتقييم تعبير مؤشرات التليف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

استندت تحليلات الصيدلة الشبكية والمعلوماتية الحيوية إلى قواعد بيانات متاحة للعموم ولم تشمل مشاركين بشريين أو حيوانات. وقد أجريت التجارب in vitro باستخدام خط خلوي معتمد ولم تتطلب موافقة أخلاقية وفقاً للمتطلبات المؤسسية.

فحص المكونات المرشحة واستعادة الهدف

تَمَّ استرداد المكونات المرشحة وأهدافها المقابلة من منصة تحليل وقاعدة بيانات فارماكولوجيا نظم الطب الصيني التقليدي (TCMSP) باستخدام مصطلح البحث “dongchongxiacao” في 13 يوليو 2025. وقد تم الاحتفاظ بالمركبات التي بلغت التوافر الحيوي الفموي المتوقع لها 30% على الأقل، والتشابه الدوائي (drug-likeness) بنسبة 0.18 على الأقل. واستوفت سبعة مكونات مرشحة كلا معياري الفرز. كما سُجل الوزن الجزيئي، والتوافر الحيوي الفموي، والتشابه الدوائي، وغيرها من واصفات الحركية الدوائية المتاحة من TCMSP لإجراء مقارنة وصفية.

تم تنزيل معلومات المركب-الهدف المرتبطة بالمكونات المستبقاة مباشرة من TCMSP. تمت إزالة إدخالات الأهداف المكررة يدويًا عند بناء مجموعة الأهداف غير المتكررة، بينما تم الاحتفاظ بعلاقات المركب-الهدف الأصلية لبناء الشبكة لاحقًا. ونظرًا لأن TCMSP وفرت أسماء الأهداف في صيغتها الكاملة بدلاً من رموز جينية موحدة، فقد تم البحث عن كل هدف في قاعدة بيانات UniProt (تم الدخول إليها في 14 يوليو 2025). وقد تم اختيار الإدخال البشري المقابل، وتحويل اسم الهدف إلى رمزه الجيني الرسمي. واستُخدمت مجموعة بيانات المركب-الهدف الموحدة لتحليل تقاطع المرض-الهدف وتحليل شبكة المركب-الهدف.

تجميع الجينات المرتبطة بالتهاب كبيبات الكلى وتقاطع الأهداف

تم استرجاع الجينات المرتبطة بالمرض من GeneCards وDisGeNET وPharmGKB وTherapeutic Target Database باستخدام مصطلح البحث "glomerulonephritis" في 14 يوليو 2025. وبالنسبة لـ GeneCards، تم الاحتفاظ بالمدخلات التي تزيد درجات صلتها عن الدرجة المتوسطة البالغة 10. كما تم تضمين المدخلات المؤهلة من قواعد البيانات الأخرى وفقاً لتعليقات المرض-الهدف المنسقة الخاصة بها. وتم توحيد أسماء الجينات وفقاً لرموز الجينات البشرية الرسمية، مع إزالة المدخلات المكررة. وأسفر هذا الإجراء عن تحديد 1,134 جيناً فريداً مرتبطاً بـ glomerulonephritis. ونظراً لأن البحث استخدم المصطلح الأعم "glomerulonephritis"، فقد اعتبرت مجموعة البيانات الناتجة ذات صلة بالعمليات الجزيئية المرتبطة بـ chronic glomerulonephritis بدلاً من أن تكون محددة بنمط نسيجي مرضي واحد.

تم تقاطع الأهداف المرتبطة بالمركبات والمستمدة من TCMSP مع مجموعة الجينات المرتبطة بالمرض باستخدام لغة R. وقد تم تحديد ثلاثة وعشرين هدفاً متداخلة. كما تم إنشاء مخططات فين باستخدام حزمة R المسماة venn، وتم بناء شبكة الأهداف المتداخلة للمركبات وتصورها باستخدام برنامج Cytoscape. وتتلخص العلاقات بين المكونات المرشحة والأهداف المتداخلة في الجدول 1.

تحليلات الإثراء الوظيفي والتفاعل بين البروتينات

تم إجراء تحليلات الإثراء لـ Gene Ontology (GO) وKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) في بيئة R باستخدام clusterProfiler وorg.Hs.eg.db. وحُللت مصطلحات Gene Ontology ضمن فئات العملية البيولوجية، والمكون الخلوي، والوظيفة الجزيئية. كما تم تعديل قيم P للاختبارات المتعددة باستخدام طريقة Benjamini-Hochberg، وتم الاحتفاظ بالمصطلحات أو المسارات التي كانت قيم P المعدلة لها أقل من 0.05. وعُرِضت المصطلحات والمسارات المثرى باستخدام مخططات شريطية ومخططات نقطية تم إنشاؤها بشكل مستقل.

تم إدخال الأهداف الـ 23 المتداخلة في قاعدة بيانات STRING، مع اختيار Homo sapiens ككائن حي وتحديد الحد الأدنى لدرجة التفاعل بأكثر من 0.4. ثم استوردت شبكة تفاعلات البروتين-بروتين الناتجة إلى برنامج Cytoscape. وتم تقييم طوبولوجيا الشبكة باستخدام CytoNCA بناءً على درجة الاتصال (degree)، والمركزية البينية (betweenness)، والمركزية التقاربية (closeness)، ومركزية المتجه الذاتي (eigenvector centrality)، ومتوسط الاتصال المحلي (local average connectivity)، ومركزية الشبكة (network centrality). عُرِّفت الأهداف المركزية (Hub targets) بأنها العقد التي كانت قيم درجة الاتصال، والمركزية البينية، والمركزية التقاربية، ومركزية المتجه الذاتي، ومتوسط الاتصال المحلي، ومركزية الشبكة فيها جميعاً أكبر من القيم الوسيطة المقابلة لها في الشبكة. وقد أدى هذا التحليل إلى تحديد تسعة أهداف مركزية ذات أولوية للتفسير اللاحق.

الالتحام الجزيئي والتحقق من صحة إعادة الالتحام

أُجري الإرساء الجزيئي باستخدام بنية سيكلوأكسيجيناز-2 المرتبطة بـ celecoxib ذات المعرف PDB ID 3LN1. تم الاحتفاظ بالسلسلة A ومجموعة الهيم المرتبطة بها كمستقبل، بينما أُزيلت جزيئات الماء البلورية ورابط celecoxib الذي تم بلورته مع البروتين أثناء تحضير المستقبل. استُخلص التشكيل الأصلي لـ celecoxib بشكل منفصل من السلسلة A لغرض التحقق من صحة إعادة الإرساء. أُضيفت ذرات الهيدروجين القطبية وشحنات Gasteiger باستخدام AutoDockTools، وحُفظ المستقبل بتنسيق PDBQT. يمثل PDB ID 3LN1 بنية بدقة 2.40 Å لـ COX-2 الفأري المرتبط بـ celecoxib. تم الحصول على بنيات β-sitosterol و linoleyl acetate من PubChem وحُضرت باستخدام Open Babel. أُضيفت ذرات الهيدروجين وشحنات Gasteiger الجزئية، وحُددت الروابط القابلة للدوران، وحُوّل كل رابط إلى تنسيق PDBQT. أُجري إرساء لكل من celecoxib و β-sitosterol و linoleyl acetate باستخدام AutoDock Vina مع استخدام نفس المستقبل ومعايير البحث.

تم تمركز صندوق الإرساء (docking box) على منطقة ارتباط celecoxib الأصلية باستخدام الإحداثيات التالية: center_x = 30.9886 center_y = -22.2836 center_z = -16.5072 size_x = 26 Å size_y = 26 Å size_z = 26 Å. وقد تم ضبط قيمة الشمولية (exhaustiveness) عند 16، وعدد أنماط المخرجات (output modes) عند 10، ونطاق الطاقة عند 3 kcal/mol. وتم الاحتفاظ بالوضعية (pose) الأعلى تصنيفاً بناءً على أدنى طاقة ارتباط متوقعة لغرض التصوير المرئي. وللتحقق من صحة البروتوكول، تمت إعادة إرساء celecoxib الأصلي تحت نفس الظروف، وحُسب متوسط مربع الانحراف (root mean square deviation) للذرات الثقيلة بين وضعيات البلورة والوضعيات المعاد إرساؤها باستخدام برنامج PyMOL. واعتُبر متوسط مربع الانحراف الذي يقل عن 2 Å إعادة إنتاج مقبولة للوضعية المرجعية. كما تم تحديد البقايا (residues) الواقعة ضمن نطاق 4 Å من كل ربيطة (ligand) تم إرساؤها في برنامج PyMOL. وتم تفسير درجات ووضعيات الإرساء كتقديرات للتوافق البنيوي وليس كدليل مباشر على الارتباط بالهدف أو التثبيط الإنزيمي.

زراعة الخلايا وتحضير المركبات

تمت زراعة خلايا ميزانجيوم الكبيبة الكلوية للجرذ من سلالة HBZY-1 في وسط Dulbecco’s modified Eagle المعدل عالي الجلوكوز والمكمل بـ 10% مصل جنين البقري و1% بنسيلين-ستريبتومايسين عند درجة حرارة 37 °C في ظروف رطبة مع 5% CO₂. استُخدمت الخلايا في الممرات من 2–7 لجميع التجارب، وتم التحقق من خلوها من الميكوبلازما قبل الاستخدام. استُخدم كل من β-Sitosterol وcelecoxib كمركبات محددة كيميائياً. أُذيب β-Sitosterol في الإيثانول المطلق لتحضير محلول مخزون بتركيز 10 mM (حوالي 4.15 mg/mL). وعند الحاجة، أجري تسونيك (sonication) قصير والتدفئة إلى 50–60 °C للحصول على محلول رائق بصرياً. أُذيب celecoxib في ثنائي ميثيل سلفوكسيد لتحضير محلول مخزون بتركيز 10 mM (حوالي 3.81 mg/mL). قُسمت المحاليل المخزونة إلى حصص وتم تخزينها عند −20 °C. وقبل المعالجة، خُففت المحاليل المخزونة مباشرة في وسط زراعة مُدفأ مسبقاً ومُزجت على الفور.

تمت مطابقة تركيزات المذيبات (Vehicle) ضمن كل تجربة. في مقايسة حيوية الخلايا، تم ضبط التركيز النهائي للإيثانول ليكون 0.2% v/v في جميع المجموعات لأن أعلى تركيز تم اختباره من β-sitosterol كان 20 µM. وفي تجربة الالتهاب المستحث بواسطة LPS، تم ضبط التركيزات النهائية للإيثانول وdimethyl sulfoxide لتكون 0.1% و0.01% v/v، على التوالي، في جميع المجموعات. أما في تجربة التليف المستحث بواسطة TGF-β1، فقد تم ضبط التركيز النهائي للإيثانول ليكون 0.1% v/v في جميع المجموعات. كما تمت إضافة أحجام مكافئة من المذيبات المقابلة إلى مجموعات Control وLPS وTGF-β1.

مقايسة حيوية الخلايا

وُزعت الخلايا في أطباق ذات 96 بئراً بكثافة 5 × 103 خلية لكل بئر في 100 µL من الوسط الغذائي الكامل، وتُركت لتلتصق لمدة 24 h. ولتقدير نطاق تركيز β-sitosterol، حُضنت الخلايا مع 0.5 أو 1 أو 5 أو 10 أو 20 µM من β-sitosterol لمدة 24 h. أما بالنسبة لاختبار حيوية الخلايا المرتبط بـ LPS، فقد عولجت الخلايا مسبقاً بـ β-sitosterol بتركيز 1 أو 5 أو 10 µM لمدة 2 h، ثم عُرّضت لـ 1 µg/mL من lipopolysaccharide لمدة 24 h إضافية.

كانت مجموعات المعالجة هي المجموعة الضابطة، وβ-sitosterol بتركيز 0.5 µM، وβ-sitosterol بتركيز 1 µM، وβ-sitosterol بتركيز 5 µM، وβ-sitosterol بتركيز 10 µM، وβ-sitosterol بتركيز 20 µM، وLPS، وLPS مع β-sitosterol بتركيز 1 µM، وLPS مع β-sitosterol بتركيز 5 µM، وLPS مع β-sitosterol بتركيز 10 µM. أضيف كاشف Cell Counting Kit-8 بمقدار 10 µL لكل بئر، وحُضنت الأطباق لمدة 2 h. ثم سُجلت الامتصاصية عند 450 nm. تم تحديد حيوية الخلايا بعد طرح قيمة الفراغ الخالي من الخلايا، وعُبّر عنها بالنسبة إلى المجموعة الضابطة. تضمنت كل حالة ستة آبار تقنية في كل تجربة من ست تجارب بيولوجية مستقلة. وتم حساب متوسط قيم الآبار التقنية من كل تجربة لإنتاج قيمة مكرر بيولوجي واحد للتحليل الإحصائي.

التنشيط الالتهابي الناجم عن LPS

بالنسبة لتجارب التنشيط الالتهابي، تم استزراع خلايا HBZY-1 في أطباق ذات 6 آبار بكثافة 2 × 105 خلية لكل بئر، وعولجت بعد وصولها إلى درجة تلاقي تتراوح تقريباً بين 70%–80%. تم الحفاظ على الخلايا في وسط مغذٍ مضاف إليه 1% من مصل جنين البقر لمدة 12 h قبل المعالجة. تم إعطاء β-Sitosterol أو celecoxib قبل 2 h من التحفيز بواسطة LPS. بعد ذلك، عُرِضت الخلايا لـ 1 µg/mL من LPS لمدة 24 h.

تمثلت المجموعات التجريبية في مجموعة ضابطة، ومجموعة β-sitosterol بتركيز 10 µM، ومجموعة LPS، ومجموعة LPS بالإضافة إلى β-sitosterol بتركيز 1 µM، ومجموعة LPS بالإضافة إلى β-sitosterol بتركيز 5 µM، ومجموعة LPS بالإضافة إلى β-sitosterol بتركيز 10 µM، ومجموعة LPS بالإضافة إلى celecoxib بتركيز 1 µM. تم إدراج celecoxib كضابط موجب وظيفي لتثبيط إنتاج البروستاجلاندين المعتمد على COX-2. وفي نهاية فترة المعالجة، جُمعت السوائل الطافية من المزارع لقياس PGE2. كما جُمعت الخلايا بشكل منفصل لإجراء تحليل PCR الكمي في الوقت الحقيقي لـ Tnf و Il6 و Ptgs2، ولإجراء تحليل western blot لـ COX-2.

التنشيط المحفز للتليف بواسطة TGF-β1

تم استخدام نموذج منفصل محفز بواسطة TGF-β1 لتقييم التنشيط المسبب للتليف. زُرعت خلايا HBZY-1 في أطباق ذات 6 آبار بكثافة 2 × 105 خلية لكل بئر، وحُفظت في وسط مُدعم بـ 1% مصل جنين البقر لمدة 12 h قبل المعالجة. عولجت الخلايا مسبقاً بـ β-sitosterol لمدة 2 h، تلا ذلك التحفيز باستخدام 10 ng/mL من TGF-β1 المؤتلف لمدة 48 h.

شملت مجموعات المعالجة مجموعة ضابطة، وβ-sitosterol (10 µM)، وTGF-β1، وTGF-β1 + β-sitosterol (5 µM)، وTGF-β1 + β-sitosterol (10 µM). وفي نهاية فترة المعالجة، تم حصاد الخلايا لإجراء تحليل PCR الكمي في الوقت الحقيقي لكل من Col1a1 وActa2 ولإجراء تحليل لطخة ويسترن لبروتين alpha-smooth muscle actin (α-SMA).

تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي

تم عزل الحمض النووي الريبوزي الكلي (Total RNA) من الخلايا المعالجة باستخدام كاشف لاستخلاص الـ RNA يعتمد على الفينول والغوانيدينيوم وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. وقد تم تحديد تركيز الـ RNA ونقاوته باستخدام مقياس الطيف الضوئي. واستُخدمت فقط العينات التي تراوحت نسبة A260/A280 فيها بين 1.8–2.0 لعملية النسخ العكسي. وبالنسبة لكل عينة، تم تحويل 1 µg من الـ RNA الكلي عن طريق النسخ العكسي إلى حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين مكمل (complementary DNA) في حجم تفاعل نهائي قدره 20 µL. ثم خُفف الـ complementary DNA الناتج بمقدار خمسة أضعاف باستخدام ماء خالٍ من النيوكلياز قبل إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (quantitative PCR). أُجري تفاعل الـ quantitative PCR في حجم كلي قدره 20 µL يحتوي على 10 µL من 2× SYBR Green master mix، و0.4 µL من كل من البادئات الأمامية والعكسية بتركيز 10 µM، و2 µL من الـ complementary DNA المخفف، و7.2 µL من الماء الخالي من النيوكلياز. وتضمنت ظروف التضخيم خطوة مسخ أولية عند 95 °C لمدة 30 s، تلتها 40 دورة من المسخ عند 95 °C لمدة 5 s، والارتباط-التمديد عند 60 °C لمدة 30 s. وأُجري بعد ذلك تحليل لمنحنى الانصهار من 65 °C إلى 95 °C للتحقق من خصوصية التضخيم.

كانت الجينات التي تم قياسها هي Tnf وIl6 وPtgs2 وCol1a1 وActa2 وGapdh. وقد استُخدم Gapdh كجين مرجعي داخلي. تم تحديد التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة 2−ΔΔCt، مع استخدام مجموعة الضبط كمعاير. تتوفر تسلسلات البادئات في الجدول التكميلي 1. تم تحليل كل عينة في ثلاث مكررات تقنية، وأجريت ست تجارب بيولوجية مستقلة. تم حساب متوسط القيم التي تم الحصول عليها من المكررات التقنية قبل إجراء التحليل الإحصائي.

قياس PGE2 بواسطة المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم

تم جمع طافي المزرعة بعد 24 h من التحفيز بـ LPS وطردها مركزياً عند 1,000 × g لمدة 10 min عند 4 °C لإزالة حطام الخلايا. تم تقدير تركيزات PGE2 باستخدام طقم مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم متاح تجارياً وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

تم تحميل المعايير والعينات على لوحة المقايسة في مكررات ثنائية. وبعد الانتهاء من خطوات ربط الأجسام المضادة وتطوير اللون، تم تسجيل الامتصاصية عند 450 nm باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة. تم تحديد تركيزات PGE2 من منحنى قياسي لوجستي رباعي المعلمات وتم التعبير عنها بـ pg/mL. كما تم تحليل السوائل الطافية من ست تجارب خلوية مستقلة. وتم حساب متوسط القياسات المكررة لكل عينة بيولوجية قبل إجراء التحليل الإحصائي.

لطخة ويسترن

تم تحلل الخلايا المعالجة في محلول منظم لمقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي (radioimmunoprecipitation assay buffer) مضاف إليه خليط من مثبطات البروتياز. حُضنت المحللات على الثلج لمدة 30 min ثم وُضعت في جهاز الطرد المركزي بسرعة 12,000 × g لمدة 15 min عند درجة حرارة 4 °C. تم تحديد تركيزات البروتين في الرواسب الطافية باستخدام مقايسة البروتين بحمض البيسينكونينيك (bicinchoninic acid protein assay). خُلطت كميات متساوية من البروتين (30 µg لكل مسار) مع محلول التحميل ومُسخنت عند 95 °C لمدة 5 min. فُصلت البروتينات المستخلصة من تجارب LPS على هلامات بولي أكريلاميد وبيريدوديسيل كبريتات الصوديوم (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels) بتركيز 10%، بينما فُصلت البروتينات من تجارب TGF-β1 على هلامات بتركيز 12%. بعد ذلك، نُقلت البروتينات المفصولة إلى أغشية بولي فينيليدين فلوريد (polyvinylidene fluoride membranes).

تم حجب الأغشية باستخدام 5% من الحليب الخالي من الدسم في محلول ملحي منظم بالتريس يحتوي على 0.1% Tween 20 لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة، ثم حُضنت طوال الليل عند 4 °C مع أجسام مضادة أولية ضد COX-2 (1:1000)، و α-SMA (1:1000)، و GAPDH (1:5000). تم تحليل COX-2 في عينات من تجربة LPS، بينما تم تحليل α-SMA في عينات من تجربة TGF-β1. وبعد الغسل، حُضنت الأغشية مع أجسام مضادة ثانوية مقترنة ببيروكسيديز الفجل (1:5000) لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة. تم تصوير حزم البروتين باستخدام ركيزة التألق الكيميائي المحسنة والتقاطها بواسطة نظام تصوير التألق الكيميائي. كانت أوقات التعريض 10 s تقريبًا لـ COX-2، و 10 s لـ α-SMA، و 2 s لـ GAPDH.

تم تقدير كثافة الحزم باستخدام برنامج ImageJ. كما تم تطبيع إشارات COX-2 و α-SMA بالنسبة لإشارة GAPDH المقابلة. أُجري تحليل Western blotting باستخدام عينات بروتينية تم الحصول عليها من ست تجارب مستقلة لزراعة الخلايا ومعالجتها.

التحليل الإحصائي

أُجريت التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج GraphPad Prism. وتُعرض البيانات في صورة المتوسط ± الانحراف المعياري. نُفذت ست تجارب مستقلة لزراعة الخلايا ومعالجتها لكل تحليل كمي، بحيث تمثل كل تجربة مستقلة مكرراً بيولوجياً واحداً. أما قياسات المكررات التقنية التي تم الحصول عليها من نفس التجربة البيولوجية فقد حُسب متوسطها قبل التحليل الإحصائي ولم تُعتبر ملاحظات مستقلة.

بالنسبة لمقايسة حيوية الخلايا، تضمن كل اختبار بيولوجي ست آبار تقنية لكل حالة. وأُجريت تفاعلات PCR الكمي في ثلاث مكررات تقنية لكل عينة بيولوجية، بينما أُجريت قياسات PGE2 في مكررات ثنائية. واستند التكميم في تحليل Western blot إلى ست عينات بروتينية تم تحضيرها بشكل مستقل. وبناءً على ذلك، يحتوي كل شريط تكميمي على قيم ست مكررات بيولوجية فردية.

تم تحليل الفروق بين المجموعات المتعددة باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه، متبوعاً باختبار توكي للمقارنات المتعددة. وتم استخدام اختبار ثنائي الجانب P قيمة < اعتبرت القيمة 0.05 دالة إحصائياً. وعُرِضت قيم المكررات البيولوجية الفردية جنباً إلى جنب مع المتوسط والانحراف المعياري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

فحص المكونات المرشحة، واسترجاع الأهداف، وتقاطع الأهداف

تم تلخيص سير العمل لتحديد الأهداف المتداخلة المرشحة بين المركب والمرض في الشكل 1A. استوفت سبعة مركبات مرشحة من C. sinensis معايير الفحص المحددة مسبقاً وهي OB ≥30% وDL ≥0.18، وشملت حمض الأراشيدونيك، وأسيتات اللينوليل، وβ-sitosterol، وperoxyergosterol، وcerevisterol، وcholesteryl palmitate، وCLR (الجدول 2). وبالتوازي مع ذلك، تم استرجاع 1,134 جيناً مرتبطاً بالتهاب كبيبات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

دمجت هذه الدراسة بين علم الصيدلة الشبكي، والالتحام الجزيئي الذي تم التحقق منه بواسطة ربيطة مرجعية، والتجارب على مستوى المركبات لفحص فرضية مرتبطة بـ PTGS2 مستمدة من المكونات المرشحة لنبات C. sinensis. استوفت سبعة مكونات معايير الفحص المحددة مسبقاً في قاعدة بيانات TCMSP، وتداخل 23 هدفاً مع مجموعة الجينات المرتبطة بالتهاب كبيبات الكلى. وأعطى تحليل التفاعل البروتيني الأولوية لتسعة أهداف مركزية، تم من بينها اختيار PTGS2 لعمليات الالتحام والتقييم التجريبي. وقد أعاد الالتحام العكسي لمركب celecoxib إنت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بأنه لا توجد لديهم أي تضاربات في المصالح. تم استخدام أدوات تعتمد على الذكاء الاصطناعي (ChatGPT, OpenAI) للمساعدة في التحرير اللغوي والتصميم الأولي للأشكال التوضيحية. كما استُخدم الذكاء الاصطناعي التوليدي للمساعدة في إعداد المسودات الرسومية الأولية للشكلين 1A و 7، والتي قام المؤلفون لاحقاً بمراجعتها وتنقيحها لضمان اتساقها مع الطرق والنتائج المذكورة. وقد تم تقييم جميع المخرجات المدعومة بالذكاء الاصطناعي تقييماً نقدياً واعتمادها من قبل المؤلفين. كما تحقق المؤلفون من المحتوى النهائي للأشكال وتحملوا المسؤولية الكاملة عن سلامة المخطوطة ودقتها.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة من قبل تخصص أمراض الكلى المتكامل بين الطب الصيني التقليدي والطب الغربي (ZYTSZK2-3) ودراسة استراتيجية تدخل الطب الصيني التقليدي في مرض الكلى المزمن من منظور إدارة الأمراض المزمنة (202240169).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
إيثانول مطلقSigma-Aldrich/MerckE7023إيثانول بتركيز 200 proof، غير ممسوخ، بدرجة نقاء مناسبة للبيولوجيا الجزيئية؛ مذيب للمحلول المخزون من β-sitosterol.
AutoDock VinaScripps ResearchVersion 1.1.2محاكاة الالتحام الجزيئي
كابينة السلامة البيولوجيةThermo Fisher Scientific1300 Series A2عمليات زراعة الخلايا المعقمة
CelecoxibMedChemExpressHY-14398مثبط انتقائي لـ COX-2 مستخدم كضابط موجب؛ محلول مخزون بتركيز 10 mM في DMSO. 
Cell Counting Kit-8Dojindo Molecular Technologies, Inc.CK04مقايسة WST-8 اللونية لحيوية الخلايا؛ يتم قياس الامتصاص عند 450 nm.
نظام تصوير باللمعان الكيميائيBio-Rad LaboratoriesChemiDoc MPالحصول على صور لطخة ويسترن
حزمة clusterProfiler لـ RBioconductorVersion 4.10.0تحليل إثراء GO و KEGG
حاضنة زراعة خلايا CO2Thermo Fisher ScientificForma Series II 3111تحضين الخلايا عند 37 °C و 5% CO2
COX-2 (D5H5) Rabbit Monoclonal AntibodyCell Signaling Technology12282تم التحقق منه في لطخة ويسترن للإنسان والفأر والجرذ لـ COX-2؛ يستخدم بنسبة 1:1,000.
إضافة CytoNCACytoscape App StoreVersion 2.1.6التحليل الطوبولوجي للأهداف المركزية (Hub targets)
برنامج CytoscapeCytoscape ConsortiumVersion 3.8.0تصوير وتحليل الشبكات
ثنائي ميثيل سلفوكسيدSigma-Aldrich/MerckD2650كاشف بيولوجي مفلتر ومعقم، ≥99.7%؛ مذيب للمحلول المخزون من celecoxib.
قاعدة بيانات DisGeNETIntegrative Biomedical Informatics GroupNot applicableاسترجاع الجينات المرتبطة بمرض التهاب كبيبات الكلى
وسط Dulbecco المعدل (DMEM)Gibco/Thermo Fisher ScientificC11995500BTوسط أساسي لزراعة خلايا HBZY-1
ركيزة اللمعان الكيميائي المعززBeyotime BiotechnologyP0018Sتصوير حزم لطخة ويسترن
مصل جنين البقرGibco/Thermo Fisher Scientific10099-141Cمكمل مصل لزراعة الخلايا
GAPDH (D16H11) Rabbit Monoclonal AntibodyCell Signaling Technology5174ضابط تحميل لطخة ويسترن؛ يتفاعل مع GAPDH في الإنسان والفأر والجرذ؛ يستخدم بنسبة 1:5,000 بعد التحسين المخبري.
قاعدة بيانات GeneCardsWeizmann Institute of ScienceNAاسترجاع الجينات المرتبطة بالتهاب كبيبات الكلى
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0.0.121التحليل الإحصائي للبيانات التجريبية في المختبر (in vitro)
HRP-conjugated goat anti-rabbit IgGProteintech GroupSA00001-2جسم مضاد ثانوي للأجسام المضادة الأولية من الأرانب
برنامج ImageJNational Institutes of HealthVersion 1.54التحليل الكثافي لطخة ويسترن
مجهر تباين طوري مقلوبOlympusCKX53مراقبة مورفولوجيا الخلايا
حزمة org.Hs.eg.db لـ RBioconductorVersion 3.18.0توصيف الجينات البشرية لتحليل الإثراء
محلول بنسيلين-ستربتومايسينGibco/Thermo Fisher Scientific15140122مكمل مضاد حيوي لزراعة الخلايا
PGE2 Parameter Assay KitR&D Systems, a Bio-Techne brandKGE004Bمقايسة ELISA تنافسية لعدة أنواع لسوائل زراعة الخلايا العلوية؛ نطاق المقايسة 39–2,500 pg/mL؛ كشف لوني عند 450 nm.
قاعدة بيانات PharmGKBPharmacogenomics KnowledgebaseNAاسترجاع الأهداف المرتبطة بالأمراض
قاعدة بيانات PubChemNational Center for Biotechnology InformationNAاسترجاع تراكيب الربيطات (ligands)
غشاء PVDFMillipore/MerckIPVH00010غشاء نقل البروتين للطخة ويسترن
نظام PyMOL للرسومات الجزيئيةSchrödinger, LLCVersion 2.6.2تصوير وضعية الالتحام
برنامج RR Foundation for Statistical ComputingVersion 4.3.2تحليل تقاطع الأهداف والإثراء
خط خلايا ميزانجيوم كبيبي من الجرذ (HBZY-1)Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0117نموذج تحقق من الخلايا الميزانجية في المختبر (in vitro)
RCSB Protein Data BankResearch Collaboratory for Structural BioinformaticsPDB ID: 3LN1استرجاع البنية البلورية لـ PTGS2/COX2
بروتين TGF-β1 البشري المأشوبPeproTech, a Thermo Fisher Scientific brand100-21-10UGTGF-β1 بشري مأشوب مشتق من HEK293؛ تحفيز تليفي بتركيز 10 ng/mL. 
نظام الرحلان الكهربائي SDS-PAGEBio-Rad LaboratoriesMini-PROTEAN Tetraفصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE
قاعدة بيانات STRINGELIXIR/STRING ConsortiumVersion 12.0بناء شبكة التفاعلات بين البروتينات
قاعدة بيانات TCMSPTraditional Chinese Medicine Systems Pharmacology DatabaseNAفحص المركبات المرشحة من Cordyceps sinensis
قاعدة بيانات الأهداف العلاجيةInnovative Drug Research and Bioinformatics GroupNAاسترجاع الأهداف العلاجية
جسم مضاد أولي لـ α-SMAProteintech Group14395-1-APكشف تعبير بروتين α-SMA
β-Sitosterol (نقاء >98%)MedChemExpressHY-N0171ACAS 83-46-5؛ مركب محدد مستخدم لمعالجة الخلايا؛ محلول مخزون بتركيز 10 mM في إيثانول مطلق. 

المراجع

  1. Kidney Disease: Improving Global Outcomes Glomerular Diseases Work G. KDIGO 2021 Clinical Practice Guideline for the Management of Glomerular Diseases. Kidney Int. 2021;100(4S):S1–S276.
  2. Roccatello D. et al. From inflammation to renal fibrosis: A one-way road in autoimmunity? Autoimmun Rev. 2024;23(4):103466.
  3. Reiss AB. et al. Fibrosis in Chronic Kidney Disease: Pathophysiology and Therapeutic Targets. J Clin Med. 2024;13(7).
  4. Kant S, Kronbichler A, Geetha D. Principles of Immunosuppression in the Management of Kidney Disease: Core Curriculum 2022. Am J Kidney Dis. 2022;80(3):393–405.
  5. El Karoui K, Fervenza FC, De Vriese AS. Treatment of IgA Nephropathy: A Rapidly Evolving Field. J Am Soc Nephrol. 2024;35(1):103–16.
  6. Stenvinkel P. et al. Chronic Inflammation in Chronic Kidney Disease Progression: Role of Nrf2. Kidney Int Rep. 2021;6(7):1775–87.
  7. Tanaka S, Portilla D, Okusa MD. Role of perivascular cells in kidney homeostasis, inflammation, repair and fibrosis. Nat Rev Nephrol. 2023;19(11):721–32.
  8. Liu W. et al. Mechanism of Cordyceps sinensis and its Extracts in the Treatment of Diabetic Kidney Disease: A Review. Front Pharmacol. 2022;13:881835.
  9. Yan G. et al. The effects of Ophiocordyceps sinensis combined with ACEI/ARB on diabetic kidney disease: A systematic review and meta-analysis. Phytomedicine. 2023;108:154531.
  10. Li S, Pang W, Wang Y, Zhang Y. Cordyceps sinensis extract protects against acute kidney injury by inhibiting perforin expression in NK cells via the STING/IRF3 pathway. Aging (Albany NY). 2024;16(7):5887–904.
  11. Zhang Y, Li K, Zhang C, Liao H, Li R. Research Progress of Cordyceps sinensis and Its Fermented Mycelium Products on Ameliorating Renal Fibrosis by Reducing Epithelial-to-Mesenchymal Transition. J Inflamm Res. 2023;16:2817–30.
  12. Zhao L. et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 2023;309:116306.
  13. Ru J. et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 2014;6:13.
  14. Bi Y. et al. beta-Sitosterol Suppresses LPS-Induced Cytokine Production in Human Umbilical Vein Endothelial Cells via MAPKs and NF-kappaB Signaling Pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2023;2023:9241090.
  15. Sun Y, Gao L, Hou W, Wu J. beta-Sitosterol Alleviates Inflammatory Response via Inhibiting the Activation of ERK/p38 and NF-kappaB Pathways in LPS-Exposed BV2 Cells. Biomed Res Int. 2020;2020:7532306.
  16. Park YJ. et al. Effects of beta-Sitosterol from Corn Silk on TGF-beta1-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition in Lung Alveolar Epithelial Cells. J Agric Food Chem. 2019;67(35):9789–95.
  17. Li DD. et al. RTEC-intrinsic IL-17-driven inflammatory circuit amplifies antibody-induced glomerulonephritis and is constrained by Regnase-1. JCI Insight. 2021;6(13).
  18. Martin-Carro B. et al. Role of Klotho and AGE/RAGE-Wnt/beta-Catenin Signalling Pathway on the Development of Cardiac and Renal Fibrosis in Diabetes. Int J Mol Sci. 2023;24(6).
  19. Naas S, Schiffer M, Schodel J. Hypoxia and renal fibrosis. Am J Physiol Cell Physiol. 2023;325(4):C999–C1016.
  20. Harris RC, Breyer MD. Physiological regulation of cyclooxygenase-2 in the kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 2001;281(1):F1–11.
  21. Calder PC. Eicosanoids. Essays Biochem. 2020;64(3):423–41.
  22. Waldner C, Heise G, Schror K, Heering P. COX-2 inhibition and prostaglandin receptors in experimental nephritis. Eur J Clin Invest. 2003;33(11):969–75.
  23. Pan Y. et al. Myeloid cyclooxygenase-2/prostaglandin E2/E-type prostanoid receptor 4 promotes transcription factor MafB-dependent inflammatory resolution in acute kidney injury. Kidney Int. 2022;101(1):79–91.
  24. Volzke A, Koch A, Meyer Zu Heringdorf D, Huwiler A, Pfeilschifter J. Sphingosine 1-phosphate (S1P) induces COX-2 expression and PGE2 formation via S1P receptor 2 in renal mesangial cells. Biochim Biophys Acta. 2014;1841(1):11–21.
  25. Sawano H. et al. 15-Deoxy-Delta12,14-prostaglandin J2 inhibits IL-1beta-induced cyclooxygenase-2 expression in mesangial cells. Kidney Int. 2002;61(6):1957–67.
  26. Guo B. et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ligands inhibit TGF-beta 1-induced fibronectin expression in glomerular mesangial cells. Diabetes. 2004;53(1):200–8.
  27. Zou R. et al. PPARgamma agonists inhibit TGF-beta-PKA signaling in glomerulosclerosis. Acta Pharmacol Sin. 2010;31(1):43–50.
  28. Wei J. et al. PP2 Ameliorates Renal Fibrosis by Regulating the NF-kappaB/COX-2 and PPARgamma/UCP2 Pathway in Diabetic Mice. Oxid Med Cell Longev. 2021;2021:7394344.
  29. Yang C, Chen EA, Zhang Y. Protein-Ligand Docking in the Machine-Learning Era. Molecules. 2022;27(14).
  30. Quiroga R, Villarreal MA. Developing Generalizable Scoring Functions for Molecular Docking: Challenges and Perspectives. Curr Med Chem. 2025;32(28):5960–72.
  31. Li J. et al. TGF-beta/Smad signaling in chronic kidney disease: Exploring post-translational regulatory perspectives (Review). Mol Med Rep. 2024;30(2).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

بيتا-سيتوستيرولعلم الصيدلة الشبكيالإرساء الجزيئيتثبيط COX-2المسارات الالتهابيةالتنشيط المحفز للتليفCordyceps sinensisتحليل التفاعل البروتيني-البروتيني
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.