يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التأثيرات الواقية للكلى لعلاج N-Acetylcysteine وMontelukast بعد حقن المادة الظليل في نموذج جرذان للإصابة الكلوية الحادة الناجمة عن المادة الظليل

108 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/73087

⸱

سبتمبر 3, 2026

 ,  , 
1Department of Emergency Medicine, Kırşehir Ahi Evran University Faculty of Medicine, 2Department of Histology and Embryology, Kırşehir Ahi Evran University Faculty of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هذا البروتوكول نموذجاً في الجرذان للإصابة الكلوية الحادة الناجمة عن المادة الملونة، ويقيم إعطاء N-acetylcysteine وmontelukast بعد حقن المادة الملونة، سواء بشكل منفصل أو مجتمعين. وقد ارتبطت أنظمة العلاج بخلل وظيفي كلوي أقل شدة، وانخفاض في الإجهاد التأكسدي والالتهاب والإصابة النسيجية المرضية، على الرغم من أن العلاج المزدوج لم يتفوق باستمرار على العلاج الأحادي.

الملخص

تُعد إصابة الكلى الحادة الناجمة عن الصبغة (CI-AKI) مضاعفة هامة للتعرض للصبغات اليودية، حيث يساهم الإجهاد التأكسدي والعمليات الالتهابية في حدوث تلف كلوي. قامت هذه الدراسة بإنشاء نموذج تجريبي لإصابة الكلى الحادة الناجمة عن الصبغة في الجرذان، وبحثت في آثار العلاج الذي بدأ بعد إعطاء الصبغة باستخدام N-acetylcysteine (NAC)، أو montelukast، أو مزيج منهما. خضعت ذكور جرذان Wistar البالغة لحرمان من الماء، تلاه إعطاء متسلسل وريدي لكل من Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)، وindomethacin، وiohexol. بدأ العلاج بعد ساعة واحدة من اكتمال إعطاء iohexol، أي بعد حوالي 1.5 ساعة من إعطاء L-NAME، واستمر العلاج مرة واحدة يومياً لمدة 3 أيام متتالية. تم تقييم مؤشرات وظائف الكلى، ومعايير الإجهاد التأكسدي، والسيتوكينات الالتهابية، والمؤشرات الحيوية للإصابة الكلوية، وعلم الأمراض النسيجي للكلى. أظهرت مجموعة CI-AKI غير المعالجة خللاً وظيفياً كلوياً واضحاً، وملفاً غير مواتٍ للإجهاد التأكسدي والالتهاب، وتلفاً نسيجياً مرضياً كبيراً. وبالمقارنة مع مجموعة CI-AKI غير المعالجة، أظهرت الحيوانات التي تلقت NAC، أو montelukast، أو النظام العلاجي المشترك، تحسناً عاماً في النتائج البيوكيميائية والنسيجية المرضية. كانت مستويات Glutathione (GSH) هي الأعلى، وكانت متوسطات درجات الإصابة النسيجية المرضية هي الأقل عددياً في مجموعة العلاج المشترك؛ ومع ذلك، لم يتفوق العلاج المشترك باستمرار على العلاج الأحادي في جميع النتائج التي تم تقييمها. يوفر هذا البروتوكول إطاراً ما قبل سريري مضبوطاً لتقييم التدخلات ما بعد التباين في حالات CI-AKI، وتستوجب النتائج مزيداً من الاستقصاء التجريبي لـ NAC وmontelukast دون إثبات الفعالية السريرية أو وجود ميزة محددة للجمع بينهما.

المقدمة

غالبًا ما تُعقّد إصابة الكلى الحادة (AKI) مسار المرضى المنومين في المستشفيات، وتساهم في زيادة معدلات المراضة والوفيات واستهلاك موارد الرعاية الصحية. ونظرًا لأن وسائط التباين اليودية تُستخدم بشكل روتيني في التصوير التشخيصي والإجراءات التداخلية، أصبح تدهور وظائف الكلى بعد التعرض لوسائط التباين مصدر قلق سريري هام. تميز التسميات الحالية بين إصابة الكلى الحادة المرتبطة بالتباين (CA-AKI)، والتي تشمل أي نوبة من إصابة الكلى الحادة تحدث بعد إعطاء وسيط التباين، وبين إصابة الكلى الحادة الناجمة عن التباين (CI-AKI)، والتي تعزى فيها الإصابة الكلوية سببياً إلى عامل التباين. وبناءً على ذلك، يظل مصطلح CI-AKI مستخدمًا على نطاق واسع في النماذج التجريبية المنضبطة، حيث يمكن ربط التعرض للتباين مباشرة بالتلف الكلوي1,2.

يعد المرضى الذين يعانون من مرض الكلى المزمن، أو داء السكري، أو كبار السن، أو فشل القلب، أو غيرها من الأمراض القلبية الوعائية المصاحبة، عرضة بشكل خاص للإصابة بـ CI-AKI. وتتعافى وظائف الكلى لدى العديد من المرضى المصابين؛ ومع ذلك، قد يحدث قصور كلوي مستمر، والحاجة إلى العلاج التعويضي للكلى، وزيادة خطر الوفاة في الحالات الأكثر شدة. كما يرتبط CI-AKI بفترات استشفاء أطول وزيادة في استهلاك موارد الرعاية الصحية. وتؤكد هذه العواقب السلبية على الحاجة المستمرة لتطوير نهج وقائية وعلاجية فعالة للإصابة الكلوية المرتبطة بالصبغة1,3,4,5.

يتضمن تطور إصابة الكلى الحادة الناجمة عن مادة التباين (CI-AKI) عدة عمليات مترابطة، بما في ذلك تغير تروية الكلى، واختلال توازن الأكسجين في النخاع، والإجهاد التأكسدي، والالتهاب، والتسمم الأنبوبي المباشر. يؤدي التعرض لمادة التباين إلى تحويل النغمة الوعائية داخل الكلى نحو تضيق الأوعية مع إضعاف استجابات توسيع الأوعية، مما يؤدي بدوره إلى تقليل تدفق الدم الكلوي. ويعد النخاع الخارجي عرضة للتضرر بشكل خاص لأن توفر الأكسجين في هذه المنطقة محدود بالفعل في الظروف الفسيولوجية. ولذلك، فإن أي انخفاض إضافي في توصيل الأكسجين بعد إعطاء مادة التباين قد يعجل بحدوث إصابة أنبوبية نقص تروية2,6,7.

يصاحب نقص الأكسجين الكلوي الناتج عن التعرض لمواد التباين زيادة في توليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، مما يساهم بشكل كبير في إصابة الكلى. وعندما يتجاوز إنتاج ROS القدرة الذاتية لمضادات الأكسدة، قد يحدث تلف تأكسدي في الدهون الخلوية والبروتينات والحمض النووي DNA، بينما تتعزز في الوقت ذاته إشارات الالتهاب. وفي كل من السياقين التجريبي والسريري، ارتبط إعطاء مواد التباين بزيادة مؤشرات الإجهاد التأكسدي وضعف دفاعات مضادات الأكسدة. وتشمل المسارات الجزيئية المتورطة في هذه الاستجابة تكوين الجذور الحرة المعتمد على إنزيم NADPH oxidase وتنشيط العامل النووي kappa-B (NF-κB)1,6,8,9.

يشير دور الالتهاب إلى أن الإصابة الكلوية الحادة المرتبطة بالصبغة (CI-AKI) لا يمكن تفسيرها من خلال الاضطراب الديناميكي الدموي وحده. كما أشارت الأدلة الحديثة إلى تورط الموت الخلوي الحديدي (ferroptosis)، والإجهاد النيتروزي، والمصائد خارج الخلوية للعدلات في الإصابة الكلوية التي تلي التعرض للصبغة. وقد أدى التعرف على هذه الآليات الإضافية إلى توسيع نطاق الأهداف الجزيئية التي يتم استقصاؤها للوقاية من CI-AKI وعلاجه1.

يُستخدم كرياتينين المصل ومخرجات البول عادةً لتشخيص إصابة الكلى الحادة الناجمة عن مادة التباين (CI-AKI)، ولكن كلاهما قد لا يتغير إلا بعد تطور إصابة الكلى بالفعل. وقد شجع هذا القصور على تقييم مؤشرات مبكرة، بما في ذلك جزيء إصابة الكلى-1 (KIM-1)، الذي يعكس التلف الأنبوبي، وسيستاتين C، المرتبط بتغيرات الترشيح الكبيبي. وتشير الأدلة من الدراسات التجريبية والسريرية إلى أن التغيرات في هذه المؤشرات الحيوية قد تصبح قابلة للكشف خلال المرحلة المبكرة من CI-AKI، وبالتالي تدعم التقييم المبكر لإصابة الكلى9,10,11.

لقد شجعت التطورات في فهم الفسيولوجيا المرضية لإصابة الكلى الحادة الناتجة عن صبغة التباين (CI-AKI) على تقييم التدخلات الدوائية الموجهة نحو المسارات التأكسدية والالتهابية. ويظل الترطيب الكافي هو الإجراء الوقائي الرئيسي، بينما تباينت الفوائد المبلغ عنها للأساليب القائمة على الأدوية عبر الدراسات المختلفة. وبناءً على ذلك، لم يثبت أي علاج دوائي حتى الآن فعالية متسقة كافية لاعتماده كتدخل سريري قياسي لحالات CI-AKI1,4,12,13.

لقد تم تقييم N-acetylcysteine (NAC) على نطاق واسع كنهج دوائي للحد من الإصابة بـ CI-AKI. وترتبط تأثيراته المقترحة في حماية الكلى بتنظيف الأنواع التفاعلية واستعادة احتياطيات الجلوتاثيون. جاء الدعم السريري المبكر من دراسة بارزة على مرضى يعانون من مرض الكلى المزمن، حيث قلل NAC من حدوث خلل وظائف الكلى المرتبط بالصبغة14. ومع ذلك، أدت التجارب السريرية والتحليلات التوليفية اللاحقة للأدلة إلى نتائج غير متسقة، حيث أبلغت بعض الدراسات عن وجود فائدة بينما لم تظهر دراسات أخرى أي تأثير سريري ملموس. وبناءً على ذلك، تظل فعالية NAC في علاج CI-AKI غير مؤكدة12,15,16,17.

يعمل دواء Montelukast على غلق مستقبلات الليكوترين السيستيني-1 بشكل انتقائي، وقد استُخدم لفترة طويلة في علاج الربو والاضطرابات التحسسية. كما تشير الأدلة التجريبية إلى أن هذا العامل يمارس تأثيرات مضادة للالتهابات، ومضادة للأكسدة، ومضادة لموت الخلايا المبرمج. وفي نماذج مختلفة من الإصابات الكلوية، ارتبط إعطاء montelukast بتقليل بيروكسيد الدهون، وتعزيز الدفاعات المضادة للأكسدة الداخلية، وتخفيف حدة التلف النسيجي المرضي، وتخفيف إصابة الكلى18,19,20,21,22.

لا تزال الأدلة التي تفحص تحديداً دواء montelukast في حالات CI-AKI محدودة. وتشير النتائج التجريبية المتاحة إلى أن تأثيراته الكلوية قد تتضمن تعديل إشارات الأكسدة والالتهاب. وقد اقتُرح أن خفض تعبير NADPH oxidase 4 (NOX4)، و p22phox، و NF-κB يعد أحد الآليات التي قد يقلل من خلالها montelukast من الإصابة الكلوية المرتبطة بالصبغة9.

يؤثر كل من NAC والمونتيلوكاست على مسارات متميزة جزئياً ولكنها متداخلة تشارك في الإصابة الكلوية. يدعم NAC بشكل أساسي الدفاعات المضادة للأكسدة، بينما يتميز المونتيلوكاست بخصائص مضادة للالتهابات ومضادة للأكسدة معاً. لذا، فإن الإعطاء المتزامن لهذه العوامل قد يؤثر على مكونات متعددة من الفسيولوجيا المرضية لـ CI-AKI؛ ومع ذلك، لم يتم إثبات ما إذا كان تفاعلهما ينتج فائدة تجميعية أو تآزرية في النماذج التجريبية18,19,20,21,22.

ركزت الدراسات السابقة بشكل أساسي على تقييم التدخلات التي يتم تقديمها قبل التعرض للمادة الظليلية، بينما تظل الأدلة المتعلقة بالعلاجات التي تبدأ بعد التعرض شحيحة. وبوجه خاص، حظيت عملية إعطاء montelukast مع NAC بعد حقن المادة الظليلية بدراسة محدودة في حالات إصابة الكلى الحادة الناجمة عن المادة الظليلية (CI-AKI) التجريبية. وبناءً على ذلك، قامت الدراسة الحالية بتقييم تأثير montelukast وNAC، عند إعطائهما بعد التعرض للمادة الظليلية سواء بشكل منفصل أو مشترك، وذلك فيما يتعلق بوظائف الكلى، ومعايير الإجهاد التأكسدي والدفاعات المضادة للأكسدة، ومؤشرات الإصابة الكلوية والالتهابية، والتغيرات النسيجية المرضية في نموذج جرذان مصاب بـ CI-AKI.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت جميع الإجراءات التجريبية التي شملت الحيوانات وفقاً للإرشادات المقبولة دولياً لرعاية واستخدام حيوانات المختبر، وكانت متوافقة مع معايير إبلاغ أبحاث الحيوانات (Animal Research: Reporting of) داخل الجسم الحي إرشادات التجارب (ARRIVE). تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل لجنة أخلاقيات التجارب المحلية على الحيوان في جامعة Ahi Evran، كيرشهر، تركيا (قرار رقم 2، اجتماع رقم 12، بتاريخ 12 يونيو 2025). وقد بُذلت كافة الجهود لتقليل معاناة الحيوانات والحد من عدد الحيوانات المستخدمة طوال فترة الدراسة. وتدرج تفاصيل جميع الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

تحضير المواد الكيميائية

استُخدم في هذه الدراسة كل من Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)، والإندوميتاسين، والإيوهيكسول، ومونتيلوكاست الصوديوم، وNAC. تم تحضير محلول L-NAME بتركيز 10 mg/mL في محلول ملحي طبيعي معقم بتركيز 0.9% باستخدام 1 g من L-NAME لكل 100 mL. حُضّر المحلول حديثاً في يوم الإعطاء واستُخدم دون تخزينه بعد ذلك اليوم. ولتحفيز نموذج CI-AKI التجريبي، أُعطي L-NAME عن طريق الوريد (IV) بجرعة 10 mg/kg. وبالنسبة لجرذ يزن حوالي 220 g، كانت الكمية المحسوبة حوالي 2.2 mg، وهو ما يعادل حجم إعطاء يبلغ حوالي 0.22 mL. حُضّر الإندوميتاسين في محلول بيكربونات الصوديوم بتركيز 5% بتركيز 10 mg/mL عن طريق إذابة 100 mg في حجم نهائي قدره 10 mL. خضع التحضير للرج بواسطة جهاز vortex حتى أصبح متجانساً ظاهرياً. لم يتم قياس الرقم الهيدروجيني (pH) النهائي لمحلول الإندوميتاسين المحضر أثناء التجربة، وبالتالي لم يتسنَّ تحديده بأثر رجعي. كما لم يتم توثيق إجراء تعقيم أو ترشيح محدد لمحلول الإندوميتاسين المحضر في السجلات التجريبية، وبالتالي تعذر الإبلاغ عنه بأثر رجعي. لم يتم تحديد أو تقييم فترة استقرار رسمية؛ حيث حُضّر المحلول حديثاً واستُخدم في اليوم نفسه. ولتحفيز نموذج CI-AKI التجريبي، أُعطي الإندوميتاسين عن طريق الوريد بجرعة 10 mg/kg. وبالنسبة لجرذ يزن حوالي 220 g، كانت الكمية المحسوبة حوالي 2.2 mg، وهو ما يعادل حجم إعطاء يبلغ حوالي 0.22 mL.

تم إعطاء تركيبة iohexol التجارية، التي تحتوي على 647 mg iohexol/mL وتركيز يود مكافئ قدره 300 mg/mL، دون تخفيف إضافي. لم يتم تسجيل درجة الحرارة الدقيقة لـ iohexol وقت الحقن. ولم يتسنَّ التحقق من قيمة الأسمولالية الخاصة بالتركيبة بشكل موثوق من السجلات التجريبية المتاحة، وبالتالي لم يتم ذكرها. ولتحفيز نموذج CI-AKI التجريبي، تم إعطاء iohexol عن طريق الوريد بجرعة 3 g iodine/kg. وفي جرذ يزن حوالي 220 g، وفرت هذه الجرعة حوالي 0.66 g من اليود، وهو ما يعادل حجم حقن يقارب 2.2 mL.

تَمَّ تحضير معلق مونتيلوكاست الصوديوم في كربوكسي ميثيل السليلوز (CMC) بتركيز 0.5%. وقد حُضِّر المعلق حديثاً في كل يوم إعطاء، ومُزِج باستخدام جهاز الـ vortex مباشرة قبل الجرعات لضمان توزيع متجانس للجسيمات المعلقة. وحُسبت جرعة المونتيلوكاست المطلوبة لكل حيوان بشكل منفصل بناءً على وزن الجسم المسجل عند بدء الدراسة باستخدام الصيغة التالية: الجرعة المطلوبة (mg) = وزن الجسم (kg) × 10 mg/kg. وبالنسبة لحيوان يزن 220 g تقريباً، كانت الجرعة المحسوبة 2.2 mg تقريباً، وأُعطيت عن طريق التغذية القسرية الفموية. كما تم فحص المعلق بصرياً قبل كل عملية إعطاء، وأي تحضير يظهر فيه ترسب تم مزجه مجدداً باستخدام جهاز الـ vortex قبل الاستخدام.

تم إعطاء NAC لمجموعات العلاج من تركيبته التجارية دون تخفيف إضافي بجرعة 100 mg/kg عن طريق الحقن داخل الصفاق. وبالنسبة لكل حيوان، تم حساب الجرعة المطلوبة بشكل فردي بناءً على وزن الجسم المسجل عند بدء الدراسة. وفي حالة حيوان يزن 220 g تقريبًا، كان ذلك يعادل 22 mg تقريبًا من NAC وحجم حقن يبلغ 0.15 mL تقريبًا. وقبل إعطاء الجرعات، تم فحص المحلول بصريًا، واستُخدمت فقط التحضيرات التي كانت شفافة وخالية من الجسيمات المرئية.

خضع كل مستحضر للفحص البصري قبل الإعطاء. وتمما فحص محاليل L-NAME وindomethacin وiohexol وNAC للتأكد من خلوها من تغير اللون والجسيمات المرئية. وقبل الإعطاء مباشرة، تم خلط معلق montelukast باستخدام جهاز vortex وفحصه بصرياً للتأكد من التجانس. ولم يُستخدم أي مستحضر لم يستوفِ معايير القبول هذه. كما تم ارتداء معاطف المختبر والقفازات الواقية وواقيات العين أثناء تحضير وإعطاء جميع المواد الكيميائية. والتزمت جميع الإجراءات بمتطلبات السلامة المختبرية والسلامة البيولوجية المؤسسية.

اختيار الحيوانات، وإيواؤها، والمجموعات التجريبية، والتوزيع العشوائي

تم الحصول على ثلاثين جرذاً من ذكور جرذان ويستار البيضاء البالغة (عمرها 8–12 أسبوعاً؛ وزن الجسم 200–220 g) من مختبر أبحاث الحيوانات التجريبية في جامعة أهي إيفران، قرشهر، تركيا. تم اختيار الذكور للحفاظ على الاتساق المنهجي مع نماذج إصابة الكلى الحادة الناجمة عن التباين في التروية (CI-AKI) التجريبية المنشورة سابقاً، ولتجنب إدخال مرحلة دورة الشبق كمتغير بيولوجي إضافي. ولم يتم تقييم الجنس كمتغير تجريبي في هذه الدراسة. كانت منشأة الحيوانات تحمل رخصة تربية/إنتاج رقم 184، وقد تمت تربية الجرذان والحفاظ عليها هناك في ظل ظروف مختبرية قياسية. عند التسجيل، لم يكن للحيوانات حالة موثقة خالية من مسببات الأمراض المحددة (SPF) أو أي تصنيف صحي ميكروبيولوجي رسمي آخر. تم إيواء كل جرذ على حدة في قفص من البولي كربونات مقاس 40 cm × 25 cm × 20 cm، مع استخدام نشارة الصنوبر المقطعة خشناً كفرشة. وتم الحفاظ على ظروف الغرفة عند 24 °C ± 2 °C ورطوبة نسبية 35% ± 10% بواسطة نظام آلي للتحكم البيئي والتهوية. تم تطبيق جدول إضاءة 12 ساعة ضوء/12 ساعة ظلام، مع الإضاءة من الساعة 07:00 إلى 19:00. لم يتم توفير أي إثراء بيئي مخصص خلال فترة التأقلم التي استمرت 7 أيام أو الفترة التجريبية اللاحقة. كان علف القوارض القياسي المحبب ومياه الصنبور متاحين بحرية (ad libitum)، باستثناء فترة حرمان من الماء محددة بـ 16 h تسبق تحريض CI-AKI. كانت تركيبة العلف تتكون من 24% بروتين خام، و3.94% سيليلوز خام، و5.08% دهون خام، و8.8% رماد خام، و1.44% ليسين، و0.61% ميثيونين، و1.14% كالسيوم، و0.89% فسفور، و0.28% صوديوم. تم تأقلم جميع الحيوانات لمدة 7-days قبل بدء الإجراءات التجريبية. وأجريت ملاحظات يومية خلال فترتي التأقلم والتجربة لتقييم الحالة العامة، واستهلاك الغذاء والماء، والحركة، والوضعية، ومظهر الفراء، وأي علامات ضيق. ولتقليل تحيز الاختيار، تم توزيع الحيوانات على المجموعات التجريبية الخمس باستخدام تسلسل تخصيص عشوائي تم إنتاجه بواسطة الكمبيوتر، مع تخصيص ستة حيوانات لكل مجموعة. تم تحديد حجم العينة من خلال تحليل قوة مسبق (a priori power analysis) باستخدام برنامج G*Power الإصدار 3.1.9.6.

تم تحديد حجم العينة من خلال تحليل القوة المسبق لتحليل التباين أحادي الاتجاه ذو التأثيرات الثابتة الذي شمل خمس مجموعات تجريبية. وبافتراض أن حجم التأثير (f) هو 0.65، ومعدل الخطأ من النوع الأول (α) هو 0.05، وقوة إحصائية بنسبة 80%، فقد تم حساب إجمالي حجم العينة المطلوب ليكون 30 حيواناً، أي ستة حيوانات لكل مجموعة. وقد افترض مسبقاً أن حجم التأثير (f = 0.65) يمثل تأثيراً كلياً كبيراً بين المجموعات في مقارنة المجموعات الخمس. وقد استهدف هذا الحساب تحديد حجم العينة المطلوب للكشف عن مثل هذا التأثير الكلي، ولم يتم تصميمه خصيصاً للكشف عن فروق زوجية أصغر بين مجموعات العلاج النشطة. واعتُبر الحيوان الفردي هو الوحدة التجريبية لجميع التحليلات.

باستثناء الرعاية الروتينية، والمراقبة الصحية اليومية، والإجراءات النهائية، لم تخضع الحيوانات في مجموعة Control لأي تعامل أو تقييد مرتبط بالبروتوكول، أو حرمان من الماء، أو حقن وريدي أو داخل الصفاق، أو تغذية أنبوبية فموية، أو إعطاء مادة حاملة. وتكونت مجموعة CI-AKI من حيوانات تم فيها إنشاء نموذج CI-AKI في اليوم الثامن ولم تتلقَّ أي علاج. وتكونت مجموعة CI-AKI + Montelukast من حيوانات تم فيها إنشاء نموذج CI-AKI وعولجت لاحقاً باستخدام montelukast. وتكونت مجموعة CI-AKI + NAC من حيوانات تم فيها إنشاء نموذج CI-AKI وعولجت لاحقاً باستخدام NAC. أما مجموعة CI-AKI + Montelukast + NAC فقد تكونت من حيوانات تم فيها إنشاء نموذج CI-AKI وعولجت لاحقاً بمزيج من montelukast و NAC. ولم تخضع مجموعة Control ولا مجموعة CI-AKI غير المعالجة لإجراءات وهمية مطابقة للعلاج؛ وتحديداً، لم يتم إجراء أي تعامل وهمي، أو تغذية أنبوبية فموية وهمية، أو حقن علاجية وهمية، أو إعطاء مواد حاملة مطابقة للعلاج في هذه المجموعات. كانت المواد الحاملة المستخدمة لتحضير L-NAME و indomethacin و montelukast هي محلول ملحي طبيعي 0.9%، ومحلول بيكربونات الصوديوم 5%، و 0.5% CMC على التوالي، كما هو موضح في تحضير المواد الكيميائية. تم إعطاء NAC من تركيبته التجارية دون مزيد من التخفيف، ولم يتم تحضير مادة حاملة منفصلة لـ NAC. وفي اليوم الثامن، خضعت جميع الحيوانات باستثناء تلك الموجودة في مجموعة Control لحرمان من الماء لمدة 16 h، تلا ذلك إعطاء متسلسل عن طريق الوريد لكل من L-NAME (10 mg/kg)، و indomethacin (10 mg/kg)، و iohexol (3 g iodine/kg) لتحفيز الإصابة الكلوية الحادة الناجمة عن المادة الملونة. وفي مجموعات العلاج المحددة، تم إعطاء montelukast (10 mg/kg، تغذية أنبوبية فموية) و/أو NAC (100 mg/kg، حقن داخل الصفاق) أولاً بعد ساعة واحدة من إتمام إعطاء iohexol في اليوم الثامن، وهو ما يقابل حوالي 1.5 h بعد إعطاء L-NAME، ثم أُعطيت لاحقاً مرة واحدة يومياً في نفس الوقت في اليومين التاسع والعاشر.

بروتوكول إعطاء الدواء

تم إحداث إصابة الكلى الحادة الناجمة عن الصبغة (CI-AKI) وفقاً لبروتوكول تجريبي منشور يتكون من حرمان من الماء لمدة 16 h، يليه إعطاء متتابع وريدي لكل من L-NAME، والإندوميتاسين (indomethacin)، والإوهكسول (iohexol)23,24,25. تم إعطاء كل من L-NAME والإندوميتاسين بجرعة 10 mg/kg، بينما تم إعطاء الإوهكسول بجرعة 3 g iodine/kg. وكانت جرعات العلاج 10 mg/kg لمونتيلوكاست الصوديوم (montelukast sodium) و 100 mg/kg لـ NAC. وقد استند اختيار جرعات تحريض النموذج والعلاج إلى دراسات تجريبية منشورة سابقاً22,26,27. ولم يتم إجراء أي دراسة تمهيدية لتحديد نطاق الجرعة أو تحسينها. كما تم اختيار جرعات NAC والمونتيلوكاست بشكل مستقل بناءً على دراسات تجريبية منشورة سابقاً لكل عامل على حدة، ولم تُشتق من دراسة تحديد جرعة خاصة بالتركيبات المشتركة. ولم يكن الهدف من الجرعات المختارة تمثيل تعرضات متساوية من الناحية الفارماكولوجية، ولم يتم إجراء تحليل للاستجابة للجرعة أو تحليل رسمي للتفاعلات الدوائية. كما لم يتم استخدام أي عتبة عددية أو مخبرية محددة مسبقاً لتعريف نجاح تحريض النموذج على مستوى الحيوان الفردي. وعند نقطة نهاية الدراسة، تم تأكيد النجاح في إحداث إصابة كلوية من خلال التغيرات النسيجية المرضية المميزة الملاحظة في مجموعة CI-AKI غير المعالجة مقارنة بمجموعة الضبط (Control). وفي اليوم 8، خضعت جميع الحيوانات باستثناء تلك الموجودة في مجموعة الضبط لفترة واحدة من الحرمان من الماء لمدة 16 h مباشرة قبل تحريض إصابة الكلى الحادة الناجمة عن الصبغة. ولم يتكرر الحرمان من الماء خلال الفترة التجريبية المتبقية. وظل العلف المكبب القياسي متاحاً حسب الرغبة (ad libitum) طوال فترة الحرمان من الماء. وعند الانتهاء من فترة الحرمان من الماء الوحيدة التي استمرت 16 h، تمت استعادة الوصول إلى مياه الصنبور في آن واحد وحسب الرغبة في جميع المجموعات التجريبية المحرومة من الماء، وذلك قبل إعطاء أول عامل محرض للنموذج، وهو L-NAME، واستمر ذلك لما تبقى من الفترة التجريبية. وكانت توقيتات وظروف استعادة المياه متطابقة في جميع المجموعات المحرومة من الماء. كما لم يتم تقييد كمية المياه المتناولة بعد استعادتها بحجم محدد مسبقاً ولم يتم قياسها كمياً. ولم يتم قياس أوزان الجسم المزدوجة مباشرة قبل وبعد فترة الحرمان من الماء لمدة 16 h؛ وبالتالي، تعذر حساب النسبة المئوية لفقدان وزن الجسم المرتبط بالجفاف. كما لم يتم مراقبة إخراج البول كمياً. وبعد استعادة الوصول إلى الماء، بدأ تحريض CI-AKI. وتم إجراء جميع عمليات الإعطاء الوريدي المتتابعة لـ L-NAME والإندوميتاسين والإوهكسول عبر الوريد الجانبي للذيل باستخدام إبرة 26 G متصلة بمحقنة معقمة سعة 5 mL. وقبل الإعطاء الوريدي، تم تدفئة الذيل في الماء لعدة دقائق لتسهيل رؤية وتوسيع الأوردة الجانبية للذيل. وبعد كل عملية إعطاء وريدي، تم غسل الوريد بـ 0.5 mL من المحلول الملحي العادي المعقم بتركيز 0.9%، بالإضافة إلى حجم الإعطاء المحسوب للعامل المحرض للنموذج المعني. وتمت مراقبة موقع الحقن بصرياً طوال فترة الإعطاء والغسل للتأكد من عدم وجود تورم أو تسرب أو دليل على التسرب خارج الوريد. تم إعطاء L-NAME (10 mg/kg) أولاً. وبعد خمس عشرة دقيقة من إعطاء L-NAME، تم إعطاء الإندوميتاسين (10 mg/kg) وريدياً عبر الوريد الجانبي للذيل نفسه. وبعد خمس عشرة دقيقة من إعطاء الإندوميتاسين، تم إعطاء الإوهكسول وريدياً عبر الوريد الجانبي للذيل نفسه بجرعة 3 g iodine/kg. وبالنسبة لكل حيوان، تم حساب جرعة الإوهكسول وحجم الحقن المقابل بشكل فردي بناءً على وزن الجسم المسجل عند بدء الدراسة وتركيز اليود التجاري البالغ 300 mg iodine/mL. وناظر ذلك حجم إعطاء قدره 10 mL/kg، وبالتالي، حوالي 2.0–2.2 mL للجرذان التي تزن 200–220 g. ولم يتم تحديد حد أقصى مسموح به للحجم الوريدي في البروتوكول؛ وكان أكبر حجم إعطاء وريدي لعامل واحد استُخدم في هذه الدراسة هو الإوهكسول بـ 10 mL/kg. وتم إعطاء الإوهكسول ببطء على مدار 1–2 min تقريباً. وتم التحقق من نجاح الإعطاء الوريدي من خلال عدم وجود تورم مرئي أو تسرب أو تسرب خارج الوريد في موقع الحقن. ولم يلاحظ أي تسرب جزئي خارج الوريد، ولم تتطلب أي حقنة إعادة محاولة أو تكرار الجرعة بسبب الاشتباه في التسرب خارج الوريد. وبعد ساعة من إتمام إعطاء الإوهكسول، أُعطيت العلاجات المحددة لأول مرة لمجموعات العلاج. ونظراً لأن إعطاء الإوهكسول بدأ بعد 30 min من إعطاء L-NAME واكتمل في غضون 1–2 min تقريباً، فإن بدء العلاج حدث بعد حوالي 91–92 min (حوالي 1.5 h) من إعطاء L-NAME. تم إعطاء مونتيلوكاست الصوديوم (10 mg/kg) عن طريق التغذية القسرية الفموية (oral gavage)، بينما تم إعطاء NAC (100 mg/kg) عن طريق الحقن داخل الصفاق (intraperitoneally).

أُجري التغذية القسرية عن طريق الفم (Oral gavage) باستخدام قُنبلة تغذية من الفولاذ المقاوم للصدأ بقياس 22 G. تم الحفاظ على كل حيوان في وضع عمودي، ودُفعت قُنبلة التغذية برفق عبر المريء وصولاً إلى المعدة. وفي حال مواجهة مقاومة مفرطة، كانت القُنبلة تُسحب ثم يُعاد وضعها قبل الإعطاء. وتمت مراقبة الحيوان للتأكد من عدم حدوث ارتجاع أثناء التغذية القسرية وبعدها مباشرة. لم يُلاحظ أي ارتجاع أو أي دليل آخر على عدم اكتمال الجرعة الفموية أثناء أو بعد التغذية القسرية في أي من الحيوانات، ولم يُستبعد أي حيوان بناءً على الاشتباه في فشل الإعطاء عن طريق الفم. أما الحقن داخل الصفاق (Intraperitoneal injections)، فقد أُعطيت في الربع السفلي الأيمن من البطن، حيث أُدخلت الإبرة بزاوية تتراوح تقريباً بين 30°–45°، وأُجري عملية شفط قبل الإعطاء للتأكد من عدم الدخول غير المقصود في وعاء دموي. كما تمت مراقبة موقع الحقن بصرياً أثناء الإعطاء وبعده مباشرة للتأكد من عدم وجود تسرب أو نزيف أو أي مضاعفات مرئية أخرى. أُعطيت العلاجات المحددة مرة واحدة يومياً في الوقت نفسه في الأيام 8 و9 و10. وبناءً على ذلك، تلقت الحيوانات في مجموعة CI-AKI + Montelukast عقار montelukast مرة واحدة يومياً لمدة ثلاثة أيام متتالية، وتلقت الحيوانات في مجموعة CI-AKI + NAC عقار NAC مرة واحدة يومياً لمدة ثلاثة أيام متتالية، بينما تلقت الحيوانات في مجموعة CI-AKI + Montelukast + NAC كلاً من montelukast وNAC مرة واحدة يومياً وفقاً لجدول العلاج نفسه لمدة 3 أيام. وقد قام الباحث نفسه بتنفيذ جميع عمليات تحفيز النموذج وإعطاء العلاجات. قِيس وزن الجسم مرة واحدة لكل حيوان عند بدء الدراسة ولم يُعاد قياسه خلال الفترة التجريبية. وبالنسبة لكل حيوان، حُسبت الجرعة وحجم الإعطاء المقابل لجميع عوامل تحفيز النموذج وعلاجات الدراسة بشكل فردي باستخدام وزن الجسم المسجل عند بدء الدراسة. ونُفذت جميع إجراءات الحقن الوريدي، والحقن داخل الصفاق، والتغذية القسرية عن طريق الفم باستخدام نفس التقنية الموحدة لتقليل التباين المرتبط بعملية الإعطاء.

إجراء القتل الرحيم، والنهايات الرحيمة، وجمع العينات

تمت مراقبة الحيوانات مرة واحدة يومياً طوال فترة التجربة لرصد التغيرات في الحالة العامة، واستهلاك الغذاء والماء، والقدرة على الحركة، والوضعية الجسدية، ومظهر الفراء، وأي علامات تدل على الضيق. وشملت نقاط النهاية الإنسانية المحددة مسبقاً الخمول الشديد، وعدم القدرة على الوصول إلى الغذاء أو الماء المتاح أو استهلاكهما، والوضعية الجسدية غير الطبيعية، وانخفاض القدرة على الحركة، وانتصاب الشعر المستمر، وأي مظاهر واضحة أخرى للضيق. وكان من المقرر إخضاع الحيوانات التي تستوفي أي من هذه المعايير للقتل الرحيم الفوري؛ ومع ذلك، لم تستوفِ أي من الحيوانات معايير نقطة النهاية الإنسانية خلال الدراسة. وفي اليوم 11، وبعد مرور 24 h من العلاج النهائي، تم تحفيز التخدير العميق عن طريق الحقن داخل الصفاق للكيتامين (80 mg/kg) مع الزيلازين (10 mg/kg). واستُخدم غياب استجابة سحب الطرف للتحقق من الوصول إلى مستوى تخدير كافٍ. وبمجرد تأكيد عمق التخدير الكافي، تم سحب ما يقرب من 3–5 mL من الدم من كل حيوان عن طريق البزل داخل القلب. ثم اكتملت عملية القتل الرحيم عن طريق استنزاف الدم بينما كان الحيوان لا يزال تحت التخدير العميق. واستُخدم غياب كل من النشاط القلبي والتنفس التلقائي لتأكيد الوفاة.

وُضعت عينات الدم التي جُمعت لقياسات الكيمياء الحيوية للمصل في أنابيب خالية من مضادات التخثر وتُرِكت حتى يكتمل التجلط. ثم خضعت الأنابيب للطرد المركزي عند 3,000 × g لمدة 10–15 دقيقة عند 4 °C، وبعد ذلك تم فصل جزء المصل وتخزينه عند −80 °C حتى موعد التحليل. أما العينات المخصصة لقياس الجلوتاثيون فقد جُمعت بشكل منفصل في أنابيب تحتوي على حمض إيثيلين ثنائي أمين رباعي الخليك (EDTA). ونظراً لأن هذه العينات كانت تحتوي على مضاد للتخثر، فقد تمت معالجتها دون مرحلة التجلط وفقاً لإجراء مقايسة الجلوتاثيون المقابل. واعتُبر فصل المصل مقبولاً عندما كان المصل المسترجع صافياً ولا يظهر عليه أي دليل مرئي على حدوث تحلل دموي.

بمجرد التأكد من الوفاة، أُجري شق جراحي وسطي في البطن واستُؤصلت الكليتان بعناية من كل حيوان. ثم أزيلت الأنسجة الدهنية والضامة المحيطة بالعينات. خُصصت الكلية اليمنى حصرياً للفحص الهيستوباثولوجي، بينما خُصصت الكلية اليسرى للتحليل البيوكيميائي. وحُللت الأنسجة المختلطة من الكلية اليسرى دون تشريح منفصل للقشرة الكلوية والنخاع. تم التعامل مع الكليتين بشكل مستقل، وظلت عينات الحيوانات المختلفة منفصلة طوال عملية المعالجة دون تجميعها. وُضعت الكلية اليمنى بأكملها في فورمالدهيد منظم متعادل بتركيز 10% وعولجت لغرض التقييم الهيستوباثولوجي. وأُعدت مقاطع تشمل القشرة الكلوية والنخاع الخارجي وفُحصت وفقاً للإجراءات الموضحة في بروتوكول المعالجة والتقييم الهيستوباثولوجي. وُصمت كل كلية يسرى بشكل فردي وحُفظت في درجة حرارة -80 °C حتى مرحلة التجانس والاختبار البيوكيميائي. وبعد الاستئصال، تم التحقق من السلامة الظاهرية للأنسجة، والاحتفاظ بكمية كافية منها لإجراء التقييمات الهيستوباثولوجية والبيوكيميائية المقررة.

لم يكن من الممكن تعمية الباحث المسؤول عن استحثاث النموذج وإعطاء العلاج لأن المجموعات التجريبية خضعت لإجراءات مختلفة. ومع ذلك، تم إخفاء هويات المجموعات عن الباحثين الذين أجروا التحليلات الكيميائية الحيوية والإحصائية، وعن اختصاصي الأمراض الذي أجرى التقييمات النسيجية المرضية. تم الاحتفاظ بجميع الحيوانات المدرجة في الدراسة وإدراجها في التحليلات اللاحقة. تم التعامل مع العينات البيولوجية، وأنسجة الحيوانات، والمثبتات القائمة على الفورمالدهيد، ومواد النفايات الكيميائية الأخرى باستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة. وتم التخلص من جميع النفايات البيولوجية والكيميائية وفقاً لمتطلبات السلامة البيولوجية المؤسسية وإدارة النفايات الخطرة.

التحليلات الكيميائية الحيوية

أُجريت القياسات الكيميائية الحيوية باستخدام المصل، والدم المانع للتجلط بـ EDTA، ومتجانسات أنسجة الكلية اليسرى التي جُمِعت من كل حيوان. وتُعرض الإجراءات أدناه وفقاً للمصفوفة البيولوجية المستخدمة لكل معامل. تم تحليل المصل لتقدير اليوريا، ونيتروجين يوريا الدم (BUN)، والكرياتينين، وسوبر أكسيد ديسميوتيز (SOD)، والمالونديالدهيد (MDA). وعملت اليوريا وBUN والكرياتينين كمؤشرات لوظائف الكلى، بينما تم تقييم نشاط SOD وتركيز MDA كمعاملات للإجهاد التأكسدي. تم الحصول على قيم يوريا المصل وBUN باستخدام مقايسة اليوريز-جلوتامات ديهيدروجيناز الإنزيمية ذاتها. وفي هذه الطريقة، تم تحليل اليوريا مائياً بواسطة اليوريز لإنتاج الأمونيا، والتي تفاعلت لاحقاً مع 2-oxoglutarate ونيكوتيناميد أدنين ثنائي النوكليوتيد المختزل (NADH) في وجود جلوتامات ديهيدروجيناز. وكانت الطريقة التحليلية المستخدمة هي مقايسة حركية إنزيمية لليوريز-جلوتامات ديهيدروجيناز. وقيس انخفاض الامتصاصية الناتج عن استهلاك NADH حركياً باستخدام مطياف ضوئي. وقيس تركيز كرياتينين المصل لونياً باستخدام محلل كيميائي حيوي آلي. كما قيس نشاط SOD في المصل لونياً باستخدام عدة مقايسة متوفرة تجارياً على ذات المحلل الكيميائي الحيوي الآلي. واعتمدت مقايسة SOD على توليد جذور السوبر أكسيد بواسطة نظام الزانثين-زانثين أوكسيديز وتفاعلها مع 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride لتكوين منتج فورمازان ملون. وقيست الامتصاصية النهائية عند 505 nm، وعُبِّر عن نشاط SOD بـ U/mL. وحدد تركيز MDA في المصل لونياً باستخدام تفاعل حمض الثيوباربيتوريك. وخُلطت عينات المصل مع حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك البارد لترسيب البروتينات، وفُصل الراسب الناتج بواسطة الطرد المركزي. وأُجريت خطوة الطرد المركزي هذه عند 7,500 × g لمدة 5 min عند 4 °C. ثم فاعل السائل العلوي مع حمض الثيوباربيتوريك عند 90 °C لمدة 60 min، ثم بُرِّد وقيس عند 532 nm. وحُسبت تركيزات MDA من منحنى المعايرة المقابل وعُبِّر عنها بـ nmol/mL. أُجري تحليل الجلوتاثيون (GSH) باستخدام الدم المانع للتجلط بـ EDTA. ورُسبت البروتينات باستخدام حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك، وحُلِّلت العينات الناتجة المزيلة من البروتين لونياً بطريقة إلمان المعدلة. ومُزجت العينات مع 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) في محلول Tris المنظم بتركيز 500 mM عند pH 8.2. وأدى تفاعل مجموعات الثيول في GSH مع DTNB إلى توليد منتج ملون، وسُجلت الامتصاصية عند 412 nm. أما نشاط الكاتاليز (CAT) فقد حُدد باستخدام إجراء لوني من خطوتين. حيث حُضنت العينات أولاً مع كمية معروفة من بيروكسيد الهيدروجين، الذي حوله الكاتاليز إلى ماء وأكسجين جزيئي. وبعد إنهاء التفاعل الإنزيمي، قيس بيروكسيد الهيدروجين المتبقي باستخدام كاشف لوني. وسُجلت الامتصاصية عند 405 nm، وأُبلغ عن نشاط CAT بـ U/mL. وبالنسبة لقياسات أنسجة الكلى، استُخدمت الكلية اليسرى من كل حيوان كنسيج مختلط دون فصل القشرة عن النخاع. وكما ورد في الإجراء، فقد احتُفظت الكلية اليمنى حصرياً للتقييم النسيجي المرضي. وعولجت العينات التابعة لكل حيوان بشكل مستقل ولم تُجمع في أي مرحلة. وتم تجنيس كل عينة من الكلية اليسرى على الثلج في محلول فوسفات منظم بتركيز 50 mM عند pH 7.4 باستخدام نسبة نسيج إلى محلول منظم تبلغ 1:10 (w/v). وأُنتج متجانس نسيج كلوي واحد خاص بكل جرذ. واستُخدمت حصص منفصلة من هذا المتجانس لقياسات الأنسجة الكلوية المختلفة، لضمان اشتقاق جميع المعاملات من ذات الحيوان الفردي. ثم طردت متجانسات الأنسجة الكلوية الناتجة مركزياً عند 14,000 × g لمدة 10 min عند 4 °C. وعقب الطرد المركزي، جُمع السائل العلوي الناتج من كل حيوان على حدة وقُسم إلى حصص للتحليلات المخطط لها لأنسجة الكلى. وقِيست تركيزات عامل نخر الورم ألفا (TNF-α)، وإنترلوكين-1 بيتا (IL-1β)، وإنترلوكين-6 (IL-6)، وسيستاتين C، وKIM-1 في السوائل العلوية لأنسجة الكلى باستخدام عدات مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) الخاصة بالجرذان. وأُجريت المقايسات وفقاً لبروتوكولات الشركة المصنعة. وكانت ظروف التحضين متطابقة لمقايسات ELISA الخاصة بـ TNF-α وIL-1β وIL-6 وسيسيستاتين C وKIM-1. وفي كل مقايسة، حُضنت العينات وكواشف ELISA لمدة 1 h عند 37 °C؛ وبعد خمس دورات غسيل، أُضيفت محاليل الركيزة A وB وحُضنت لمدة 10 min عند 37 °C. وباختصار، أضيفت المعايير والسوائل العلوية لأنسجة الكلى إلى الآبار المطلية مسبقاً بالأجسام المضادة، يليه الجسم المضاد الكاشف المبيوتن والمقترن بالستريبتاديفين-بيروكسيداز الفجل الحذأ. وبعد خطوات التحضين المحددة، أزيلت المكونات غير المرتبطة باستخدام غسالة ألواح دقيقة آلية. ثم أُضيف محلول الركيزة، وأنهي تفاعل اللون باستخدام محلول إيقاف حمضي. وقِيست الامتصاصية عند 450 nm باستخدام قارئ ألواح دقيقة، وحُسبت تركيزات المادة المحللة من منحنيات المعايرة المقابلة. وأُجريت قياسات ELISA لأنسجة الكلى في مكررات ثنائية. وبالنسبة لكل مادة محللة، حُسب متوسط البئرَيْن المكررَيْن تقنياً للحصول على قيمة واحدة على مستوى الحيوان. ولم تُعتبر الآبار المكررة تقنياً والحصص المنفصلة التي تم الحصول عليها من نفس المتجانس الخاص بالحيوان ملاحظات مستقلة. وأُجريت جميع القياسات الكيميائية الحيوية تحت ظروف قياسية خاصة بكل مقايسة. وعولجت عينات المصل، والدم المانع للتجلط بـ EDTA، وعينات أنسجة الكلى بشكل منفصل وفقاً لمتطلبات الطرق التحليلية المقابلة. وكان الباحثون الذين أجروا التحليلات الكيميائية الحيوية معزولين عن معرفة توزيع المجموعات. واعتُبِر الحيوان الفردي، وليس كل عينة مصل أو عينة دم أو عينة كلية أو حصة متجانس أو بئر مكرر تقني، هو الوحدة التجريبية. وبناءً على ذلك، أُدرجت ست ملاحظات مستقلة على مستوى الحيوان في التحليل الإحصائي لكل مجموعة تجريبية.

المعالجة والتقييم النسيجي المرضي

تم تحضير عينات الكلية اليمنى للتقييم المجهري عن طريق المعالجة النسيجية الروتينية. غُمرت الكلية اليمنى كاملة من كل حيوان في فورمالدهيد منظم متعادل بتركيز 10% لمدة 72 h في درجة حرارة الغرفة. وبعد التثبيت، أُجري تجفيف للأنسجة بالتسلسل في إيثانول بتركيزات 50%، و70%، و80%، و96%، و100%، مع تطبيق كل تركيز لمدة 1 h. ثم عُرّضت العينات لحمامين من الزايلين لمدة 30 min لكل حمام قبل الطمر في البارافين. وباستخدام الميكروتوم الدوار، تم الحصول من كتل البارافين على مقاطع بسمك 5 µm تشمل كلاً من القشرة الكلوية والنخاع الخارجي.

بالنسبة لصبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين (HE)، تم إزالة البارافين من المقاطع وإعادة ترطيبها، ثم عُرِّضت للهيماتوكسيلين لمدة 5 min، وغُسلت تحت مياه الصنبور الجارية لمدة 5 min إضافية. استُخدم الكحول الحمضي للتمايز، وبعد ذلك تم تلوين المقاطع باللون الأزرق في ماء أمونياكي لمدة 1 min والصبغ المقابل بالإيوزين لمدة 2 min. ثم جُففت المقاطع المصبوغة لاحقاً في تركيزات تصاعدية من الكحول، ونُقيت باستخدام xylene، وثُبتت بشكل دائم تحت شرائح تغطية.

كذلك تم إزالة البارافين وإعادة ترطيب المقاطع المخصصة لصبغة ماسون الثلاثية (Masson’s trichrome). أُجريت المعالجة بالمثبت (mordant) لمدة 60 min عند 56 °C، يلي ذلك الشطف تحت مياه الصنبور الجارية لمدة 10 min. ثم عولجت المقاطع بالتتابع باستخدام هيماتوكسيلين الحديد لويجرت (Weigert’s iron hematoxylin) لمدة 10 min، ومحلول بيبريش سكارليت-فوشين الحمضية (Biebrich scarlet–acid fuchsin) لمدة 15 min، ومحلول حمض الفوسفوتنجستيك لمدة 10 min، ومحلول أنيلين الأزرق لمدة 10 min. وبعد الغمر في حمض الأسيتيك بتركيز 1% لمدة 5 min، تم تجفيف المقاطع، ثم تصفيتها في الزايلين، وتغطيتها بشرائح التغطية.

قبل التقييم المجهري، تم التحقق بشكل منفصل من كفاءة التصبيغ لكل طريقة. اعتُبرت المقاطع المصبوغة بـ HE مناسبة عندما كانت تفاصيل النواة والتباين السيتوبلازمي واضحة ومميزة، بينما قُبلت المقاطع المصبوغة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (Masson’s trichrome) عندما أمكن تصور تراكيب النسيج الضام بوضوح. بالنسبة لكل حيوان، تم فحص ثلاثة مقاطع مصبوغة بـ HE وثلاثة مقاطع مصبوغة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان. كما تم تقييم خمسة حقول مجهرية مختارة عشوائياً في كل مقطع باستخدام عدسة شيئية 40×. وبناءً على ذلك، تم فحص 15 حقلاً مجهرياً لكل طريقة تصبيغ لكل حيوان. أُجريت جميع الفحوصات المجهرية باستخدام نفس العدسة الشيئية وظروف تقييم موحدة عبر جميع الحيوانات والمجموعات التجريبية. قُيمت المقاطع المصبوغة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان نوعياً من حيث توزيع وترسيب الكولاجين الخلالي، وتراكم المادة الخلالية خارج الخلية، والبنية الأنبوبية الخلالية. ولم تُستخدم هذه المقاطع لإنشاء درجات الإصابة النسيجية المرضية شبه الكمية من 0 إلى 3. تم التقاط صور مجهرية ممثلة للمقاطع المصبوغة بـ HE وصبغة ماسون ثلاثية الألوان باستخدام عدسة شيئية 40×، وأُدرج شريط مقياس طول 100 µm في كل صورة ممثلة. حُصل على هذه الصور المجهرية لأغراض توضيحية ولم تُعامل كملاحظات مستقلة في التقييم النسيجي المرضي أو التحليلات الإحصائية. أجريت جميع التقييمات النسيجية المرضية بواسطة طبيب مسالك بولية خبير ظل جاهلاً لهويات المجموعات التجريبية. وكان الهدف من استخدام فاحص واحد مُعمى هو الحد من انحياز التقييم والتباين الناتج عن الاختلافات بين المراقبين. تم تقييم النخر الأنبوبي، وتوسع الأنابيب، والتنكس الخلوي، والاحتقان الوعائي بشكل شبه كمي في المقاطع الكلوية المصبوغة بـ HE وفقاً لنظام مقتبس من نماذج إصابة كلوية منشورة سابقاً28,29. وبالنسبة لكل معيار، تراوحت الدرجات من 0 إلى 3، وهو ما يقابل غياب الضرر النسيجي المرضي، أو وجود ضرر طفيف، أو متوسط، أو شديد، على التوالي. ولكل حيوان، اعتُبرت النتائج المستخلصة من الحقول المجهرية الخمسة المفحوصة في كل مقطع من المقاطع الثلاثة المصبوغة بـ HE، أي ما مجموعه 15 حقلاً، بشكل جماعي لتعيين درجة واحدة من 0 إلى 3 لكل معيار نسيجي مرضي. وبذلك، ساهم كل حيوان بدرجة واحدة للنخر الأنبوبي، وتوسع الأنابيب، والتنكس الخلوي، والاحتقان الوعائي. عُوملت المقاطع النسيجية والحقول المجهرية كعينات فرعية داخل الحيوان ولم تُعتبر ملاحظات مستقلة. وضمن كل مقطع، اختيرت الحقول المجهرية عشوائياً من مناطق قشرية نخاعية خارجية متماثلة لتوحيد أخذ العينات التشريحية عبر الحيوانات والمجموعات التجريبية. اعتُبر الحيوان الفردي، وليس كل كلية أو مقطع نسيجي أو حقل مجهري، هو الوحدة التجريبية. وبناءً على ذلك، تم تضمين ست ملاحظات مستقلة على مستوى الحيوان في التحليل الإحصائي لكل مجموعة تجريبية. وتمثل القيم المعروضة في Table 3 متوسطات المجموعات المحسوبة من درجات كل حيوان فردي للحيوانات الستة في كل مجموعة تجريبية.

التحليل الإحصائي

أُجريت التحليلات الإحصائية باستخدام برمجيات التحليل الإحصائي. واعتُبر الحيوان الفردي هو الوحدة التجريبية لجميع التحليلات الإحصائية. واشتملت كل مجموعة تجريبية على ستة حيوانات مستقلة (n = 6 لكل مجموعة). ولم تُعامل المكررات التقنية، وآبار المقايسة، والمقاطع النسيجية، والمجالات المجهرية كملاحظات مستقلة، ولم تُستخدم لزيادة حجم العينة الإحصائية. عُرضت المتغيرات المستمرة كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD). وقُيم التوزيع الطبيعي بشكل منفصل داخل كل مجموعة تجريبية باستخدام اختبار Shapiro–Wilk، كما قُيم تجانس التباينات باستخدام اختبار Levene. ونظراً للتصميم التجريبي المتوازن تماماً مع أحجام عينات متساوية عبر المجموعات، استُخدم تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) لمقارنة المجموعات. وأُجريت المقارنات الزوجية باستخدام اختبار Duncan للمقارنات المتعددة البعدية. وقُيمت القيم المتطرفة المحتملة من خلال الفحص الرسومي للمخططات الصندوقية وفحص الملاحظات الفردية. ولم تُعتبر أي ملاحظة ممثلة لخطأ في القياس أو نتيجة تجريبية غير صالحة، ولم تُستبعد أي نقطة بيانات لأسباب إحصائية. واعتُبرت القيمة الاحتمالية p-value < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

مؤشرات وظائف الكلى في المصل (اليوريا، ونيتروجين يوريا الدم، والكرياتينين)

تم تلخيص التصميم التجريبي، وتوزيع المجموعات الحيوانية، وجدول العلاج، والجدول الزمني لجمع العينات في الدراسة الحالية في  الشكل 1. لُوحظت فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات فيما يتعلق بمستويات يوريا المصل، ونيتروجين يوريا الدم (BUN)، والكرياتينين (p = 0.003، و p = 0.003، و p = 0.002، على التوالي). فقد كان متوسط مستوى يوريا الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

قيمت هذه الدراسة التجريبية حول إصابة الكلى الحادة الناجمة عن المادة الظليلة (CI-AKI) العلاج بعد التعرض للمادة الظليلة باستخدام مونتيلوكاست، أو N-acetylcysteine (NAC)، أو مزيجهما، وذلك من خلال تقييم وظائف الكلى، ومعايير الإجهاد التأكسدي، والاستجابات الالتهابية، والمؤشرات الحيوية لإصابة الكلى، والنتائج الهيستوباثولوجية. أدى التعرض للمادة الظليلة إلى زيادات ملحوظة في مستويات اليوريا في المصل، والنيتروجين في الدم (BUN)، والكرياتينين، وصاحب ذلك تغيرات سلبية في معايير الإجهاد التأكسدي والمؤشرات الحيوية الالتهابية. كما وفر ارتف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود أي تضارب في المصالح. وخلال إعداد هذه المخطوطة، استُخدمت الأدوات المساعدة بالذكاء الاصطناعي حصرياً لتحرير اللغة وتصحيح القواعد النحوية. ولم تُستخدم أي أدوات ذكاء اصطناعي في توليد البيانات أو تحليلها أو تفسيرها، ولا في إنشاء أي أشكال أو جداول أو عناصر رسومية. ويتحمل المؤلفون المسؤولية الكاملة عن محتوى المخطوطة.

مساهمات المؤلفين:

ساهم كل من YS وCS وOK في تصور الدراسة وتصميمها. وقام YS بتنفيذ الإجراءات التجريبية وجمع البيانات. وأجرى OK الفحوصات النسيجية المرضية. كما قام YS وCS بإجراء التحليلات الإحصائية وتفسير البيانات. وصاغ YS مسودة المخطوطة. وقد راجع جميع المؤلفين المخطوطة مراجعة نقدية ووافقوا على النسخة النهائية.

شكر وتقدير

لقد حظيت هذه الدراسة بدعم من وحدة تنسيق مشاريع البحث العلمي في جامعة Kırşehir Ahi Evran (مشروع رقم: TIP.A3.26.006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
 غسالة الشرائط الآليةBio-Tek Instruments، الولايات المتحدة الأمريكيةELx50الغسل الآلي لأطباق مقايسة الممتز المنسي (ELISA).
 قارئ الأطباق الدقيقةBio-Tek Instruments، الولايات المتحدة الأمريكيةELx800قياسات الامتصاصية في مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
RRID:SCR_028651
فورمالين منظم متعادل بنسبة 10%Merckلم يتم التسجيلتثبيت الأنسجة للفحص الهيستوباثولوجي (علم أمراض الأنسجة).
جهاز طرد مركزي مكتبينüفيديو (ve)NF048تحضير العينات والطرد المركزي.
كربوكسي ميثيل السليلوز (CMC)Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكيةC5678الوسط المستخدم لتحضير معلق المونتلوكاست.
طقم CAT العالميOtto Scientificأوتو 3051القياس اللوني لنشاط إنزيم الكاتالاز (CAT) في المصل باستخدام محلل الكيمياء Mindray BS-400.
المجانس الرقميDaihan ScientificHG-15Dتجانس الأنسجة.
إيوسين Y (مصفر)Merck1.15935.0025صبغ الهيماتوكسيلين والإيوسين.
محلول هيماتوكسيلين هاريسمختبر السلامة البيولوجية (BSLAB)BS-002صبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين (HE).
إندوميتاسينSigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكيةI7378تُستخدم لتحريض الإصابة بالكلى الحادة الناجمة عن تباين الصبغة (CI-AKI).
أيوكسيول (Omnipaque 300)GE HealthCareلم يتم التسجيلعامل تباين مستخدم لتحفيز الإصابة الكلوية الحادة الناجمة عن عوامل التباين.
هيدروكلوريد الكيتامين (Ketalar)Pfizer، الولايات المتحدة الأمريكيةلم يتم تسجيلهتخدير عام قبل جمع العينات.
مجهر ضوئي (Nikon Eclipse)Nikonني-يورانيومالفحص النسيجي المرضي والتصوير.
RRID:SCR_024835
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester)ω(-نيترو-إل-أرجينين ميثيل إستر)Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكيةN5751تُستخدم لاستحثاث إصابة الكلى الحادة الناجمة عن مادة التباين (CI-AKI).
طقم صبغة ماسون ثلاثية الألوانMOSLAB, TüتركياBKMTO001صبغة ماسون ثلاثية الألوان.
محلل الكيمياء MindrayMindrayBS-400التحليلات البيوكيميائية.
مونتيلوكاست الصوديومSigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكيةSML0101تُعطى عن طريق التغذية القسرية الفموية كعلاج.
ن-أسيتيل سيستين (ASIST ٣٠٠ ملجم/٢ مل)جهاز تجميع الخلايا المغناطيسي (MAC) <نص بديل للصورة="المعادلة 1" يرجى تقديم النص المصدر (source text) المراد ترجمته. بمجرد تزويدي بالنص، سأقوم بترجمته بدقة إلى اللغة العربية الأكاديمية المتخصصة وفقاً للمعايير العلمية والتعليمية المحددة في تعليماتك."/files/ftp_upload/73087/73087eq1.jpg" النمط="هامش: تلقائي؛"/>يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته.ç، Tüتركياغير مسجلأُعطيت عن طريق الحقن داخل الصفاق كعلاج.
طقم مقايسة الممتز المباشر للإنزيم المرتبط المناعي (ELISA) لسيستاتين C في الجرذانمختبر BT، الصينE0145Raقياس تركيز سيستاتين C في السوائل الطافية للأنسجة الكلوية باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
إنترلوكين-1 للجرذان (Rat IL-1)β طقم مقايسة الامتزاز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)مختبر BT، الصينE0119Raقياس IL-1 بواسطة مقايسة الممتز المنيعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)β في السوائل الطافية لأنسجة الكلى.
طقم مقايسة الممتز المائية المرتبط بالإنزيم لإنترلوكين-6 في الجرذ (Rat IL-6 ELISA Kit)مختبر بي تي (BT Lab)، الصينE0135Raقياس IL-6 في سوائل الطفو للأنسجة الكلوية باستخدام تقنية ELISA.
طقم مقايسة الممتز الموصل المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لبروتين KIM-1 في الجرذانمختبر BT، الصينE0549Raقياس مستوى KIM-1 في السوائل الطافية لأنسجة الكلى باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
عامل نخر الورم في الجرذان (Rat TNF-α)α طقم مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)مختبر BT، الصينE0764Raقياس TNF-α باستخدام مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)α في السوائل الطافية لأنسجة الكلى.
إبرة تغذية من الفولاذ المقاوم للصدأ (كانيولا تغذية أنبوبية فموية قياس 22 G)Instech Laboratories، الولايات المتحدة الأمريكيةلم يتم تسجيلهالإعطاء عن طريق التغذية القسرية الفموية.
علف القوارض القياسي على شكل حبيبات (Optima)أوبتيما، Tüتركيالم يتم تسجيلهرقم التشغيلة 58931. التركيب الغذائي: 24% بروتين خام، 3.94% سيليلوز خام، 5.08% دهون خام، 8.8% رماد خام، 1.44% ليسين، 0.61% ميثيونين، 1.14% كالسيوم، 0.89% فسفور، و0.28% صوديوم.
طقم قياس الكرياتينين العامأوتو ساينتيفيك (Otto Scientific)OttoBC139القياس اللوني للكرياتينين في المصل.
طقم قياس الجلوتاثيون المختزل الشامل (Universal GSH Kit)أوتو ساينتيفيك (Otto Scientific)أوتو 3053القياس اللوني لـ GSH في الدم المانع للتخثر بـ EDTA باستخدام طريقة إلمان المعدلة.
طقم مضخم الحمض النووي المتعدد العام (Universal MDA Kit)أوتو ساينتيفيك (Otto Scientific)أوتو 1001القياس اللوني لـ MDA في المصل باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة ELx800.
طقم قياس سوبر أكسيد ديسميوتاز العام (Universal SOD Kit)أوتو ساينتيفيك (Otto Scientific)أوتو 3047القياس اللوني لنشاط إنزيم سوبر أكسيد ديسميوتيز (SOD) في المصل باستخدام محلل الكيمياء Mindray BS-400.
طقم تحليل اليوريا العامأوتو ساينتيفيك (Otto Scientific)OttoBC157القياس اللوني لتركيز اليوريا ونيتروجين يوريا الدم (BUN) في المصل.
هيدروكلوريد الزيلازين (Rompun)باير، ألمانيالم يتم تسجيلهالتخدير العام قبل جمع العينات.

المراجع

  1. Wang Z, Wang Q, Gong X. Unveiling the mysteries of contrast-induced acute kidney injury: new horizons in pathogenesis and prevention. Toxics. 2024;12(8):620.
  2. Cho E, Ko GJ. Pathophysiology and management of radiocontrast-induced nephropathy. Diagnostics. 2022;12(1):180.
  3. Shuka N, et al. Contrast-induced nephropathy in interventional cardiology: incidence, risk factors, and identification of high-risk patients. Cureus. 2023;15(12):e51283.
  4. Shams E, Mayrovitz HN. Contrast-induced nephropathy: a review of mechanisms and risks. Cureus. 2021;13(5):e14842.
  5. Mehran R, et al. A simple risk score for prediction of contrast-induced nephropathy after percutaneous coronary intervention: development and initial validation. J Am Coll Cardiol. 2004;44(7):1393-1399.
  6. Heyman SN, Reichman J, Brezis M. Pathophysiology of radiocontrast nephropathy: a role for medullary hypoxia. Invest Radiol. 1999;34(11):685-691.
  7. Geenen RWF, Kingma HJ, van der Molen AJ. Contrast-induced nephropathy: pharmacology, pathophysiology and prevention. Insights Imaging. 2013;4:811-820.
  8. Manisaligil YA, et al. Assessment of Rac1 and β-PAK expressions in a mouse model for contrast-induced nephropathy. J Basic Clin Health Sci. 2020;4(3):230-236.
  9. Simsek O, et al. Preventative effect of montelukast in mild to moderate contrast-induced acute kidney injury in rats via NADPH oxidase 4, p22phox and nuclear factor kappa-B expressions. Int Urol Nephrol. 2025;57(7):2313-2325.
  10. Banda J, et al. Biomarkers for diagnosis and prediction of outcomes in contrast-induced nephropathy. Int J Nephrol. 2020;2020:8568139.
  11. Zisis IE, et al. Renoprotective effect of vardenafil and avanafil in contrast-induced nephropathy: emerging evidence from an animal model. J Pers Med. 2022;12(5):670.
  12. Walker H, et al. Systematic review and meta-analysis of prophylaxis use with intravenous contrast exposure to prevent contrast-induced nephropathy. Eur J Radiol. 2022;153:110368.
  13. Hossain MA, et al. Contrast-induced nephropathy: pathophysiology, risk factors, and prevention. Saudi J Kidney Dis Transpl. 2018;29(1):1-9.
  14. Tepel M, et al. Prevention of radiographic-contrast-agent-induced reductions in renal function by acetylcysteine. N Engl J Med. 2000;343(3):180-184.
  15. Liu R, et al. N-acetylcysteine for the prevention of contrast-induced nephropathy: a systematic review and meta-analysis. J Gen Intern Med. 2005;20(2):193-200.
  16. Zhu R, et al. Association of N-acetylcysteine use with contrast-induced nephropathy: an umbrella review of meta-analyses of randomized clinical trials. Front Med (Lausanne). 2023;10:1235023.
  17. Sandilands EA, et al. Acetylcysteine has no mechanistic effect in patients at risk of contrast-induced nephropathy: a failure of academic clinical science. Clin Pharmacol Ther. 2022;111(6):1222-1238.
  18. Sarmadian R, et al. The renoprotective potential of montelukast: a scoping review. Ann Med Surg (Lond). 2024;86(6):3568-3576.
  19. Kokate D, Marathe P. Evaluation of effect of montelukast in the model of streptozotocin-induced diabetic nephropathy in rats. Indian J Endocrinol Metab. 2024;28(1):47-54.
  20. Mojtahedi SY, Ghodsi M, Pourpashang P. Renoprotective efficacy of montelukast: an overview on recent advancements. J Nephropharmacol. 2025;14(1):e12759.
  21. Sener G, et al. Chronic renal failure-induced multiple-organ injury in rats is alleviated by the selective CysLT1 receptor antagonist montelukast. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2007;83(4):257-267.
  22. Sener G, et al. Montelukast protects against renal ischemia/reperfusion injury in rats. Pharmacol Res. 2006;54(1):65-71.
  23. Li LP, et al. Intrarenal oxygenation by blood oxygenation level-dependent MRI in contrast nephropathy model: effect of the viscosity and dose. J Magn Reson Imaging. 2012;36(5):1162-1167.
  24. Liu K, et al. A novel rat model of contrast-induced nephropathy based on dehydration. J Pharmacol Sci. 2019;141(1):49-55.
  25. Alshogran OY, Al Tahrawi AY, Nusair SD. Exploring the effects of edaravone in rats with contrast-induced acute kidney injury. Life Sci. 2022;309:121006.
  26. Suddek GM. Montelukast ameliorates kidney function and urinary bladder sensitivity in experimentally induced renal dysfunction in rats. Fundam Clin Pharmacol. 2013;27(2):186-191.
  27. Aydin A, et al. The examination of the nephroprotective effect of montelukast sodium and N-acetylcysteine in renal ischemia with dimercaptosuccinic acid imaging in a placebo-controlled rat model. Acta Cir Bras. 2020;35(9):e202000905.
  28. Kara O, Kilitci A, Daglioglu G. Protective effect of resveratrol on cisplatin-induced damage in rat kidney. Cukurova Med J. 2022;47(3):990-995.
  29. Pandir D, Kara O. Cisplatin-induced kidney damage and the protective effect of bilberry (Vaccinium myrtillus L.): an experimental study. Turk J Med Sci. 2013;43(6):951-956.
  30. Iordache AM, et al. Phosphodiesterase-5 inhibitors ameliorate structural kidney damage in a rat model of contrast-induced nephropathy. Food Chem Toxicol. 2020;143:111535.
  31. Morcos SK, Thomsen HS, Webb JA. Contrast-media-induced nephrotoxicity: a consensus report. Eur Radiol. 1999;9:1602-1613.
  32. Rudnick MR, et al. Nephrotoxicity of ionic and nonionic contrast media in 1196 patients: a randomized trial. Kidney Int. 1995;47(1):254-261.
  33. Modi K, Padala SA, Gupta M. Contrast-induced nephropathy. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2025 Jan–. Updated 2025 May 5. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK448066/

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

إصابة الكلى الناجمة عن الصبغةالعلاج بـ N-Acetylcysteineإصابة كلى الجرذانالإجهاد التأكسديالسيتوكينات الالتهابيةمؤشرات وظائف الكلىالتشريح المرضي النسجي للكلىالمؤشرات الحيوية لإصابة الكلىنموذج جرذان قبل سريري
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.