التأثيرات الواقية للكلى لعلاج N-Acetylcysteine وMontelukast بعد حقن المادة الظليل في نموذج جرذان للإصابة الكلوية الحادة الناجمة عن المادة الظليل

ملخص

يقدم هذا البروتوكول نموذجاً في الجرذان للإصابة الكلوية الحادة الناجمة عن المادة الملونة، ويقيم إعطاء N-acetylcysteine وmontelukast بعد حقن المادة الملونة، سواء بشكل منفصل أو مجتمعين. وقد ارتبطت أنظمة العلاج بخلل وظيفي كلوي أقل شدة، وانخفاض في الإجهاد التأكسدي والالتهاب والإصابة النسيجية المرضية، على الرغم من أن العلاج المزدوج لم يتفوق باستمرار على العلاج الأحادي.

الملخص

تُعد إصابة الكلى الحادة الناجمة عن الصبغة (CI-AKI) مضاعفة هامة للتعرض للصبغات اليودية، حيث يساهم الإجهاد التأكسدي والعمليات الالتهابية في حدوث تلف كلوي. قامت هذه الدراسة بإنشاء نموذج تجريبي لإصابة الكلى الحادة الناجمة عن الصبغة في الجرذان، وبحثت في آثار العلاج الذي بدأ بعد إعطاء الصبغة باستخدام N-acetylcysteine (NAC)، أو montelukast، أو مزيج منهما. خضعت ذكور جرذان Wistar البالغة لحرمان من الماء، تلاه إعطاء متسلسل وريدي لكل من Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)، وindomethacin، وiohexol. بدأ العلاج بعد ساعة واحدة من اكتمال إعطاء iohexol، أي بعد حوالي 1.5 ساعة من إعطاء L-NAME، واستمر العلاج مرة واحدة يومياً لمدة 3 أيام متتالية. تم تقييم مؤشرات وظائف الكلى، ومعايير الإجهاد التأكسدي، والسيتوكينات الالتهابية، والمؤشرات الحيوية للإصابة الكلوية، وعلم الأمراض النسيجي للكلى. أظهرت مجموعة CI-AKI غير المعالجة خللاً وظيفياً كلوياً واضحاً، وملفاً غير مواتٍ للإجهاد التأكسدي والالتهاب، وتلفاً نسيجياً مرضياً كبيراً. وبالمقارنة مع مجموعة CI-AKI غير المعالجة، أظهرت الحيوانات التي تلقت NAC، أو montelukast، أو النظام العلاجي المشترك، تحسناً عاماً في النتائج البيوكيميائية والنسيجية المرضية. كانت مستويات Glutathione (GSH) هي الأعلى، وكانت متوسطات درجات الإصابة النسيجية المرضية هي الأقل عددياً في مجموعة العلاج المشترك؛ ومع ذلك، لم يتفوق العلاج المشترك باستمرار على العلاج الأحادي في جميع النتائج التي تم تقييمها. يوفر هذا البروتوكول إطاراً ما قبل سريري مضبوطاً لتقييم التدخلات ما بعد التباين في حالات CI-AKI، وتستوجب النتائج مزيداً من الاستقصاء التجريبي لـ NAC وmontelukast دون إثبات الفعالية السريرية أو وجود ميزة محددة للجمع بينهما.

المقدمة

غالبًا ما تُعقّد إصابة الكلى الحادة (AKI) مسار المرضى المنومين في المستشفيات، وتساهم في زيادة معدلات المراضة والوفيات واستهلاك موارد الرعاية الصحية. ونظرًا لأن وسائط التباين اليودية تُستخدم بشكل روتيني في التصوير التشخيصي والإجراءات التداخلية، أصبح تدهور وظائف الكلى بعد التعرض لوسائط التباين مصدر قلق سريري هام. تميز التسميات الحالية بين إصابة الكلى الحادة المرتبطة بالتباين (CA-AKI)، والتي تشمل أي نوبة من إصابة الكلى الحادة تحدث بعد إعطاء وسيط التباين، وبين إصابة الكلى الحادة الناجمة عن التباين (CI-AKI)، والتي تعزى فيها الإصابة الكلوية سببياً إلى عامل التباين. وبناءً على ذلك، يظل مصطلح CI-AKI مستخدمًا على نطاق واسع في النماذج التجريبية المنضبطة، حيث يمكن ربط التعرض للتباين مباشرة بالتلف الكلوي^1,2.

يعد المرضى الذين يعانون من مرض الكلى المزمن، أو داء السكري، أو كبار السن، أو فشل القلب، أو غيرها من الأمراض القلبية الوعائية المصاحبة، عرضة بشكل خاص للإصابة بـ CI-AKI. وتتعافى وظائف الكلى لدى العديد من المرضى المصابين؛ ومع ذلك، قد يحدث قصور كلوي مستمر، والحاجة إلى العلاج التعويضي للكلى، وزيادة خطر الوفاة في الحالات الأكثر شدة. كما يرتبط CI-AKI بفترات استشفاء أطول وزيادة في استهلاك موارد الرعاية الصحية. وتؤكد هذه العواقب السلبية على الحاجة المستمرة لتطوير نهج وقائية وعلاجية فعالة للإصابة الكلوية المرتبطة بالصبغة^1,3,4,5.

يتضمن تطور إصابة الكلى الحادة الناجمة عن مادة التباين (CI-AKI) عدة عمليات مترابطة، بما في ذلك تغير تروية الكلى، واختلال توازن الأكسجين في النخاع، والإجهاد التأكسدي، والالتهاب، والتسمم الأنبوبي المباشر. يؤدي التعرض لمادة التباين إلى تحويل النغمة الوعائية داخل الكلى نحو تضيق الأوعية مع إضعاف استجابات توسيع الأوعية، مما يؤدي بدوره إلى تقليل تدفق الدم الكلوي. ويعد النخاع الخارجي عرضة للتضرر بشكل خاص لأن توفر الأكسجين في هذه المنطقة محدود بالفعل في الظروف الفسيولوجية. ولذلك، فإن أي انخفاض إضافي في توصيل الأكسجين بعد إعطاء مادة التباين قد يعجل بحدوث إصابة أنبوبية نقص تروية^2,6,7.

يصاحب نقص الأكسجين الكلوي الناتج عن التعرض لمواد التباين زيادة في توليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، مما يساهم بشكل كبير في إصابة الكلى. وعندما يتجاوز إنتاج ROS القدرة الذاتية لمضادات الأكسدة، قد يحدث تلف تأكسدي في الدهون الخلوية والبروتينات والحمض النووي DNA، بينما تتعزز في الوقت ذاته إشارات الالتهاب. وفي كل من السياقين التجريبي والسريري، ارتبط إعطاء مواد التباين بزيادة مؤشرات الإجهاد التأكسدي وضعف دفاعات مضادات الأكسدة. وتشمل المسارات الجزيئية المتورطة في هذه الاستجابة تكوين الجذور الحرة المعتمد على إنزيم NADPH oxidase وتنشيط العامل النووي kappa-B (NF-κB)^1,6,8,9.

يشير دور الالتهاب إلى أن الإصابة الكلوية الحادة المرتبطة بالصبغة (CI-AKI) لا يمكن تفسيرها من خلال الاضطراب الديناميكي الدموي وحده. كما أشارت الأدلة الحديثة إلى تورط الموت الخلوي الحديدي (ferroptosis)، والإجهاد النيتروزي، والمصائد خارج الخلوية للعدلات في الإصابة الكلوية التي تلي التعرض للصبغة. وقد أدى التعرف على هذه الآليات الإضافية إلى توسيع نطاق الأهداف الجزيئية التي يتم استقصاؤها للوقاية من CI-AKI وعلاجه¹.

يُستخدم كرياتينين المصل ومخرجات البول عادةً لتشخيص إصابة الكلى الحادة الناجمة عن مادة التباين (CI-AKI)، ولكن كلاهما قد لا يتغير إلا بعد تطور إصابة الكلى بالفعل. وقد شجع هذا القصور على تقييم مؤشرات مبكرة، بما في ذلك جزيء إصابة الكلى-1 (KIM-1)، الذي يعكس التلف الأنبوبي، وسيستاتين C، المرتبط بتغيرات الترشيح الكبيبي. وتشير الأدلة من الدراسات التجريبية والسريرية إلى أن التغيرات في هذه المؤشرات الحيوية قد تصبح قابلة للكشف خلال المرحلة المبكرة من CI-AKI، وبالتالي تدعم التقييم المبكر لإصابة الكلى^9,10,11.

لقد شجعت التطورات في فهم الفسيولوجيا المرضية لإصابة الكلى الحادة الناتجة عن صبغة التباين (CI-AKI) على تقييم التدخلات الدوائية الموجهة نحو المسارات التأكسدية والالتهابية. ويظل الترطيب الكافي هو الإجراء الوقائي الرئيسي، بينما تباينت الفوائد المبلغ عنها للأساليب القائمة على الأدوية عبر الدراسات المختلفة. وبناءً على ذلك، لم يثبت أي علاج دوائي حتى الآن فعالية متسقة كافية لاعتماده كتدخل سريري قياسي لحالات CI-AKI^1,4,12,13.

لقد تم تقييم N-acetylcysteine (NAC) على نطاق واسع كنهج دوائي للحد من الإصابة بـ CI-AKI. وترتبط تأثيراته المقترحة في حماية الكلى بتنظيف الأنواع التفاعلية واستعادة احتياطيات الجلوتاثيون. جاء الدعم السريري المبكر من دراسة بارزة على مرضى يعانون من مرض الكلى المزمن، حيث قلل NAC من حدوث خلل وظائف الكلى المرتبط بالصبغة¹⁴. ومع ذلك، أدت التجارب السريرية والتحليلات التوليفية اللاحقة للأدلة إلى نتائج غير متسقة، حيث أبلغت بعض الدراسات عن وجود فائدة بينما لم تظهر دراسات أخرى أي تأثير سريري ملموس. وبناءً على ذلك، تظل فعالية NAC في علاج CI-AKI غير مؤكدة^12,15,16,17.

يعمل دواء Montelukast على غلق مستقبلات الليكوترين السيستيني-1 بشكل انتقائي، وقد استُخدم لفترة طويلة في علاج الربو والاضطرابات التحسسية. كما تشير الأدلة التجريبية إلى أن هذا العامل يمارس تأثيرات مضادة للالتهابات، ومضادة للأكسدة، ومضادة لموت الخلايا المبرمج. وفي نماذج مختلفة من الإصابات الكلوية، ارتبط إعطاء montelukast بتقليل بيروكسيد الدهون، وتعزيز الدفاعات المضادة للأكسدة الداخلية، وتخفيف حدة التلف النسيجي المرضي، وتخفيف إصابة الكلى^{18,19,20,21,22}.

لا تزال الأدلة التي تفحص تحديداً دواء montelukast في حالات CI-AKI محدودة. وتشير النتائج التجريبية المتاحة إلى أن تأثيراته الكلوية قد تتضمن تعديل إشارات الأكسدة والالتهاب. وقد اقتُرح أن خفض تعبير NADPH oxidase 4 (NOX4)، و p22phox، و NF-κB يعد أحد الآليات التي قد يقلل من خلالها montelukast من الإصابة الكلوية المرتبطة بالصبغة⁹.

يؤثر كل من NAC والمونتيلوكاست على مسارات متميزة جزئياً ولكنها متداخلة تشارك في الإصابة الكلوية. يدعم NAC بشكل أساسي الدفاعات المضادة للأكسدة، بينما يتميز المونتيلوكاست بخصائص مضادة للالتهابات ومضادة للأكسدة معاً. لذا، فإن الإعطاء المتزامن لهذه العوامل قد يؤثر على مكونات متعددة من الفسيولوجيا المرضية لـ CI-AKI؛ ومع ذلك، لم يتم إثبات ما إذا كان تفاعلهما ينتج فائدة تجميعية أو تآزرية في النماذج التجريبية^{18,19,20,21,22}.

ركزت الدراسات السابقة بشكل أساسي على تقييم التدخلات التي يتم تقديمها قبل التعرض للمادة الظليلية، بينما تظل الأدلة المتعلقة بالعلاجات التي تبدأ بعد التعرض شحيحة. وبوجه خاص، حظيت عملية إعطاء montelukast مع NAC بعد حقن المادة الظليلية بدراسة محدودة في حالات إصابة الكلى الحادة الناجمة عن المادة الظليلية (CI-AKI) التجريبية. وبناءً على ذلك، قامت الدراسة الحالية بتقييم تأثير montelukast وNAC، عند إعطائهما بعد التعرض للمادة الظليلية سواء بشكل منفصل أو مشترك، وذلك فيما يتعلق بوظائف الكلى، ومعايير الإجهاد التأكسدي والدفاعات المضادة للأكسدة، ومؤشرات الإصابة الكلوية والالتهابية، والتغيرات النسيجية المرضية في نموذج جرذان مصاب بـ CI-AKI.

البروتوكول

أجريت جميع الإجراءات التجريبية التي شملت الحيوانات وفقاً للإرشادات المقبولة دولياً لرعاية واستخدام حيوانات المختبر، وكانت متوافقة مع معايير إبلاغ أبحاث الحيوانات (Animal Research: Reporting of) داخل الجسم الحي إرشادات التجارب (ARRIVE). تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل لجنة أخلاقيات التجارب المحلية على الحيوان في جامعة Ahi Evran، كيرشهر، تركيا (قرار رقم 2، اجتماع رقم 12، بتاريخ 12 يونيو 2025). وقد بُذلت كافة الجهود لتقليل معاناة الحيوانات والحد من عدد الحيوانات المستخدمة طوال فترة الدراسة. وتدرج تفاصيل جميع الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

تحضير المواد الكيميائية

استُخدم في هذه الدراسة كل من Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)، والإندوميتاسين، والإيوهيكسول، ومونتيلوكاست الصوديوم، وNAC. تم تحضير محلول L-NAME بتركيز 10 mg/mL في محلول ملحي طبيعي معقم بتركيز 0.9% باستخدام 1 g من L-NAME لكل 100 mL. حُضّر المحلول حديثاً في يوم الإعطاء واستُخدم دون تخزينه بعد ذلك اليوم. ولتحفيز نموذج CI-AKI التجريبي، أُعطي L-NAME عن طريق الوريد (IV) بجرعة 10 mg/kg. وبالنسبة لجرذ يزن حوالي 220 g، كانت الكمية المحسوبة حوالي 2.2 mg، وهو ما يعادل حجم إعطاء يبلغ حوالي 0.22 mL. حُضّر الإندوميتاسين في محلول بيكربونات الصوديوم بتركيز 5% بتركيز 10 mg/mL عن طريق إذابة 100 mg في حجم نهائي قدره 10 mL. خضع التحضير للرج بواسطة جهاز vortex حتى أصبح متجانساً ظاهرياً. لم يتم قياس الرقم الهيدروجيني (pH) النهائي لمحلول الإندوميتاسين المحضر أثناء التجربة، وبالتالي لم يتسنَّ تحديده بأثر رجعي. كما لم يتم توثيق إجراء تعقيم أو ترشيح محدد لمحلول الإندوميتاسين المحضر في السجلات التجريبية، وبالتالي تعذر الإبلاغ عنه بأثر رجعي. لم يتم تحديد أو تقييم فترة استقرار رسمية؛ حيث حُضّر المحلول حديثاً واستُخدم في اليوم نفسه. ولتحفيز نموذج CI-AKI التجريبي، أُعطي الإندوميتاسين عن طريق الوريد بجرعة 10 mg/kg. وبالنسبة لجرذ يزن حوالي 220 g، كانت الكمية المحسوبة حوالي 2.2 mg، وهو ما يعادل حجم إعطاء يبلغ حوالي 0.22 mL.

تم إعطاء تركيبة iohexol التجارية، التي تحتوي على 647 mg iohexol/mL وتركيز يود مكافئ قدره 300 mg/mL، دون تخفيف إضافي. لم يتم تسجيل درجة الحرارة الدقيقة لـ iohexol وقت الحقن. ولم يتسنَّ التحقق من قيمة الأسمولالية الخاصة بالتركيبة بشكل موثوق من السجلات التجريبية المتاحة، وبالتالي لم يتم ذكرها. ولتحفيز نموذج CI-AKI التجريبي، تم إعطاء iohexol عن طريق الوريد بجرعة 3 g iodine/kg. وفي جرذ يزن حوالي 220 g، وفرت هذه الجرعة حوالي 0.66 g من اليود، وهو ما يعادل حجم حقن يقارب 2.2 mL.

تَمَّ تحضير معلق مونتيلوكاست الصوديوم في كربوكسي ميثيل السليلوز (CMC) بتركيز 0.5%. وقد حُضِّر المعلق حديثاً في كل يوم إعطاء، ومُزِج باستخدام جهاز الـ vortex مباشرة قبل الجرعات لضمان توزيع متجانس للجسيمات المعلقة. وحُسبت جرعة المونتيلوكاست المطلوبة لكل حيوان بشكل منفصل بناءً على وزن الجسم المسجل عند بدء الدراسة باستخدام الصيغة التالية: الجرعة المطلوبة (mg) = وزن الجسم (kg) × 10 mg/kg. وبالنسبة لحيوان يزن 220 g تقريباً، كانت الجرعة المحسوبة 2.2 mg تقريباً، وأُعطيت عن طريق التغذية القسرية الفموية. كما تم فحص المعلق بصرياً قبل كل عملية إعطاء، وأي تحضير يظهر فيه ترسب تم مزجه مجدداً باستخدام جهاز الـ vortex قبل الاستخدام.

تم إعطاء NAC لمجموعات العلاج من تركيبته التجارية دون تخفيف إضافي بجرعة 100 mg/kg عن طريق الحقن داخل الصفاق. وبالنسبة لكل حيوان، تم حساب الجرعة المطلوبة بشكل فردي بناءً على وزن الجسم المسجل عند بدء الدراسة. وفي حالة حيوان يزن 220 g تقريبًا، كان ذلك يعادل 22 mg تقريبًا من NAC وحجم حقن يبلغ 0.15 mL تقريبًا. وقبل إعطاء الجرعات، تم فحص المحلول بصريًا، واستُخدمت فقط التحضيرات التي كانت شفافة وخالية من الجسيمات المرئية.

خضع كل مستحضر للفحص البصري قبل الإعطاء. وتمما فحص محاليل L-NAME وindomethacin وiohexol وNAC للتأكد من خلوها من تغير اللون والجسيمات المرئية. وقبل الإعطاء مباشرة، تم خلط معلق montelukast باستخدام جهاز vortex وفحصه بصرياً للتأكد من التجانس. ولم يُستخدم أي مستحضر لم يستوفِ معايير القبول هذه. كما تم ارتداء معاطف المختبر والقفازات الواقية وواقيات العين أثناء تحضير وإعطاء جميع المواد الكيميائية. والتزمت جميع الإجراءات بمتطلبات السلامة المختبرية والسلامة البيولوجية المؤسسية.

اختيار الحيوانات، وإيواؤها، والمجموعات التجريبية، والتوزيع العشوائي

تم الحصول على ثلاثين جرذاً من ذكور جرذان ويستار البيضاء البالغة (عمرها 8–12 أسبوعاً؛ وزن الجسم 200–220 g) من مختبر أبحاث الحيوانات التجريبية في جامعة أهي إيفران، قرشهر، تركيا. تم اختيار الذكور للحفاظ على الاتساق المنهجي مع نماذج إصابة الكلى الحادة الناجمة عن التباين في التروية (CI-AKI) التجريبية المنشورة سابقاً، ولتجنب إدخال مرحلة دورة الشبق كمتغير بيولوجي إضافي. ولم يتم تقييم الجنس كمتغير تجريبي في هذه الدراسة. كانت منشأة الحيوانات تحمل رخصة تربية/إنتاج رقم 184، وقد تمت تربية الجرذان والحفاظ عليها هناك في ظل ظروف مختبرية قياسية. عند التسجيل، لم يكن للحيوانات حالة موثقة خالية من مسببات الأمراض المحددة (SPF) أو أي تصنيف صحي ميكروبيولوجي رسمي آخر. تم إيواء كل جرذ على حدة في قفص من البولي كربونات مقاس 40 cm × 25 cm × 20 cm، مع استخدام نشارة الصنوبر المقطعة خشناً كفرشة. وتم الحفاظ على ظروف الغرفة عند 24 °C ± 2 °C ورطوبة نسبية 35% ± 10% بواسطة نظام آلي للتحكم البيئي والتهوية. تم تطبيق جدول إضاءة 12 ساعة ضوء/12 ساعة ظلام، مع الإضاءة من الساعة 07:00 إلى 19:00. لم يتم توفير أي إثراء بيئي مخصص خلال فترة التأقلم التي استمرت 7 أيام أو الفترة التجريبية اللاحقة. كان علف القوارض القياسي المحبب ومياه الصنبور متاحين بحرية (ad libitum)، باستثناء فترة حرمان من الماء محددة بـ 16 h تسبق تحريض CI-AKI. كانت تركيبة العلف تتكون من 24% بروتين خام، و3.94% سيليلوز خام، و5.08% دهون خام، و8.8% رماد خام، و1.44% ليسين، و0.61% ميثيونين، و1.14% كالسيوم، و0.89% فسفور، و0.28% صوديوم. تم تأقلم جميع الحيوانات لمدة 7-days قبل بدء الإجراءات التجريبية. وأجريت ملاحظات يومية خلال فترتي التأقلم والتجربة لتقييم الحالة العامة، واستهلاك الغذاء والماء، والحركة، والوضعية، ومظهر الفراء، وأي علامات ضيق. ولتقليل تحيز الاختيار، تم توزيع الحيوانات على المجموعات التجريبية الخمس باستخدام تسلسل تخصيص عشوائي تم إنتاجه بواسطة الكمبيوتر، مع تخصيص ستة حيوانات لكل مجموعة. تم تحديد حجم العينة من خلال تحليل قوة مسبق (a priori power analysis) باستخدام برنامج G*Power الإصدار 3.1.9.6.

تم تحديد حجم العينة من خلال تحليل القوة المسبق لتحليل التباين أحادي الاتجاه ذو التأثيرات الثابتة الذي شمل خمس مجموعات تجريبية. وبافتراض أن حجم التأثير (f) هو 0.65، ومعدل الخطأ من النوع الأول (α) هو 0.05، وقوة إحصائية بنسبة 80%، فقد تم حساب إجمالي حجم العينة المطلوب ليكون 30 حيواناً، أي ستة حيوانات لكل مجموعة. وقد افترض مسبقاً أن حجم التأثير (f = 0.65) يمثل تأثيراً كلياً كبيراً بين المجموعات في مقارنة المجموعات الخمس. وقد استهدف هذا الحساب تحديد حجم العينة المطلوب للكشف عن مثل هذا التأثير الكلي، ولم يتم تصميمه خصيصاً للكشف عن فروق زوجية أصغر بين مجموعات العلاج النشطة. واعتُبر الحيوان الفردي هو الوحدة التجريبية لجميع التحليلات.

باستثناء الرعاية الروتينية، والمراقبة الصحية اليومية، والإجراءات النهائية، لم تخضع الحيوانات في مجموعة Control لأي تعامل أو تقييد مرتبط بالبروتوكول، أو حرمان من الماء، أو حقن وريدي أو داخل الصفاق، أو تغذية أنبوبية فموية، أو إعطاء مادة حاملة. وتكونت مجموعة CI-AKI من حيوانات تم فيها إنشاء نموذج CI-AKI في اليوم الثامن ولم تتلقَّ أي علاج. وتكونت مجموعة CI-AKI + Montelukast من حيوانات تم فيها إنشاء نموذج CI-AKI وعولجت لاحقاً باستخدام montelukast. وتكونت مجموعة CI-AKI + NAC من حيوانات تم فيها إنشاء نموذج CI-AKI وعولجت لاحقاً باستخدام NAC. أما مجموعة CI-AKI + Montelukast + NAC فقد تكونت من حيوانات تم فيها إنشاء نموذج CI-AKI وعولجت لاحقاً بمزيج من montelukast و NAC. ولم تخضع مجموعة Control ولا مجموعة CI-AKI غير المعالجة لإجراءات وهمية مطابقة للعلاج؛ وتحديداً، لم يتم إجراء أي تعامل وهمي، أو تغذية أنبوبية فموية وهمية، أو حقن علاجية وهمية، أو إعطاء مواد حاملة مطابقة للعلاج في هذه المجموعات. كانت المواد الحاملة المستخدمة لتحضير L-NAME و indomethacin و montelukast هي محلول ملحي طبيعي 0.9%، ومحلول بيكربونات الصوديوم 5%، و 0.5% CMC على التوالي، كما هو موضح في تحضير المواد الكيميائية. تم إعطاء NAC من تركيبته التجارية دون مزيد من التخفيف، ولم يتم تحضير مادة حاملة منفصلة لـ NAC. وفي اليوم الثامن، خضعت جميع الحيوانات باستثناء تلك الموجودة في مجموعة Control لحرمان من الماء لمدة 16 h، تلا ذلك إعطاء متسلسل عن طريق الوريد لكل من L-NAME (10 mg/kg)، و indomethacin (10 mg/kg)، و iohexol (3 g iodine/kg) لتحفيز الإصابة الكلوية الحادة الناجمة عن المادة الملونة. وفي مجموعات العلاج المحددة، تم إعطاء montelukast (10 mg/kg، تغذية أنبوبية فموية) و/أو NAC (100 mg/kg، حقن داخل الصفاق) أولاً بعد ساعة واحدة من إتمام إعطاء iohexol في اليوم الثامن، وهو ما يقابل حوالي 1.5 h بعد إعطاء L-NAME، ثم أُعطيت لاحقاً مرة واحدة يومياً في نفس الوقت في اليومين التاسع والعاشر.

بروتوكول إعطاء الدواء

تم إحداث إصابة الكلى الحادة الناجمة عن الصبغة (CI-AKI) وفقاً لبروتوكول تجريبي منشور يتكون من حرمان من الماء لمدة 16 h، يليه إعطاء متتابع وريدي لكل من L-NAME، والإندوميتاسين (indomethacin)، والإوهكسول (iohexol)^23,24,25. تم إعطاء كل من L-NAME والإندوميتاسين بجرعة 10 mg/kg، بينما تم إعطاء الإوهكسول بجرعة 3 g iodine/kg. وكانت جرعات العلاج 10 mg/kg لمونتيلوكاست الصوديوم (montelukast sodium) و 100 mg/kg لـ NAC. وقد استند اختيار جرعات تحريض النموذج والعلاج إلى دراسات تجريبية منشورة سابقاً^22,26,27. ولم يتم إجراء أي دراسة تمهيدية لتحديد نطاق الجرعة أو تحسينها. كما تم اختيار جرعات NAC والمونتيلوكاست بشكل مستقل بناءً على دراسات تجريبية منشورة سابقاً لكل عامل على حدة، ولم تُشتق من دراسة تحديد جرعة خاصة بالتركيبات المشتركة. ولم يكن الهدف من الجرعات المختارة تمثيل تعرضات متساوية من الناحية الفارماكولوجية، ولم يتم إجراء تحليل للاستجابة للجرعة أو تحليل رسمي للتفاعلات الدوائية. كما لم يتم استخدام أي عتبة عددية أو مخبرية محددة مسبقاً لتعريف نجاح تحريض النموذج على مستوى الحيوان الفردي. وعند نقطة نهاية الدراسة، تم تأكيد النجاح في إحداث إصابة كلوية من خلال التغيرات النسيجية المرضية المميزة الملاحظة في مجموعة CI-AKI غير المعالجة مقارنة بمجموعة الضبط (Control). وفي اليوم 8، خضعت جميع الحيوانات باستثناء تلك الموجودة في مجموعة الضبط لفترة واحدة من الحرمان من الماء لمدة 16 h مباشرة قبل تحريض إصابة الكلى الحادة الناجمة عن الصبغة. ولم يتكرر الحرمان من الماء خلال الفترة التجريبية المتبقية. وظل العلف المكبب القياسي متاحاً حسب الرغبة (ad libitum) طوال فترة الحرمان من الماء. وعند الانتهاء من فترة الحرمان من الماء الوحيدة التي استمرت 16 h، تمت استعادة الوصول إلى مياه الصنبور في آن واحد وحسب الرغبة في جميع المجموعات التجريبية المحرومة من الماء، وذلك قبل إعطاء أول عامل محرض للنموذج، وهو L-NAME، واستمر ذلك لما تبقى من الفترة التجريبية. وكانت توقيتات وظروف استعادة المياه متطابقة في جميع المجموعات المحرومة من الماء. كما لم يتم تقييد كمية المياه المتناولة بعد استعادتها بحجم محدد مسبقاً ولم يتم قياسها كمياً. ولم يتم قياس أوزان الجسم المزدوجة مباشرة قبل وبعد فترة الحرمان من الماء لمدة 16 h؛ وبالتالي، تعذر حساب النسبة المئوية لفقدان وزن الجسم المرتبط بالجفاف. كما لم يتم مراقبة إخراج البول كمياً. وبعد استعادة الوصول إلى الماء، بدأ تحريض CI-AKI. وتم إجراء جميع عمليات الإعطاء الوريدي المتتابعة لـ L-NAME والإندوميتاسين والإوهكسول عبر الوريد الجانبي للذيل باستخدام إبرة 26 G متصلة بمحقنة معقمة سعة 5 mL. وقبل الإعطاء الوريدي، تم تدفئة الذيل في الماء لعدة دقائق لتسهيل رؤية وتوسيع الأوردة الجانبية للذيل. وبعد كل عملية إعطاء وريدي، تم غسل الوريد بـ 0.5 mL من المحلول الملحي العادي المعقم بتركيز 0.9%، بالإضافة إلى حجم الإعطاء المحسوب للعامل المحرض للنموذج المعني. وتمت مراقبة موقع الحقن بصرياً طوال فترة الإعطاء والغسل للتأكد من عدم وجود تورم أو تسرب أو دليل على التسرب خارج الوريد. تم إعطاء L-NAME (10 mg/kg) أولاً. وبعد خمس عشرة دقيقة من إعطاء L-NAME، تم إعطاء الإندوميتاسين (10 mg/kg) وريدياً عبر الوريد الجانبي للذيل نفسه. وبعد خمس عشرة دقيقة من إعطاء الإندوميتاسين، تم إعطاء الإوهكسول وريدياً عبر الوريد الجانبي للذيل نفسه بجرعة 3 g iodine/kg. وبالنسبة لكل حيوان، تم حساب جرعة الإوهكسول وحجم الحقن المقابل بشكل فردي بناءً على وزن الجسم المسجل عند بدء الدراسة وتركيز اليود التجاري البالغ 300 mg iodine/mL. وناظر ذلك حجم إعطاء قدره 10 mL/kg، وبالتالي، حوالي 2.0–2.2 mL للجرذان التي تزن 200–220 g. ولم يتم تحديد حد أقصى مسموح به للحجم الوريدي في البروتوكول؛ وكان أكبر حجم إعطاء وريدي لعامل واحد استُخدم في هذه الدراسة هو الإوهكسول بـ 10 mL/kg. وتم إعطاء الإوهكسول ببطء على مدار 1–2 min تقريباً. وتم التحقق من نجاح الإعطاء الوريدي من خلال عدم وجود تورم مرئي أو تسرب أو تسرب خارج الوريد في موقع الحقن. ولم يلاحظ أي تسرب جزئي خارج الوريد، ولم تتطلب أي حقنة إعادة محاولة أو تكرار الجرعة بسبب الاشتباه في التسرب خارج الوريد. وبعد ساعة من إتمام إعطاء الإوهكسول، أُعطيت العلاجات المحددة لأول مرة لمجموعات العلاج. ونظراً لأن إعطاء الإوهكسول بدأ بعد 30 min من إعطاء L-NAME واكتمل في غضون 1–2 min تقريباً، فإن بدء العلاج حدث بعد حوالي 91–92 min (حوالي 1.5 h) من إعطاء L-NAME. تم إعطاء مونتيلوكاست الصوديوم (10 mg/kg) عن طريق التغذية القسرية الفموية (oral gavage)، بينما تم إعطاء NAC (100 mg/kg) عن طريق الحقن داخل الصفاق (intraperitoneally).

أُجري التغذية القسرية عن طريق الفم (Oral gavage) باستخدام قُنبلة تغذية من الفولاذ المقاوم للصدأ بقياس 22 G. تم الحفاظ على كل حيوان في وضع عمودي، ودُفعت قُنبلة التغذية برفق عبر المريء وصولاً إلى المعدة. وفي حال مواجهة مقاومة مفرطة، كانت القُنبلة تُسحب ثم يُعاد وضعها قبل الإعطاء. وتمت مراقبة الحيوان للتأكد من عدم حدوث ارتجاع أثناء التغذية القسرية وبعدها مباشرة. لم يُلاحظ أي ارتجاع أو أي دليل آخر على عدم اكتمال الجرعة الفموية أثناء أو بعد التغذية القسرية في أي من الحيوانات، ولم يُستبعد أي حيوان بناءً على الاشتباه في فشل الإعطاء عن طريق الفم. أما الحقن داخل الصفاق (Intraperitoneal injections)، فقد أُعطيت في الربع السفلي الأيمن من البطن، حيث أُدخلت الإبرة بزاوية تتراوح تقريباً بين 30°–45°، وأُجري عملية شفط قبل الإعطاء للتأكد من عدم الدخول غير المقصود في وعاء دموي. كما تمت مراقبة موقع الحقن بصرياً أثناء الإعطاء وبعده مباشرة للتأكد من عدم وجود تسرب أو نزيف أو أي مضاعفات مرئية أخرى. أُعطيت العلاجات المحددة مرة واحدة يومياً في الوقت نفسه في الأيام 8 و9 و10. وبناءً على ذلك، تلقت الحيوانات في مجموعة CI-AKI + Montelukast عقار montelukast مرة واحدة يومياً لمدة ثلاثة أيام متتالية، وتلقت الحيوانات في مجموعة CI-AKI + NAC عقار NAC مرة واحدة يومياً لمدة ثلاثة أيام متتالية، بينما تلقت الحيوانات في مجموعة CI-AKI + Montelukast + NAC كلاً من montelukast وNAC مرة واحدة يومياً وفقاً لجدول العلاج نفسه لمدة 3 أيام. وقد قام الباحث نفسه بتنفيذ جميع عمليات تحفيز النموذج وإعطاء العلاجات. قِيس وزن الجسم مرة واحدة لكل حيوان عند بدء الدراسة ولم يُعاد قياسه خلال الفترة التجريبية. وبالنسبة لكل حيوان، حُسبت الجرعة وحجم الإعطاء المقابل لجميع عوامل تحفيز النموذج وعلاجات الدراسة بشكل فردي باستخدام وزن الجسم المسجل عند بدء الدراسة. ونُفذت جميع إجراءات الحقن الوريدي، والحقن داخل الصفاق، والتغذية القسرية عن طريق الفم باستخدام نفس التقنية الموحدة لتقليل التباين المرتبط بعملية الإعطاء.

إجراء القتل الرحيم، والنهايات الرحيمة، وجمع العينات

تمت مراقبة الحيوانات مرة واحدة يومياً طوال فترة التجربة لرصد التغيرات في الحالة العامة، واستهلاك الغذاء والماء، والقدرة على الحركة، والوضعية الجسدية، ومظهر الفراء، وأي علامات تدل على الضيق. وشملت نقاط النهاية الإنسانية المحددة مسبقاً الخمول الشديد، وعدم القدرة على الوصول إلى الغذاء أو الماء المتاح أو استهلاكهما، والوضعية الجسدية غير الطبيعية، وانخفاض القدرة على الحركة، وانتصاب الشعر المستمر، وأي مظاهر واضحة أخرى للضيق. وكان من المقرر إخضاع الحيوانات التي تستوفي أي من هذه المعايير للقتل الرحيم الفوري؛ ومع ذلك، لم تستوفِ أي من الحيوانات معايير نقطة النهاية الإنسانية خلال الدراسة. وفي اليوم 11، وبعد مرور 24 h من العلاج النهائي، تم تحفيز التخدير العميق عن طريق الحقن داخل الصفاق للكيتامين (80 mg/kg) مع الزيلازين (10 mg/kg). واستُخدم غياب استجابة سحب الطرف للتحقق من الوصول إلى مستوى تخدير كافٍ. وبمجرد تأكيد عمق التخدير الكافي، تم سحب ما يقرب من 3–5 mL من الدم من كل حيوان عن طريق البزل داخل القلب. ثم اكتملت عملية القتل الرحيم عن طريق استنزاف الدم بينما كان الحيوان لا يزال تحت التخدير العميق. واستُخدم غياب كل من النشاط القلبي والتنفس التلقائي لتأكيد الوفاة.

وُضعت عينات الدم التي جُمعت لقياسات الكيمياء الحيوية للمصل في أنابيب خالية من مضادات التخثر وتُرِكت حتى يكتمل التجلط. ثم خضعت الأنابيب للطرد المركزي عند 3,000 × g لمدة 10–15 دقيقة عند 4 °C، وبعد ذلك تم فصل جزء المصل وتخزينه عند −80 °C حتى موعد التحليل. أما العينات المخصصة لقياس الجلوتاثيون فقد جُمعت بشكل منفصل في أنابيب تحتوي على حمض إيثيلين ثنائي أمين رباعي الخليك (EDTA). ونظراً لأن هذه العينات كانت تحتوي على مضاد للتخثر، فقد تمت معالجتها دون مرحلة التجلط وفقاً لإجراء مقايسة الجلوتاثيون المقابل. واعتُبر فصل المصل مقبولاً عندما كان المصل المسترجع صافياً ولا يظهر عليه أي دليل مرئي على حدوث تحلل دموي.

بمجرد التأكد من الوفاة، أُجري شق جراحي وسطي في البطن واستُؤصلت الكليتان بعناية من كل حيوان. ثم أزيلت الأنسجة الدهنية والضامة المحيطة بالعينات. خُصصت الكلية اليمنى حصرياً للفحص الهيستوباثولوجي، بينما خُصصت الكلية اليسرى للتحليل البيوكيميائي. وحُللت الأنسجة المختلطة من الكلية اليسرى دون تشريح منفصل للقشرة الكلوية والنخاع. تم التعامل مع الكليتين بشكل مستقل، وظلت عينات الحيوانات المختلفة منفصلة طوال عملية المعالجة دون تجميعها. وُضعت الكلية اليمنى بأكملها في فورمالدهيد منظم متعادل بتركيز 10% وعولجت لغرض التقييم الهيستوباثولوجي. وأُعدت مقاطع تشمل القشرة الكلوية والنخاع الخارجي وفُحصت وفقاً للإجراءات الموضحة في بروتوكول المعالجة والتقييم الهيستوباثولوجي. وُصمت كل كلية يسرى بشكل فردي وحُفظت في درجة حرارة -80 °C حتى مرحلة التجانس والاختبار البيوكيميائي. وبعد الاستئصال، تم التحقق من السلامة الظاهرية للأنسجة، والاحتفاظ بكمية كافية منها لإجراء التقييمات الهيستوباثولوجية والبيوكيميائية المقررة.

لم يكن من الممكن تعمية الباحث المسؤول عن استحثاث النموذج وإعطاء العلاج لأن المجموعات التجريبية خضعت لإجراءات مختلفة. ومع ذلك، تم إخفاء هويات المجموعات عن الباحثين الذين أجروا التحليلات الكيميائية الحيوية والإحصائية، وعن اختصاصي الأمراض الذي أجرى التقييمات النسيجية المرضية. تم الاحتفاظ بجميع الحيوانات المدرجة في الدراسة وإدراجها في التحليلات اللاحقة. تم التعامل مع العينات البيولوجية، وأنسجة الحيوانات، والمثبتات القائمة على الفورمالدهيد، ومواد النفايات الكيميائية الأخرى باستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة. وتم التخلص من جميع النفايات البيولوجية والكيميائية وفقاً لمتطلبات السلامة البيولوجية المؤسسية وإدارة النفايات الخطرة.

التحليلات الكيميائية الحيوية

أُجريت القياسات الكيميائية الحيوية باستخدام المصل، والدم المانع للتجلط بـ EDTA، ومتجانسات أنسجة الكلية اليسرى التي جُمِعت من كل حيوان. وتُعرض الإجراءات أدناه وفقاً للمصفوفة البيولوجية المستخدمة لكل معامل. تم تحليل المصل لتقدير اليوريا، ونيتروجين يوريا الدم (BUN)، والكرياتينين، وسوبر أكسيد ديسميوتيز (SOD)، والمالونديالدهيد (MDA). وعملت اليوريا وBUN والكرياتينين كمؤشرات لوظائف الكلى، بينما تم تقييم نشاط SOD وتركيز MDA كمعاملات للإجهاد التأكسدي. تم الحصول على قيم يوريا المصل وBUN باستخدام مقايسة اليوريز-جلوتامات ديهيدروجيناز الإنزيمية ذاتها. وفي هذه الطريقة، تم تحليل اليوريا مائياً بواسطة اليوريز لإنتاج الأمونيا، والتي تفاعلت لاحقاً مع 2-oxoglutarate ونيكوتيناميد أدنين ثنائي النوكليوتيد المختزل (NADH) في وجود جلوتامات ديهيدروجيناز. وكانت الطريقة التحليلية المستخدمة هي مقايسة حركية إنزيمية لليوريز-جلوتامات ديهيدروجيناز. وقيس انخفاض الامتصاصية الناتج عن استهلاك NADH حركياً باستخدام مطياف ضوئي. وقيس تركيز كرياتينين المصل لونياً باستخدام محلل كيميائي حيوي آلي. كما قيس نشاط SOD في المصل لونياً باستخدام عدة مقايسة متوفرة تجارياً على ذات المحلل الكيميائي الحيوي الآلي. واعتمدت مقايسة SOD على توليد جذور السوبر أكسيد بواسطة نظام الزانثين-زانثين أوكسيديز وتفاعلها مع 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride لتكوين منتج فورمازان ملون. وقيست الامتصاصية النهائية عند 505 nm، وعُبِّر عن نشاط SOD بـ U/mL. وحدد تركيز MDA في المصل لونياً باستخدام تفاعل حمض الثيوباربيتوريك. وخُلطت عينات المصل مع حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك البارد لترسيب البروتينات، وفُصل الراسب الناتج بواسطة الطرد المركزي. وأُجريت خطوة الطرد المركزي هذه عند 7,500 × g لمدة 5 min عند 4 °C. ثم فاعل السائل العلوي مع حمض الثيوباربيتوريك عند 90 °C لمدة 60 min، ثم بُرِّد وقيس عند 532 nm. وحُسبت تركيزات MDA من منحنى المعايرة المقابل وعُبِّر عنها بـ nmol/mL. أُجري تحليل الجلوتاثيون (GSH) باستخدام الدم المانع للتجلط بـ EDTA. ورُسبت البروتينات باستخدام حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك، وحُلِّلت العينات الناتجة المزيلة من البروتين لونياً بطريقة إلمان المعدلة. ومُزجت العينات مع 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) في محلول Tris المنظم بتركيز 500 mM عند pH 8.2. وأدى تفاعل مجموعات الثيول في GSH مع DTNB إلى توليد منتج ملون، وسُجلت الامتصاصية عند 412 nm. أما نشاط الكاتاليز (CAT) فقد حُدد باستخدام إجراء لوني من خطوتين. حيث حُضنت العينات أولاً مع كمية معروفة من بيروكسيد الهيدروجين، الذي حوله الكاتاليز إلى ماء وأكسجين جزيئي. وبعد إنهاء التفاعل الإنزيمي، قيس بيروكسيد الهيدروجين المتبقي باستخدام كاشف لوني. وسُجلت الامتصاصية عند 405 nm، وأُبلغ عن نشاط CAT بـ U/mL. وبالنسبة لقياسات أنسجة الكلى، استُخدمت الكلية اليسرى من كل حيوان كنسيج مختلط دون فصل القشرة عن النخاع. وكما ورد في الإجراء، فقد احتُفظت الكلية اليمنى حصرياً للتقييم النسيجي المرضي. وعولجت العينات التابعة لكل حيوان بشكل مستقل ولم تُجمع في أي مرحلة. وتم تجنيس كل عينة من الكلية اليسرى على الثلج في محلول فوسفات منظم بتركيز 50 mM عند pH 7.4 باستخدام نسبة نسيج إلى محلول منظم تبلغ 1:10 (w/v). وأُنتج متجانس نسيج كلوي واحد خاص بكل جرذ. واستُخدمت حصص منفصلة من هذا المتجانس لقياسات الأنسجة الكلوية المختلفة، لضمان اشتقاق جميع المعاملات من ذات الحيوان الفردي. ثم طردت متجانسات الأنسجة الكلوية الناتجة مركزياً عند 14,000 × g لمدة 10 min عند 4 °C. وعقب الطرد المركزي، جُمع السائل العلوي الناتج من كل حيوان على حدة وقُسم إلى حصص للتحليلات المخطط لها لأنسجة الكلى. وقِيست تركيزات عامل نخر الورم ألفا (TNF-α)، وإنترلوكين-1 بيتا (IL-1β)، وإنترلوكين-6 (IL-6)، وسيستاتين C، وKIM-1 في السوائل العلوية لأنسجة الكلى باستخدام عدات مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) الخاصة بالجرذان. وأُجريت المقايسات وفقاً لبروتوكولات الشركة المصنعة. وكانت ظروف التحضين متطابقة لمقايسات ELISA الخاصة بـ TNF-α وIL-1β وIL-6 وسيسيستاتين C وKIM-1. وفي كل مقايسة، حُضنت العينات وكواشف ELISA لمدة 1 h عند 37 °C؛ وبعد خمس دورات غسيل، أُضيفت محاليل الركيزة A وB وحُضنت لمدة 10 min عند 37 °C. وباختصار، أضيفت المعايير والسوائل العلوية لأنسجة الكلى إلى الآبار المطلية مسبقاً بالأجسام المضادة، يليه الجسم المضاد الكاشف المبيوتن والمقترن بالستريبتاديفين-بيروكسيداز الفجل الحذأ. وبعد خطوات التحضين المحددة، أزيلت المكونات غير المرتبطة باستخدام غسالة ألواح دقيقة آلية. ثم أُضيف محلول الركيزة، وأنهي تفاعل اللون باستخدام محلول إيقاف حمضي. وقِيست الامتصاصية عند 450 nm باستخدام قارئ ألواح دقيقة، وحُسبت تركيزات المادة المحللة من منحنيات المعايرة المقابلة. وأُجريت قياسات ELISA لأنسجة الكلى في مكررات ثنائية. وبالنسبة لكل مادة محللة، حُسب متوسط البئرَيْن المكررَيْن تقنياً للحصول على قيمة واحدة على مستوى الحيوان. ولم تُعتبر الآبار المكررة تقنياً والحصص المنفصلة التي تم الحصول عليها من نفس المتجانس الخاص بالحيوان ملاحظات مستقلة. وأُجريت جميع القياسات الكيميائية الحيوية تحت ظروف قياسية خاصة بكل مقايسة. وعولجت عينات المصل، والدم المانع للتجلط بـ EDTA، وعينات أنسجة الكلى بشكل منفصل وفقاً لمتطلبات الطرق التحليلية المقابلة. وكان الباحثون الذين أجروا التحليلات الكيميائية الحيوية معزولين عن معرفة توزيع المجموعات. واعتُبِر الحيوان الفردي، وليس كل عينة مصل أو عينة دم أو عينة كلية أو حصة متجانس أو بئر مكرر تقني، هو الوحدة التجريبية. وبناءً على ذلك، أُدرجت ست ملاحظات مستقلة على مستوى الحيوان في التحليل الإحصائي لكل مجموعة تجريبية.

المعالجة والتقييم النسيجي المرضي

تم تحضير عينات الكلية اليمنى للتقييم المجهري عن طريق المعالجة النسيجية الروتينية. غُمرت الكلية اليمنى كاملة من كل حيوان في فورمالدهيد منظم متعادل بتركيز 10% لمدة 72 h في درجة حرارة الغرفة. وبعد التثبيت، أُجري تجفيف للأنسجة بالتسلسل في إيثانول بتركيزات 50%، و70%، و80%، و96%، و100%، مع تطبيق كل تركيز لمدة 1 h. ثم عُرّضت العينات لحمامين من الزايلين لمدة 30 min لكل حمام قبل الطمر في البارافين. وباستخدام الميكروتوم الدوار، تم الحصول من كتل البارافين على مقاطع بسمك 5 µm تشمل كلاً من القشرة الكلوية والنخاع الخارجي.

بالنسبة لصبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين (HE)، تم إزالة البارافين من المقاطع وإعادة ترطيبها، ثم عُرِّضت للهيماتوكسيلين لمدة 5 min، وغُسلت تحت مياه الصنبور الجارية لمدة 5 min إضافية. استُخدم الكحول الحمضي للتمايز، وبعد ذلك تم تلوين المقاطع باللون الأزرق في ماء أمونياكي لمدة 1 min والصبغ المقابل بالإيوزين لمدة 2 min. ثم جُففت المقاطع المصبوغة لاحقاً في تركيزات تصاعدية من الكحول، ونُقيت باستخدام xylene، وثُبتت بشكل دائم تحت شرائح تغطية.

كذلك تم إزالة البارافين وإعادة ترطيب المقاطع المخصصة لصبغة ماسون الثلاثية (Masson’s trichrome). أُجريت المعالجة بالمثبت (mordant) لمدة 60 min عند 56 °C، يلي ذلك الشطف تحت مياه الصنبور الجارية لمدة 10 min. ثم عولجت المقاطع بالتتابع باستخدام هيماتوكسيلين الحديد لويجرت (Weigert’s iron hematoxylin) لمدة 10 min، ومحلول بيبريش سكارليت-فوشين الحمضية (Biebrich scarlet–acid fuchsin) لمدة 15 min، ومحلول حمض الفوسفوتنجستيك لمدة 10 min، ومحلول أنيلين الأزرق لمدة 10 min. وبعد الغمر في حمض الأسيتيك بتركيز 1% لمدة 5 min، تم تجفيف المقاطع، ثم تصفيتها في الزايلين، وتغطيتها بشرائح التغطية.

قبل التقييم المجهري، تم التحقق بشكل منفصل من كفاءة التصبيغ لكل طريقة. اعتُبرت المقاطع المصبوغة بـ HE مناسبة عندما كانت تفاصيل النواة والتباين السيتوبلازمي واضحة ومميزة، بينما قُبلت المقاطع المصبوغة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (Masson’s trichrome) عندما أمكن تصور تراكيب النسيج الضام بوضوح. بالنسبة لكل حيوان، تم فحص ثلاثة مقاطع مصبوغة بـ HE وثلاثة مقاطع مصبوغة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان. كما تم تقييم خمسة حقول مجهرية مختارة عشوائياً في كل مقطع باستخدام عدسة شيئية 40×. وبناءً على ذلك، تم فحص 15 حقلاً مجهرياً لكل طريقة تصبيغ لكل حيوان. أُجريت جميع الفحوصات المجهرية باستخدام نفس العدسة الشيئية وظروف تقييم موحدة عبر جميع الحيوانات والمجموعات التجريبية. قُيمت المقاطع المصبوغة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان نوعياً من حيث توزيع وترسيب الكولاجين الخلالي، وتراكم المادة الخلالية خارج الخلية، والبنية الأنبوبية الخلالية. ولم تُستخدم هذه المقاطع لإنشاء درجات الإصابة النسيجية المرضية شبه الكمية من 0 إلى 3. تم التقاط صور مجهرية ممثلة للمقاطع المصبوغة بـ HE وصبغة ماسون ثلاثية الألوان باستخدام عدسة شيئية 40×، وأُدرج شريط مقياس طول 100 µm في كل صورة ممثلة. حُصل على هذه الصور المجهرية لأغراض توضيحية ولم تُعامل كملاحظات مستقلة في التقييم النسيجي المرضي أو التحليلات الإحصائية. أجريت جميع التقييمات النسيجية المرضية بواسطة طبيب مسالك بولية خبير ظل جاهلاً لهويات المجموعات التجريبية. وكان الهدف من استخدام فاحص واحد مُعمى هو الحد من انحياز التقييم والتباين الناتج عن الاختلافات بين المراقبين. تم تقييم النخر الأنبوبي، وتوسع الأنابيب، والتنكس الخلوي، والاحتقان الوعائي بشكل شبه كمي في المقاطع الكلوية المصبوغة بـ HE وفقاً لنظام مقتبس من نماذج إصابة كلوية منشورة سابقاً^28,29. وبالنسبة لكل معيار، تراوحت الدرجات من 0 إلى 3، وهو ما يقابل غياب الضرر النسيجي المرضي، أو وجود ضرر طفيف، أو متوسط، أو شديد، على التوالي. ولكل حيوان، اعتُبرت النتائج المستخلصة من الحقول المجهرية الخمسة المفحوصة في كل مقطع من المقاطع الثلاثة المصبوغة بـ HE، أي ما مجموعه 15 حقلاً، بشكل جماعي لتعيين درجة واحدة من 0 إلى 3 لكل معيار نسيجي مرضي. وبذلك، ساهم كل حيوان بدرجة واحدة للنخر الأنبوبي، وتوسع الأنابيب، والتنكس الخلوي، والاحتقان الوعائي. عُوملت المقاطع النسيجية والحقول المجهرية كعينات فرعية داخل الحيوان ولم تُعتبر ملاحظات مستقلة. وضمن كل مقطع، اختيرت الحقول المجهرية عشوائياً من مناطق قشرية نخاعية خارجية متماثلة لتوحيد أخذ العينات التشريحية عبر الحيوانات والمجموعات التجريبية. اعتُبر الحيوان الفردي، وليس كل كلية أو مقطع نسيجي أو حقل مجهري، هو الوحدة التجريبية. وبناءً على ذلك، تم تضمين ست ملاحظات مستقلة على مستوى الحيوان في التحليل الإحصائي لكل مجموعة تجريبية. وتمثل القيم المعروضة في Table 3 متوسطات المجموعات المحسوبة من درجات كل حيوان فردي للحيوانات الستة في كل مجموعة تجريبية.

التحليل الإحصائي

أُجريت التحليلات الإحصائية باستخدام برمجيات التحليل الإحصائي. واعتُبر الحيوان الفردي هو الوحدة التجريبية لجميع التحليلات الإحصائية. واشتملت كل مجموعة تجريبية على ستة حيوانات مستقلة (n = 6 لكل مجموعة). ولم تُعامل المكررات التقنية، وآبار المقايسة، والمقاطع النسيجية، والمجالات المجهرية كملاحظات مستقلة، ولم تُستخدم لزيادة حجم العينة الإحصائية. عُرضت المتغيرات المستمرة كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD). وقُيم التوزيع الطبيعي بشكل منفصل داخل كل مجموعة تجريبية باستخدام اختبار Shapiro–Wilk، كما قُيم تجانس التباينات باستخدام اختبار Levene. ونظراً للتصميم التجريبي المتوازن تماماً مع أحجام عينات متساوية عبر المجموعات، استُخدم تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) لمقارنة المجموعات. وأُجريت المقارنات الزوجية باستخدام اختبار Duncan للمقارنات المتعددة البعدية. وقُيمت القيم المتطرفة المحتملة من خلال الفحص الرسومي للمخططات الصندوقية وفحص الملاحظات الفردية. ولم تُعتبر أي ملاحظة ممثلة لخطأ في القياس أو نتيجة تجريبية غير صالحة، ولم تُستبعد أي نقطة بيانات لأسباب إحصائية. واعتُبرت القيمة الاحتمالية p-value < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

مؤشرات وظائف الكلى في المصل (اليوريا، ونيتروجين يوريا الدم، والكرياتينين)

تم تلخيص التصميم التجريبي، وتوزيع المجموعات الحيوانية، وجدول العلاج، والجدول الزمني لجمع العينات في الدراسة الحالية في  الشكل 1. لُوحظت فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات فيما يتعلق بمستويات يوريا المصل، ونيتروجين يوريا الدم (BUN)، والكرياتينين (p = 0.003، و p = 0.003، و p = 0.002، على التوالي). فقد كان متوسط مستوى يوريا المصل 67.43 mg/dL ± 53.11 mg/dL في مجموعة الضبط (Control)، وارتفع إلى 606.71 mg/dL ± 429.42 mg/dL في مجموعة CI-AKI. وبالمثل، ارتفع متوسط مستوى BUN من 31.51 mg/dL ± 24.82 mg/dL في مجموعة الضبط إلى 268.63 mg/dL ± 190.84 mg/dL في مجموعة CI-AKI. كما ارتفعت مستويات كرياتينين المصل بشكل ملحوظ، من 0.60 mg/dL ± 0.05 mg/dL في مجموعة الضبط إلى 3.27 mg/dL ± 2.14 mg/dL في مجموعة CI-AKI. وأظهرت مقارنات دانكن البعدية (Duncan’s post hoc) أن مستويات يوريا المصل وBUN والكرياتينين كانت أقل بشكل ملحوظ في كل مجموعة علاجية، وهي مجموعات CI-AKI + Montelukast، وCI-AKI + NAC، وCI-AKI + Montelukast + NAC، مقارنة بمجموعة CI-AKI غير المعالجة (جميع قيم p < 0.05). تظهر بيانات مؤشرات وظائف الكلى في المصل في الجدول 1.

معايير الإجهاد التأكسدي وأنشطة الإنزيمات المضادة للأكسدة

لوحظت فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات من حيث مستويات SOD وGSH وCAT وMDA (p = 0.044، وp = 0.001، وp = 0.003، وp = 0.001، على التوالي؛ الجدول 1). وأظهر تحليل Duncan البعدي أن مستويات GSH كانت أعلى بشكل ملحوظ في مجموعات المونتيلوكاست، وNAC، والعلاج المركب مقارنة بمجموعة CI-AKI غير المعالجة (جميع قيم p < 0.05). كما سجلت المجموعة المركبة مستوى GSH أعلى بشكل ملحوظ من مجموعة Control (p < 0.05). ومع ذلك، لم تُلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعة المركبة وأي من مجموعتي العلاج الأحادي، أو بين مجموعتي العلاج الأحادي نفسهما (جميع قيم p > 0.05). وقد لوحظ أدنى مستوى لـ SOD في مجموعة CI-AKI (92.23 U/mL ± 16.37 U/mL)، بينما سجلت مجموعة Control قيمة 147.81 U/mL ± 33.27 U/mL. وكانت مستويات GSH في أدنى مستوياتها في مجموعة CI-AKI (66.05 mmol/L ± 24.72 mmol/L) وفي أعلى مستوياتها في مجموعة CI-AKI + Montelukast + NAC (172.44 mmol/L ± 60.48 mmol/L). وكان نشاط CAT في أعلى مستوياته في مجموعة Control (93.35 U/mL ± 18.75 U/mL) وفي أدنى مستوياته في مجموعة CI-AKI (33.22 U/mL ± 17.07 U/mL). أما فيما يتعلق بمستويات MDA، فقد لوحظت أعلى قيمة في مجموعة CI-AKI (54.13 nmol/mL ± 19.37 nmol/mL)، بينما سُجلت أدنى قيمة في مجموعة CI-AKI + NAC (21.53 nmol/mL ± 5.07 nmol/mL). وتظهر البيانات المتعلقة بمعايير الإجهاد التأكسدي وأنشطة الإنزيمات المضادة للأكسدة في الجدول 1.

المؤشرات الحيوية للإصابة الكلوية والالتهاب (KIM-1 وCystatin C وTNF-α وIL-1β وIL-6)

لوحظت فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات فيما يتعلق بمستويات cystatin C الكلوي، وIL-6، وKIM-1، وTNF-α، وIL-1β (p < 0.001، وp = 0.008، وp = 0.027، وp = 0.006، وp < 0.001، على التوالي؛ الجدول 2). وأظهرت مقارنات دكان اللاحقة (Duncan’s post hoc) أن مستويات cystatin C، وIL-6، وKIM-1، وTNF-α، وIL-1β كانت أقل بشكل ملحوظ في كل مجموعة علاجية، وهي مجموعات CI-AKI + Montelukast، وCI-AKI + NAC، وCI-AKI + Montelukast + NAC، مقارنة بمجموعة CI-AKI غير المعالجة (جميع القيم p < 0.05). وبالنسبة لـ IL-1β، لوحظ أيضًا فرق ذو دلالة إحصائية بين مجموعتي CI-AKI + Montelukast وCI-AKI + NAC (p < 0.05). وكانت مستويات cystatin C الكلوي هي الأعلى في مجموعة CI-AKI (18.43 ng/mL ± 1.06 ng/mL)، بينما سجلت مجموعة Control قيمة 10.30 ng/mL ± 0.78 ng/mL. وبالمثل، كانت مستويات IL-6 هي الأعلى في مجموعة CI-AKI (13.41 ng/L ± 2.14 ng/L) والأدنى في مجموعة Control (9.29 ng/L ± 2.70 ng/L). وكانت مستويات KIM-1 هي الأعلى في مجموعة CI-AKI (3.07 ng/mL ± 0.36 ng/mL)، مقارنة بـ 2.25 ng/mL ± 0.54 ng/mL في مجموعة Control. وبالمثل، كانت مستويات TNF-α هي الأعلى في مجموعة CI-AKI (161.69 ng/L ± 26.14 ng/L)، بينما لوحظت المستويات الأدنى في مجموعة Control (95.49 ng/L ± 16.98 ng/L). وكانت مستويات IL-1β هي الأعلى في مجموعة CI-AKI (9.28 ng/mL ± 0.68 ng/mL)، بينما لوحظت القيمة الأدنى في مجموعة CI-AKI + Montelukast (7.34 ng/mL ± 0.57 ng/mL). البيانات المتعلقة بالمؤشرات الحيوية للإصابة الكلوية والالتهاب معروضة في الجدول 2. ومن المهم الإشارة إلى أنه على الرغم من أن بعض قيم المؤشرات الكيميائية الحيوية في مجموعة CI-AKI + Montelukast + NAC كانت أعلى عدديًا من تلك الموجودة في مجموعة CI-AKI + Montelukast، إلا أن مقارنات دكان اللاحقة لم تظهر فروقًا ذات دلالة إحصائية بين مجموعتي العلاج هاتين لأي من المتغيرات الكيميائية الحيوية التي تم تقييمها، بما في ذلك بارامترات الإجهاد التأكسدي، والمؤشرات الحيوية للإصابة الكلوية، والمؤشرات الحيوية للالتهاب (p > 0.05).

التقييم النسيجي المرضي

النتائج الهيستوباثولوجية

أظهرت مقاطع الكلى المصبوغة بـ HE حفاظاً على البنية الكلوية في مجموعة Control، مع شكل طبيعي للكبيبات والأنابيب. وفي المقابل، أظهرت مجموعة CI-AKI غير المعالجة تغيرات نسيجية مرضية ملحوظة، شملت إصابة الخلايا الطلائية الأنبوبية، وتنكس خلوي واسع النطاق، وتوسعاً أنبوبياً، وبقايا خلوية داخل اللمعات الأنبوبية، واحتقاناً وعائياً. وكانت التغيرات التنخرية واضحة بشكل خاص في القطع الأنبوبية القريبة. وفي مجموعة CI-AKI + Montelukast، انخفضت شدة الإصابة الأنبوبية مقارنة بمجموعة CI-AKI غير المعالجة، رغم بقاء التغيرات التنكسية البؤرية واضحة. وبالمثل، أظهرت مجموعة CI-AKI + NAC حفاظاً أفضل على سلامة الخلايا الطلائية الأنبوبية ومناطق تنخرية أقل. وعند الفحص النسيجي المرضي النوعي، بدت البنية الكلوية محفوظة في مجموعة CI-AKI + Montelukast + NAC، مع حفاظ كبير على تراكيب القشرة والنخاع، وكون التنخر الأنبوبي، والتوسع الأنبوبي، والتنكس الخلوي، والاحتقان الوعائي محدودة نسبياً. وكشفت المقاطع المصبوغة بـ Masson’s trichrome عن توزيع طبيعي للكولاجين الخلالي في مجموعة Control. أما في مجموعة CI-AKI غير المعالجة، فقد لوحظ زيادة في ترسيب الكولاجين الخلالي، واختلال في التنظيم البنيوي الأنبوبي الخلالي، وتراكم في المادة الخلالية خارج الخلوية. وبدت هذه التغيرات أقل وضوحاً في مجموعات العلاج، بما في ذلك مجموعة العلاج المركب، مقارنة بمجموعة CI-AKI غير المعالجة. تظهر مقاطع الكلى الممثلة المصبوغة بـ HE و Masson’s trichrome والتي توضح هذه النتائج في Figure 2.

التقييم النسيجي المرضي شبه الكمي

أظهر التقييم الهيستوباثولوجي شبه الكمي أن درجات نخر الأنيبيبات، وتوسع الأنيبيبات، والتنكس الخلوي، والاحتقان الوعائي كانت الأعلى في مجموعة CI-AKI غير المعالجة. وكانت متوسطات الدرجات في هذه المجموعة 2.67 و 2.83 و 2.67 و 2.50، على التوالي. وتماشى ارتفاع متوسطات الدرجات نسبياً، واقترابها من الحد الأعلى للمقياس (0-3)، مع التغيرات الأنيبيبية والوعائية الشاملة والشديدة التي لوحظت في الفحص الهيستوباثولوجي النوعي في المجموعة ذاتها. وفي المقابل، كانت جميع المعايير غائبة في مجموعة الضبط (Control). ولوحظت درجات إصابة أقل في جميع مجموعات العلاج مقارنة بمجموعة CI-AKI غير المعالجة. حيث أظهرت مجموعة CI-AKI + Montelukast متوسطات درجات بلغت 1.33 لنخر الأنيبيبات، و 1.50 لتوسع الأنيبيبات، و 1.17 للتنكس الخلوي، و 1.00 للاحتقان الوعائي. وكانت القيم المقابلة في مجموعة CI-AKI + NAC هي 1.17 و 1.17 و 0.83 و 0.83، على التوالي. ومن الناحية العددية، لوحظت أدنى متوسطات لدرجات الإصابة الهيستوباثولوجية في مجموعة CI-AKI + Montelukast + NAC، حيث بلغت القيم المتوسطة 0.50 و 0.67 و 0.50 و 0.17 لنخر الأنيبيبات، وتوسع الأنيبيبات، والتنكس الخلوي، والاحتقان الوعائي، على التوالي. وتُعرض بيانات تسجيل الدرجات الهيستوباثولوجية التفصيلية في الجدول 3.

يتم توفير البيانات الخام التي تستند إليها جميع التحليلات الكيميائية الحيوية والنسيجية المرضية، وصور الأنسجة الأصلية غير المقصوصة لصبغة HE وصبغة ماسون ثلاثية الألوان (Masson’s trichrome) في الملف التكميلي 1.

الشكل 1: التصميم التجريبي والجدول الزمني للدراسة. تمثيل تخطيطي لمسار العمل التجريبي. تم توزيع ثلاثين من ذكور جردان Wistar البالغة عشوائياً على خمس مجموعات (عدد = 6 لكل مجموعة) بعد فترة تأقلم استمرت 7 أيام. لم تخضع مجموعة الضبط (Control) لحرمان من الماء، أو تحريض لإصابة الكلى الحادة الناجمة عن الصبغة (CI-AKI)، أو أي علاج. أما المجموعات المتبقية فقد خضعت لفترة حرمان من الماء لمدة 16 ساعة لمرة واحدة، تلاها إعطاء تسلسلي وريدي لكل من L-NAME (بجرعة 10 mg/kg)، وإندوميتاسين (بجرعة 10 mg/kg)، وأيوهيكسول (بجرعة 3 g iodine/kg) لتحريض CI-AKI. وبعد ساعة واحدة من إعطاء أيوهيكسول، تلقت مجموعات العلاج المحددة مونتيلوكاست (بجرعة 10 mg/kg، عن طريق التغذية القسرية الفموية)، أو NAC (بجرعة 100 mg/kg، عن طريق الحقن داخل الصفاق)، أو كليهما مرة واحدة يومياً في الأيام من 8 إلى 10، بينما لم تتلقَّ مجموعة CI-AKI غير المعالجة أي علاج علاجي. وخضعت جميع المجموعات للإجراءات النهائية وجمع العينات في اليوم 11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: مقاطع ممثلة للكلى مصبوغة بصبغة HE وصبغة ماسون ثلاثية الألوان من المجموعات التجريبية. مقاطع ممثلة للكلى مصبوغة بصبغة HE وصبغة ماسون ثلاثية الألوان تم الحصول عليها من مجموعات (A) الضابطة، و(B) إصابة الكلى الحادة الناجمة عن صبغة التباين (CI-AKI)، و(C) CI-AKI + مونتيلوكاست، و(D) CI-AKI + NAC، و(E) CI-AKI + مونتيلوكاست + NAC. تُظهر المقاطع المصبوغة بصبغة HE (الصف العلوي) حفاظاً على البنية الكلوية في المجموعة الضابطة، بينما تُظهر مجموعة CI-AKI نخرًا أنبوبيًا بارزًا (*)، وتوسعًا أنبوبيًا (+)، وتنكسًا خلويًا (×)، واحتقانًا وعائيًا (↑). وبدت هذه التغيرات النسيجية المرضية مخففة في المقاطع الممثلة لمجموعات العلاج مقارنة بتلك الخاصة بمجموعة CI-AKI غير المعالجة. وتُظهر المقاطع المصبوغة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (الصف السفلي) زيادة في ترسب الكولاجين الخلالي وتفككًا في البنية الأنبوبية الخلالية في مجموعة CI-AKI، بينما بدت هذه التغيرات أقل وضوحًا في المقاطع الممثلة لمجموعات العلاج. شريط المقياس = 100 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

متغير	مجموعة الضبط	إصابة الكلى الحادة الناجمة عن صبغة التباين	إصابة الكلى الحادة الناجمة عن صبغة التباين + المورفين (CI-AKI+M)	إصابة الكلى الحادة الناجمة عن صبغة التباين + إن-أسيتيل سيستين	إصابة الكلى الحادة الناجمة عن صبغة التباين + إن-أستيل سيستين + مـ	p
اليوريا (ملجم/ديسيلتر)	67.43±53.11a	606.71±429.42b	105.89±28.63a	243.14±135.99a	293.61±212.05a	0.003
نيتروجين يوريا الدم (مجم/ديسيلتر)	31.51±24.82a	268.63±190.84b	51.53±14.69a	129.54±73.54a	108.38±87.36a	0.003
الكرياتينين (ملغم/ديسيلتر)	0.60±0.05a	3.27±2.14b	0.61±0.12a	1.53±1.17a	1.28±0.55a	0.002
سوبر أكسيد ديسميوتاز (وحدة/مل)	147.81±33.27a	92.23±16.37b	130.96±42.19a	137.87±31.95a	141.71±30.27a	0.044
الجلوتاثيون المختزل (ملي مول/لتر)	124.29±21.24b	66.05±24.72a	133.87±26.95تحدث هذه الحالة عندما يتم إغلاق صمام الشريان الأبهر (البطين الأيسر) بشكل غير كامل، مما يؤدي إلى تدفق الدم في الاتجاه المعاكس من الشريان الأبهر إلى البطين الأيسر.	139.31±30.10سرطان الثدي	172.44±60.48ج	0.001
كاتالاز (وحدة/مل)	93.35±18.75جـ	33.22±17.07a	58.67±32.95أ ب	52.64±19.97أب	75.46±26.85بسبب	0.003
مالون ديالدهيد (نمول/مل)	23.42±13.48a	54.13±19.37b	22.40±14.81a	21.53±5.07a	37.01±9.29a	0.001
ضمن كل صف، لم تكن المجموعات التي تتشارك في حرف علوي واحد على الأقل مختلفة بشكل معنوي، بينما كانت المجموعات التي لا تشترك في أي حرف علوي مختلفة بشكل معنوي وفقاً لاختبار دنكان للمقارنات البعدية (p < 0.05).

الجدول 1: معايير الإجهاد البيوكيميائي والأكسجيني في المجموعات التجريبية. الفوارق الزوجية الجوهرية: اليوريا، وBUN، والكرياتينين (CREA)، وSOD، وMDA، بين مجموعة CI-AKI ومجموعات Control، وCI-AKI+M، وCI-AKI+NAC، وCI-AKI+M+NAC؛ وGSH، بين مجموعة CI-AKI وجميع المجموعات الأخرى، وبين مجموعة Control ومجموعة CI-AKI+M+NAC؛ وCAT، بين مجموعة Control ومجموعات CI-AKI، وCI-AKI+M، وCI-AKI+NAC، وبين مجموعة CI-AKI ومجموعة CI-AKI+M+NAC. البيانات معروضة كمتوسط ± الانحراف المعياري (n = 6) وتم تحليلها باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way ANOVA) متبوعاً باختبار دنكان البعدي (Duncan’s post hoc test). القيم التي لا تشترك في حرف علوي تختلف جوهرياً (p < 0.05).

متغير	مجموعة ضابطة	إصابة الكلى الحادة المرتبطة بصبغة التباين (CI-AKI)	إصابة الكلى الحادة الناجمة عن صبغة التباين + M	إصابة الكلى الحادة الناجمة عن صبغة التباين + إن-أسيتيل سيستين	إصابة الكلى الحادة الناجمة عن صبغة التباين + إن-أستيل سيستئين + ميموريستور	p
سيستاتين سي (نانوجرام/مللي لتر)	10.30±0.78a	18.43±1.06b	10.90±1.13a	11.00±0.59a	11.13±0.84a	<0.001
إنترلوكين-6 (نانوجرام/لتر)	9.29±2.70a	13.41±2.14b	10.24±0.86a	10.66±0.83a	10.85±1.63a	0.008
KIM-1 (نانوجرام/ملليلتر)	2.25±0.54a	3.07±0.36b	2.39±0.60a	2.45±0.33a	2.45±0.17a	0.027
عامل نخر الورم-α (نانوجرام/لتر)	95.49±16.98a	161.69±26.14b	110.26±38.12a	119.42±35.35a	127.76±15.13a	0.006
إنترلوكين-1β (نانوجرام/ملل)	7.65±0.53أب	9.28±0.68س	7.34±0.57a	8.24±0.73b	8.11±0.72أب	<0.001
ضمن كل صف، لم تكن المجموعات التي تشترك في حرف علوي واحد على الأقل مختلفة بشكل معنوي، بينما كانت المجموعات التي لا تشترك في أي حرف علوي مختلفة بشكل معنوي وفقًا لاختبار دنكان البعدي (p < 0.05).

الجدول 2: مستويات المؤشرات الحيوية للإصابة الكلوية والالتهاب في المجموعات التجريبية. فروق زوجية ذات دلالة إحصائية: cystatin C و IL-6 و KIM-1 و TNF-α، بين مجموعة CI-AKI ومجموعة Control، ومجموعات CI-AKI+M و CI-AKI+NAC و CI-AKI+M+NAC؛ أما IL-1β، فبين مجموعة CI-AKI وجميع المجموعات الأخرى، وبين مجموعة CI-AKI+M ومجموعة CI-AKI+NAC. البيانات معروضة كمتوسط ± الانحراف المعياري (n = 6) وتم تحليلها باستخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه متبوعاً باختبار Duncan للمقارنات البعدية. القيم التي لا تشترك في نفس الحرف العلوي تختلف بشكل ملحوظ (p < 0.05).

المجموعات	النخر النبيبي	توسع النبيبات	التنكس الخلوي	الاحتقان الوعائي
المجموعة الضابطة	0	0	0	0
CI-AKI	2.67	2.83	2.67	2.5
CI-AKI+M	1.33	1.5	1.17	1
CI-AKI+NAC	1.17	1.17	0.83	0.83
CI-AKI+NAC+M	0.5	0.67	0.5	0.17

الجدول 3: مقارنة بارامترات الضرر النسيجي المرضي لأنسجة الكلى في المجموعات التجريبية. تُعرض درجات الإصابة النسيجية المرضية شبه الكمية بناءً على صبغة HE كمتوسطات للمجموعات (عدد الحيوانات = 6 لكل مجموعة). صُنفت الدرجات كـ 0 (لا يوجد ضرر)، و1 (طفيف)، و2 (متوسط)، و3 (ضرر شديد)، حيث تشير الدرجات الأعلى إلى إصابة نسيجية مرضية أكبر.

الملف التكميلي 1: البيانات الداعمة لنتائج هذه الدراسة.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

قيمت هذه الدراسة التجريبية حول إصابة الكلى الحادة الناجمة عن المادة الظليلة (CI-AKI) العلاج بعد التعرض للمادة الظليلة باستخدام مونتيلوكاست، أو N-acetylcysteine (NAC)، أو مزيجهما، وذلك من خلال تقييم وظائف الكلى، ومعايير الإجهاد التأكسدي، والاستجابات الالتهابية، والمؤشرات الحيوية لإصابة الكلى، والنتائج الهيستوباثولوجية. أدى التعرض للمادة الظليلة إلى زيادات ملحوظة في مستويات اليوريا في المصل، والنيتروجين في الدم (BUN)، والكرياتينين، وصاحب ذلك تغيرات سلبية في معايير الإجهاد التأكسدي والمؤشرات الحيوية الالتهابية. كما وفر ارتفاع مستويات KIM-1 وسستاتين C أدلة إضافية على حدوث إصابة كلوية.

ارتبط العلاج بعد التباين باستخدام montelukast، أو NAC، أو مزيجهما بتغيرات إيجابية في عدة معاملات تم تقييمها. ومع ذلك، لم يتفوق المزيج باستمرار على العلاج الأحادي بـ montelukast عبر النتائج الكيميائية الحيوية. وبشكل عام، تتوافق هذه الملاحظات مع دور الإجهاد التأكسدي والالتهاب في الإصابة الكلوية الحادة الناجمة عن صبغة التباين (CI-AKI)، وتشير إلى أن التدخلات التي تؤثر على هذه العمليات قد تخفف من الإصابة الكلوية، رغم أن مسارات التأشير الكامنة لم يتم فحصها مباشرة في الدراسة الحالية^1,30.

تدعم الارتفاعات الملحوظة في مستويات اليوريا في المصل، ونيتروجين Blood Urea Nitrogen (BUN)، والكرياتينين بعد إعطاء المادة الظليلة نجاح تحفيز القصور الكلوي في نموذج إصابة الكلى الحادة الناجمة عن المادة الظليلة (CI-AKI) التجريبي هذا. يمكن أن يؤدي التعرض للمادة الظليلة إلى ضعف وظائف الكلى من خلال عمليات متداخلة تشمل تضيق الأوعية الدموية داخل الكلية، ونقص الأكسجة النخاعية، والإصابة التأكسدية، وتلف الخلايا النبيبية. وقد يؤدي الانخفاض الناتج في التروية الكلوية والترشيح الكبيبي إلى الحد من التخلص من الفضلات النيتروجينية، مما يؤدي بالتالي إلى زيادة تركيزاتها في الدورة الدموية. وتتوافق التغيرات في وظائف الكلى الملاحظة في مجموعة CI-AKI غير المعالجة مع تلك الواردة في الدراسات التجريبية السابقة^1,30,31,32.

لوحظ تباين كبير داخل المجموعة الواحدة لنسب البولة في المصل وBUN في مجموعة CI-AKI غير المعالجة، وهو ما عكسته الانحرافات المعيارية الكبيرة نسبيًا. وقد يعكس هذا التشتت الاختلافات البيولوجية بين الأفراد في مدى القابلية للتأثر ببروتوكول تحفيز CI-AKI المحسس، بما في ذلك التباين في الاستجابة الكلوية للحرمان من الماء، وتثبيط مسارات أكسيد النيتريك والبروستاجلاندين، والتعرض للمادة المتباينة. كما قد تكون الاختلافات الطفيفة في الاحتياطي الوظيفي الكلوي والاستجابات الفسيولوجية بين الحيوانات قد ساهمت في تباين شدة الإصابة الكلوية. وبناءً على ذلك، يجب تفسير الانحرافات المعيارية الكبيرة كدليل على وجود تباين بيولوجي جوهري ضمن هذا النموذج التجريبي وليس كخطأ في القياس. ومع ذلك، ونظرًا لصغر عدد الحيوانات في كل مجموعة، يجب تفسير خصائص التوزيع وحجم الاختلافات المرتبطة بالعلاج بحذر.

في الدراسة الحالية، كانت مستويات اليوريا في المصل، وBUN، والكرياتينين أقل عددياً في المجموعة المعالجة بـ NAC مقارنة بمجموعة CI-AKI غير المعالجة، وهو نمط يتسق مع الاحتمالية المرجحة لتخفيف الخلل الكلوي. لقد تمت دراسة NAC على نطاق واسع في حالات CI-AKI، إلا أن تأثيراتها المبلغ عنها على الوظيفة الكلوية تباينت عبر الدراسات^14,15,16,17. وتشمل الآليات المقترحة كنس الأنواع التفاعلية، ودعم تخليق الجلوتاثيون، والحد من الإصابة التأكسدية داخل الأنسجة الكلوية¹. وبناءً على ذلك، قد يكون ملف الوظيفة الكلوية الملاحظ بعد العلاج بـ NAC مرتبطاً بخصائصه المضادة للأكسدة، على الرغم من أن هذه الآلية لم يتم فحصها بشكل مباشر في الدراسة الحالية.

في الدراسة الحالية، كانت مستويات اليوريا في المصل، ونيتروجين يوريا الدم (BUN)، والكرياتينين أقل عدديًا في المجموعة المعالجة بـ montelukast مقارنة بمجموعة CI-AKI غير المعالجة، مما يشير إلى احتمال تخفيف الاختلال الوظيفي الكلوي. وقد أفادت دراسات تجريبية سابقة، بما في ذلك أبحاث حول CI-AKI، بشكل مماثل عن انخفاض مستويات الكرياتينين واليوريا في المصل بعد إعطاء montelukast^9,18,19. كما أظهرت مجموعة العلاج المشترك مؤشرات وظائف كلوية أقل عدديًا من مجموعة CI-AKI غير المعالجة. ومع ذلك، كانت مستويات اليوريا وBUN والكرياتينين أقل عدديًا مع العلاج الأحادي بـ montelukast مقارنة بالعلاج المشترك، وأظهرت مقارنات Duncan اللاحقة عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين هاتين المجموعتين (p > 0.05). وبالتالي، لم يثبت العلاج المشترك تفوقًا على العلاج الأحادي بـ montelukast فيما يتعلق بمؤشرات وظائف الكلى هذه.

تعتبر الإصابة التأكسدية مساهماً هاماً في الفسيولوجيا المرضية لإصابة الكلى الحادة الناجمة عن مادة التباين (CI-AKI). حيث يؤدي نقص الأكسجة النخاعي الناجم عن التعرض لمادة التباين إلى تحفيز التوليد المفرط لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، مما قد يتسبب في تلف الدهون الخلوية والميتوكوندريا، وإصابة الخلايا الظهارية الأنبوبية، وتعزيز إشارات الالتهاب^1,12,30.

أظهرت مجموعة إصابة الكلى الحادة الناجمة عن الصبغة (CI-AKI) غير المعالجة أعلى تركيز لـ MDA، إلى جانب أدنى مستويات نشاط SOD و CAT وأقل مستوى لـ GSH، مما يشير إلى وجود خلل في التوازن بين العبء التأكسدي والدفاعات المضادة للأكسدة بعد التعرض للصبغة. وقد تم الإبلاغ عن أنماط مماثلة، تتميز بزيادة MDA مع انخفاض القدرة المضادة للأكسدة، في نماذج تجريبية أخرى من CI-AKI^18,19. وتتوافق هذه النتائج مع كون الإجهاد التأكسدي يساهم في تطور وتفاقم الإصابة الكلوية بدلاً من كونه مجرد نتيجة ثانوية^1,30.

بالمقارنة مع مجموعة إصابة الكلى الحادة الناجمة عن التباين في تروية الدم (CI-AKI) غير المعالجة، أظهرت المجموعات المعالجة بـ NAC والمونتيلوكاست عمومًا قيم MDA أقل بالتزامن مع قيم أعلى لكل من SOD وGSH وCAT، وهو نمط يتوافق مع تخفيف الإصابة التأكسدية. وتشمل الإجراءات المضادة للأكسدة المقترحة لـ NAC تحييد الأنواع التفاعلية والحفاظ على توافر الجلوتاثيون داخل الخلايا^1,14. كما قد يعمل المونتيلوكاست على الحد من الإصابة التأكسدية الكلوية من خلال آليات تتجاوز غلق مستقبلات الليوكوتريين السيستينييل، بما في ذلك تثبيط الاستجابات التأكسدية داخل أنسجة الكلى^18,33. وبالمثل، أفادت دراسات سابقة حول الإصابة الكلوية، بما في ذلك نماذج CI-AKI، بانخفاض بيروكسيد الدهون وتحسن الدفاعات المضادة للأكسدة بعد العلاج بالمونتيلوكاست^9,19,27. ورغم ملاحظة معايير إيجابية للإجهاد التأكسدي في مجموعة العلاج المزدوج، إلا أن العلاج المركب لم يتفوق باستمرار على أي من العلاجين الأحاديين. وبناءً على ذلك، فإن هذه النتائج لا تثبت وجود تأثير مضاد للأكسدة تراكمي أو تآزري عند إعطاء NAC والمونتيلوكاست معًا.

قدمت نتائج KIM-1 وcystatin C أدلة تكميلية على حدوث إصابة كلوية عقب التعرض للمادة الملونة. يرتبط KIM-1 بشكل أساسي بتلف الخلايا الظهارية الأنبوبية، بينما يُستخدم cystatin C كمؤشر للتغيرات المتعلقة بالترشيح الكلوي والإصابة؛ وقد تم تقييم كليهما كعلامات حيوية مبكرة في نماذج تجريبية للإصابة الكلوية الحادة الناجمة عن المادة الملونة (CI-AKI)^1,10. وفي مجموعة CI-AKI غير المعالجة، ترافق أعلى مستوى لكلا العلامتين الحيويتين مع تدهور ملحوظ في معاملات وظائف الكلى التقليدية. ويتفق هذا النمط مع الدراسات التجريبية السابقة التي أبلغت عن ارتفاع مستويات KIM-1 وcystatin C بعد الإصابة الكلوية الناجمة عن المادة الملونة^1,10.

مقارنة بمجموعة CI-AKI غير المعالجة، أظهرت مجموعات العلاج قيمًا أقل لـ KIM-1 وcystatin C، وهو نمط يتوافق مع تخفيف الإصابة الكلوية. وقد توازى ملف المؤشرات الحيوية هذا مع انخفاض عددي في تركيزات اليوريا والكرياتنين في المصل لوحظ بعد العلاج. وقد ربطت دراسات تجريبية سابقة بين إعطاء montelukast وانخفاض تعبير KIM-1، وإصابة أنبوبية أقل حدة، والحفاظ على وظائف الكلى في نماذج CI-AKI ونماذج الإصابة الكلوية الأخرى^9,18,19. وبالمثل، ارتبط NAC بملفات مؤشرات حيوية أكثر إيجابية للإصابة الكلوية الحادة، ويحتمل أن يكون ذلك من خلال الحد من التلف الخلوي المرتبط بالإجهاد التأكسدي^14,15,16,17. ومع ذلك، لم يتم اكتشاف فروق ذات دلالة إحصائية في KIM-1 أو cystatin C بين مجموعات العلاج المركب ومجموعة العلاج الأحادي بـ montelukast (p > 0.05). وبناءً على ذلك، لا تظهر النتائج الحالية فائدة إضافية للمؤشرات الحيوية من العلاج المركب.

قد تعزز الاستجابات التأكسدية والالتهابية بعضها البعض أثناء الإصابة الكلوية الحادة المرتبطة بصبغات التباين (CI-AKI). حيث يمكن أن تحفز الأنواع الأكسجينية التفاعلية (ROS) الزائدة إشارات التهابية، مما يؤدي إلى زيادات لاحقة في TNF-α وIL-1β وIL-6، والتي قد تؤدي بدورها إلى تفاقم إصابة الأنسجة الكلوية^1,12,13,30.

أظهرت مجموعة CI-AKI غير المعالجة أعلى تركيزات من TNF-α وIL-1β وIL-6، مما يدعم وجود استجابة التهابية بعد التعرض للمادة الظليلية. وفي نماذج CI-AKI التجريبية، ارتبطت الزيادات في هذه السيتوكينات بإصابة النبيبات، وتسلل الخلايا الالتهابية، وضعف الوظائف الكلوية^10,12,13. ويتوافق ملف السيتوكينات الالتهابية الملاحظ في هذه الدراسة مع النتائج التجريبية السابقة التي تم الإبلاغ عنها بعد إعطاء المادة الظليلية¹.

أظهرت المجموعات المعالجة بـ NAC والمونتيلوكاست قيمًا أقل لـ TNF-α وIL-1β وIL-6 مقارنة بمجموعة CI-AKI غير المعالجة، وهو نمط يتوافق مع تخفيف الاستجابة الالتهابية. وقد ينجم النشاط المضاد للالتهابات المقترح لـ NAC جزئيًا عن تقليل العبء التأكسدي وما ينتج عن ذلك من تقييد لإنتاج السيتوكينات المحفزة للالتهابات^{1,14,15,16,17}. وقد يؤثر المونتيلوكاست على تعبير السيتوكينات من خلال حصر مستقبلات ليوكوتريين السيستين، بالإضافة إلى تعديل عمليات تأشير التهابية أخرى^18,33. كما ربطت دراسات إصابة الكلى التجريبية بين العلاج بالمونتيلوكاست وتقليل التأشير المرتبط بـ NF-κB والنشاط المحفز للالتهابات^9,19,27. وبناءً على ذلك، فإن ملف السيتوكينات الملاحظ في هذه الدراسة يتوافق مع تعديل العمليات الالتهابية التي تشمل مسارات مثل NF-κB وعائلة مستقبلات NOD-like التي تحتوي على نطاق البيرين 3 (NLRP3) inflammasome. ومع ذلك، لم يتم قياس NF-κB وNLRP3 وNOX4 بشكل مباشر؛ لذا فإن نتائج المؤشرات الحيوية تقدم أدلة داعمة غير مباشرة فقط، ولا يمكنها إثبات التنشيط أو التثبيط الخاص بمسار معين.

كانت قيم السيتوكينات الالتهابية في مجموعة العلاج المدمج أقل منها في مجموعة إصابة الكلى الحادة الناجمة عن تباين التروية (CI-AKI) غير المعالجة، ولكن العلاج المدمج لم ينتج باستمرار قيمًا أقل من استخدام المونتيلوكاست وحده. ولم يتم اكتشاف فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعتي CI-AKI + Montelukast و CI-AKI + Montelukast + NAC بالنسبة لـ TNF-α أو IL-1β أو IL-6 (p > 0.05). وبالتالي، فإن النتائج الحالية لا تقدم دليلاً على أن إضافة NAC إلى المونتيلوكاست تمنح فائدة إضافية مضادة للالتهابات.

أظهرت التقييمات النسيجية المرضية كذلك أن إعطاء الوسائط التباينية أدى إلى إصابة كلوية هيكلية جسيمة. وتمثل نتائج النخر النبيبي، وتوسع النبيبات، والتنكس الخلوي، والاحتقان الوعائي التي لوحظت في مجموعة CI-AKI سمات نسيجية مرضية مميزة لـ CI-AKI، وقد ارتبطت بضعف التروية الكلوية، والإجهاد التأكسدي، وإصابة الخلايا النبيبية^1,12,18,19. وبالتزامن مع النتائج البيوكيميائية، تؤكد هذه التغيرات النسيجية المرضية أن إعطاء الوسائط التباينية أدى إلى إصابة جسيمة في أنسجة الكلى. ويشير انخفاض درجة الإصابة النسيجية المرضية الملاحظة في المجموعات المعالجة بـ montelukast وNAC إلى أن هذه العوامل قد تمارس تأثيرات وقائية على أنسجة الكلى. ومن الملاحظ أن مجموعة العلاج المشترك أظهرت أدنى درجات الإصابة النسيجية المرضية عددياً بين مجموعات العلاج. علاوة على ذلك، أظهر التقييم النوعي للمقاطع المصبوغة بـ Masson’s trichrome ترسباً أقل بروزاً للكولاجين الخلالي وحفاظاً أفضل على بنية الأنابيب والنسيج الخلالي في مجموعات العلاج مقارنة بمجموعة CI-AKI غير المعالجة. ونظراً لفترة الملاحظة الحادة والطبيعة النوعية لتقييم Masson’s trichrome، يجب تفسير هذه النتائج كدليل على حفظ هيكلي أفضل في النقطة الزمنية التي تم فحصها، وليس كدليل على تغير في إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلوية على المدى الطويل.

كان التقييم النسيجي المرضي شبه الكمي متسقاً مع الملاحظات النوعية، حيث أظهر درجات إصابة أقل في جميع مجموعات العلاج مقارنة بمجموعة CI-AKI غير المعالجة. وعلى الرغم من أن المجموعة التي تلقت العلاج المشترك أظهرت أدنى درجات الإصابة النسيجية المرضية من الناحية العددية، إلا أن هذه النتيجة لم يصاحبها تفوق متسق عبر النتائج البيوكيميائية. لذلك، لا ينبغي تفسير النتائج النسيجية المرضية المواتية الملاحظة مع العلاج المشترك على أنها دليل على تأثير تراكمي أو تآزري بناءً على تصميم الدراسة الحالية. وبالمثل، أفادت دراسات سابقة في نماذج تجريبية لـ CI-AKI وأشكال أخرى من الإصابة الكلوية الحادة أن تثبيط الإجهاد التأكسدي والالتهاب يقلل من الضرر النسيجي المرضي ويساهم في الحفاظ على سلامة الأنابيب الكلوية^9,18,19,27.

لوحظ تباين ظاهري بين النتائج البيوكيميائية والنتائج الهستوباثولوجية. فعلى الرغم من أن العديد من المتغيرات البيوكيميائية كانت أكثر ملاءمة عددياً في مجموعة العلاج الأحادي بـ montelukast مقارنة بمجموعة العلاج المركب، إلا أن هذه الاختلافات لم تكن ذات دلالة إحصائية. وفي المقابل، أظهرت مجموعة العلاج المركب أدنى درجات الإصابة الهستوباثولوجية عددياً. قد يعكس هذا الانفصال الجزئي اختلافات في العمليات البيولوجية والملفات الزمنية التي ترصدها منهجتا التقييم. حيث يفحص الفحص الهستوباثولوجي بشكل مباشر الإصابة الخلوية والتركيبية الموضعية داخل النسيج الكلوي، وبالتالي قد يكشف عن حفظ النسيج عند نقطة زمنية محددة حتى لو لم تتحسن مؤشرات وظائف الكلى في المصل والمقاييس البيوكيميائية الأخرى بنفس القدر. وفي المقابل، توفر النتائج البيوكيميائية قراءات وظيفية أو جزيئية غير مباشرة، وقد تتأثر بالاحتياطي الوظيفي الكلوي، والآليات التعويضية، والتباين البيولوجي بين الحيوانات، وتوقيت جمع العينات. ونظراً لأن جميع النقاط النهائية قد قُيّمت في نقطة زمنية نهائية واحدة، فمن المحتمل ألا يكون الحفظ التركيبي والتعافي البيوكيميائي متزامنين. وبناءً على ذلك، يجب تفسير المظهر الهستوباثولوجي الأكثر ملاءمة في مجموعة العلاج المركب على أنه اختلاف بين طرق التقييم وليس كدليل على فعالية إجمالية فائقة. ومع ذلك، وعلى الرغم من إجراء التقييمات الهستوباثولوجية تحت ظروف التعمية لتقليل انحياز الفاحص، فقد تم تقييم جميع المقاطع النسيجية بواسطة طبيب pathologist واحد، مما حال دون تقييم التباين بين الفاحصين. وقد تساهم الدراسات المستقبلية التي تشرك مقيمين مستقلين متعددين في تعزيز موثوقية وقابلية تكرار النتائج الهستوباثولوجية.

يعتمد التطبيق القابل للتكرار لهذا النموذج على الأداء المتسق لعدة خطوات إجرائية. ويجب توحيد مدة الحرمان من الماء، والفواصل الزمنية المحددة مسبقًا التي تفصل بين إعطاء L-NAME والإندوميتاسين واليوهيكسول، والتوصيل الوريدي البطيء لليوهيكسول عبر جميع الحيوانات. يمكن أن يؤدي تسرب المادة خارج الوريد في الذيل إلى تقليل جرعة التباين الفعالة وزيادة التباين في شدة الإصابة الكلوية؛ لذا يجب مراقبة موقع الحقن بعناية طوال فترة الإعطاء. وفي حالة حدوث تسرب أو خروج المادة عن الوريد أو وجود مقاومة كبيرة أثناء الحقن، يجب مراعاة احتمالية عدم اكتمال توصيل المادة المتباينة عند تفسير النتائج المقابلة. قد يتأثر اتساق الجرعة أيضًا بسبب الارتجاع أثناء التغذية القسرية الفموية أو عدم إعادة تعليق مستحضر المونتيلوكاست بشكل كافٍ. إن تطبيق نفس الإجراءات الموحدة على جميع الحيوانات وإسناد عمليات الإعطاء إلى نفس الباحث كلما كان ذلك ممكنًا قد يقلل من التباين الإجرائي الذي يمكن تجنبه.

يتيح هذا البروتوكول إحداث إصابة الكلى الحادة الناجمة عن تباين التروية (CI-AKI) خلال فترة تجريبية قصيرة نسبياً، مع السماح بفحص النتائج الكيميوحيوية والنسيجية المرضية في نفس النموذج الحيواني^1,2,9.

تتمثل إحدى نقاط القوة في الدراسة الحالية في توصيف الإصابة الكلوية باستخدام نتائج وظيفية وكيميائية حيوية والتهابية ونسجية مرضية متكاملة. وقد أتاح تقييم مؤشرات الوظائف الكلوية جنبًا إلى جنب مع معايير الإجهاد التأكسدي، والسيتوكينات الالتهابية، وKIM-1، وcystatin C، ومورفولوجيا الأنسجة الكلوية فحص عدة مكونات من إصابة الكلى الحادة الناجمة عن الصبغة (CI-AKI) ضمن التجربة ذاتها. كما أدى إدراج KIM-1 وcystatin C إلى توسيع نطاق التقييم ليتجاوز قياسات كرياتينين المصل التقليدية. وقد سمح اختبار montelukast وNAC بشكل منفصل ومعًا بإجراء مقارنة مباشرة بين استراتيجيات العلاج؛ ومع ذلك، لم تظهر النتائج تفوقًا ثابتًا للتركيبة العلاجية على العلاج الأحادي عبر النتائج التي تم تقييمها. علاوة على ذلك، وعلى عكس مناهج الحث القائمة على التعرض للصبغة وحده، يدمج النموذج الحالي تضيق الأوعية الكلوية ونقص الأكسجة النخاعية، مما يخلق حالة إصابة كلوية واضحة يمكن من خلالها تقييم التغيرات البيولوجية المرتبطة بالعلاج.

يمثل الفاصل الزمني البالغ 1 h بين التعرض للمادة الملونة وبدء العلاج النقطة الزمنية الوحيدة التي تم فحصها في هذا البروتوكول التجريبي، ولا ينبغي تفسيره على أنه نافذة علاجية مثبتة سريرياً. وعلى الرغم من أن العلاج فور التعرض المعروف للمادة الملونة قد يكون ذا صلة بالأبحاث الانتقالية المستقبلية، إلا أن هذه الدراسة الحيوانية الحالية لا يمكنها تحديد جدواها أو فعاليتها في السياقات السريرية. وبشكل خاص، لا يزال وقت البدء الأمثل، والجرعة، وطريق الإعطاء، ومدة العلاج، ومجموعة المرضى المستهدفة غير معروفة. ويجب استقصاء هذه العوامل في دراسات انتقالية وسريرية مخصصة قبل إمكانية النظر في استخدام NAC أو montelukast سريرياً بعد التعرض للمواد الملونة.

يجب الإقرار بعدد من المحدوديات في الدراسة الحالية. فقد تم الحصول على النتائج من نموذج حيواني قبل سريري، وبالتالي لا يمكن تعميمها مباشرة على الممارسة السريرية. ونظرًا لأن البروتوكول جمع بين الحرمان من الماء وتثبيط مسارات أكسيد النيتريك والبروستاجلاندين، فإن الإصابة الكلوية الناتجة قد تكون أكثر شدة من الإصابة التي تحدث عادةً بعد التعرض للمواد الملونة لدى المرضى. وبناءً على ذلك، يجب تفسير النتائج في سياق هذا الإعداد التجريبي المحفز. ومع أن هذا النموذج يسمح بتقييم منضبط للاستجابات البيولوجية للعلاجات المرشحة لحماية الكلى، إلا أنه لا يعيد إنتاج كامل التباين أو نطاق الشدة الخاص بـ CI-AKI السريري. لذا، قد تختلف التغييرات المرتبطة بالعلاج الملحوظة في هذه الدراسة لدى المرضى الذين لديهم ملفات مخاطر أخف أو أكثر تنوعًا. ومن ثمَّ، فإن الأمر يتطلب تكرار التجربة في نماذج أقل كثافة تقترب بشكل أكبر من الظروف السريرية الشائعة، تليها دراسات سريرية مصممة بشكل مناسب، قبل أن يمكن تحديد حجم هذه التأثيرات أو أهميتها السريرية. وتتمثل محدودية إضافية في أن الدراسة شملت ذكور الجرذان فقط؛ وبناءً على ذلك، لم يتم تقييم الاختلافات المحتملة المرتبطة بالجنس في القابلية للإصابة بـ CI-AKI والاستجابات لـ NAC والمونتيلوكاست، ولا ينبغي افتراض تعميم النتائج الحالية على الإناث. وهناك حاجة إلى دراسات مستقبلية تشمل كلا الجنسين لتحديد ما إذا كان الجنس يؤثر على شدة الإصابة الكلوية أو الاستجابة للعلاج.

تتمثل إحدى القيود الأخرى في غياب مجموعة وهمية إجرائية مطابقة للمجموعات التجريبية من حيث التعامل المرتبط بالبروتوكول، والتقييد، والحرمان من الماء، والحقن، والتغذية القسرية الفموية، وإعطاء المادة الناقلة. وبما أن مجموعة الضبط لم تخضع لهذه الإجراءات، فلا يمكن استبعاد احتمالية أن يكون الإجهاد الإجرائي غير المتكافئ والتأثيرات غير النوعية المرتبطة بالتقييد، والتعامل المتكرر، والحقن، والتغذية القسرية الفموية، والتعرض للمادة الناقلة، عوامل مساهمة في بعض الاختلافات الملاحظة بين مجموعة الضبط والمجموعات التجريبية. ومن شأن إدراج مجموعات وهمية إجرائية ومجموعات ضبط للمادة الناقلة مطابقة بشكل مناسب في الدراسات المستقبلية أن يساعد في التمييز بين هذه التأثيرات غير النوعية المرتبطة بالإجراءات وتلك التي تعزى تحديداً إلى تحريض وعلاج CI-AKI.

على الرغم من أنه تم حساب حجم العينة المحدد مسبقاً لتوفير قوة إحصائية بنسبة 80% للكشف عن تأثير إجمالي كبير مفترض عبر المجموعات التجريبية الخمس، إلا أن الدراسة لم تكن مصممة بقوة إحصائية محددة للكشف عن فروق زوجية أصغر بين مجموعات العلاج الأحادي والعلاج المدمج. لذلك، قد تكون الدراسة قد تمتلك قوة محدودة للكشف عن مثل هذه الفروق بين العلاجات، ولا ينبغي تفسير الاتجاهات الرقمية غير الدالة إحصائياً على أنها دليل على التكافؤ. وسيتطلب الأمر دراسات ذات أحجام عينات أكبر لتحديد ما إذا كانت هذه الاتجاهات تمثل فروقاً علاجية قابلة للتكرار.

نظراً لتقييم جرعة واحدة فقط من كل مادة، لا يمكن للدراسة الحالية تحديد التركيبة الجرعية المثلى من NAC–montelukast، أو توصيف التفاعلات التآزرية أو التضادية المعتمدة على الجرعة، أو قياس المساهمة النسبية لكل مادة في التأثيرات الملحوظة عند العلاج المركب. وبالتالي، قد تكون إحدى المادتين قد ساهمت بشكل أقوى في نتائج محددة، ولكن لا يمكن إثبات ذلك من خلال تصميم الدراسة الحالي. وستكون هناك حاجة إلى دراسات مستقبلية تتضمن مستويات جرعات متعددة وتحليلات رسمية للتفاعل الدوائي لتوصيف علاقات الاستجابة للجرعة وتحديد نظام التركيبة المثلى.

قيمت الدراسة المؤشرات البيوكيميائية للإجهاد التأكسدي والالتهاب، ولكنها لم تبحث بشكل مباشر في مسارات التأشير داخل الخلايا المرتبطة بها. لذا، لا يمكن لمخططات المؤشرات الحيوية الملحوظة أن تثبت ما إذا كان التأشير المرتبط بـ NF-κB أو NLRP3 أو NOX4 قد تم تنشيطه أو تثبيطه بواسطة العلاج. وتتطلب الأبحاث المستقبلية استخدام مقاربات جزيئية، بما في ذلك لطخة ويسترن وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)، لتحديد كيفية مساهمة هذه المسارات في التأثيرات الكلوية للمونتيلوكاست و NAC.

نظراً لأن التقييمات اقتصرت على المرحلة الحادة، فإن الدراسة الحالية لا توفر معلومات بشأن التعافي الكلوي اللاحق أو إعادة تشكيل الأنسجة على المدى الطويل. لذا، يجب اعتبار الترسيب المحدود نسبياً للكولاجين الذي لوحظ في مجموعات العلاج عند نقطة النهاية التي تم فحصها بمثابة نتيجة هيكلية مبكرة، وليس دليلاً على منع التليف الكلوي المزمن. وقد تعكس هذه النتيجة بدلاً من ذلك تخفيف حدة الإصابة الكلوية الأولية. ثمة حاجة إلى إجراء دراسات طولية تتضمن نقاط تقييم لاحقة لتحديد ما إذا كانت هذه التغييرات المبكرة ستستمر، وما إذا كانت ستؤثر على الوظائف الكلوية أو إعادة تشكيل الأنسجة على المدى الطويل.

بشكل عام، ارتبط إعطاء المونتيلوكاست والـ NAC بعد حقن المادة الملونة، سواء بمفردهما أو في مزيج مشترك، بتخفيف ضعف وظائف الكلى، والإجهاد التأكسدي، والاستجابات الالتهابية، والإصابة النسيجية المرضية في هذا النموذج التجريبي لإصابة الكلى الحادة الناجمة عن المادة الملونة (CI-AKI). ومع ذلك، لم يظهر العلاج المركب تفوقاً مستمراً على العلاج الأحادي عبر النتائج التي تم تقييمها. تقتصر هذه النتائج على النموذج قبل السريري الحالي، وهي تدعم إجراء المزيد من الاستقصاءات التجريبية بدلاً من التعميم المباشر على الممارسة السريرية.

وفي الختام، ارتبط العلاج بعد حقن المادة الظليلة باستخدام montelukast، أو NAC، أو مزيجهما بنتائج كيميائية حيوية ونسيجية مرضية أكثر إيجابية في هذا النموذج التجريبي من إصابة الكلى الحادة الناجمة عن المادة الظليلة (CI-AKI). ومع ذلك، لم يتفوق النظام العلاجي المدمج بشكل مستمر على العلاج الأحادي في جميع النتائج التي تم تقييمها. وبما أن هذه الملاحظات تم الحصول عليها في دراسة حيوانية قبل سريرية، فيجب اعتبارها أساساً لمزيد من التحقق التجريبي بدلاً من كونها دليلاً على الفعالية السريرية أو القابلية للتطبيق. هناك حاجة إلى أبحاث إضافية لتحديد الصلة المحتملة لنهج العلاج هذه بعد حقن المادة الظليلة فيما يتعلق بحالات CI-AKI السريرية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
غسالة الشرائط الآلية	Bio-Tek Instruments، الولايات المتحدة الأمريكية	ELx50	الغسل الآلي لأطباق مقايسة الممتز المنسي (ELISA).
قارئ الأطباق الدقيقة	Bio-Tek Instruments، الولايات المتحدة الأمريكية	ELx800	قياسات الامتصاصية في مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). RRID:SCR_028651
فورمالين منظم متعادل بنسبة 10%	Merck	لم يتم التسجيل	تثبيت الأنسجة للفحص الهيستوباثولوجي (علم أمراض الأنسجة).
جهاز طرد مركزي مكتبي	نüفيديو (ve)	NF048	تحضير العينات والطرد المركزي.
كربوكسي ميثيل السليلوز (CMC)	Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكية	C5678	الوسط المستخدم لتحضير معلق المونتلوكاست.
طقم CAT العالمي	Otto Scientific	أوتو 3051	القياس اللوني لنشاط إنزيم الكاتالاز (CAT) في المصل باستخدام محلل الكيمياء Mindray BS-400.
المجانس الرقمي	Daihan Scientific	HG-15D	تجانس الأنسجة.
إيوسين Y (مصفر)	Merck	1.15935.0025	صبغ الهيماتوكسيلين والإيوسين.
محلول هيماتوكسيلين هاريس	مختبر السلامة البيولوجية (BSLAB)	BS-002	صبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين (HE).
إندوميتاسين	Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكية	I7378	تُستخدم لتحريض الإصابة بالكلى الحادة الناجمة عن تباين الصبغة (CI-AKI).
أيوكسيول (Omnipaque 300)	GE HealthCare	لم يتم التسجيل	عامل تباين مستخدم لتحفيز الإصابة الكلوية الحادة الناجمة عن عوامل التباين.
هيدروكلوريد الكيتامين (Ketalar)	Pfizer، الولايات المتحدة الأمريكية	لم يتم تسجيله	تخدير عام قبل جمع العينات.
مجهر ضوئي (Nikon Eclipse)	Nikon	ني-يورانيوم	الفحص النسيجي المرضي والتصوير. RRID:SCR_024835
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester)ω(-نيترو-إل-أرجينين ميثيل إستر)	Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكية	N5751	تُستخدم لاستحثاث إصابة الكلى الحادة الناجمة عن مادة التباين (CI-AKI).
طقم صبغة ماسون ثلاثية الألوان	MOSLAB, Tüتركيا	BKMTO001	صبغة ماسون ثلاثية الألوان.
محلل الكيمياء Mindray	Mindray	BS-400	التحليلات البيوكيميائية.
مونتيلوكاست الصوديوم	Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكية	SML0101	تُعطى عن طريق التغذية القسرية الفموية كعلاج.
ن-أسيتيل سيستين (ASIST ٣٠٠ ملجم/٢ مل)	جهاز تجميع الخلايا المغناطيسي (MAC) <نص بديل للصورة="المعادلة 1" يرجى تقديم النص المصدر (source text) المراد ترجمته. بمجرد تزويدي بالنص، سأقوم بترجمته بدقة إلى اللغة العربية الأكاديمية المتخصصة وفقاً للمعايير العلمية والتعليمية المحددة في تعليماتك."/files/ftp_upload/73087/73087eq1.jpg" النمط="هامش: تلقائي؛"/>يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته.ç، Tüتركيا	غير مسجل	أُعطيت عن طريق الحقن داخل الصفاق كعلاج.
طقم مقايسة الممتز المباشر للإنزيم المرتبط المناعي (ELISA) لسيستاتين C في الجرذان	مختبر BT، الصين	E0145Ra	قياس تركيز سيستاتين C في السوائل الطافية للأنسجة الكلوية باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
إنترلوكين-1 للجرذان (Rat IL-1)β طقم مقايسة الامتزاز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)	مختبر BT، الصين	E0119Ra	قياس IL-1 بواسطة مقايسة الممتز المنيعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)β في السوائل الطافية لأنسجة الكلى.
طقم مقايسة الممتز المائية المرتبط بالإنزيم لإنترلوكين-6 في الجرذ (Rat IL-6 ELISA Kit)	مختبر بي تي (BT Lab)، الصين	E0135Ra	قياس IL-6 في سوائل الطفو للأنسجة الكلوية باستخدام تقنية ELISA.
طقم مقايسة الممتز الموصل المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لبروتين KIM-1 في الجرذان	مختبر BT، الصين	E0549Ra	قياس مستوى KIM-1 في السوائل الطافية لأنسجة الكلى باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
عامل نخر الورم في الجرذان (Rat TNF-α)α طقم مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)	مختبر BT، الصين	E0764Ra	قياس TNF-α باستخدام مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)α في السوائل الطافية لأنسجة الكلى.
إبرة تغذية من الفولاذ المقاوم للصدأ (كانيولا تغذية أنبوبية فموية قياس 22 G)	Instech Laboratories، الولايات المتحدة الأمريكية	لم يتم تسجيله	الإعطاء عن طريق التغذية القسرية الفموية.
علف القوارض القياسي على شكل حبيبات (Optima)	أوبتيما، Tüتركيا	لم يتم تسجيله	رقم التشغيلة 58931. التركيب الغذائي: 24% بروتين خام، 3.94% سيليلوز خام، 5.08% دهون خام، 8.8% رماد خام، 1.44% ليسين، 0.61% ميثيونين، 1.14% كالسيوم، 0.89% فسفور، و0.28% صوديوم.
طقم قياس الكرياتينين العام	أوتو ساينتيفيك (Otto Scientific)	OttoBC139	القياس اللوني للكرياتينين في المصل.
طقم قياس الجلوتاثيون المختزل الشامل (Universal GSH Kit)	أوتو ساينتيفيك (Otto Scientific)	أوتو 3053	القياس اللوني لـ GSH في الدم المانع للتخثر بـ EDTA باستخدام طريقة إلمان المعدلة.
طقم مضخم الحمض النووي المتعدد العام (Universal MDA Kit)	أوتو ساينتيفيك (Otto Scientific)	أوتو 1001	القياس اللوني لـ MDA في المصل باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة ELx800.
طقم قياس سوبر أكسيد ديسميوتاز العام (Universal SOD Kit)	أوتو ساينتيفيك (Otto Scientific)	أوتو 3047	القياس اللوني لنشاط إنزيم سوبر أكسيد ديسميوتيز (SOD) في المصل باستخدام محلل الكيمياء Mindray BS-400.
طقم تحليل اليوريا العام	أوتو ساينتيفيك (Otto Scientific)	OttoBC157	القياس اللوني لتركيز اليوريا ونيتروجين يوريا الدم (BUN) في المصل.
هيدروكلوريد الزيلازين (Rompun)	باير، ألمانيا	لم يتم تسجيله	التخدير العام قبل جمع العينات.