مقالة بحثية

تخفف كبسولات Yangjing من خلل تكوين الحيوانات المنوية في الفئران عن طريق تثبيط مسار QKI-5/p38 MAPK من خلال زيادة تنظيم IncRNA NONMMUT031883.2

11 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/73166

⸱

أغسطس 28, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Andrology, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine/Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine, 2Medical College of Qinghai University, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 4Anorectal Surgery, Jiangbei Branch of Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 5Department of Andrology, Shaanxi Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

في هذه المقالة

ملخص

تقيم هذه الدراسة التأثيرات الوقائية لكبسولة Yangjing على خلل تكوين الحيوانات المنوية الناجم عن السيكلوفوسفاميد في الفئران، وتفحص مشاركة مسار تأشير lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.

الملخص

يعد خلل تكوين الحيوانات المنوية سببًا هامًا للعقم عند الذكور، ويمكن أن يؤدي عقار cyclophosphamide (CP) إلى إضعاف عملية تكوين الحيوانات المنوية من خلال تحفيز الموت الخلوي المبرمج غير الطبيعي للخلايا المنوية. وقد استُخدمت كبسولات Yangjing (YC) لتحسين الوظيفة الإنجابية، إلا أن آليتها الجزيئية الكامنة لا تزال غير واضحة. بحثت هذه الدراسة في التأثيرات الوقائية لـ YC في نموذج فأر مصاب بخلل تكوين الحيوانات المنوية المستحث بواسطة CP، وفي خلايا GC-1 المنوية. وتم تقييم عدد الحيوانات المنوية وحركتها، والخصوبة الذكرية، ومستويات الهرمونات الجنسية في المصل، والتغيرات الهيستوباثولوجية في الخصيتين والبربخ. كما تم تقييم حيوية الخلايا، وإطلاق إنزيم lactate dehydrogenase، والموت الخلوي المبرمج، والبروتينات المرتبطة بالموت الخلوي المبرمج في خلايا GC-1. واستُخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي (qRT-PCR)، ومقايسات RNA pull-down، والفلورة المناعية، واللطخة الغربية (Western blotting) لفحص lncRNA NONMMUT031883.2، و Quaking-5 (QKI-5)، ومسار إشارات p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK). أدت YC، بطريقة تعتمد على الجرعة، إلى تحسين جودة الحيوانات المنوية، ومستويات الهرمونات الجنسية في المصل، ومورفولوجيا الأعضاء التناسلية، والهيستوباثولوجيا الخصوية، والخصوبة في الفئران المعالجة بـ CP. وفي خلايا GC-1، زادت YC من حيوية الخلايا وقللت من التلف الخلوي والموت الخلوي المبرمج. وتفاعل lncRNA NONMMUT031883.2 فيزيائيًا مع QKI-5، وأدى العلاج بـ YC إلى زيادة تعبير lncRNA NONMMUT031883.2 بينما قلل من تعبير QKI-5 وفسفرة p38. كما ثبط العلاج بـ YC الموت الخلوي المبرمج المستحث عن طريق تثبيط (knockdown) lncRNA NONMMUT031883.2 في خلايا GC-1، بينما قلل التعبير المفرط لـ QKI-5 من التأثيرات المضادة للموت الخلوي المبرمج لـ YC. وتشير هذه النتائج إلى أن YC يخفف من خلل تكوين الحيوانات المنوية المستحث بواسطة CP، وأن تأثيراته الوقائية تتم عبر تنظيم مسار lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.

المقدمة

يشير الخلل الوظيفي في تكوين الحيوانات المنوية إلى ضعف إنجابي ناتج عن تشوهات في إنتاج الحيوانات المنوية أو نضجها أو وظيفتها في الجهاز التناسلي الذكري. ويتميز بانخفاض عدد الحيوانات المنوية وحركيتها وزيادة معدل تشوه الحيوانات المنوية1,2. وتعد إمراضية الخلل الوظيفي في تكوين الحيوانات المنوية معقدة وترتبط بعوامل وراثية، واضطرابات المناعة الذاتية، والسموم البيئية، والتلف الناجم عن العلاج الكيميائي، وآفات الأعضاء التناسلية3-5. ويمكن للأدوية الكيميائية مثل cyclophosphamide (CP) أن تسبب تلفاً مباشراً في الأنابيب المنوية في الخصية وتحفز موت الخلايا المبرمج في الخلايا المنوية، مما يساهم في حدوث الخلل الوظيفي في تكوين الحيوانات المنوية لدى الذكور6,7. ويُستخدم حالياً العلاج بالبدائل الهرمونية، والمكملات المضادة للأكسدة، وتقنيات المساعدة على الإنجاب كتدخلات سريرية. ومع ذلك، فإن هذه النهج تظهر فعالية غير متسقة وآثاراً جانبية كبيرة8,9,10. لذا، فإن تحديد تدخلات آمنة وفعالة وتوضيح أهدافها الجزيئية يعد أمراً مهماً سريرياً لتحسين نتائج الخصوبة لدى المرضى الذين يعانون من خلل وظيفي في تكوين الحيوانات المنوية.

أظهرت الأدوية العشبية الصينية إمكانات في حماية وظائف التكاثر لدى الذكور وعلاج خلل تكوين النطاف بفضل خصائصها متعددة الأهداف وسميتها المنخفضة نسبيًا11,12. وتُعد كبسولة Yangjing (YC) دواءً صينيًا تقليديًا مسجلاً يتكون من Rehmannia glutinosa وEpimedium والمشيمة وPolygonatum sibiricum وAngelica sinensis وأعشاب صينية أخرى؛ حيث تُستخدم لتقوية الكلى والجوهر، وتغذية الدم والنخاع، وتنظيم الوظيفة التناسلية13. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن YC يمكن أن تنظم مستويات الهرمونات الجنسية في الحيوانات الذكرية، وتحسن جودة الحيوانات المنوية، وتصلح تلف أنسجة الخصية، وتحمي من الإصابات التناسلية الناجمة عن العوامل الكيميائية14,15. وتشكل الخلايا المنوية البدائية أساس عملية تكوين النطاف، ويعد الموت الخلوي المبرمج غير الطبيعي لهذه الخلايا حدثًا مركزيًا في تطور خلل تكوين النطاف16. كما أفادت التقارير بأن YC تعمل على تحسين حيوية الخلايا المنوية البدائية، وزيادة نسبة الخلايا في طور S، وتثبيط الموت الخلوي المبرمج17. ومع ذلك، لا تزال تأثيراتها الوقائية وآلياتها الجزيئية المحددة في خلل تكوين النطاف الناجم عن CP غير واضحة.

تعد الحمضيات النووية الريبوزية غير المشفرة الطويلة (lncRNAs) جزيئات RNA يزيد طولها عن 200 نيوكليوتيد وتفتقر إلى القدرة على تشفير البروتين18. يمكن لـ lncRNAs تنظيم التعبير الجيني من خلال آليات تشمل إسكات الكروموسومات، وتعديل الكروماتين، والبصمة الجينية، والتنشيط النسخي19,20. يشارك البروتين الرابط لـ RNA المسمى Quaking-5 (QKI-5) في العمليات الفسيولوجية والمرضية، بما في ذلك تكاثر الخلايا والموت الخلوي المبرمج، وذلك عن طريق تنظيم الربط البديل للجينات المصب21. يشارك مسار p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) في تنظيم الموت الخلوي المبرمج ويلعب أيضاً دوراً هاماً في خصوبة الذكور وتطور الخصية22,23. أظهرت دراسة سابقة أن الإفراط في تعبير QKI-5 ينشط مسار p38 MAPK في خلايا سرطان الخلايا الكبدية24. بالإضافة إلى ذلك، تبين أن lncRNA NONMMUT074098.2 يرتبط بـ QKI-5 في الخلايا الجرثومية المنوية، بينما أدى تثبيط QKI-5 إلى تثبيط مسار p38 MAPK وتقليل الموت الخلوي المبرمج للخلايا الجرثومية المنوية25. استخدمت هذه الدراسة نموذج فأر مصاب بخلل في تكوين الحيوانات المنوية مستحث بواسطة CP للبحث فيما إذا كان YC ينظم تعبير lncRNA NONMMUT031883.2 ومحور إشارات QKI-5/p38 MAPK، مما يقلل من الموت الخلوي المبرمج غير الطبيعي للخلايا الجرثومية المنوية ويخفف من خلل تكوين الحيوانات المنوية المستحث بواسطة CP (الشكل 1). وكان الهدف هو توضيح الآلية الجزيئية الكامنة وراء التأثيرات الوقائية لـ YC على تكوين الحيوانات المنوية وتوسيع فهم دوره الصيدلاني في حماية الوظيفة الإنجابية للذكور.

figure-introduction-1
الشكل 1: مخطط تخطيطي للتصميم التجريبي. يلخص اللوح العلوي التجارب التي أجريت in vitro في خلايا GC-1 المنوية. تم استخدام تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2 لتحفيز الموت الخلوي المبرمج والتلف الخلوي، يليه تثبيط QKI-5 لتقييم تأثيراته على الموت الخلوي المبرمج وإصابة الخلايا. ويلخص اللوح السفلي التجارب التي أجريت in vivo في نماذج فئران تعاني من خلل في تكوين الحيوانات المنوية ناتج عن السيكلوفوسفاميد (CP). تلقت الفئران علاجاً بكبسولات Yangjing و/أو تدخلاً باستخدام lncRNA NONMMUT031883.2 أو QKI-5. بعد ذلك، تم تقييم الخصوبة، ومستويات الهرمونات في المصل، وأنسجة الخصية والبربخ، ومعلق الحيوانات المنوية، ومخزون الحيوانات المنوية، وجودة الحيوانات المنوية، والتلف النسيجي المرضي للخصية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

البروتوكول

أُجريت جميع تجارب الحيوانات وفقًا لإرشادات ARRIVE والدليل الخاص بالرعاية والاستخدام للحيوانات المعملية الصادر عن المعاهد الوطنية للصحة. وقد تم مراجعة جميع البروتوكولات التجريبية والموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة جنوب شرق (رقم الموافقة: 20230216022).

١. تحضير مصل يحتوي على YC
تم فتح كبسولتين من كبسولات يانغجينغ (YC؛ 0,5 غرام/كبسولة)، ووزن 0,8 غرام من محتويات الكبسولة. أُضيف محلول ملحي عادي حتى حجم نهائي قدره 10 مل، وتم خلط المزيج جيدًا باستخدام جهاز الاهتزاز الدوامي لإعداد معلق بتركيز 80 ملغم/مل. تم تربية ذكور فئران BALB/c الخالية من مسببات الأمراض المحددة، بوزن 22–25 غرامًا وبعمر 8 أسابيع، في 22 °C وفي رطوبة تتراوح بين 55% و60% ضمن دورة ضوئية/مظلمة مدتها 12 ساعة، مع توفير الطعام والماء حسب الرغبةبعد أسبوع من التأقلم، تلقّت الفئران مستخلص YC عن طريق التجريع الفموي بجرعة 800 مغ/كغ من وزن الجسم في حجم 10 مل/كغ مرة واحدة يوميًا ولمدة 5 أيام متتالية. بعد ساعتين من الجرعة الأخيرة، جُرّعت الفئران بالبنتوباربيتال الصوديوم 1% عن طريق الحقن البطني، وجمعت عينات الدم لإعداد مصل يحتوي على YC. ثم أُوقف تنشيط المصل عند 56 °C لمدة 30 دقيقة، يُرشّح عبر مِرشّح 0.22 µm غشاء، ويخزن عند −80 °C حتى الاستخدام.

٢. زراعة الخلايا والنقل الجيني
تم الحفاظ على خلايا الحيوانات المنوية الغerminalية للفأر (GC-1) في وسط DMEM يحتوي على ١٪ بنسلين-ستربتوميسين و١٠٪ مصل بقري جنيني. تم الحفاظ على جميع الزراعات عند ٣٧ °س في جو يحتوي على ٥٪ CO₂ (بالحجم/بالحجم).

تم تصنيع وتجميع RNA مزدوج موجه ضد الـlncRNA (sh-lncRNA)، وبلازميد يُعبر عن زيادة التعبير الجيني لـQKI-5 (OE-QKI-5)، وRNA متدخل صغير موجه ضد QKI-5 (si-QKI-5)، بالإضافة إلى الضوابط السلبية المقابلة لها (sh-NC، OE-NC، وsi-NC). تم إدخال الشظايا sh-lncRNA أو sh-NC، si-QKI-5 أو si-NC، أو OE-QKI-5 أو OE-NC إلى خلايا GC-1 وفقًا لتعليمات كاشف الإدخال. وبعد حضن الخلايا لمدة 48 ساعة، تم تقييم كفاءة الإدخال عن طريق قياس التعبير عن الـlncRNA NONMMUT031883.2 أو التعبير عن QKI-5.

بالنسبة لمجموعة sh-lncRNA + si-QKI-5 + etoposide، تم إجراء عملية انتقال للخلايا GC-1 باستخدام sh-lncRNA وsi-QKI-5، ثم عُوملت بـ 100 µM من etoposide لمدة 12 ساعة26. وبالنسبة للتجارب اللاحقة لقياس قابلية البقاء الخلوي، تم زراعة الخلايا GC-1 في وسط مغذٍ مُكمَّل بـ 5% أو 10% أو 20% من المصل المحتوي على YC، وسُميت هذه المجموعات على التوالي بـ مجموعة YC بجرعة منخفضة (L-YC)، ومجموعة YC بجرعة متوسطة (M-YC)، ومجموعة YC بجرعة عالية (H-YC). وقد تم تحديد تراكيز المصل المحتوي على YC (5%، 10%، و20% YC) بناءً على نتائج تجارب أولية لتدرج التركيز. وبالنسبة لمجموعتي sh-lncRNA + H-YC + OE-NC وsh-lncRNA + H-YC + OE-QKI-5، تم انتقال الخلايا GC-1 باستخدام sh-lncRNA مع OE-NC أو sh-lncRNA مع OE-QKI-5 لمدة 48 ساعة، ثم عُرضت للعلاج بـ 20% من المصل المحتوي على YC لمدة 24 ساعة.

3. اختبار كيت عد الخلايا-8
تم زراعة خلايا GC-1 في أطباق ذات 96 بئرًا بتركيز 5 × 103 خلايا/بئر وتربيت لمدة 24 ساعة. بعد التصاق الخلايا، استُبدل الوسط الأصلي بـ 100 µL من وسط كامل مكمل بمصل يحتوي على YC، وحُضنت الخلايا لمدة 6 أو 12 أو 24 ساعة. بعد الحضن، 10 µL تم إضافة كاشف حزمة عد الخلايا-8 إلى كل بئر، وتم حضن الخلايا عند 37 °C في الظلام لمدة ساعتين. قُيس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الميكروبيت.

٤. فحص ديهايدروجيناز اللاكتات
بعد التحوير الوراثي باستخدام sh-NC أو sh-lncRNA لمدة ٤٨ ساعة، تم جمع وسط زراعة الخلايا GC-1، ثم تم الحصول على السوبرناتنت بالطرد المركزي. وفقًا لتعليمات كيت فحص ديهايدروجيناز اللاكتات، تم خلط السوبرناتنت بلطف مع محلول الكشف العامل ونقله إلى لوحة ذات ٩٦ بئرًا. تُحفَظ اللوحة عند ٢٥ °م في الظلام لمدة ٣٠ دقيقة. تم قياس الامتصاصية عند الطول الموجي ٤٩٠ نانومتر باستخدام قارئ الميكروبلت، وتم حساب إطلاق ديهايدروجيناز اللاكتات لتقييم مدى تلف الخلايا.

5. التلوين بـ كالسين أ.م / بروبيديوم يوديد
بعد مرور 48 ساعة على التحوير الوراثي باستخدام sh-NC أو sh-lncRNA، تم تقييم بقاء خلايا GC-1 باستخدام صبغة كالسين أم/بروبيديوم يوديد (PI). زرعت الخلايا في أطباق ذات 12 بئرًا بتركيز 5 × 104 خلايا/بئر وتم زراعتها حتى وصلت إلى تراص بنسبة 60٪–70٪. شُطبت الخلايا بلطف باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات، و 500 µL أُضيف محلول صبغة كالسين أ.م/آي.بي إلى كل بئر. ثُمَّ حُضنت الخلايا عند 37 °C في الظلام لمدة 30 دقيقة، ثم فُحصت تحت المجهر الفلوري. تم عد الخلايا الحية والميتة باستخدام برنامج تحليل الصور، وتم حساب نسبة الخلايا الناجية.

6. قياس التدفق الخلوي
تم جمع خلايا GC-1 بالطرد المركزي وشُطبت بلطف باستخدام محلول ملحي مُخَصَّب بالفوسفات. أُعيد تعليق كريّة الخلايا في 500 µL من عازل الربط بكثافة 5 × 105 خلايا/مل. ثم أُضيف أنكسين V-APC وPI بتركيز 5 µL كلٍّ، وتم خلط المعلق بشكل جيد ومن ثم حضنه عند 25 °C في الظلام لمدة 10 دقائق. تم تحليل موت الخلايا المبرمج باستخدام مطيافية تدفق الخلايا وبأطوال موجية للإثارة/الانبعاث 633/660 نانومتر لـ APC و488/630 نانومتر لـ PI. تم تقييم معدل موت الخلايا المبرمج باستخدام برنامج تحليل مطيافية تدفق الخلايا.

7. فحص نشاط الكاسباز-3
بعد العلاجات المحددة، تقريبًا 1 × 106 تم جمع خلايا GC-1، وشُطبت، ثم أُعيد تعليقها في محلول ملحي مخزّن بالفوسفات. خُلطت الخلايا مع 100 µL من المحلول الثاني من مجموعة كشف نشاط الكاسباز-3 وتم تحليل العينات على الجليد لمدة 15 دقيقة. بعد الطرد المركزي، 50 µL تم جمع السوبرناتان من المعلق المحفور وخلطه مع 40 µL من المحلول الأول و 10 µL من المحلول الثالث. تُحفَظ الخلطة عند درجة حرارة 37 °C لمدة ساعتين. قُيست الامتصاصية عند الطول الموجي 405 نانومتر باستخدام قارئ الميكروبيت، وتم تقييم نشاط الكاسباز-3 وفقًا لتعليمات العلبة المتوفرة.

٨. فحص سحب الحمض النووي الريبي
تم تصنيع الخيوط المحسوسة وعكس المحسوسة للحمض النووي الريبي طويل غير المشفر NONMMUT031883.2 وفقًا للتسلسل المقابل وتسميتها بالبيوتين. تم تحليل الخلايا في عازل تحليل الخلايا للترسيب المناعي على الجليد لمدة ٣٠ دقيقة، وتم جمع المعلق المحتوي على البروتين بالطرد المركزي. تم غسل حبيبات المغناطيسية المغطاة بالستربتavidين ثلاث مرات بعازل ارتباط الحمض النووي الريبي، ثم حضنت في عازل ارتباط يحتوي على ١٪ ألبومين مصل البقر لمدة ٣٠ دقيقة.

تم مزج الخرز المعالج مسبقًا مع المجسات الموسومة بالبيوتين واحتضانها عند 25 °C لمدة 30 دقيقة. وأُزيلت المجسات غير المرتبطة بواسطة الفصل المغناطيسي. ثم أُضيف المطافي المستخلص من الخلايا، واحتضن المزيج عند 4 °C لمدة 4 ساعات لتكوين معقدات الخرز المغناطيسي-الحمض النووي الريبي-البروتين. وغُسلت الخرز المغناطيسية ثلاث مرات باستخدام محلول الغسل لإزالة البروتينات المرتبطة غير النوعية. وأُزيل محلول الغسل بواسطة الفصل المغناطيسي، ثم أُضيف محلول التحميل العينات 2× SDS. سُخنت العينات عند 95 °C لمدة 10 دقائق، وجُمع المطافي بواسطة الفصل المغناطيسي لتحليله اللاحق بالبلوت الغربي.

٩. بناء نموذج فأر لخلل التكوين المنوي
بعد ٥ أيام من التأقلم، تلقّى ذكور الفئران من سلالة BALB/c الخالية من مسببات الأمراض المحددة، والتي تزن ٢٢–٢٥ غرامًا ويبلغ عمرها ٨ أسابيع، عقار السيكلوفوسفاميد (CP) عن طريق الحقن داخل الصفاق بجرعة ٥٠ ملغ/كغ مرة واحدة يوميًا على مدى ٧ أيام لإنشاء نموذج لخلل التكوين المنوي14,27. ثم قُسّمت الفئران الناجحة في النموذج عشوائيًا باستخدام جدول الأرقام العشوائية إلى المجموعات التالية: CP، وYC بجرعة ٢٠٠ ملغ/كغ، وYC بجرعة ٤٠٠ ملغ/كغ، وYC بجرعة ٨٠٠ ملغ/كغ، وYC بجرعة ٨٠٠ ملغ/كغ + sh-NC، وYC بجرعة ٨٠٠ ملغ/كغ + sh-lncRNA، بواقع ستة فئران في كل مجموعة.

تلقّت الفئران في المجموعات المعالجة بـ YC الجرعة المقابلة من YC عن طريق التغذية عن طريق المعدة مرة واحدة يوميًا على مدى 30 يومًا13. بالنسبة لمجموعتي 800 ملغ/كغ يو سي + ش-إن سي و800 ملغ/كغ يو سي + ش-آر إن إيه لnc، بعد إتمام نجاح إنشاء النموذج، تم تهوية الفئران بـ 2% من الآيسوفلورين. وبعد التأكد من عدم وجود انعكاس سحب القدم لدى كل فأر واستقرار معدل التنفس، تم حلق موقع الجراحة وتعقيمه باستخدام اليود البوفيدون. وفي ظل ظروف معقمة، تم إجراء شق منتصف بطني عبر الجلد وجدار الجسم أمام الأعضاء التناسلية. ثم تم التعرض للخصية عن طريق تحريك وسادة الدهون الوبائية بعناية، مع اتخاذ الحيطة لتجنب إصابة الأوعية الدموية. وباستخدام جهاز التحكم الدقيق، تم تصور الأنابيب المنوية، و 1 µL من علقة الأدينوفايرس (1 × 1010 تم حقن (وحدة تكاثر/مل) ببطء باستخدام إبرة الحقن المجهري28تُرك الإبرة في مكانها لمدة 5 دقائق بعد الحقن، ثم سُحبت ببطء، وتم إيقاف النزيف باستخدام قطنة معقمة. ثم أُجريت نفس الإجرائية على الخصية المقابلة. بعد ذلك، أُغلق الشق بالخياطة، وسُمح للفئران بالتعافي على وسادة تسخين بعد العملية. وتلقّت فئران المجموعة الضابطة حجمًا مساويًا من محلول الملح الفسيولوجي عن طريق التغذية أنفية وحقن يوميًا.

10. تقييم الخصوبة
بعد انتهاء إعطاء الدواء، تم تزاوج الفئران الذكور في كل مجموعة بحرية مع فئران أنثى من سلالة BALB/c بنسبة 1:2 لمدة 7 أيام. تم مراقبة وتسجيل تكوّن السدادة المهبلية لدى الفئران الإناث يوميًا. وبعد التأكد من التزاوج الناجح، تم إزالة الفئران الذكور، وتم حجز الفئران الإناث بشكل منفصل حتى الولادة الطبيعية. تم الحصول على تسع فئران حبلى لكل مجموعة وتم إدراجها في التحليل. تم تسجيل متوسط عدد الصغار في كل وِلادة لتقييم خصوبة الذكور في كل مجموعة.

في نهاية الفترة التجريبية، تم إعدام الفئران عن طريق الحقن البطني بـ 100 ملغ/كغ من البابيتورات الصوديوم. وقد وافقت لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة جنوب شرق على هذه الطريقة في إعدام الحيوانات (رقم الموافقة: 20230216022). تم فصل الخصيتين والبربخين بعناية، ثم تم تصويرهما ووزنهما. وتم حساب دلائل الخصية والبربخ كنسبة وزن العضو إلى وزن الجسم. تم جمع بروبخ واحد من كل فأر، وقطع إلى قطع صغيرة، ووضع في 1 مل من محلول ملحي مخفف بالفوسفات المحمّى مسبقًا (37 °C، واحتضن لمدة 20 دقيقة للسماح للحيوانات المنوية بالسباحة خارجًا29تم خلط عينة الحيوانات المنوية بلطف، و 10 µL ووُضِعَ جزء من معلق الحيوانات المنوية على لوحة عد خلايا دم مسخنة مسبقًا. وجرى عد الحيوانات المنوية يدويًا باستخدام المجهر الضوئي عند تكبير 200× تَكبير، وتم التعبير عن النتائج كـ 106/ل. علاوةً على ذلك، تم حساب النسبة المئوية للحيوانات المنوية المتحركة تقدميًا بالنسبة إلى العدد الكلي للحيوانات المنوية باعتبارها نسبة حيوية الحيوانات المنوية13.

11. تحديد مستويات الهرمونات الجنسية
تم جمع الدم من الوريد المداري للفئران في كل مجموعة وترك عند 25 °C لمدة 30 دقيقة. تم جمع المصل بالطرد المركزي عند 3,000 × g لمدة 10 دقائق30. قُيست مستويات التستوستيرون، والهرمون الملوتن (LH)، والهرمون المحفز للجريب (FSH) في المصل باستخدام أطقم اختبار المناعي المرتبط بالإنزيمات المقابلة.

١٢. فحص ثبات الحمض النووي الريبي
زرعت خلايا GC-1 في أطباق زراعة ذات ٩٦ بئرًا، ثم أُدخل إليها si-QKI-5 أو si-NC، وثُقفت لمدة ٤٨ ساعة. بعد ذلك، أُضيف أكتينوميسين D بتركيز ٥ µg/mL، وجمعت الخلايا عند الزمن ٠، ٣، ٦، و٩ ساعات. تم عزل الحمض النووي الريبي الكلي، وتم تحديد المستوى النسبي للحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل NONMMUT031883.2 باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي بعد التحويل العكسي. وتم حساب المستوى النسبي للحمض النووي الريبي عند كل نقطة زمنية باستخدام المستوى التعبيري عند الزمن ٠ ساعة كمرجع بنسبة ١٠٠٪.

13. تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي الكمي
غُسِلت خلايا GC-1 ونُسج الخصية الفأرية بوساطة محلول ملحي مُخَصَّب بالفوسفات وتم تحليلها لعزل إجمالي الحمض النووي الريبي. تم توليد الحمض النووي المتمم باستخدام إنزيم النسخ العكسي AMV. أُجري تضخيم تفاعل سلسلة البوليميراز باستخدام نظام تفاعل سلسلة البوليميراز المتضخم في الوقت الحقيقي وكيت تفاعل سلسلة البوليميراز الكمي، مع استخدام الحمض النووي المتمم كقالب للتضخيم. استُخدم U6 كمرجع داخلي للحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل NONMMUT031883.2، واستُخدم GAPDH كمرجع داخلي للـ مصدر داخلي لـ QKI-5. تم حساب التعبير النسبي للجين المستهدف باستخدام الطريقة 2−ΔΔ.Ct طريقة25تم عزل الـRNA أيضًا بشكل منفصل من الكسور السيتوبلازمية والنواة لتحديد التوزيع الفرعي للخلية للـlncRNA NONMMUT031883.2. ترد تسلسلات البدائل في الجدول 1.

جينالبادئ الأمامي (من 5' إلى 3')المرناة العكسية (من 5' إلى 3')
QKI-5CTGTCATGCCAAACGGAACجاتجغكاحغكجاتاتغتجت
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
lncRNA NONMMUT031883.2CCACTGTGGCACATTGAAGTATTAAGTTAATGGGTGCTGTGTT
RNA يو6CTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT

الجدول 1: تسلسلات البدائل المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي الكمي. تُسرد تسلسلات البدائل الأمامية والعكسية بالاتجاه 5′–3′ لكل من الـlncRNA NONMMUT031883.2، وQKI-5، وU6، وGAPDH.

14. صبغ الهيماتوكسيلين والإيوزين
غُمرت أنسجة الخصية والبربخ للفأر في فورمالدهيد 4% وثُبتت عند 4 °C لمدة 24 ساعة. بعد الشطف ب محلول ملحي مخزن بالفوسفات، خضعت الأنسجة للجفاف باستخدام سلسلة تدريجية من الإيثانول، ثم أُدرجت في البارافين وقُطعت بسمك 5 µم. سُخنت الشرائح عند 60 °C لمدة 60 دقيقة، ثم أُزيل منها الشمع باستخدام الزايلين لمدة 30 دقيقة.

بعد الترطيب من خلال سلسلة كحول إيثيلي متدرجة، صبغت الأقسام بهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق، وعولجت ب محلول التمايز حمض الهيدروكلوريك-الكحول الإيثيلي لمدة 10 ثوانٍ، ثم غسلت بماء الصنبور لإعادة التزرق، وصُبغت بـ 1% إيوسين لمدة دقيقتين. بعد ذلك، جُففت الأقسام في كحول إيثيلي 95% وكحول إيثيلي مطلق، ونُظفت في الزايلين لمدة 30 دقيقة. وبعد التجفيف الهوائي، وُضعت الأقسام باستخدام صمغ متعادل. لُوحظت التغيرات النسيجية في الخصيتين والبربخ تحت المجهر.

15. التألق المناعي
تم إزالة الشمع من أقسام الخصية الفأرية الشمعية وترطيبها من خلال سلسلة كحولية متدرجة، تليها استرجاع المستضد بوساطة المايكروويف في محلول السترات عند درجة حموضة 6.0. بعد التبريد الطبيعي حتى درجة حرارة الغرفة، تم حضن الأقسام مع 0.3% تريتون X-100 لمدة 10 دقائق. ثم تم منع الأقسام باستخدام 5% ألبومين المصل البقري عند 25 °C لمدة 60 دقيقة، وشُطبت بمحلول ملحي مخفف بالفوسفات، وحُضنت طوال الليل عند 4 °C مع جسم مضاد أولي ضد Ki67. في اليوم التالي، تم تطبيق جسم مضاد ثانوي مناعي غلوبولين G موسوم بعامل متألق، وحُضنت الأقسام عند 37 °C في الظلام لمدة 60 دقيقة. بعد الشطف بمحلول ملحي مخفف بالفوسفات، تم صبغ الأقسام تنازلياً بـ DAPI لمدة 10 دقائق ومشاهدتها تحت المجهر المتألق. تم تحليل شدة التألق باستخدام برنامج تحليل الصور.

لإجراء تلوين المناعة بال fluorescein للخلايا GC-1، زُرعت الخلايا في أطباق 12 بئرًا بتركيز 1 × 105 خلية/بئر وحُضنت لمدة 24 ساعة. ثُبتت الخلايا باستخدام 4% بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة، ثم نُفّذت عملية النفاذية باستخدام 0.3% تريتون X-100 لمدة 10 دقائق، تليها خطوة الحجب باستخدام 5% ألبومين مصل البقر، ثم حُضنت الخلايا طوال الليل عند 4 °م مع الجسم المضاد الأولي ضد QKI-5. نُفذت الخطوات المتبقية كما وُصف بالنسبة لأقسام نسيج الخصية.

16. صبغة TUNEL
تم إزالة الشمع من أقسام الخصية الفأرية الشمعية، وتُرطيبها عبر سلسلة كحولية متباعدة، ثم تُحضنت مع 0.1% من Triton X-100 لمدة 5 دقائق لزيادة نفاذية الغشاء الخلوي. طُبّق محلول عمل بروتينيز K بتركيز 20 µg/mL بدون إنزيم DNase بشكل موحد على الأقسام، ثم حُضنت الأقسام عند 37 °C لمدة 15 دقيقة. أُضيف محلول الكشف عن TUNEL، وحُضنت الأقسام عند 37 °C في الظلام لمدة 90 دقيقة. بعد الحضن مع DAPI لمدة 10 دقائق، طُبّق وسط تثبيت مقاوم للبهتان، وتم فحص نسيج الخصية تحت المجهر الفلوري.

تم زرع خلايا GC-1 في أطباق ذات 12 بئر وتثبيتها باستخدام Paraformaldehyde بنسبة 4% لمدة 30 دقيقة. بعد التخلخل باستخدام Triton X-100 بنسبة 0.1% لمدة 5 دقائق، طُبّق محلول الكشف عن TUNEL على الخلايا، تبعاً لذلك التحفيظ في الظلام لمدة 60 دقيقة. ثم صُبغت الخلايا بـ DAPI لمدة 10 دقائق ورُصدت تحت المجهر الفلوري.

17. التحليل بالمناعة الغربية
تم تحليل أنسجة الخصية للفأر والخلايا GC-1 في محلول تحليل الخلايا للترسيب المناعي على الجليد لمدة 30 دقيقة، وتم تفتيتها باستخدام الموجات فوق الصوتية. وبعد الطرد المركزي، جُمع المحلول العلوي المحتوي على البروتين، وحُدد تركيز البروتين باستخدام مجموعة كشف حمض البيسينكونينيك. ثم خُلط المحلول العلوي البروتيني مع محلول التحميل SDS وسُخّن في ماء مغلي لمدة 10 دقائق. وبعد الفصل بالهجرة الكهربائية على هلام، نُقلت البروتينات إلى أغشية بولي فلوريد الإيثيلين ثنائي البولي فينيليدين، وحُجبت باستخدام 5% ألبومين مصل البقر لمدة ساعتين31.

تم حضن الأغشية طوال الليل عند 4 °C مع الأجسام المضادة الأولية ضد الكاسباز-3 المنشّق (1:500)، وBcl-2 (1:1000)، والكاسباز-3 (1:2000)، وBax (1:500)، وQKI-5 (1:1000)، وp38 المفسفر (1:1000)، أو p38 (1:500). في اليوم التالي، شُطبت الأغشية باستخدام محلول ملحي مخزّن بالترس يحتوي على تويين 20، ثم حُضنت مع الغلوبيولين المناعي المضاد للأرنب من مصدر الماعز بنسبة 1:10000 لمدة ساعتين عند 25 °C. تم تطبيق محلول العمل للانبعاث الكيميائي المقوى على سطح الغشاء، وصُورت الحزم البروتينية باستخدام نظام تصوير الجل. جُرى تحليل شدة الحزم باستخدام برنامج تحليل الصور، وتم تسوية التعبير النسبي عن البروتين بالنسبة إلى GAPDH (1:3000).

تم استخدام السيكلوهكسيميد بتركيز 50 µg/mL لتثبيط تخليق البروتين. ولتحديد عمر نصف QKI-5، جُمعت الخلايا عند الزمن 0، 3، 6، و9 ساعة، ثم قُيّمت مستويات بروتين QKI-5 لاحقًا بواسطة التحليل بالبلوت الغربي25.

18. التحليل الإحصائي
تم تحليل جميع البيانات إحصائيًا ورسمها باستخدام برامج إحصائية ورسم بياني وتحليل الصور. تم استخدام اختبار شابيرو-ويلك لتقييم طبيعة توزيع البيانات. تُعرض البيانات التجريبية كمتوسط ± الانحراف المعياري. تم استخدام تحليل التباين الأحادي الاتجاه لتقييم الفروق بين المجموعات. واستُخدم اختبار LSD-t للمقارنات الزوجية اللاحقة عندما كانت التباينات متجانسة، في حين استُخدم اختبار دونيت T3 عندما كانت التباينات غير متجانسة. واعتُبرت القيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2 يحفز موت الخلايا المبرمج في الخلايا المكونة للنطاف
تم ترانزفكشن خلايا GC-1 باستخدام sh-lncRNA لتثبيط تعبير lncRNA NONMMUT031883.2. ومقارنة بالخلايا التي تم ترانزفكشنها بـ sh-NC، انخفض المستوى النسخي لـ lncRNA NONMMUT031883.2 بشكل ملحوظ بعد ترانزفكشن sh-lncRNA، مما يؤكد نجاح عملية التثبيط (الشكل 2A). وعقب تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2، انخفضت حيوية خلايا GC-1 بشكل كبير (الشكل 2B)، بينما زاد إطلاق LDH بشكل ملحوظ، مما يشير إلى زيادة التلف الخلوي (الشكل 2C). وأظهر صبغ Calcein-AM/PI زيادة في عدد خلايا GC-1 الموجبة لـ PI وانخفاض في نسبة الخلايا الباقية في مجموعة sh-lncRNA (الشكل 2D، E). كما ارتفع معدل موت الخلايا المبرمج في خلايا GC-1 بشكل ملحوظ بعد تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2 (الشكل 2F، G). وكان معدل الإيجابية لـ TUNEL مرتفعاً بشكل كبير أيضاً في مجموعة sh-lncRNA، مما يشير بشكل إضافي إلى زيادة موت الخلايا المبرمج (الشكل 2H، I). بالإضافة إلى ذلك، أدى تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2 إلى زيادة نشاط caspase-3 بشكل كبير في خلايا GC-1 (الشكل 2J). وفي مجموعة sh-lncRNA، زاد تعبير Bax بشكل ملحوظ، وانخفض تعبير Bcl-2، وارتفعت نسبة cleaved caspase-3/caspase-3 بشكل كبير (الشكل 2K، L). وتشير هذه النتائج إلى أن تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2 يحفز موت الخلايا المبرمج في خلايا GC-1. تم الحصول على جميع البيانات الكمية باستخدام n = 6.

figure-results-1
الشكل 2: تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2 يحفز الموت الخلوي المبرمج في الخلايا المنوية. (A) تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي (qRT-PCR) للتعبير عن lncRNA NONMMUT031883.2 في خلايا GC-1. (B) اختبار طقم عد الخلايا-8 (CCK-8) لحيوية خلايا GC-1 بعد تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2. (C) تحرر إنزيم لاكتات ديهيدروجيناز (LDH) من خلايا GC-1 بعد تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2. (D, E) صبغ Calcein-AM/propidium iodide (PI) لبقاء خلايا GC-1 (تكبير 20×؛ شريط المقياس، 100 µm). (F, G) تحليل قياس التدفق الخلوي للموت الخلوي المبرمج بعد تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2. (H, I) تحليل وسم النهايات المقطوعة بـ dUTP بواسطة إنزيم نقل ديوكسي نيوكليوتيديل الطرفي (TUNEL) لخلايا GC-1 (تكبير 40×؛ شريط المقياس، 50 µm). (J) نشاط Caspase-3 بعد تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2. (K, L) تحليل لطخة ويسترن للتعبير عن Bcl-2 و Bax و caspase-3 و cleaved caspase-3 بعد ترانسفكشن sh-lncRNA. يتم عرض البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري؛ n = 6. ***p < 0.001 مقابل sh-NC. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تفاعل LncRNA NONMMUT031883.2 مع QKI-5
تم فحص التفاعل بين lncRNA NONMMUT031883.2 و QKI-5 لتوضيح الآلية الجزيئية الكامنة وراء موت الخلايا المبرمج في الخلايا المنوية. بعد فصل الكسور النووية والسيتوبلازمية، أظهر تحليل qRT-PCR أن lncRNA NONMMUT031883.2 يتمركز بشكل أساسي في نوى خلايا GC-1 (الشكل 3A). وأظهر تحليل التألق المناعي أن QKI-5 كان مركزاً أيضاً في النواة، مما وفر أساساً مكانياً للتفاعل بين lncRNA NONMMUT031883.2 و QKI-5 (الشكل 3B). تم قياس نصف عمر lncRNA NONMMUT031883.2 بعد المعالجة بـ actinomycin D لتقييم ما إذا كان QKI-5 ينظم استقرار lncRNA. ولم يكن لإسكات QKI-5 أي تأثير ملحوظ على نصف عمر نسخة lncRNA (الشكل 3C). وبعد تثبيط تخليق البروتين بواسطة cycloheximide، لم يؤدِ إسكات lncRNA NONMMUT031883.2 إلى تغيير تعبير بروتين QKI-5 (الشكل 3D, E). ثم تم تقييم كفاءة التقاط المسبار المضاد للاتجاه المسمى بالبيوتين والمستهدف لـ lncRNA NONMMUT031883.2 بواسطة qRT-PCR. وقد قام المسبار المضاد للاتجاه بإثراء lncRNA المستهدف بكفاءة، وبالتالي استُخدم في مقايسة سحب الحمض النووي الريبي (RNA pull-down) اللاحقة (الشكل 3F). وأظهر سحب RNA متبوعاً بنقل ويسترن (Western blotting) وجود تفاعل فيزيائي محدد بين lncRNA NONMMUT031883.2 و QKI-5 (الشكل 3G, H). تشير هذه النتائج إلى أن lncRNA NONMMUT031883.2 و QKI-5 يتمركزان معاً في نوى خلايا GC-1 ويتفاعلان بشكل محدد. تم الحصول على البيانات الكمية في الشكل 3C و الشكل 3D, F باستخدام n = 3، بينما تم الحصول على بقية البيانات الكمية باستخدام n = 6.

figure-results-2
الشكل 3: يتفاعل LncRNA NONMMUT031883.2 مع QKI-5. (A) تحليل qRT-PCR للتوزيع النووي والسيتوبلازمي لـ lncRNA NONMMUT031883.2 في خلايا GC-1. (B) تحليل التألق المناعي للتوضع تحت الخلوي لـ QKI-5 في خلايا GC-1 (40×؛ شريط المقياس، 50 µm). (C) تحليل qRT-PCR لعمر النصف لـ lncRNA NONMMUT031883.2 بعد المعالجة بـ actinomycin D وتثبيط QKI-5 (n = 3). (D, E) تحليل Western blot للتعبير البروتيني لـ QKI-5 بعد المعالجة بـ cycloheximide وتثبيط lncRNA NONMMUT031883.2 (n = 3). (F) التحقق بواسطة qRT-PCR من كفاءة إثراء المسبار المضاد للحس المسمى بالبيوتين والذي يستهدف lncRNA NONMMUT031883.2. (G, H) تحليل RNA pull-down وWestern blot للتفاعل بين lncRNA NONMMUT031883.2 وQKI-5. يتم عرض البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري؛ n = 6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تثبيط QKI-5 يمنع موت الخلايا المبرمج في الخلايا المنوية عن طريق كبح مسار p38 MAPK
تم فحص دور QKI-5 ومسار p38 MAPK المصب في عملية موت الخلايا المنوية المبرمج. بعد عفن الخلايا باستخدام si-QKI-5، انخفضت مستويات بروتين QKI-5 بشكل ملحوظ في خلايا GC-1، مما أكد نجاح عملية التثبيط (الشكل 4A، B). أدى تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2 إلى زيادة ملحوظة في نسبة p-p38/p38، بينما أدى التثبيط المتزامن لـ QKI-5 إلى خفض هذه النسبة، مما يشير إلى تثبيط تنشيط مسار p38 MAPK (الشكل 4C، D). خفف تثبيط QKI-5 من الضرر الذي لحق بخلايا GC-1 والناتج عن تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2، بينما أدى العلاج بمحفز موت الخلايا المبرمج etoposide إلى خفض حيوية الخلايا بشكل ملحوظ (الشكل 4E). قلل تثبيط QKI-5 بشكل ملحوظ من معدل موت خلايا GC-1 المبرمج، في حين أدى العلاج بـ etoposide إلى زيادة موت الخلايا المبرمج بشكل واضح (الشكل 4F، G). كما أدى عفن الخلايا باستخدام si-QKI-5 إلى خفض نشاط caspase-3 بشكل ملحوظ، بينما أدى العلاج بـ etoposide إلى زيادة نشاط caspase-3 (الشكل 4H). قلل تثبيط QKI-5 من تعبير Bax، وزاد من تعبير Bcl-2، وخفض بشكل ملحوظ من نسبة cleaved caspase-3/caspase-3، بينما عكس العلاج بـ etoposide أنماط التعبير هذه (الشكل 4I، J). تشير هذه النتائج إلى أن تثبيط QKI-5 يكبح موت الخلايا المبرمج في الخلايا المنوية GC-1 عن طريق تثبيط مسار p38 MAPK. تم الحصول على جميع البيانات الكمية باستخدام n = 6.

figure-results-3
الشكل 4: تثبيط QKI-5 يمنع موت الخلايا المبرمج في الخلايا النطافية عن طريق كبح مسار p38 MAPK. (A, B) تحليل لطخة ويسترن لتعبير QKI-5 في خلايا GC-1 بعد التحويل باستخدام si-NC أو si-QKI-5. (C, D) تحليل لطخة ويسترن لتعبير p38 المفسفر (p-p38) وp38 الكلي. (E) تحليل CCK-8 لحيوية خلايا GC-1 في مجموعات العلاج المختلفة. (F, G) تحليل قياس التدفق الخلوي لموت الخلايا المبرمج بعد المعالجة بـ etoposide. (H) نشاط Caspase-3 في مجموعات العلاج المختلفة. (I, J) تحليل لطخة ويسترن لتعبير Bax وBcl-2 وcaspase-3 وcleaved caspase-3 في خلايا GC-1. البيانات معروضة كمتوسط ± الانحراف المعياري؛ n = 6. ***p < 0.001 مقابل si-NC أو sh-NC؛ ###p < 0.001 مقابل sh-lncRNA؛ &&&p < 0.001 مقابل sh-lncRNA + si-QKI-5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يثبط YC موت الخلايا المبرمج في الخلايا المنسلية للنطاف عبر مسار lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK
بعد معالجة خلايا GC-1 بمصل يحتوي على YC لمدة 6 و12 و24 ساعة، زادت حيوية الخلايا تدريجياً مع زيادة تركيزات YC وإطالة فترات التعرض. بناءً على ذلك، تم اختيار هذه التركيزات للتجارب اللاحقة، مع اعتماد مدة معالجة قدرها 24 ساعة (الشكل 5A). أدت المعالجة بـ YC لمدة 24 ساعة إلى زيادة ملحوظة في المستوى النسخي لـ lncRNA NONMMUT031883.2 في خلايا GC-1 (الشكل 5B) وعززت قدرته على الارتباط بـ QKI-5 (الشكل 5C، D). وعقب المعالجة بـ YC، انخفض تعبير QKI-5 ونسبة p-p38/p38 بشكل ملحوظ في خلايا GC-1، مما يشير إلى تثبيط مسار p38 MAPK (الشكل 5E، F). كما أدت المعالجة بـ YC إلى خفض معدل موت الخلايا المبرمج بشكل ملحوظ (الشكل 5G، H)، وتقليل نشاط caspase-3 (الشكل 5I)، وزيادة تعبير Bcl-2، وخفض تعبير Bax ونسبة cleaved caspase-3/caspase-3 (الشكل 5J، K).

للمزيد من تقييم خصوصية المسار، تم نقل OE-NC أو OE-QKI-5 إلى خلايا GC-1. وقد زاد تعبير بروتين QKI-5 بشكل ملحوظ في الخلايا المنقولة بـ OE-QKI-5، مما يؤكد نجاح الإفراط في التعبير (الشكل 5L، M). أدى تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2 إلى خفض حيوية الخلايا بشكل ملحوظ، بينما عكس العلاج بـ YC هذا التأثير. وقد أدى الإفراط في تعبير QKI-5 إلى تخفيف التأثير الواقي للخلايا لـ YC (الشكل 5N). كما خفض العلاج بـ YC من الموت الخلوي المبرمج الناجم عن تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2 (الشكل 5O، P)، وخفض نشاط caspase-3 (الشكل 5Q)، وقلل من تعبير Bax، وزاد من تعبير Bcl-2، وخفض نسبة cleaved caspase-3/caspase-3 (الشكل 5R، S). وفي المقابل، أدى الإفراط في تعبير QKI-5 إلى تخفيف التأثيرات المضادة للموت الخلوي المبرمج لـ YC. تشير هذه النتائج إلى أن YC يحفز تعبير lncRNA NONMMUT031883.2 ويعزز ارتباطه بـ QKI-5، مما يؤدي إلى تثبيط مسار p38 MAPK وكبح الموت الخلوي المبرمج في خلايا GC-1. تم الحصول على جميع البيانات الكمية باستخدام n = 6.

figure-results-4
الشكل 5يعمل YC على تثبيط الموت الخلوي المبرمج للخلايا النطفية عبر مسار lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK. (أ) تحليل CCK-8 لصلاحية خلايا GC-1 بعد التعرض لمصل يحتوي على كبسولة Yangjing (YC) لمدة 6 و12 و24 ساعة. (ب) تحليل qRT-PCR للتعبير عن lncRNA NONMMUT031883.2 في خلايا GC-1 بعد 24 ساعة من المعالجة بـ YC. (ج، د) تحليل سحب الحمض النووي الريبي (RNA pull-down) لارتباط الحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل lncRNA NONMMUT031883.2 ببروتين QKI-5 بعد المعالجة بمركب YC. (هـ، و) تحليل لطخة ويسترن للتعبير عن QKI-5 وp-p38 وp38 بعد المعالجة بـ YC. (G, H) تحليل قياس التدفق الخلوي لموت الخلايا المبرمج في خلايا GC-1 بعد المعالجة بـ YC. (أ) نشاط كاسبيز-3 بعد المعالجة بـ YC. (ج، ك) تحليل لطخة ويسترن لتعبير Bcl-2 وBax وcaspase-3 وcleaved caspase-3 بعد المعالجة بـ YC. (L, M) تحليل لطخة ويسترن لتعبير QKI-5 بعد تعدي الخلايا بـ OE-NC أو OE-QKI-5. (ن) تحليل CCK-8 لحيويّة خلايا GC-1. (O, P) تحليل التدفق الخلوي للموت الخلوي المبرمج في خلايا GC-1 بعد الإفراط في تعبير QKI-5. (س) نشاط كاسباز-3 عقب الإفراط في تعبير QKI-5. (R, S) تحليل لطخة ويسترن (Western blot) للتعبير عن بروتينات Bax وBcl-2 وcaspase-3 وcleaved caspase-3 عقب الإفراط في التعبير عن QKI-5. يتم عرض البيانات في صورة المتوسط الحسابي ± الانحراف المعياري؛ n = 6. ***p < 0.001 مقارنة بالمجموعة الضابطة؛ ###p < 0.001 مقابل sh-lncRNA؛ &&&p < 0.001 مقابل sh-lncRNA + H-YC + OE-NC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يعمل YC على تحسين الخلل الوظيفي في تكوين الحيوانات المنوية الناجم عن CP في الفئران
تم تقييم التأثيرات الوقائية لـ YC في فئران تعاني من خلل وظيفي في تكوين الحيوانات المنوية. أظهرت الخصيتان والبربخ في مجموعة CP ضموراً ملحوظاً، وانخفاضاً في الحجم، ومظهراً باهتاً. وبعد العلاج بجرعات مختلفة من YC، تحسن شكل الأعضاء التناسلية وامتلاؤها ولونها تدريجياً (الشكل 6A). كما زادت الأوزان النسبية للخصيتين والبربخ بشكل ملحوظ، حيث لوحظ أكبر تأثير في مجموعة YC بجرعة 800 mg/kg (الشكل 6B، C).

ارتفع معدل تشوه الحيوانات المنوية بشكل ملحوظ في مجموعة CP، مع ظهور تشوهات متكررة شملت تشوه الرأس، والتفاف الذيل، والتلف الهيكلي. كما انخفض عدد الحيوانات المنوية وحركيتها بشكل ملحوظ. وبعد العلاج بـ YC، تحسن شكل الحيوانات المنوية (الشكل 6D)، وزاد عددها (الشكل 6E)، وتحسنت حركتها بشكل كبير (الشكل 6F). وأظهرت تجارب التزاوج أن الخصوبة وحجم البطن انخفضا بشكل ملحوظ في مجموعة CP، بينما أدى العلاج بـ YC إلى تحسين الخصوبة (الشكل 6G). كما انخفضت مستويات هرمون التستوستيرون، والهرمون المنشط للجريبات، والهرمون اللوتيني في المصل بشكل ملحوظ في مجموعة CP، ثم ارتفعت بعد العلاج بـ YC (الشكل 6H-J). وتشير هذه النتائج إلى أن YC يحسن من ضمور الأعضاء التناسلية، وجودة الحيوانات المنوية، والخصوبة، وإفراز الهرمونات الجنسية في الفئران التي تعاني من خلل في تكوين الحيوانات المنوية. تم الحصول على البيانات الكمية في الشكل 6G باستخدام n = 9، بينما تم الحصول على بقية البيانات الكمية باستخدام n = 6.

figure-results-5
الشكل 6: يحسن YC الخلل الوظيفي في تكوين الحيوانات المنوية الناجم عن CP في الفئران. (A-C) مورفولوجيا الأعضاء التناسلية في مجموعات التحكم، وcyclophosphamide (CP)، والعلاج بـ YC (A)، ومؤشر الخصية (B)، ومؤشر البربخ (C). (D-F) مورفولوجيا الحيوانات المنوية (D) (40×؛ شريط المقياس، 50 µm)، وكثافة الحيوانات المنوية (E)، وحركية الحيوانات المنوية (F). (G) تقييم خصوبة الذكور من خلال تجارب التزاوج (n = 9). (H-J) مستويات الهرمون المنبه للحويصلة (FSH)، والتستوستيرون، والهرمون اللوتيني (LH) في المصل والتي تم قياسها باستخدام أطقم مقايسة الممتز المترابطة إنزيمياً. البيانات معروضة كالمتوسط ± الانحراف المعياري؛ n = 6. ***p < 0.001 مقابل مجموعة التحكم؛ #p < 0.05، ##p < 0.01، و ###p < 0.001 مقابل CP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يعمل YC على تحسين التلف النسيجي المرضي للخصية في الفئران التي تعاني من خلل في تكوين الحيوانات المنوية
تم تقييم التأثير الإصلاحي لـ YC على تلف أنسجة الخصية عن طريق الصبغ النسيجي. أظهر صبغ الهيماتوكسيلين والإيوسين بنية نسيجية سليمة، وطبقات خلوية متميزة، وأعداداً كافية من الخلايا في المجموعة الضابطة. وفي المقابل، أظهرت مجموعة CP ضموراً ملحوظاً في الأنابيب المنوية واختلالاً في البنية، وانخفاضاً في أعداد الخلايا، وانهياراً في لمعة البربخ. وبعد العلاج بـ YC، انخفض تلف الخصية والبربخ، واستعادت بنية الأنابيب المنوية تدريجياً، وأصبحت الخلايا أكثر تنظيماً وزادت في العدد (الشكل 7A، B).

زادت نسبة الخلايا الموجبة لاختبار TUNEL في أنسجة الخصية بشكل ملحوظ في مجموعة CP، وانخفضت بشكل كبير بعد العلاج بـ YC (الشكل 7C، D). كما ارتفع تعبير Bax ونسبة cleaved caspase-3/caspase-3 بشكل ملحوظ في مجموعة CP، بينما انخفض تعبير Bcl-2. وقد عكس العلاج بـ YC أنماط التعبير هذه (الشكل 7E، F). وأظهر تحليل التألق المناعي أن شدة تألق Ki67 انخفضت بشكل ملحوظ في مجموعة CP وزادت بشكل كبير بعد العلاج بـ YC، مما يشير إلى استعادة تكاثر الخلايا المنوية (الشكل 7G، H). وتشير هذه النتائج إلى أن YC يقلل من التلف النسيجي المرضي الناجم عن CP في الخصيتين والبربخ، ويثبط الموت الخلوي المبرمج المفرط، ويعزز تكاثر الخلايا المنوية. تم الحصول على جميع البيانات الكمية باستخدام n = 6.

figure-results-6
الشكل 7يؤدي YC إلى تحسين الضرر النسيجي المرضي الناجم عن CP في أنسجة الخصية لدى الفئران. (أ، ب) صبغ الخصيتين بالهيماتوكسيلين والإيوزين (HE) (أ) والبربخين (ب) بعد المعالجة بـ YC (20×شريط المقياس، 100 µm). (ج، د) تحليل TUNEL لموت الخلايا المبرمج في نسيج الخصية لدى الفأر (40×شريط القياس، 50 µm). (هـ، و) تحليل لطخة ويسترن (Western blot) للتعبير عن البروتينات Bax وBcl-2 وcaspase-3 وcleaved caspase-3 في أنسجة الخصية بعد العلاج بـ YC. (G, H) تحليل التألق المناعي للتعبير عن Ki67 في أنسجة الخصية لدى الفأر (40×شريط المقياس، 50 µm). تُعرض البيانات في صورة المتوسط الحسابي ± الانحراف المعياري؛ ن = 6. ***p < 0.001 مقابل المجموعة الضابطة؛ p < 0.001 مقابل CP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يعمل YC على تحسين خلل تكوين الحيوانات المنوية والتلف الباثولوجي للخصية في الفئران عبر مسار lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK
تم إجراء مزيد من التقييم لمدى مشاركة مسار lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK في تأثيرات YC. انخفض تعبير lncRNA NONMMUT031883.2 بشكل ملحوظ في أنسجة الخصية للفئران في مجموعة CP، بينما ارتفع تعبير QKI-5 ونسبة p-p38/p38 بشكل ملحوظ (الشكل 8A-D). وبعد العلاج بـ YC، ارتفع تعبير lncRNA NONMMUT031883.2، بينما انخفض تعبير QKI-5 ونسبة p-p38/p38.

ولمزيد من تقييم خصوصية المسار، تم تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2 في الفئران باستخدام sh-lncRNA. وقد انخفض مستوى تعبير lncRNA NONMMUT031883.2 بشكل ملحوظ، مما أكد نجاح عملية التثبيط (الشكل 8E). بعد تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2، لم يتغير مستوى QKI-5 في نسيج الخصية بشكل ملحوظ، ولكن مستوى p-p38/p38 ارتفع بشكل ملحوظ (الشكل 8F، جيأدى العلاج بـ Sh-lncRNA إلى تخفيف آثار 800 ملجم/كجم من YC، مما أدى إلى انخفاض تعبير lncRNA NONMMUT031883.2 في أنسجة الخصية (الشكل 8H) وزيادة في مستويات p-p38/p38 (الشكل 8I، جأدى العلاج بـ YC إلى زيادة كبيرة في عدد الحيوانات المنوية وحركيتها بعد تحريض CP، بينما أدى تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2 إلى تخفيف هذه التأثيرات.الشكل 8K، لكما أدى العلاج بـ YC إلى زيادة مستويات التستوستيرون، والهرمون المنشط للحويصلة، والهرمون اللوتيني في مجموعة CP، بينما أدى تثبيط الـ lncRNA إلى تخفيف هذه التأثيرات (الشكل 8M-أو).

أظهر صبغ الهيماتوكسيلين والإيوسين أن YC أدى إلى تحسين تلف الخصية الناجم عن CP، بما في ذلك ضمور الأنابيب المنوية واختلال تنظيم ترتيب الخلايا المكونة للنطاف. وقد أدى تثبيط LncRNA NONMMUT031883.2 إلى إضعاف هذه التأثيرات الوقائية (الشكل 8P). وبعد العلاج بـ YC، انخفض تعبير Bax ونسبة cleaved caspase-3/caspase-3، بينما ارتفع تعبير Bcl-2. كما أدى تثبيط LncRNA NONMMUT031883.2 إلى عكس هذه التأثيرات على البروتينات المرتبطة بموت الخلايا المبرمج (الشكل 8Q، R). وتشير هذه النتائج إلى أن YC يحسن جودة الحيوانات المنوية ويقلل من تلف أنسجة الخصية بعد استحثاث CP من خلال زيادة تنظيم lncRNA NONMMUT031883.2، وتقليل تنظيم QKI-5، وتثبيط مسار p38 MAPK. تم الحصول على جميع البيانات الكمية باستخدام n = 6.

figure-results-7
الشكل 8: يعمل YC على تحسين عملية تكوين الحيوانات المنوية وتقليل التلف النسيجي المرضي للخصية عبر مسار lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK. (A) تحليل qRT-PCR للتعبير عن lncRNA NONMMUT031883.2 في أنسجة خصية الفأر. (B-D) تحليل Western blot للتعبير عن QKI-5 و p-p38 و p38 في أنسجة خصية الفأر بعد العلاج بـ YC. (E) التحقق بواسطة qRT-PCR من إسكات lncRNA NONMMUT031883.2 في أنسجة خصية الفأر بعد إعطاء sh-lncRNA. (F, G) تحليل Western blot لمستويات QKI-5 و p-p38/p38 في أنسجة خصية الفئران بعد إسكات lncRNA NONMMUT031883.2. (H) تحليل qRT-PCR للتعبير عن lncRNA NONMMUT031883.2 في أنسجة خصية الفأر بعد العلاج بـ YC وإعطاء sh-lncRNA. (I, J) تحليل Western blot للتعبير عن p-p38 و p38 في أنسجة خصية الفأر. (K, L) عدد الحيوانات المنوية (K) وحركية الحيوانات المنوية (L) في مجموعات العلاج المختلفة. (M-O) قياس مستويات FSH والتستوستيرون و LH في المصل باستخدام أطقم المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA). (P) صبغة HE لأنسجة الخصية في الفئران المعالجة بـ CP (تكبير 20×؛ شريط المقياس، 100 µm). (Q, R) تحليل Western blot للتعبير عن Bcl-2 و Bax و cleaved caspase-3 و caspase-3 في أنسجة خصية الفأر. البيانات معروضة كالمتوسط ± الانحراف المعياري؛ n = 6. ***p < 0.001 مقابل المجموعة الضابطة؛ p < 0.001 مقابل CP؛ p < 0.001 مقابل 800 mg/kg YC + sh-NC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

توافر البيانات:
البيانات الخام التي تدعم نتائج هذه الدراسة متوفرة في الملف التكميلي 1.

الملف التكميلي 1: البيانات الأصلية. يحتوي ملف Excel هذا على البيانات الرقمية الخام التي استندت إليها التحليلات الكمية المعروضة في الأشكال 2-8. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

يعتبر خلل تكوين الحيوانات المنوية المكتسب الناجم عن العلاج الكيميائي سبباً هاماً للعقم عند الذكور32,33,34. ومع ذلك، لا تزال الآليات الجزيئية المحددة غير مفهومة بشكل كامل. تُظهر نتائج هذه الدراسة أن كبسولات Yangjing (YC) تحسن بشكل يعتمد على الجرعة من اضطرابات الهرمونات الجنسية، والتلف النسيجي المرضي في الخصية، وضعف الخصوبة الناجم عن السيكلوفوسفاميد (CP) في ذكور الفئران. وقد ارتبطت هذه التحسينات بزيادة تنظيم lncRNA NONMMUT031883.2 وتثبيط مسار QKI-5/p38 MAPK، مما يشير إلى أن YC قد يعمل من خلال هذا المحور لتقليل الموت الخلوي المبرمج غير الطبيعي للخلايا المنوية الأصلية.

تم توثيق السمية التناسلية لـ CP على نطاق واسع. حيث يمكن لمستقلبه "أكرولين" أن يتراكم في أنسجة الخصية ويحفز موت الخلايا المبرمج في الخلايا الجرثومية من خلال الإجهاد التأكسدي وتلف DNA ومسارات أخرى. وتُعد الخلايا النطفية الأم، باعتبارها الخلايا الأولية في عملية تكوين الحيوانات المنوية، حساسة بشكل خاص للتأثيرات السامة للخلايا لـ CP35,36. وقد وجد Cao et al. أن إشارات نقاط تفتيش تلف DNA كانت غنية بشكل ملحوظ في أنسجة الخصية لدى المرضى الذين يعانون من فقد النطاف بعد العلاج الكيميائي بـ CP، بينما انخفض تعبير الجينات المرتبطة بتطور الحيوانات المنوية بشكل ملحوظ وتعطل السلامة الهيكلية للأنابيب المنوية37. ويُعد Bcl-2 بروتيناً مضاداً لموت الخلايا المبرمج يعمل عن طريق الحفاظ على سلامة الغشاء الميتوكوندري38. أما Bax فهو بروتين محفز لموت الخلايا المبرمج، ويمكن أن يؤدي ارتفاع تعبيره إلى تعزيز إطلاق السيتوكروم c من الميتوكوندريا إلى السيتوبلازم، وتنشيط شلال الكاسبيز، وتحفيز موت الخلايا المبرمج39,40. وقد أثبت Saleh et al. أن التعرض لـ CP سبب ضمور الأنابيب المنوية ووذمة خلالية في الفئران، مصحوباً بانخفاض تعبير Bcl-2 وارتفاع تعبير Bax، مما أدى في النهاية إلى انخفاض عدد الحيوانات المنوية وحركتها41. لذا، قد يمثل تثبيط موت الخلايا النطفية الأم المفرط الناتج عن CP هدفاً مهماً لحماية الوظيفة التناسلية بعد العلاج الكيميائي. وفي الدراسة الحالية، أدى التدخل بـ YC إلى تقليل التشوهات الناجمة عن CP في إفراز الهرمونات الجنسية في المصل بشكل يعتمد على الجرعة، وأصلح تلف الأنابيب المنوية، وحسن حركة الحيوانات المنوية والخصوبة لدى الذكور. كما زاد YC من تعبير Bcl-2 وخفض تعبير Bax، ونسبة cleaved caspase-3/caspase-3، وعدد الخلايا الموجبة لـ TUNEL في أنسجة الخصية. In vitro، قلل المصل المحتوي على YC بشكل ملحوظ من موت خلايا GC-1 المبرمج وزاد من حيوية الخلايا، مما يدعم بشكل أكبر وجود تأثير مثبط لموت الخلايا النطفية الأم المبرمج.

تلعب الحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل (lncRNAs) أدواراً تنظيمية مهمة في العمليات الفسيولوجية والمرضية، بما في ذلك عملية تكوين الحيوانات المنوية وموت الخلايا الجرثومية المبرمج42,43. ويمكن أن يؤدي التعبير غير الطبيعي لـ lncRNA إلى ضعف وظيفة تكوين الحيوانات المنوية في الخصية من خلال تنظيم الإجهاد التأكسدي ومسارات الموت الخلوي المبرمج، مما يمثل آلية جزيئية مهمة للعقم عند الذكور44. وقد وجد Wang et al. أن lncRNA DNM3OS ينظم محور miR-214-5p/E2F2، مما يؤدي إلى تقليل نشاط الخلايا المكونة للنطاف وزيادة الموت الخلوي المبرمج والشيخوخة، وهو ما يساهم في النهاية في حدوث فقد النطاف غير الانسدادي45. كما أظهرت أبحاث سابقة أن تثبيط lncRNA NONMMUT074098.2 في الخلايا المكونة للنطاف يحفز الموت الخلوي المبرمج25. وتشير هذه الدراسات إلى أن lncRNAs هي منظمات مهمة لموت الخلايا المكونة للنطاف المبرمج وعملية تكوين الحيوانات المنوية. وفي الدراسة الحالية، أدى تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2 إلى تحفيز الموت الخلوي المبرمج للخلايا المكونة للنطاف. وقد انخفض تعبيره بشكل ملحوظ في أنسجة خصية الفئران بعد التحفيز بواسطة CP، بينما أدى التدخل بـ YC إلى استعادة تعبيره جزئياً. بالإضافة إلى ذلك، خفف التدخل بـ YC من الموت الخلوي المبرمج غير الطبيعي للخلايا المكونة للنطاف الناتج عن تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2، مما يشير إلى أن التأثير الوقائي لـ YC قد يكون مرتبطاً بتنظيم هذا الـ lncRNA.

يُعد QKI-5 بروتيناً مرتبطاً بـ RNA ينتمي إلى عائلة STAR، ويشارك في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية من خلال تنظيم عملية ربط mRNA المستهدف، واستقراره، وكفاءة ترجمته46,47. وقد أثبتت الأبحاث السابقة أن QKI-5 منظم مهم في الجهاز التناسلي، وأن تعبيره غير الطبيعي يمكن أن يعزز موت الخلايا الجرثومية المبرمج ويضعف وظيفة الحيوانات المنوية من خلال تنشيط مسار p38 MAPK في المصب25. ووجد Li et al. أن تثبيط تنشيط مسار p38 MAPK أدى إلى تقليل تلف أنسجة الخصية الناجم عن CP واستعادة وظيفة الحاجز الدموي الخصوي في الجرذان48. تشير هذه النتائج إلى أن محور QKI-5/p38 MAPK قد يكون مساراً مهماً ينظم موت الخلايا المنوية المبرمج وهدفاً محتملاً لعلاج خلل تكوين الحيوانات المنوية. في الدراسة الحالية، زاد تعبير QKI-5 وفسفرة p38 بشكل ملحوظ في أنسجة خصية الفئران بعد تحفيز CP، بينما أدى التدخل بـ YC إلى تقليل تعبير QKI-5 وتنشيط مسار p38 MAPK. ارتبط LncRNA NONMMUT031883.2 مباشرة بـ QKI-5، بينما لم يؤثر تعبير QKI-5 على استقرار lncRNA، مما يشير إلى أن lncRNA NONMMUT031883.2 قد ينظم وظيفة QKI-5 من خلال التفاعل المباشر. أدى تثبيط QKI-5 إلى تخفيف الضرر الذي لحق بخلايا GC-1 والناجم عن تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2، بينما أدى الإفراط في تعبير QKI-5 إلى تقليل التأثيرات الوقائية لـ YC على خلايا GC-1. ذكر Li et al. أن lncRNA NONMMUT074098.2 ينظم موت الخلايا الجرثومية المبرمج عن طريق الارتباط بـ QKI-525. وتظهر النتائج الحالية أن lncRNA NONMMUT031883.2 يرتبط أيضاً بـ QKI-5 ويشارك في تنظيم موت الخلايا المنوية المبرمج. وبناءً على ذلك، تشير هذه البيانات إلى أن YC قد يحفز تعبير lncRNA NONMMUT031883.2، ويثبط مسار QKI-5/p38 MAPK، ويقلل من موت الخلايا المنوية المبرمج غير الطبيعي، ويخفف من خلل تكوين الحيوانات المنوية الناجم عن CP. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن YC عبارة عن تركيبة عشبية متعددة المكونات من المحتمل أن تعمل على أهداف متعددة. ولا يمكن استبعاد آليات أخرى، مثل التأثيرات المضادة للأكسدة المباشرة لمكونات YC، أو تعديل مسارات إشارات أخرى، أو التنظيم فوق الجيني المستقل عن محور lncRNA-QKI-5، والتي قد تساهم في التأثيرات الوقائية الملحوظة.

يجب الإقرار بوجود عدة قيود لهذه الدراسة؛ حيث أجريت الدراسة فقط على نموذج فأر وفي خط خلايا GC-1، وافتقرت إلى التحقق باستخدام عينات سريرية من مرضى يعانون من العقم. وتعد عملية تكوين الحيوانات المنوية عملية معقدة، وتستغرق الدورة الكاملة لتكوين الحيوانات المنوية في الفئران حوالي 35 يوماً49,50. ولم يغطِ نظام YC الذي استمر لمدة 30 يوماً والمستخدم في هذه الدراسة دورة كاملة لتكوين الحيوانات المنوية. لذلك، هناك حاجة إلى دراسات مستقبلية تعتمد بروتوكولات تدخل تبلغ ≥35 يوماً لتقييم التأثيرات العلاجية لـ YC بشكل منهجي على مدار دورة تكوين حيوانات منوية كاملة. بالإضافة إلى ذلك، لا تزال الأحداث الجزيئية الدقيقة التي تلي ارتباط lncRNA NONMMUT031883.2 بـ QKI-5، مثل التغيرات في نشاط وصل QKI-5 وتوضعه داخل الخلايا، والتعرف على أهداف الوصل المصبة وتنظيمها، بحاجة إلى استكشاف. علاوة على ذلك، وعلى الرغم من أن العلاج بـ YC أدى إلى زيادة تعبير lncRNA NONMMUT031883.2، إلا أن عوامل النسخ العلوية والآليات فوق الجينية لا تزال بحاجة إلى توضيح. هناك حاجة إلى دراسات مستقبلية تتضمن تحليل المحفز واختبارات الترسيب المناعي للكروماتين لتوضيح الأساس الجزيئي للتعبير عن lncRNA NONMMUT031883.2 المستحث بواسطة YC. وفضلاً عن ذلك، يجب أن تقيم الدراسات المستقبلية تأثيرات YC على المرضى الذين يعانون من عقم ذكري مرتبط بالعلاج الكيميائي، وتقييم تعبير lncRNA NONMMUT031883.2 في أنسجة الخصية أو السائل المنوي لتحديد قيمته السريرية المحتملة كعلامة تشخيصية أو علاجية.

وفي الختام، يعمل YC على زيادة تنظيم lncRNA NONMMUT031883.2 وتثبيط تنشيط مسار QKI-5/p38 MAPK، مما يؤدي إلى تقليل موت الخلايا المبرمج في الخلايا المنسلية المنوية وتخفيف تلف الخصية وتحسين خلل تكوين الحيوانات المنوية في الفئران. وتوضح هذه النتائج الآلية الجزيئية الكامنة وراء التأثيرات الوقائية لـ YC ضد خلل تكوين الحيوانات المنوية، كما توسع الفهم الحالي لأدوار lncRNA NONMMUT031883.2 ومسار QKI-5/p38 MAPK في تنظيم عملية تكوين الحيوانات المنوية. قد يمثل lncRNA NONMMUT031883.2 و QKI-5 أهدافاً علاجية محتملة لعلاج خلل تكوين الحيوانات المنوية لدى الذكور.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود أي تضارب في المصالح، سواء كانت مالية أو غير مالية.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (منحة رقم 82374257)، والدفعة الرابعة من برنامج تدريب المواهب الأكاديمية المتميزة في مستشفى مقاطعة جيانغسو للطب الصيني (منحة رقم k2026yrc74)، ومشاريع البحث العلمي للطب الصيني التقليدي والطب المتكامل الصيني والغربي في مقاطعة جيانغسو (منحة رقم CYTF2026019).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أكتينومايسين د (Actinomycin D)MedChemExpress، مونماوث جنكشن، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكيةHY-17559مثبط نسخ يُستخدم في فحوصات استقرار الحمض النووي الريبوزي (RNA)
إنزيم النسخ العكسي لفيروس لويكوز الدواجن (AMV)Takara، طوكيو، اليابان2621إنزيم تخليق الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين المكمل
طقم كشف Annexin V-APC/PIBioLab Technology، بكين، الصينKFS191طقم لتحليل الموت الخلوي المبرمج باستخدام قياس التدفق الخلوي
وسط تثبيت مضاد للتلاشيMedChemExpress، مونماوث جانكشن، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكيةHY-K1042وسط التثبيت للحفاظ على الفلورة
الأجسام المضادة الأولية لـ BaxAffinity Biosciences، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكيةAF0120الجسم المضاد الأولي للكشف عن Bax
طقم BCAماكلين، شنغهاي، الصينB917925طقم تقدير تركيز البروتين
الأجسام المضادة الأولية لـ Bcl-2Affinity Biosciences، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكيةAF0769الأجسام المضادة الأولية للكشف عن Bcl-2
ألبومين المصل البقريBioLab Technology، بكين، الصينBTN131070كاشف الحجب
طقم كشف Calcein/PIBeyotime، شنغهاي، الصينC2015Mطقم صبغ الخلايا الحية والميتة
طقم فحص نشاط كاسباز-3BioLab Technology، بكين، الصينQN2866طقم قياس نشاط كاسباز-3
الأجسام المضادة الأولية لإنزيم كاسباز-3Abcam، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكيةab184787الجسم المضاد الأولي للكشف عن caspase-3
كاشف CCK-8MedChemExpress, مونماوث جونكشن، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكيةHY-K0301كاشف لتقييم حيوية الخلايا
الأجسام المضادة الأولية لـ caspase-3 المشطورAbcam، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكيةab32042جسم مضاد أولي للكشف عن كاسباز-3 المشطور
سيكلوهكسيميدماكلين، شنغهاي، الصينH823111مثبط تخليق البروتين المستخدم في مقايسات استقرار البروتين
سيكلوفوسفاميدMedChemExpress، مونموث جنكشن، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكيةHY-17420تُستخدم لاستحثاث خلل في تكوين الحيوانات المنوية
كاشف DAPIBeyotime، شنغهاي، الصينC1006صبغة نووية متباينة
وسط DMEMووهان صن سيل للتكنولوجيا الحيوية (Wuhan Sunncell Biotechnology)، هوبي، الصينSNLM-302وسط زراعة الخلايا لخلايا GC-1
محلول العمل للتألق الكيميائي الكهربائي (ECL)Solarbio، بكين، الصينSW2030ركيزة كيميائية مضيئة للكشف عن حزم البروتين
إيتوبوسيدMedChemExpress، مونموث جنكشن، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكيةHY-13629عامل محفز لموت الخلايا المبرمج
جهاز قياس التدفق الخلويBD Biosciences، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكيةBD FACSCaliburجهاز لتحليل الموت الخلوي المبرمج
برنامج FlowJoBD Biosciences، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكيةv10.8برمجيات تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي
المجهر الفلوريLeica، هايدلبرغ، ألمانياDM3000جهاز التصوير الفلوري
جسم مضاد ثانوي IgG موسوم بالفلوريسنتServicebio، ووهان، الصينGB22303الأجسام المضادة الثانوية للكشف باستخدام التألق المناعي
طقم مقايسة الممتز الموحد للإنزيم (ELISA) للهرمون المنشط للحويصلةHuamei Biotech، ووهان، الصينCSB-E06871mطقم قياس الهرمون المنبه للجريب في المصل
الأجسام المضادة الأولية لـ GAPDHAffinity Biosciences، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكيةT0004الأجسام المضادة الضابطة للتحميل في تحليل لطخة ويسترن
خلايا GC-1Wuhan Sunncell Biotechnology، هوبي، الصينSNL-302خط خلايا الخلايا المنوية في الفأر
نظام تصوير الهلامجهاز تحليل جينبينج (Jinpeng)، شنغهاي، الصينJP-2880نظام تصوير لمعاينة الهلام والبصمة البروتينية
نظام تصوير الهلامInvitrogen, Carlsbad, CA, USAiBright CL1500نظام تصوير التألق الكيميائي لتحليل لطخة ويسترن
جسم مضاد من الماعز ضد IgG الأرنبServicebio، ووهان، الصينGB23303الأجسام المضادة الثانوية لطريقة لطخة ويسترن
محلول الهيماتوكسيلينBioLab Technology، بكين، الصينYT165صبغة نووية للتحليل النسيجي
محلول التمييز بين حمض الهيدروكلوريك والإيثانولBeyotime، شنغهاي، الصينC0163Sكاشف التمايز لصبغة الهيماتوكسيلين
برنامج ImageJالمعاهد الوطنية للصحة، الولايات المتحدة الأمريكية١.٥٤ ساعةبرمجيات التكميم الصوري
محلول تحلل الخلايا لترسيب المناعة (IP)Beyotime، شنغهاي، الصينP0013محلول التحلل للترسيب المناعي واستخلاص البروتين
الأجسام المضادة الأولية لـ Ki67Affinity Biosciences, أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكيةAF0198الأجسام المضادة الأولية للكشف عن Ki67
طقم تحليل السمية الخلوية بإنزيم LDHBeyotime، شنغهاي، الصينC0016طقم قياس إطلاق إنزيم لاكتات ديهيدروجيناز والتلف الخلوي
المجهر الضوئيأوليمبوس، طوكيو، اليابانCKX53تُستخدم لعدّ الحيوانات المنوية وفحص خصائصها المورفولوجية
Lipofectamine 3000Invitrogen, Carlsbad, CA, USAL3000001كاشف ترانسفكشن (كاشف نقل الجينات)
قارئ الأطباق الدقيقةMolecular Devices، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكيةSpectraMax Miniجهاز لقياس الامتصاصية
طقم مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) للهرمون الملوتن للفأرشركة Huamei Biotech، ووهان، الصينCSB-E12770mطقم قياس الهرمون اللوتيني في المصل
طقم مقايسة الممتز الموحد للإنزيم المرتبط (ELISA) لهرمون التستوستيرون في الفئرانHuamei Biotech، ووهان، الصينCSB-E05101mطقم قياس التستوستيرون في المصل
صمغ متعادلBioLab Technology، بكين، الصينQN1253وسط التثبيت للمقاطع النسيجية
الأجسام المضادة الأولية لـ p38Affinity Biosciences، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكيةAF6456الأجسام المضادة الأولية للكشف عن البروتين p38 الكلي
بارافورمالدهيدMedChemExpress، مونماوث جنكشن، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكيةHY-Y0333المثبت للخلايا والأنسجة
طقم PARISInvitrogen، كارلسباد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكيةAM1921طقم فصل الحمض الريبي النووي (RNA) النووي والسيتوبلازمي
نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)ABI، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكيةABI PRISM 7300جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (Real-time PCR)
الأجسام المضادة الأولية لـ p-p38Affinity Biosciences، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكيةAF3455الأجسام المضادة الأولية للكشف عن بروتين p38 المفسفر
محلول بروتيناز ك (Proteinase K)Beyotime، شنغهاي، الصينST532كاشف نفاذية الأنسجة قبل صبغ TUNEL
أغشية PVDFMillipore، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكيةISEQ00010أغشية نقل البروتين في تحليل لطخة ويسترن (Western blotting)
الأجسام المضادة الأولية QKI-5Abcam، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكيةab126742جسم مضاد أولي للكشف عن QKI-5
محلول ربط الحمض النووي الريبي (RNA)Invitrogen، كارلسباد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية65040Dمحلول منظم لتفاعلات ارتباط البروتين بالحمض النووي الريبي (RNA)
محلول تحميل SDS (سلفات دوديسيل الصوديوم)Beyotime، شنغهاي، الصينP0286محلول تحميل العينات لتقنية SDS-PAGE
حبيبات الستربتافيدين المغناطيسيةMedChemExpress، مونماوث جانكشن، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكيةHY-K0208خرزات مغناطيسية لالتقاط مجسات الحمض الريبي النووي (RNA) المسمى بالبيوتين
طقم TB Green FAST qPCRTakara، طوكيو، اليابانCN830Sطقم كواشف لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي
Triton X-100ماكلين، شنغهاي، الصينT824275كاشف النفاذية
كاشف TRIzolInvitrogen، كارلسباد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية15596018CNكاشف لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي (RNA)
محلول الكشف عن TUNELBeyotime، شنغهاي، الصينC1086كاشف للكشف عن تفتت الحمض النووي (DNA)
زايلينماكلين، شنغهاي، الصينX821391كاشف لإزالة البارافين وتصفية الأنسجة

المراجع

  1. Bhattacharya I, Sharma SS, Majumdar SS. Etiology of male infertility: an update. Reprod Sci. 2024;31(4):942-965.
  2. Dong S, et al. Testicular aging, male fertility and beyond. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:1012119.
  3. Wang X, et al. Decoding the pathogenesis of spermatogenic failure in cryptorchidism through single-cell transcriptomic profiling. Cell Rep Med. 2024;5(9):101709.
  4. Stallmeyer B, et al. Inherited defects of piRNA biogenesis cause transposon de-repression, impaired spermatogenesis, and human male infertility. Nat Commun. 2024;15(1):6637.
  5. Szlachcikowska D, Koszła O, Sołek P, Tabęcka-Łonczyńska A. Non-canonical apoptosis mediates oxaliplatin-induced disruption of spermatogenic cells: implications for male fertility. Chem Biol Interact. 2026;431:112009.
  6. Chi YN, et al. Geniposide attenuates spermatogenic dysfunction via .inhibition of endoplasmic reticulum stress in male mice. Chem Biol Interact. 2022;366:110144.
  7. Guo XB, et al. Protective effect of bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes against the reproductive toxicity of cyclophosphamide is associated with the p38 MAPK/ERK and AKT signaling pathways. Asian J Androl. 2021;23(4):386-391.
  8. Lamb DJ. Chromosome defects and male factor infertility. Fertil Steril. 2025;123(6):933-942.
  9. Kathrins M, Niederberger C. Diagnosis and treatment of infertility-related male hormonal dysfunction. Nat Rev Urol. 2016;13(6):309-323.
  10. Piechka A, et al. Molecular mechanisms of cellular dysfunction in testes from men with non-obstructive azoospermia. Nat Rev Urol. 2024;21(2):67-90.
  11. Li Z, et al. The role of Cistanches Herba and its ingredients in improving reproductive outcomes: a comprehensive review. Phytomedicine. 2024;129:155681.
  12. Jiang X, et al. Shenling Baizhu San improves spermatogenic dysfunction in hyperuricemia mice by regulating Sirt3/Nrf2 to inhibit testicular ferroptosis. J Ethnopharmacol. 2025;340:119310.
  13. Deng W, Sun D, Cai B, Jin B. Yangjing capsule improves oligoasthenozoospermia by promoting nitric oxide production through the PLCγ1/AKT/eNOS pathway. Front Pharmacol. 2023;14:1056091.
  14. Zhao H, et al. Yangjing Capsule ameliorates spermatogenesis in male mice exposed to cyclophosphamide. Evid Based Complement Alternat Med. 2015;2015:980583.
  15. Jin B, et al. Yangjing Capsule improves testicular angiogenesis by activating the VEGFA/eNOS signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2020;2020:1957267.
  16. Guo W, et al. Chlorocholine chloride exposure induced spermatogenic dysfunction via .iron overload caused by AhR/PERK axis-dependent ferritinophagy activation. Ecotoxicol Environ Saf. 2024;274:116193.
  17. Wang Z, et al. Yangjing Capsule extract promotes proliferation of GC-1 Spg cells. Evid Based Complement Alternat Med. 2014;2014:640857.
  18. Zhang P, et al. LncRNA-mediated adipogenesis in different adipocytes. Int J Mol Sci. 2022;23(13).
  19. Núñez-Martínez HN, Recillas-Targa F. Emerging functions of lncRNA loci beyond the transcript itself. Int J Mol Sci. 2022;23(11).
  20. Herman AB, Tsitsipatis D, Gorospe M. Integrated lncRNA function upon genomic and epigenomic regulation. Mol Cell. 2022;82(12):2252-2266.
  21. Wang JZ, et al. QKI-5 regulates the alternative splicing of the cytoskeletal gene ADD3 in lung cancer. J Mol Cell Biol. 2021;13(5):347-360.
  22. Zeng Y, et al. Nickel induces blood-testis barrier damage through ROS-mediated p38 MAPK pathways in mice. Redox Biol. 2023;67:102886.
  23. Luo D, He Z, Yu C, Guan Q. Role of p38 MAPK signaling in testis development and male fertility. Oxid Med Cell Longev. 2022;2022:6891897.
  24. Xia C, et al. LncRNA CCAT1 enhances chemoresistance in hepatocellular carcinoma by targeting QKI-5. Sci Rep. 2022;12(1):7826.
  25. Li K, et al. A long noncoding RNA binding to QKI-5 regulates germ cell apoptosis via .the p38 MAPK signaling pathway. Cell Death Dis. 2019;10(10):699.
  26. Zhou X, et al. ANKRD49 inhibits etoposide-induced intrinsic apoptosis of GC-1 cells by modulating NF-κB signaling. Mol Cell Biochem. 2019;457(1-2):21-29.
  27. Fang C, et al. Integrative proteomics and metabolomics approach to identify the key roles of icariin-mediated protective effects against cyclophosphamide-induced spermatogenesis dysfunction in mice. Front Pharmacol. 2022;13:1040544.
  28. Li K, et al. Adeno-associated-virus-mediated delivery of CRISPR-CasRx induces efficient RNA knockdown in the mouse testis. Theranostics. 2024;14(10):3827-3842.
  29. Yi H, et al. Retinoic acid mitigates NSC319726-induced spermatogenesis dysfunction through cuproptosis-independent mechanisms. Cell Biol Toxicol. 2024;40(1):26.
  30. Guo Y, Wang A, Liu X, Li E. Effects of resveratrol on reducing spermatogenic dysfunction caused by high-intensity exercise. Reprod Biol Endocrinol. 2019;17(1):42.
  31. Beeraka NM, et al. Ginsenoside Rh4 suppresses Notch3 and PI3K/Akt signaling to inhibit the growth and metastasis of gastric cancer cells. J Cancer Biomol Ther. 2025;2(1):145-156.
  32. Li P, et al. Proteomic analysis of cisplatin-induced spermatogenesis defects in mice. Ann Med. 2026;58(1):2612816.
  33. Wang Z, et al. Melatonin ameliorates paclitaxel-induced spermatogenesis and fertility defects in mice. J Cell Mol Med. 2022;26(4):1219-1228.
  34. Abdi M, et al. Cyclophosphamide-induced infertility and the impact of antioxidants. Am J Reprod Immunol. 2024;92(6):e70014.
  35. Özbilgin MK, Demirören S, Üçöz M, Oztatlici M. Cyclophosphamide suppresses spermatogenesis in the testes of mice through downregulation of miR-34b and miR-34c. Andrologia. 2021;53(7):e14071.
  36. Poojary KK, et al. Curcumin nanocrystals attenuate cyclophosphamide-induced testicular toxicity in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 2021;433:115772.
  37. Cao J, et al. Single-cell map of human azoospermic testes caused by cyclophosphamide chemotherapy. Sci Data. 2024;11(1):163.
  38. Dong Y, et al. New insights into polycyclic aromatic hydrocarbons: Phenanthrene targets ribosomes to induce neuronal apoptosis. Aquat. Toxicol. 2026;298:107884.
  39. Wang Y, et al. Interplay between elemental imbalance-related PI3K/Akt/mTOR-regulated apoptosis and autophagy in arsenic (III)-induced jejunum toxicity of chicken. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2018;25(19):18662-18672.
  40. Liu H, et al. Integrating network toxicology, transcriptomics and experimental validation to elucidate the potential mechanisms of fluoride-induced neurotoxicity in zebrafish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 2026;306:110549.
  41. Saleh DO, et al. Cyclophosphamide-induced testicular injury: the role of chrysin in mitigating iron overload and ferroptosis. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(5):5475-5489.
  42. Dong S, et al. Loss of lncRNAs 1700101O22Rik and 1700027A15Rik causes sperm malformation and subfertility. Andrology. 2025;13(5):1223-1235.
  43. Liu W, et al. A novel meiosis-related lncRNA, Rbakdn, contributes to spermatogenesis by stabilizing Ptbp2. Front Genet. 2021;12:752495.
  44. Sun TC, et al. LncRNAs induce oxidative stress and spermatogenesis by regulating endoplasmic reticulum genes and pathways. Aging (Albany NY). 2021;13(10):13764-13787.
  45. Hua R, et al. DNM3OS enhances the apoptosis and senescence of spermatogonia associated with nonobstructive azoospermia by providing miR-214-5p and decreasing E2F2 expression. Anal Cell Pathol (Amst). 2023;2023:1477658.
  46. Wang S, et al. Quaking 5 suppresses TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition and cell invasion in lung adenocarcinoma. EMBO Rep. 2021;22(6):e52079.
  47. Chen X, et al. The emerging roles of the RNA-binding protein QKI in cardiovascular development and function. Front Cell Dev Biol. 2021;9:668659.
  48. Li J, et al. Qiangjing tablets repair blood-testis barrier dysfunction in rats by regulating oxidative stress and the p38 MAPK pathway. BMC Complement Med Ther. 2022;22(1):133.
  49. Tang Z, et al. MRE11 is essential for the long-term viability of undifferentiated spermatogonia. Cell Prolif. 2024;57(9):e13685.
  50. Jiao Y, Feng Z, Zhang T, Chen X. Impact of Vitamin D(3) Supplementation on Androgens and Semen Parameters in Infertile Men: A Systematic Review and Meta-Analysis Based on Prospective Randomised Controlled Trials. Arch. Esp. 2025;78(6):772-781.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BiologyYangjing Capsulesspermatogenic dysfunctionlncRNA NONMMUT031883 2Quaking I 5p38 MAPK pathway

مقالات ذات صلة