تقيم هذه الدراسة التأثيرات الوقائية لكبسولة Yangjing على خلل تكوين الحيوانات المنوية الناجم عن السيكلوفوسفاميد في الفئران، وتفحص مشاركة مسار تأشير lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة بحثية
تقيم هذه الدراسة التأثيرات الوقائية لكبسولة Yangjing على خلل تكوين الحيوانات المنوية الناجم عن السيكلوفوسفاميد في الفئران، وتفحص مشاركة مسار تأشير lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.
يعد خلل تكوين الحيوانات المنوية سببًا هامًا للعقم عند الذكور، ويمكن أن يؤدي عقار cyclophosphamide (CP) إلى إضعاف عملية تكوين الحيوانات المنوية من خلال تحفيز الموت الخلوي المبرمج غير الطبيعي للخلايا المنوية. وقد استُخدمت كبسولات Yangjing (YC) لتحسين الوظيفة الإنجابية، إلا أن آليتها الجزيئية الكامنة لا تزال غير واضحة. بحثت هذه الدراسة في التأثيرات الوقائية لـ YC في نموذج فأر مصاب بخلل تكوين الحيوانات المنوية المستحث بواسطة CP، وفي خلايا GC-1 المنوية. وتم تقييم عدد الحيوانات المنوية وحركتها، والخصوبة الذكرية، ومستويات الهرمونات الجنسية في المصل، والتغيرات الهيستوباثولوجية في الخصيتين والبربخ. كما تم تقييم حيوية الخلايا، وإطلاق إنزيم lactate dehydrogenase، والموت الخلوي المبرمج، والبروتينات المرتبطة بالموت الخلوي المبرمج في خلايا GC-1. واستُخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي (qRT-PCR)، ومقايسات RNA pull-down، والفلورة المناعية، واللطخة الغربية (Western blotting) لفحص lncRNA NONMMUT031883.2، و Quaking-5 (QKI-5)، ومسار إشارات p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK). أدت YC، بطريقة تعتمد على الجرعة، إلى تحسين جودة الحيوانات المنوية، ومستويات الهرمونات الجنسية في المصل، ومورفولوجيا الأعضاء التناسلية، والهيستوباثولوجيا الخصوية، والخصوبة في الفئران المعالجة بـ CP. وفي خلايا GC-1، زادت YC من حيوية الخلايا وقللت من التلف الخلوي والموت الخلوي المبرمج. وتفاعل lncRNA NONMMUT031883.2 فيزيائيًا مع QKI-5، وأدى العلاج بـ YC إلى زيادة تعبير lncRNA NONMMUT031883.2 بينما قلل من تعبير QKI-5 وفسفرة p38. كما ثبط العلاج بـ YC الموت الخلوي المبرمج المستحث عن طريق تثبيط (knockdown) lncRNA NONMMUT031883.2 في خلايا GC-1، بينما قلل التعبير المفرط لـ QKI-5 من التأثيرات المضادة للموت الخلوي المبرمج لـ YC. وتشير هذه النتائج إلى أن YC يخفف من خلل تكوين الحيوانات المنوية المستحث بواسطة CP، وأن تأثيراته الوقائية تتم عبر تنظيم مسار lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.
يشير الخلل الوظيفي في تكوين الحيوانات المنوية إلى ضعف إنجابي ناتج عن تشوهات في إنتاج الحيوانات المنوية أو نضجها أو وظيفتها في الجهاز التناسلي الذكري. ويتميز بانخفاض عدد الحيوانات المنوية وحركيتها وزيادة معدل تشوه الحيوانات المنوية1,2. وتعد إمراضية الخلل الوظيفي في تكوين الحيوانات المنوية معقدة وترتبط بعوامل وراثية، واضطرابات المناعة الذاتية، والسموم البيئية، والتلف الناجم عن العلاج الكيميائي، وآفات الأعضاء التناسلية3-5. ويمكن للأدوية الكيميائية مثل cyclophosphamide (CP) أن تسبب تلفاً مباشراً في الأنابيب المنوية في الخصية وتحفز موت الخلايا المبرمج في الخلايا المنوية، مما يساهم في حدوث الخلل الوظيفي في تكوين الح....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
أُجريت جميع تجارب الحيوانات وفقًا لإرشادات ARRIVE والدليل الخاص بالرعاية والاستخدام للحيوانات المعملية الصادر عن المعاهد الوطنية للصحة. وقد تم مراجعة جميع البروتوكولات التجريبية والموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة جنوب شرق (رقم الموافقة: 20230216022).
١. تحضير مصل يحتوي على YC
تم فتح كبسولتين من كبسولات يانغجينغ (YC؛ 0,5 غرام/كبسولة)، ووزن 0,8 غرام من محتويات الكبسولة. أُضيف محلول ملحي عادي حتى حجم نهائي قدره 10 مل، وتم خلط المزيج جيدًا باستخدام جهاز الاهتزاز الدوامي لإعداد معلق بتركيز 80 ملغم/مل. تم تربية ذكور فئران BALB/c الخالية من مسببات الأمراض المحددة، بوزن 22–25 غرامًا وبعمر 8 أسابيع، في 22 &#....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2 يحفز موت الخلايا المبرمج في الخلايا المكونة للنطاف
تم ترانزفكشن خلايا GC-1 باستخدام sh-lncRNA لتثبيط تعبير lncRNA NONMMUT031883.2. ومقارنة بالخلايا التي تم ترانزفكشنها بـ sh-NC، انخفض المستوى النسخي لـ lncRNA NONMMUT031883.2 بشكل ملحوظ بعد ترانزفكشن sh-lncRNA، مما يؤكد نجاح عملية التثبيط (الشكل 2A). وعقب تثبيط lncRNA NONMMUT031883.2، انخفضت حيوية خلايا GC-1 بشكل كبير (الشكل 2B)، بينما زاد إطلاق LDH بشكل ملحوظ، .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يعتبر خلل تكوين الحيوانات المنوية المكتسب الناجم عن العلاج الكيميائي سبباً هاماً للعقم عند الذكور32,33,34. ومع ذلك، لا تزال الآليات الجزيئية المحددة غير مفهومة بشكل كامل. تُظهر نتائج هذه الدراسة أن كبسولات Yangjing (YC) تحسن بشكل يعتمد على الجرعة من اضطرابات الهرمونات الجنسية، والتلف النسيجي المرضي في الخصية، وضعف الخصوبة الناجم عن السيكلوفوسفاميد (CP) في ذكور الفئران. وقد ارتبطت هذه التحسينات بزيادة تنظيم lncRNA NONMMUT031883.2.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يصرح المؤلفون بعدم وجود أي تضارب في المصالح، سواء كانت مالية أو غير مالية.
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (منحة رقم 82374257)، والدفعة الرابعة من برنامج تدريب المواهب الأكاديمية المتميزة في مستشفى مقاطعة جيانغسو للطب الصيني (منحة رقم k2026yrc74)، ومشاريع البحث العلمي للطب الصيني التقليدي والطب المتكامل الصيني والغربي في مقاطعة جيانغسو (منحة رقم CYTF2026019).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أكتينومايسين د (Actinomycin D) | MedChemExpress، مونماوث جنكشن، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية | HY-17559 | مثبط نسخ يُستخدم في فحوصات استقرار الحمض النووي الريبوزي (RNA) |
| إنزيم النسخ العكسي لفيروس لويكوز الدواجن (AMV) | Takara، طوكيو، اليابان | 2621 | إنزيم تخليق الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين المكمل |
| طقم كشف Annexin V-APC/PI | BioLab Technology، بكين، الصين | KFS191 | طقم لتحليل الموت الخلوي المبرمج باستخدام قياس التدفق الخلوي |
| وسط تثبيت مضاد للتلاشي | MedChemExpress، مونماوث جانكشن، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية | HY-K1042 | وسط التثبيت للحفاظ على الفلورة |
| الأجسام المضادة الأولية لـ Bax | Affinity Biosciences، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكية | AF0120 | الجسم المضاد الأولي للكشف عن Bax |
| طقم BCA | ماكلين، شنغهاي، الصين | B917925 | طقم تقدير تركيز البروتين |
| الأجسام المضادة الأولية لـ Bcl-2 | Affinity Biosciences، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكية | AF0769 | الأجسام المضادة الأولية للكشف عن Bcl-2 |
| ألبومين المصل البقري | BioLab Technology، بكين، الصين | BTN131070 | كاشف الحجب |
| طقم كشف Calcein/PI | Beyotime، شنغهاي، الصين | C2015M | طقم صبغ الخلايا الحية والميتة |
| طقم فحص نشاط كاسباز-3 | BioLab Technology، بكين، الصين | QN2866 | طقم قياس نشاط كاسباز-3 |
| الأجسام المضادة الأولية لإنزيم كاسباز-3 | Abcam، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية | ab184787 | الجسم المضاد الأولي للكشف عن caspase-3 |
| كاشف CCK-8 | MedChemExpress, مونماوث جونكشن، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية | HY-K0301 | كاشف لتقييم حيوية الخلايا |
| الأجسام المضادة الأولية لـ caspase-3 المشطور | Abcam، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية | ab32042 | جسم مضاد أولي للكشف عن كاسباز-3 المشطور |
| سيكلوهكسيميد | ماكلين، شنغهاي، الصين | H823111 | مثبط تخليق البروتين المستخدم في مقايسات استقرار البروتين |
| سيكلوفوسفاميد | MedChemExpress، مونموث جنكشن، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية | HY-17420 | تُستخدم لاستحثاث خلل في تكوين الحيوانات المنوية |
| كاشف DAPI | Beyotime، شنغهاي، الصين | C1006 | صبغة نووية متباينة |
| وسط DMEM | ووهان صن سيل للتكنولوجيا الحيوية (Wuhan Sunncell Biotechnology)، هوبي، الصين | SNLM-302 | وسط زراعة الخلايا لخلايا GC-1 |
| محلول العمل للتألق الكيميائي الكهربائي (ECL) | Solarbio، بكين، الصين | SW2030 | ركيزة كيميائية مضيئة للكشف عن حزم البروتين |
| إيتوبوسيد | MedChemExpress، مونموث جنكشن، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية | HY-13629 | عامل محفز لموت الخلايا المبرمج |
| جهاز قياس التدفق الخلوي | BD Biosciences، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية | BD FACSCalibur | جهاز لتحليل الموت الخلوي المبرمج |
| برنامج FlowJo | BD Biosciences، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية | v10.8 | برمجيات تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي |
| المجهر الفلوري | Leica، هايدلبرغ، ألمانيا | DM3000 | جهاز التصوير الفلوري |
| جسم مضاد ثانوي IgG موسوم بالفلوريسنت | Servicebio، ووهان، الصين | GB22303 | الأجسام المضادة الثانوية للكشف باستخدام التألق المناعي |
| طقم مقايسة الممتز الموحد للإنزيم (ELISA) للهرمون المنشط للحويصلة | Huamei Biotech، ووهان، الصين | CSB-E06871m | طقم قياس الهرمون المنبه للجريب في المصل |
| الأجسام المضادة الأولية لـ GAPDH | Affinity Biosciences، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكية | T0004 | الأجسام المضادة الضابطة للتحميل في تحليل لطخة ويسترن |
| خلايا GC-1 | Wuhan Sunncell Biotechnology، هوبي، الصين | SNL-302 | خط خلايا الخلايا المنوية في الفأر |
| نظام تصوير الهلام | جهاز تحليل جينبينج (Jinpeng)، شنغهاي، الصين | JP-2880 | نظام تصوير لمعاينة الهلام والبصمة البروتينية |
| نظام تصوير الهلام | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | iBright CL1500 | نظام تصوير التألق الكيميائي لتحليل لطخة ويسترن |
| جسم مضاد من الماعز ضد IgG الأرنب | Servicebio، ووهان، الصين | GB23303 | الأجسام المضادة الثانوية لطريقة لطخة ويسترن |
| محلول الهيماتوكسيلين | BioLab Technology، بكين، الصين | YT165 | صبغة نووية للتحليل النسيجي |
| محلول التمييز بين حمض الهيدروكلوريك والإيثانول | Beyotime، شنغهاي، الصين | C0163S | كاشف التمايز لصبغة الهيماتوكسيلين |
| برنامج ImageJ | المعاهد الوطنية للصحة، الولايات المتحدة الأمريكية | ١.٥٤ ساعة | برمجيات التكميم الصوري |
| محلول تحلل الخلايا لترسيب المناعة (IP) | Beyotime، شنغهاي، الصين | P0013 | محلول التحلل للترسيب المناعي واستخلاص البروتين |
| الأجسام المضادة الأولية لـ Ki67 | Affinity Biosciences, أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكية | AF0198 | الأجسام المضادة الأولية للكشف عن Ki67 |
| طقم تحليل السمية الخلوية بإنزيم LDH | Beyotime، شنغهاي، الصين | C0016 | طقم قياس إطلاق إنزيم لاكتات ديهيدروجيناز والتلف الخلوي |
| المجهر الضوئي | أوليمبوس، طوكيو، اليابان | CKX53 | تُستخدم لعدّ الحيوانات المنوية وفحص خصائصها المورفولوجية |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | L3000001 | كاشف ترانسفكشن (كاشف نقل الجينات) |
| قارئ الأطباق الدقيقة | Molecular Devices، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية | SpectraMax Mini | جهاز لقياس الامتصاصية |
| طقم مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) للهرمون الملوتن للفأر | شركة Huamei Biotech، ووهان، الصين | CSB-E12770m | طقم قياس الهرمون اللوتيني في المصل |
| طقم مقايسة الممتز الموحد للإنزيم المرتبط (ELISA) لهرمون التستوستيرون في الفئران | Huamei Biotech، ووهان، الصين | CSB-E05101m | طقم قياس التستوستيرون في المصل |
| صمغ متعادل | BioLab Technology، بكين، الصين | QN1253 | وسط التثبيت للمقاطع النسيجية |
| الأجسام المضادة الأولية لـ p38 | Affinity Biosciences، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكية | AF6456 | الأجسام المضادة الأولية للكشف عن البروتين p38 الكلي |
| بارافورمالدهيد | MedChemExpress، مونماوث جنكشن، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية | HY-Y0333 | المثبت للخلايا والأنسجة |
| طقم PARIS | Invitrogen، كارلسباد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية | AM1921 | طقم فصل الحمض الريبي النووي (RNA) النووي والسيتوبلازمي |
| نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) | ABI، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية | ABI PRISM 7300 | جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (Real-time PCR) |
| الأجسام المضادة الأولية لـ p-p38 | Affinity Biosciences، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكية | AF3455 | الأجسام المضادة الأولية للكشف عن بروتين p38 المفسفر |
| محلول بروتيناز ك (Proteinase K) | Beyotime، شنغهاي، الصين | ST532 | كاشف نفاذية الأنسجة قبل صبغ TUNEL |
| أغشية PVDF | Millipore، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية | ISEQ00010 | أغشية نقل البروتين في تحليل لطخة ويسترن (Western blotting) |
| الأجسام المضادة الأولية QKI-5 | Abcam، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية | ab126742 | جسم مضاد أولي للكشف عن QKI-5 |
| محلول ربط الحمض النووي الريبي (RNA) | Invitrogen، كارلسباد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية | 65040D | محلول منظم لتفاعلات ارتباط البروتين بالحمض النووي الريبي (RNA) |
| محلول تحميل SDS (سلفات دوديسيل الصوديوم) | Beyotime، شنغهاي، الصين | P0286 | محلول تحميل العينات لتقنية SDS-PAGE |
| حبيبات الستربتافيدين المغناطيسية | MedChemExpress، مونماوث جانكشن، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية | HY-K0208 | خرزات مغناطيسية لالتقاط مجسات الحمض الريبي النووي (RNA) المسمى بالبيوتين |
| طقم TB Green FAST qPCR | Takara، طوكيو، اليابان | CN830S | طقم كواشف لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي |
| Triton X-100 | ماكلين، شنغهاي، الصين | T824275 | كاشف النفاذية |
| كاشف TRIzol | Invitrogen، كارلسباد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية | 15596018CN | كاشف لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي (RNA) |
| محلول الكشف عن TUNEL | Beyotime، شنغهاي، الصين | C1086 | كاشف للكشف عن تفتت الحمض النووي (DNA) |
| زايلين | ماكلين، شنغهاي، الصين | X821391 | كاشف لإزالة البارافين وتصفية الأنسجة |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.