تُظهر هذه الدراسة أن miR-1298 يرتبط ارتباطاً وثيقاً بالاجتياح والهجرة في سرطان القولون والمستقيم (CRC)، وقد يعمل كمثبط للأورام من خلال تثبيط تطور هذا السرطان، مما يسلط الضوء على إمكاناته كهدف علاجي جديد لعلاج سرطان القولون والمستقيم.
مقالة بحثية
دور محور miR-1298/البروتين المكون للعظام 7 في سرطان القولون والمستقيم
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لقد شهد معدل الإصابة بسرطان القول والمستقيم (CRC) ارتفاعاً في السنوات الأخيرة. وقد قمنا باستكشاف الأهمية السريرية والآليات الجزيئية لـ miR-1298 في سرطان القول والمستقيم. تم إدراج ما مجموعه 85 مريضاً مصاباً بسرطان القول والمستقيم. تم تقييم جميع مستويات الجينات بواسطة RT-qPCR. وفي خلايا سرطان القول والمستقيم، تم تنظيم مستويات miR-1298 والبروتين المكون للعظم 7 (BMP7) باستخدام عملية ترانسفكشن الخلايا. تم التنبؤ بهدف miR-1298 باستخدام تحليل المعلوماتية الحيوية وتم تحديده بواسطة نظام مراسل لوسيفيراز المزدوج. كما تم تقييم وظيفة خلايا سرطان القول والمستقيم باستخدام مقايسة CCK-8، ومقايسة Transwell، وقياس التدفق الخلوي. تم تحليل العلاقة بين miR-1298 و BMP7 في أنسجة سرطان القول والمستقيم باستخدام ارتباط بيرسون. وقد لوحظ انخفاض كبير في مستويات miR-1298 في سرطان القول والمستقيم، وارتبط ذلك بخصائص مرضية سريرية خبيثة. وفي خلايا سرطان القول والمستقيم، قام miR-1298 بتثبيط التكاثر والهجرة والغزو، وزاد من عملية الموت الخلوي المبرمج. وكان BMP7 هدفاً في المصب لـ miR-1298 وارتبط معه ارتباطاً عكسياً. وقد أدى الإفراط في تعبير BMP7 إلى عكس التأثير المثبط لـ miR-1298 جزئياً على التكاثر والهجرة والغزو في خلايا سرطان القول والمستقيم، وكذلك عكس تحفيزه للموت الخلوي المبرمج. ارتبط miR-1298 بالغزو والهجرة وقد يثبط تطور سرطان القول والمستقيم. كما قد يكون BMP7 وسيطاً وظيفياً محتملاً لـ miR-1298 في سرطان القول والمستقيم.
المقدمة
يشكل سرطان القولون والمستقيم (CRC) عبئاً صحياً كبيراً على مستوى العالم، حيث يُصنف كأحد المساهمين الرئيسيين في الوفيات المرتبطة بالسرطان عالمياً1. ينشأ سرطان القولون والمستقيم من الخلايا الظهارية للقولون والمستقيم، وعادة ما يتطور تدريجياً عبر عملية متعددة المراحل تُعرف باسم التطور من الورم الغدي إلى السرطان، وهي عملية تستغرق عدة سنوات2. وتُعد تداعيات سرطان القولون والمستقيم بعيدة المدى ومتعددة الأوجه؛ فبالإضافة إلى خطر الوفاة، يمكن أن يؤثر هذا المرض بشكل كبير على الحياة اليومية للمرضى. وعادة ما يتطلب العلاج جراحة كبرى، والتي قد تؤدي إلى مضاعفات مثل فغر القولون الدائم، أو خلل في وظائف الأمعاء، أو خلل في الوظائف الجنسية والبولية3. علاوة على ذلك، فإن العبء المالي للعلاج الكيميائي والعلاج الموجه والمراقبة طويلة الأمد يشكل ضغطاً كبيراً على كل من المرضى ونظام الرعاية الصحية. ولذلك، يظل البحث في الآليات الجزيئية الكامنة وراء سرطان القولون والمستقيم أولوية رئيسية في مجال الصحة العامة.
في سرطان القولون والمستقيم (CRC)، يُعد خلل تنظيم جزيئات RNA ميكروية (miRNAs) محددة سمة بارزة في عملية التسرطن ويؤثر على عمليات حيوية رئيسية4. ولا يؤدي تحديد هذه الـ miRNAs ذات التعبير المتباين إلى تعزيز فهمنا للإمراض الخاص بسرطان القولون والمستقيم فحسب، بل يفتح أيضاً آفاقاً محتملة لمؤشرات حيوية تشخيصية جديدة وأهداف علاجية. ومن بين العديد من الـ miRNAs المرتبطة بالسرطان، برز miR-1298 كهدف رئيسي للبحث. وتشير الأدلة الحالية إلى أن miR-1298 يعمل غالباً ككابت للأورام في أنواع مختلفة من السرطانات. فعلى سبيل المثال، يقوم في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) بتثبيط نمو الخلايا وغزوها عن طريق استهداف مسارات جينية مسببة للسرطان5. وبالمثل، يرتبط انخفاض تعبيره في أورام الدماغ بتطور الورم، بينما يؤدي استعادته إلى تثبيط تقدم الورم6. ونظراً لدوره المثبت ككابت للأورام في سرطانات أخرى، فإن الدور المحدد لـ miR-1298 في التسرطن الغدّي للقولون والمستقيم - وخاصة أهدافه المصبّة والنتائج الوظيفية في سرطان القولون والمستقيم - لا يزال غير مستكشف إلى حد كبير. وتعتبر هذه الفجوة المعرفية كبيرة، نظراً للمشهد الجزيئي المتميز لسرطان القولون والمستقيم مقارنة بالأورام الخبيثة الأخرى.
يُعد BMP7 سيتوكينًا مفرزًا ومتعدد الوظائف ينتمي إلى عائلة عوامل النمو المحولة-β (TGF-β) الفائقة7. وفي سرطان القولون والمستقيم (CRC)، يلعب BMP7 دورًا أساسيًا في تعزيز نمو الورم. وعادةً ما يزداد تعبير BMP7 في أنسجة وخلايا سرطان القولون والمستقيم8. حيث يعمل BMP7 على رفع مستويات الغزو والهجرة والخصائص الشبيهة بالخلايا الجذعية في الخلايا السرطانية، وذلك على الأرجح من خلال تنشيط شلالات إشارات معززة للغزو وتعديل البيئة الدقيقة للورم لتعزيز الهجرة9. وفي أنواع مختلفة من السرطان، تم تحديد جزيئات miRNA معينة على أنها كابتات مباشرة لما بعد النسخ لـ BMP7. فعلى سبيل المثال، يستهدف miR-137 بروتين BMP7 في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) لتثبيط نمو الخلايا10. وفي ضوء هذه النتائج، نفترض أن BMP7 قد يكون مشاركًا في سرطان القولون والمستقيم. ومع ذلك، فإن ما إذا كان miR-1298 يستهدف BMP7 مباشرة في سرطان القولون والمستقيم لم يتم التحقق منه تجريبيًا. علاوة على ذلك، لا توجد دراسة وصفت بشكل شامل محور miR-1298/BMP7 في سرطان القولون والمستقيم من خلال دمج التحقق الميكانيكي، والتنميط الوظيفي، والارتباط السريري.
وبناءً على ذلك، هدفت هذه الدراسة إلى: (1) استقصاء نمط تنظيم miR-1298 في سرطان القولون والمستقيم (CRC) وارتباطه بالسمات المرضية السريرية؛ (2) التوصيف الوظيفي لتأثيرات miR-1298 على تكاثر خلايا سرطان القولون والمستقيم وموتها المبرمج وغزوها وهجرتها؛ (3) التحقق تجريبياً من أن BMP7 يمثل هدفاً لـ miR-1298 في سرطان القولون والمستقيم؛ (4) تقييم القيمة التشخيصية والإنذارية لـ miR-1298 لدى مرضى سرطان القولون والمستقيم. ومن خلال دمج هذه النهج المتكاملة، سعينا إلى تقديم فهم شامل لمحور miR-1298/BMP7 في سرطان القولون والمستقيم، واكتشاف مؤشرات حيوية وأهداف علاجية ناشئة لهذا المرض.
البروتوكول
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى ووهان للدماغ (رقم الموافقة: 20220826). وقدم جميع المشاركين موافقة كتابية مستنيرة قبل الالتحاق بالدراسة. أُجريت هذه الدراسة وفقاً لإعلان هلسنكي. كما تم الحصول على موافقة للنشر من جميع المشاركين الذين أُدرجت بياناتهم. تتوفر تفاصيل الكواشف، والمجموعات التحليلية، والأجسام المضادة، والخطوط الخلوية، والبلازميدات، والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة، بما في ذلك الشركات المصنعة ومعلومات الكتالوج، في جدول المواد.
المرضى والعينات
في الفترة من مايو 2022 إلى أغسطس 2024، قمنا بجمع عينات متزاوجة من الأنسجة السرطانية والأنسجة غير السرطانية المجاورة من 85 مريضاً مصاباً بسرطان القولون والمستقيم (CRC). لم يكن لدى أي من المشاركين تاريخ من الإصابة بالسرطان، أو العلاج الكيميائي، أو العلاج الإشعاعي. بالإضافة إلى ذلك، شملت هذه الدراسة 71 شخصاً سليماً كانوا يخضعون لفحص بدني.
الإنذار
تحددت القيم الحرجة لمجموعات التعبير العالي/المنخفض لـ miR-1298 بناءً على مستوى التعبير الوسيط في عينات أنسجة سرطان القولون والمستقيم (CRC). بلغت فترة المتابعة 12 شهراً، حيث أُجريت المتابعة عبر الهاتف أو من خلال إعادة الفحص. وكان الحدث النهائي هو الوفاة. ومن بين 85 مريضاً، سُجلت 14 حالة وفاة خلال فترة المتابعة، ولم يكن هناك مرضى مستبعدون من التحليل (censored).
زراعة الخلايا وترنسفكشن الخلايا
تم الحصول على خط خلايا القولون البشري الطبيعي FHC، بالإضافة إلى خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم البشري SW480 وHCT-116. زُرعت الخلايا في وسط Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) المكمل بـ 10% من مصل جنين البقر (FBS). تم إجراء ترنسفكشن لـ miR-1298 mimic أو المثبط في خلايا SW480 وHCT-116 باستخدام Lipofectamine 3000. بعد ذلك، تم إجراء ترنسفكشن مشترك لـ miR-1298 mimic مع pcDNA3.1-BMP7 (OE-BMP7) أو ناقل pcDNA3.1 (OE-NC) في خلايا SW480 وخلايا HCT-116. كانت الخطوات المحددة كما يلي: زُرعت الخلايا عند 37 °C مع 5% CO₂ حتى وصلت إلى درجة تلاقي بنسبة 70%–80%. تم استزراع الخلايا بكثافة 5 x 104 خلية لكل بئر في طبق ذي 24 بئراً وحُضنت طوال الليل. تم تحضير خليط ترنسفكشن يحتوي على 250 µL من Opti-MEM، و1.25 µL من Lipofectamine 3000، و1.5 µL من P3000، و50 nM من miRNA، و1 µg من البلازميد، وحُضن لمدة 15 min قبل إضافته إلى الخلايا. استُبدل الوسط بـ DMEM كامل بعد 6 h، وجُمعت العينات عند 48 h.
تحليل المعلوماتية الحيوية
تم التنبؤ بهدف miR-1298 باستخدام قاعدة بيانات TargetScan 8.0 (https://www.targetscan.org/vert_80/). ومن ثم تم تحديد موقع الارتباط المتوقع بين miR-1298 و BMP7.
مقايسة المراسل ثنائي اللوسيفيراز
النوع البري والطفرة 3′تم استنساخ تتابعات المنطقة غير المترجمة (UTR) لبروتين BMP7 التي تحتوي على موقع ارتباط miR-1298 المتوقع في ناقل تقرير لوسيفيراز المزدوج pmirGLO لإنتاج بلازميدات التقرير BMP7 Wt وBMP7 Mut على التوالي. وبالنسبة لمقايسة اللوسيفيراز، تم إجراء ترانسفكشن مشترك لخلايا SW480 وHCT-116 باستخدام إما بلازميد BMP7 Wt أو BMP7 Mut مع محاكي miR-1298 أو مثبطه، أو الضوابط السلبية المقابلة لها. وكانت الخطوات المحددة كما يلي: تم استزراع الخلايا في أطباق ذات 24 بئراً بكثافة 4 × 104 خلية لكل بئر. وقد تم إجراء ترانسفكشن مشترك (co-transfected) في كل بئر بواسطة 0.8 µg من البلازميد المراسل، و50 نانومولار من محاكي miR-1298، أو المثبط، أو الضابط السلبي المقابل، وLipofectamine 3000. وبعد مرور 8 ساعات، تم سحب وسط الزرع، وحُللت الخلايا بإضافة 100 µL من محلول منظم التحلل الخامل (PLB) لمدة 15 دقيقة. أ 20 µL نُقلت حصة من المستخلص الخلوي إلى لوحة تحليل بيضاء، 50 µL أضيفت كمية من LAR II، ثم قيس نشاط لوسيفيريز اليراع. وهناك... 50 µL توقف&أُضيف كاشف Glo لقياس Renilla. وفي الختام، تم إكمال عملية تسوية البيانات.
تقنية RT-qPCR
تم استخلاص الـ RNA من الخلايا المستزرعة والمصل وأنسجة سرطان القولون والمستقيم (CRC) المجمدة باستخدام كاشف TRIzol. وباختصار، تم تحلل الخلايا مباشرة في 1 mL من TRIzol لكل طبق قطر 10 cm؛ بينما تم تجانس قطع الأنسجة في TRIzol على الثلج. وبعد فصل الطور باستخدام الكلوروفورم والترسيب باستخدام الإيزوبروبانول، غُسلت كرات الـ RNA بـ 75% ethanol، ثم جُففت بالهواء وأذيبت في ماء خالٍ من الـ RNase. تم تحديد نقاء وتركيز الـ RNA باستخدام مقياس طيف ضوئي دقيق الحجم (A260/A280 = 1.8–2.1، A260/A230 > 2.0). ولتحليل الـ mRNA، تمت إزالة الـ DNA الجينومي المتبقي باستخدام gDNA Eraser، وتم نسخ 500 ng من الـ RNA عكسياً باستخدام طقم PrimeScript RT Reagent Kit مع oligo(dT) وسداسيات عشوائية (37 °C لمدة 15 min و 85 °C لمدة 5 s). ولتحليل الـ miRNA، تم نسخ 100 ng من الـ RNA عكسياً باستخدام بادئ stem-loop متخصص لـ miR-1298-5p أو U6 باستخدام طقم Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit (16 °C لمدة 30 min، 42 °C لمدة 30 min، و 85 °C لمدة 5 s). تضمنت كل عملية تشغيل ضوابط خالية من النسخ العكسي (No-RT) وضوابط خالية من القالب (no-template). تم تخفيف الـ cDNA بشكل مناسب وتخزينه في درجة حرارة −80 °C حتى بدء عملية الـ qPCR. تم تقدير مستويات miR-1298 و BMP7 كمياً باستخدام كيمياء SYBR Green. واستُخدم U6 و GAPDH كضوابط داخلية لتقييس الـ miRNA والـ mRNA على التوالي. حُسب التعبير النسبي باستخدام طريقة 2−ΔΔCt المقارنة. وكانت تسلسلات البادئات (5′–3′) كما يلي: miR-1298-forward: TCGGCAGGTTCATTCGGCTGTC، و reverse: CTCAACTGGTGTCGTGGA؛ و U6-forward: CTCGCTTCGGCAGCACA، و reverse: AACGCTTCACGAATTTGCGT؛ و BMP7-forward: CAAGAACCAGGAAGCCCTGC، و reverse: TTCTTACAGGCCTGCCTCTGG؛ و GAPDH-forward: GACATGCCGCCTGGAGAAAC، و reverse: AGCCCAGGATGCCCTTTAGT. وكانت ظروف التفاعل لـ qPCR كما يلي: 95 °C لمدة 2 min، و 35 دورة من 95 °C لمدة 30 s، و 60 °C لمدة 30 s، و 72 °C لمدة 60 s. تم تخفيف قوالب الـ cDNA تسلسلياً (بواقع 5 أضعاف) لإنشاء منحنيات قياسية. وحُسبت كفاءة التضخيم E باستخدام الصيغة: E = (10-1/slope-1) x 100%. وحُسبت كفاءة تضخيم البادئات كما يلي: EmiR-1298 = 102.1%، EBMP7 = 96.3%، EGAPDH = 100.3%، EU6 = 99.8%. واستوفت جميع البادئات نطاق الكفاءة المقبول الذي يتراوح بين 90–110%. تضمنت جميع تجارب RT-qPCR ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة، مع 3 مكررات تقنية لكل منها. تم تقييم استقرار U6 و GAPDH باستخدام خوارزمية geNorm. وكانت قيم M لكلا الجينين أقل من العتبة الموصى بها البالغة 1.5، مما يؤكد ملاءمتهما.
مقايسة طقم عد الخلايا-8 (CCK-8)
تم استزراع خلايا SW480 و HCT-116 في أطباق ذات 96 بئر بمعدل 2 x 103 خلية/بئر في 100 µL من وسط DMEM الكامل، وحُضنت لمدة 24 h. وبعد 48 h من عملية عفن الخلايا (transfection)، حُضنت الأطباق لمدة 1 h عند 37 °C. تم قياس الامتصاصية عند 450 nm باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة (microplate reader). استُخدمت ست آبار مكررة لكل مجموعة، وطُرحت قيمة العينة الضابطة (blank) التي تحتوي على الوسط بالإضافة إلى CCK-8 بدون خلايا.
قياس التدفق الخلوي
تم تقييم الموت الخلوي المبرمج عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام مجموعة كشف الموت الخلوي المبرمج Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit. بعد 48 ساعة من عملية عفن الخلايا (transfection)، تم حصد خلايا SW480 و HCT-116 عن طريق التريبسين (trypsinization)، وغسلها مرتين بمحلول PBS بارد، ثم إعادة تعليقها في محلول ربط (binding buffer) بتركيز 1x وبكثافة 1 x 106 cells/mL. نُقلت عينات تحتوي على 1 x 105 cells إلى أنابيب FACS، وصُبغت بـ 5 µL من Annexin V-FITC و 5 µL من PI لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام، ثم خُففت بـ 400 µL من محلول الربط قبل عملية الحصول على البيانات. تضمنت التجربة ضوابط إيجابية غير مصبغة، ومصبغة بصبغة واحدة، ومعالجة بـ staurosporine من أجل التعويض (compensation) وتحديد البوابات (gate setting). حُللت البيانات باستخدام برنامج FlowJo (FlowJo 10.2).
هجرة الخلايا وغزوها
تم تقييم هجرة الخلايا وغزوها باستخدام غرف Transwell ذات 24 بئراً ومزودة بأغشية PET بمسام بحجم 8 µm. وبالنسبة لمقايسات الغزو، تم طلاء الغشاء العلوي مسبقاً بـ 50 µL من Matrigel عند 37 °C لمدة 2 h، ثم تمت إعادة ترطيبه باستخدام DMEM خالٍ من المصل لمدة 30 min قبل استزراع الخلايا؛ بينما أغفلت مقايسات الهجرة خطوة الطلاء هذه. تم تجويع خلايا SW480 وHCT-116 المنقولة جينياً في وسط DMEM خالٍ من المصل لمدة 12 h، وبعد ذلك تم استزراع 2 x 104 خلية في 100 µL من وسط DMEM خالٍ من المصل يحتوي على 0.1% BSA في الغرفة العلوية. مُلئت الغرفة السفلية بـ 600 µL من وسط DMEM يحتوي على 10% FBS ليعمل كجاذب كيميائي. بعد مرور 24 h (للهجرة) أو 48 h (للغزو) عند 37 °C، تمت إزالة الخلايا غير المهاجرة من السطح العلوي باستخدام مسحة قطنية. ثم تم تثبيت الخلايا الموجودة على السطح السفلي باستخدام 4% paraformaldehyde لمدة 15 min، وصبغها بـ 0.1% crystal violet لمدة 20 min، ثم شطفها وتجفيفها في الهواء. تم تصوير خمسة حقول عشوائية لكل غشاء بتكبير 200x باستخدام مجهر مقلوب، وتم عدّ الخلايا يدوياً بواسطة مراقبين مستقلين.
لطخة ويسترن
تم استخلاص البروتينات الخلوية الكلية عن طريق تجانس الخلايا في محلول RIPA lysis buffer المضاف إليه مزيج من مثبطات البروتياز. تم تحديد تركيزات البروتين باستخدام طقم BCA Protein Assay Kit. فُصلت كميات متكافئة من نواتج تحلل البروتين (50 µg) بواسطة 10% SDS-PAGE ثم نُقلت لاحقاً إلى أغشية PVDF. وبعد حجب مواقع الارتباط غير النوعية باستخدام 2% BSA، تم فحص الأغشية باستخدام أجسام مضادة أولية ضد BMP7 (1:1,000) و GAPDH (1:2,000) لمدة 90 min عند 37 °C. وبعد ثلاث غسلات باستخدام PBST، تم تحضين الأغشية مع جسم مضاد ثانوي مقترن بإنزيم بيروكسيداز الفجل (HRP). وتم تصوير حزم البروتين باستخدام كاشف ECL للمضي الكيميائي.
التحليل الإحصائي
تم تحليل البيانات باستخدام برنامج SPSS 27.0. وقد تم تسجيل جميع القيم كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD)، ما لم يُذكر خلاف ذلك. وطُبق اختبار Shapiro-Wilk للتحقق من التوزيع الطبيعي. كما تم تحديد الفروق بين المجموعتين باستخدام اختبار t لـ Student غير المقترن وذي الذيلين. وأُجريت مقارنة تعبير miR-1298 بين أنسجة أورام CRC والأنسجة المجاورة غير السرطانية باستخدام اختبار t لـ Student المقترن. وقبل إجراء الاختبار المعلمي، استُخدم اختبار Levene لتقييم تجانس التباينات. وبالنسبة لمقارنات المجموعات المتعددة، حُللت البيانات المعلمية عبر تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way ANOVA)، مع استخدام اختبار Tukey's HSD للمقارنات الزوجية البعدية. كما تم تقييم الارتباط بين miR-1298 و BMP7 في أنسجة CRC باستخدام تحليل ارتباط Pearson. واعتُبرت القيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.
النتائج
انخفض مستوى miR-1298 بشكل كبير في سرطان القولون والمستقيم (CRC)
في أنسجة سرطان القولون والمستقيم (CRC)، كانت مستويات miR-1298 أقل مما كانت عليه في الأنسجة غير السرطانية المجاورة (الشكل 1أوكشف تحليل النقائل في العقد اللمفاوية أن مستويات miR-1298 كانت أقل لدى المرضى الذين يعانون من نقائل في العقد اللمفاوية مقارنة بأولئك الذين لا يعانون منها (الشكل 1ب). وفي المرضى المصابين بسرطان القولون والمستقيم (CRC) الذين كان حجم الورم لديهم > كان مستوى miR-1298 أقل بشكل ملحوظ في المرضى الذين بلغ حجم الورم لديهم > 5 سم مقارنة بالمرضى الذين كان حجم الورم لديهم ≤ 5 سم (p = 0.017; الشكل 1جانخفض مستوى miR-1298 مع تقدم مرحلة الورم، مع وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين المرحلة 1 والمرحلة 3.p = 0.047) وبين المرحلة 1 والمرحلة 4 (p = 0.009; الشكل 1د). في مصل المرضى المصابين بسرطان القولون والمستقيم (CRC)، انخفض مستوى miR-1298 بشكل ملحوظ (الشكل 1هـ)، وأظهر تحليل منحنى خصائص تشغيل المستقبل (ROC) أن المساحة تحت المنحنى (AUC) بلغت 0.889، بحساسية قدرها 78.82% ونوعية قدرها 83.10% (الشكل 1و).
بناءً على مستوى التعبير الوسيط لـ miR-1298، تم تقسيم المرضى المصابين بـ CRC إلى مجموعات ذات تعبير منخفض وعالٍ. وفي المرضى المصابين بـ CRC، ارتبط miR-1298 ارتباطاً وثيقاً بمرحلة TNM (p < 0.001)، وحجم الورم (p = 0.003)، وانتقالات العقد اللمفاوية (p = 0.003)، وتمايز الورم (p = 0.035). ومع ذلك، لم يرتبط miR-1298 بالعمر (p = 0.832) أو الجنس (p = 0.165) (الجدول 1). وأظهر تحليل Kaplan–Meier أن المرضى المصابين بـ CRC الذين يعانون من تعبير منخفض لـ miR-1298 كان لديهم بقاء إجمالي أقصر مقارنة بأولئك الذين لديهم تعبير عالٍ لـ miR-1298 (log-rank p = 0.039؛ الشكل 1G). كما أشار تحليل انحدار Cox إلى أن انخفاض تعبير miR-1298 قد يكون مؤشراً إنذارياً محتملاً لدى المرضى المصابين بـ CRC (p = 0.035، الجدول 2).
ثبط miR-1298 التكاثر وحفز الموت الخلوي المبرمج في خلايا CRC
في خلايا SW480، أدى ترنسفكشن المحاكي (mimic) أو المثبط الخاص بـ miR-1298 إلى تغيير تعبير miR-1298 بشكل فعال، مع وجود فرق معنوي بين مجموعتي NC للمثبط ومثبط miR-1298 (p = 0.005؛ الشكل 2A). أدى الإفراط في تعبير miR-1298 إلى خفض حيوية الخلايا وتحفيز الموت الخلوي المبرمج، بينما أدى تثبيط miR-1298 إلى زيادة حيوية الخلايا وخفض الموت الخلوي المبرمج؛ وقد اختلف الموت الخلوي المبرمج بشكل معنوي بين مجموعتي NC للمثبط ومثبط miR-1298 (p = 0.008؛ الشكل 2B،C). وفي خلايا HCT-116، أدى الترنسفكشن وبشكل مماثل إلى تغيير تعبير miR-1298 (p = 0.002؛ الشكل 2D)، ولوحظت فروق معنوية بين مجموعتي NC للمثبط ومثبط miR-1298 فيما يتعلق بحيوية الخلايا (p = 0.007؛ الشكل 2E) والموت الخلوي المبرمج (p = 0.005؛ الشكل 2F).
قام miR-1298 بتثبيط هجرة وغزو خلايا سرطان القولون والمستقيم (CRC)
أدى الإفراط في تعبير miR-1298 إلى خفض أعداد خلايا SW480 وHCT-116 المهاجرة والغازية، بينما أدى تثبيط miR-1298 إلى زيادة هجرة الخلايا وغزوها (الشكل 3A–D). وفي خلايا SW480، كان عدد الخلايا الغازية أقل بشكل ملحوظ في مجموعة محاكي miR-1298 مقارنة بمجموعة mimic NC (p = 0.004؛ الشكل 3B).
كان BMP7 هدفاً لـ miR-1298 في سرطان القولون والمستقيم (CRC)
أشار TargetScan إلى أن BMP7 قد يكون هدفاً لـ miR-1298 (الشكل 4A). وأظهرت مقايسات مراسل لوسيفيراز المزدوج في خلايا SW480 وHCT-116 أن الإفراط في تعبير miR-1298 أو تثبيطه أدى إلى تغيير نشاط اللوسيفيراز لمراسل BMP7 Wt وليس مراسل BMP7 Mut (الشكل 4B،C). وفي خلايا HCT-116، كان نشاط اللوسيفيراز لمراسل BMP7 Wt أقل بكثير في مجموعة محاكي miR-1298 مقارنة بمجموعة mimic NC (p = 0.002؛ الشكل 4C). وفي أنسجة سرطان القولون والمستقيم (CRC)، ارتفع BMP7 بشكل ملحوظ (الشكل 4D). بالإضافة إلى ذلك، أظهر BMP7 وmiR-1298 ارتباطاً سلبياً (الشكل 4E). وفي خلايا SW480 وخلايا HCT-116، أدى الإفراط في تعبير miR-1298 إلى تثبيط BMP7 على مستويي RNA والبروتين، بينما أدى تثبيط miR-1298 إلى زيادة تعبير BMP7 (الشكل 4F،G).
قد يمارس miR-1298 تأثيراً كابحاً للأورام في سرطان القولون والمستقيم (CRC) من خلال تنظيم BMP7
في خلايا SW480، تم التأكد من نجاح تعديل تعبير BMP7 (الشكل 5A). أدى الإفراط في تعبير BMP7 إلى عكس جزئي في انخفاض حيوية الخلايا وزيادة موت الخلايا المبرمج الناتج عن الإفراط في تعبير miR-1298، بينما أدى تثبيط BMP7 إلى مزيد من الانخفاض في حيوية الخلايا وزيادة موت الخلايا المبرمج (الشكل 5B،C). وفي خلايا HCT-116، تم التأكد أيضاً من نجاح تعديل تعبير BMP7 (الشكل 5D)، مع وجود تأثيرات مقابلة على حيوية الخلايا وموت الخلايا المبرمج (الشكل 5E،F). وفي خلايا SW480، كان تعبير BMP7 وحيوية الخلايا أقل بكثير في مجموعة miR-1298 mimic + si-BMP7 مقارنة بمجموعة miR-1298 mimic + si-NC (p = 0.002 و p = 0.005، على التوالي؛ الشكل 5A،B). وكان موت الخلايا المبرمج مختلفاً بشكل ملحوظ بين مجموعتي miR-1298 mimic + OE-BMP7 و miR-1298 mimic + OE-NC (p = 0.001؛ الشكل 5C). أما في خلايا HCT-116، فقد كانت حيوية الخلايا أقل بكثير في مجموعة miR-1298 mimic + si-BMP7 مقارنة بمجموعة miR-1298 mimic + si-NC (p = 0.002؛ الشكل 5E). وقد عكس التعبير المرتفع لـ BMP7 جزئياً التأثيرات الكابحة لـ miR-1298 على هجرة وغزو خلايا سرطان القولون والمستقيم، بينما أدى تثبيط BMP7 إلى تعزيز هذه التأثيرات المثبطة (الشكل 6A–D). وفي خلايا SW480، أدى تثبيط BMP7 إلى خفض أعداد الخلايا المهاجرة والغازية بشكل ملحوظ مقارنة بمجموعة si-NC (p = 0.003 و p = 0.020، على التوالي؛ الشكل 6A،B). وفي خلايا HCT-116، أدى الإفراط في تعبير BMP7 إلى تغيير ملحوظ في عدد الخلايا المهاجرة مقارنة بمجموعة OE-NC (p = 0.030؛ الشكل 6C)، بينما أدى تثبيط BMP7 إلى خفض عدد الخلايا الغازية بشكل ملحوظ مقارنة بمجموعة si-NC (p = 0.007؛ الشكل 6D).
توافر البيانات:
البيانات التي تدعم نتائج هذه الدراسة متوفرة في ملف تكميلي.
الشكل 1: تعبير miR-1298 في أنسجة سرطان القولون والمستقيم (CRC). (A) التعبير النسبي لـ miR-1298 في أنسجة CRC والأنسجة غير السرطانية المجاورة. (B) التعبير النسبي لـ miR-1298 في أنسجة CRC لدى المرضى الذين يعانون من نقائل في العقد اللمفاوية (LNM+) والذين لا يعانون منها (LNM−). (C) التعبير النسبي لـ miR-1298 في أنسجة CRC وفقاً لحجم الورم. (D) التعبير النسبي لـ miR-1298 في أنسجة CRC وفقاً لمرحلة الورم. (E) التعبير النسبي لـ miR-1298 في المصل لدى مرضى CRC ومجموعة ضابطة من الأصحاء. (F) منحنى خصائص تشغيل المستقبل (ROC) لـ miR-1298 في المصل للتمييز بين مرضى CRC والأصحاء. (G) منحنيات كابلان-ماير للبقاء على قيد الحياة الإجمالي لمرضى CRC وفقاً لانخفاض وارتفاع تعبير miR-1298. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تأثيرات miR-1298 على تكاثر وموت خلايا سرطان القولون والمستقيم (CRC) المبرمج. (A) التعبير النسبي لـ miR-1298 في خلايا FHC و SW480 بعد عفن miR-1298 mimic، أو mimic NC، أو miR-1298 inhibitor، أو inhibitor NC. (B) حيوية خلايا SW480 بعد زيادة تعبير miR-1298 أو تثبيطه. (C) الموت المبرمج لخلايا SW480 بعد زيادة تعبير miR-1298 أو تثبيطه. (D) التعبير النسبي لـ miR-1298 في خلايا FHC و HCT-116 بعد عفن miR-1298 mimic، أو mimic NC، أو miR-1298 inhibitor، أو inhibitor NC. (E) حيوية خلايا HCT-116 بعد زيادة تعبير miR-1298 أو تثبيطه. (F) الموت المبرمج لخلايا HCT-116 بعد زيادة تعبير miR-1298 أو تثبيطه. البيانات معروضة كمتوسط ± SD. تمثل أشرطة الخطأ SD. **p < 0.01; ***p < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تأثيرات miR-1298 على هجرة وغزو خلايا CRC. (A) أعداد الخلايا المهاجرة في خلايا SW480 بعد عفن (transfection) باستخدام miR-1298 mimic، أو mimic NC، أو miR-1298 inhibitor، أو inhibitor NC. (B) أعداد الخلايا الغازية في خلايا SW480 بعد العفن باستخدام miR-1298 mimic، أو mimic NC، أو miR-1298 inhibitor، أو inhibitor NC. (C) أعداد الخلايا المهاجرة في خلايا HCT-116 بعد العفن باستخدام miR-1298 mimic، أو mimic NC، أو miR-1298 inhibitor، أو inhibitor NC. (D) أعداد الخلايا الغازية في خلايا HCT-116 بعد العفن باستخدام miR-1298 mimic، أو mimic NC، أو miR-1298 inhibitor، أو inhibitor NC. تُعرض البيانات كمتوسط ± SD. تمثل أشرطة الخطأ SD. **p < 0.01؛ ***p < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: علاقة الاستهداف بين miR-1298 و BMP7. (A) موقع الارتباط المتوقع بين miR-1298 والمنطقة غير المترجمة 3′ UTR لـ BMP7. (B) نشاط اللوسيفيريز النسبي لمراسلات BMP7 Wt و BMP7 Mut بعد زيادة تعبير miR-1298 أو تثبيطه في خلايا SW480. (C) نشاط اللوسيفيريز النسبي لمراسلات BMP7 Wt و BMP7 Mut بعد زيادة تعبير miR-1298 أو تثبيطه في خلايا HCT-116. (D) التعبير النسبي لـ BMP7 في أنسجة CRC والأنسجة غير السرطانية المجاورة. (E) الارتباط بين تعبير miR-1298 و BMP7 في أنسجة CRC. (F) التعبير النسبي لـ BMP7 في خلايا SW480 و HCT-116 بعد ترنسفكشن باستخدام miR-1298 mimic، أو mimic NC، أو miR-1298 inhibitor، أو inhibitor NC. (G) مستويات بروتين BMP7 النسبية في خلايا SW480 و HCT-116 بعد ترنسفكشن باستخدام miR-1298 mimic، أو mimic NC، أو miR-1298 inhibitor، أو inhibitor NC. **p < 0.01; ***p < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: التنظيم المشترك لـ miR-1298 و BMP7 في عملية التكاثر والموت الخلوي المبرمج في خلايا CRC. تم إجراء ترنسفكشن مشترك لخلايا SW480 و HCT-116 باستخدام miR-1298 mimic مع OE-NC، أو OE-BMP7، أو si-NC، أو si-BMP7. (A) التعبير النسبي لـ BMP7 في خلايا SW480. (B) حيوية الخلايا في خلايا SW480. (C) الموت الخلوي المبرمج في خلايا SW480. (D) التعبير النسبي لـ BMP7 في خلايا HCT-116. (E) حيوية الخلايا في خلايا HCT-116. (F) الموت الخلوي المبرمج في خلايا HCT-116. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SD. تمثل أشرطة الخطأ SD. **p < 0.01; ***p < 0.001. الاختصارات: OE-NC = التحكم السلبي للإفراط في التعبير؛ OE-BMP7 = الإفراط في التعبير عن BMP7؛ si-NC = التحكم السلبي للحمض النووي الريبي المتداخل الصغير؛ si-BMP7 = الحمض النووي الريبي المتداخل الصغير المستهدف لـ BMP7. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: التنظيم المشترك لـ miR-1298 وBMP7 على هجرة وغزو خلايا CRC. تم إجراء ترانسفكشن مشترك لخلايا SW480 وHCT-116 باستخدام miR-1298 mimic مع OE-NC، أو OE-BMP7، أو si-NC، أو si-BMP7. (A) أعداد الخلايا المهاجرة في خلايا SW480. (B) أعداد الخلايا الغازية في خلايا SW480. (C) أعداد الخلايا المهاجرة في خلايا HCT-116. (D) أعداد الخلايا الغازية في خلايا HCT-116. تُعرض البيانات كـ mean ± SD. تمثل أشرطة الخطأ SD. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. الاختصارات: OE-NC = ضابط سلبي للإفراط في التعبير؛ OE-BMP7 = الإفراط في تعبير BMP7؛ si-NC = ضابط سلبي للحمض النووي الريبوزي المتداخل الصغير؛ si-BMP7 = الحمض النووي الريبوزي المتداخل الصغير الذي يستهدف BMP7. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| المتغير | الإجمالي | miR-1298 | قيمة p | |
| (n = 85) | منخفض (n = 46) | مرتفع (n = 39) | ||
| العمر (سنوات) | ||||
| ≤50 | 49 | 27 | 22 | 0.832 |
| >50 | 36 | 19 | 17 | |
| الجنس (ذكر/أنثى) | ||||
| ذكر | 44 | 27 | 17 | 0.165 |
| أنثى | 41 | 19 | 22 | |
| مرحلة TNM | ||||
| 1–2 | 60 | 41 | 19 | <0.001*** |
| 3–4 | 25 | 5 | 20 | |
| حجم الورم (cm) | ||||
| ≤5 | 72 | 34 | 38 | 0.003** |
| >5 | 13 | 12 | 1 | |
| نقائل العقد اللمفاوية | ||||
| نعم | 34 | 25 | 9 | 0.003** |
| لا | 51 | 21 | 30 | |
| تمايز الورم | ||||
| درجة منخفضة | 53 | 24 | 29 | 0.035* |
| درجة عالية | 32 | 22 | 10 | |
الجدول 1: الارتباط بين الميزات السريرية المرضية ومستويات تعبير miR-1298 لدى المرضى المصابين بـ CRC. تم تقسيم المرضى إلى مجموعات ذات تعبير منخفض (n = 46) وتعبير مرتفع (n = 39) لـ miR-1298، وتم تقييم الارتباطات بين تعبير miR-1298 والخصائص السريرية المرضية. *p < 0.05؛ **p < 0.01؛ ***p < 0.001. الاختصارات: CRC = سرطان القولون والمستقيم؛ TNM = تصنيف الورم والعقد الليمفاوية والنقائل.
| المتغير | نسبة المخاطر | فاصل الثقة 95% CI | قيمة p | |
| الحد الأدنى | الحد الأعلى | |||
| العمر | 0.776 | 0.186 | 3.242 | 0.728 |
| الجنس | 0.614 | 0.152 | 2.474 | 0.492 |
| مرحلة TNM | 4.62 | 1.181 | 18.078 | 0.028* |
| حجم الورم | 8.078 | 1.833 | 35.587 | 0.006** |
| النقائل في العقد اللمفاوية | 6.584 | 1.134 | 38.245 | 0.036* |
| تمايز الورم | 6.392 | 1.748 | 23.377 | 0.005** |
| miR-1298 | 0.145 | 0.024 | 0.87 | 0.035* |
الجدول 2: تحليل انحدار كوكس للعوامل الإنذارية لدى المرضى المصابين بسرطان القولون والمستقيم (CRC). تم إجراء تحليل انحدار كوكس لتقييم الارتباط بين الخصائص المرضية السريرية وتعبير miR-1298 والإنذار لدى المرضى المصابين بـ CRC. *p < 0.05؛ **p< 0.01. المختصرات: CI = فاصل الثقة؛ CRC = سرطان القولون والمستقيم؛ TNM = تصنيف الورم والعقد اللمفاوية والنقائل.
الملف التكميلي. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.
المناقشة
يفرض سرطان القولون والمستقيم (CRC) عبئاً كبيراً على الأفراد والمجتمع بسبب ارتفاع معدلات الإصابة والوفيات. وعلى الرغم من برامج الفحص مثل تنظير القولون، لا يزال يتم تشخيص عدد كبير من مرضى سرطان القولون والمستقيم في مرحلة متقدمة، مما يسلط الضوء على الحاجة الملحّة إلى مؤشرات حيوية غير بضعية وأكثر فعالية للكشف المبكر11. علاوة على ذلك، لا يزال مآل سرطان القولون والمستقيم النقيلي سيئاً، حيث تشيع مقاومة الأدوية وعودة ظهور المرض بشكل نسبي12. لذا، فإن الفهم العميق للآليات الجزيئية الكامنة وراء ظهور سرطان القولون والمستقيم وتطوره وانتشاره أمر ضروري لتطوير علاجات مستهدفة جديدة والتغلب على مقاومة العلاج. يتميز سرطان القولون والمستقيم بتغاير شديد، مما يعني أن الأورام التي قد تبدو متشابهة قد تظهر اختلافات جوهرية في سلوكها13. ومن هنا تبرز أهمية الأبحاث الجارية لتحسين الكشف المبكر، وتطوير العلاج الشخصي، وتحسين معدلات البقاء على قيد الحياة لمرضى سرطان القولون والمستقيم في نهاية المطاف.
ترتبط الاختلالات في miRNA بتطور سرطان القولون والمستقيم وتحديده مرحلياً والتنبؤ بمآله المرضي14. ونظراً لاستقرارها في سوائل الجسم، تمتلك miRNAs أيضاً إمكانات كبيرة كمؤشرات حيوية تشخيصية وتنبؤية غير بضعية15. في هذه الدراسة، انخفض التعبير عن miR-1298 في أنسجة سرطان القولون والمستقيم، وارتبط تعبيره بمرحلة TNM وانتقال الورم إلى العقد اللمفاوية، مما يشير إلى دور محتمل في تطور سرطان القولون والمستقيم. والجدير بالذكر أن دراستنا هي الأولى التي تحدد بشكل شامل تعبير miR-1298 في مجموعة سريرية من مرضى سرطان القولون والمستقيم وتثبت ارتباطه بالمعايير المرضية السريرية الرئيسية، بما في ذلك مرحلة TNM، وانتقال الورم إلى العقد اللمفاوية، وتمايز الورم.
يُعد خلل تنظيم العمليات الخلوية الأساسية — بما في ذلك التكاثر، والموت الخلوي المبرمج، والهجرة، والغزو — محركاً أساسياً لتطور السرطان والوفيات المرتبطة به16. حيث يتيح التكاثر غير المنضبط للخلايا الورمية إجراء التوسع النسيلي الأولي. وفي الوقت نفسه، يسمح التهرب من الموت الخلوي المبرمج لهذه الخلايا بالبقاء والتراكم في مواجهة التلف الداخلي أو الضغوط الخارجية. ويؤدي هذا المزيج إلى نمو الورم الأولي17,18. لذا، فإن العلاجات الموجهة التي تستهدف المحركات الجزيئية لهذه الخصائص تعد مفتاحاً لتطوير علاجات فعالة لسرطان القولون والمستقيم (CRC). وتساهم الـ miRNAs في تطور الورم عن طريق تنظيم النمط الظاهري الخبيث للخلايا السرطانية19. ويُعد miR-1298 أحد هذه الـ miRNAs؛ فعلى سبيل المثال، يؤدي انخفاض تنظيم miR-1298-5p إلى تعزيز تطور سرطان المعدة20. بينما يعمل miR-1298 عند زيادة تنظيمه على تثبيط تكاثر خلايا سرطان الثدي، وتحفيز الموت الخلوي المبرمج، والتسبب في توقف الدورة الخلوية21. بالإضافة إلى ذلك، يعمل miR-1298-5p أيضاً ككابح للورم في سرطان المثانة22. وقد أشارت نتائج هذه الدراسة إلى أن الإفراط في تعبير miR-1298 قد ثبط التكاثر والهجرة والغزو ورفع معدل الموت الخلوي المبرمج، مما يشير إلى أنه قد يكبح النمط الظاهري الخبيث لسرطان القولون والمستقيم. والأهم من ذلك، أن دراستنا توسعت بما يتجاوز التقارير السابقة من خلال التقييم المنهجي للأنماط الظاهرية الخبيثة الرئيسية في خلايا سرطان القولون والمستقيم، مما قدم توصيفاً وظيفياً أكثر اكتمالاً لـ miR-1298 في هذا النوع المحدد من السرطان.
فيما يتعلق بآثاره المعززة للأورام، يمكن لـ BMP7 تحفيز تكاثر الخلايا السرطانية عن طريق تنظيم مسارات التأشير مثل PI3K/AKT23. ومن خلال تعديل مستوى العوامل المضادة لموت الخلايا المبرمج مثل Bcl‑2، يمنح BMP7 مقاومة لموت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية24. بالإضافة إلى ذلك، يعمل BMP7 بشكل أساسي على تعزيز هجرة وغزو الخلايا السرطانية عن طريق تحفيز الانتقال الظهاري المتوسط (EMT)25. ويتسق تورط BMP7 في تعزيز السرطان مع ما توصلنا إليه من ارتفاع مستويات BMP7 في أنسجة سرطان القولون والمستقيم (CRC). وقد أشار تحليل المعلوماتية الحيوية إلى أن BMP7 قد يكون هدفًا لـ miR-1298، كما حدد موقع ارتباط متوقع بين miR-1298 وBMP7. علاوة على ذلك، أشارت تجارب الإنقاذ إلى أن BMP7 يعمل على الأرجح كوسيط وظيفي لـ miR-1298 في سرطان القولون والمستقيم. وبالنظر إلى مسارات التأشير المرتبطة بـ BMP7 في السرطان، افترضنا كذلك أن محور miR-1298/BMP7 ينظم مسارات التأشير المصبّة (SMAD, PI3K/AKT, EMT) التي تتحكم في سلوك خلايا سرطان القولون والمستقيم. والأهم من ذلك، أننا تحققنا تجريبيًا من هذا التوقع من خلال فحوصات المراسل لـ luciferase، مما أكد الارتباط المباشر لـ miR-1298 بالمنطقة غير المترجمة 3′ UTR لـ BMP7. كما أظهرت تجارب الإنقاذ أن استعادة BMP7 أدت إلى عكس التأثيرات الكابحة للأورام الناتجة عن فرط تعبير miR-1298 جزئيًا، مما قدم دليلًا وظيفيًا على أن BMP7 كان وسيطًا في المصب لـ miR-1298 في سرطان القولون والمستقيم. وحسب علمنا، فإن هذه هي الدراسة الأولى التي تثبت وجود محور تنظيم miR-1298/BMP7 في سرطان القولون والمستقيم.
بالإضافة إلى الرؤى الميكانيكية، قدمت دراستنا دليلاً انتقالياً يدعم الفائدة السريرية لـ miR-1298. وأظهر تحليل منحنى ROC أن miR-1298 قد يكون له قيمة تشخيصية في سرطان القولون والمستقيم (CRC). علاوة على ذلك، كشف تحليل البقاء أن انخفاض تعبير miR-1298 كان مرتبطاً بإنذار أسوأ، كما أشار تحليل انحدار Cox إلى أن انخفاض miR-1298 قد يكون عاملاً إنذارياً لسرطان القولون والمستقيم، مما يدعم القيمة الكامنة لـ miR-1298 كعلامة بيولوجية تشخيصية وإنذارية لسرطان القولون والمستقيم.
تتضمن هذه الدراسة بعض القيود. ففيما يتعلق بالعينات السريرية، ونظراً لأن هذه الدراسة اعتمدت بشكل أساسي على بيانات من مركز واحد، فإن هناك حاجة إلى دراسات تحقق مستقبلية متعددة المراكز لتأكيد الدور الكابح للأورام لـ miR-1298 في CRC بشكل أكثر قوة. ركزت هذه الدراسة على التجارب الخلوية في المختبر (in vitro)، والتي لم تستوعب بشكل كامل تعقيد البيئة الدقيقة للورم في الجسم الحي (in vivo). وكان الافتقار إلى نماذج أورام xenograft أحد قيود هذه الدراسة. لذا يجب أن تتضمن الأبحاث المستقبلية تحققاً في الجسم الحي لمزيد من التوضيح لدور محور miR-1298/BMP7 في البيئة الدقيقة للورم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للتجارب المستقبلية إجراء المزيد من التحقق من المسارات العلوية والسفلية لمحور miR-1298/BMP7 من خلال تنبؤات المعلوماتية الحيوية وتجارب in vitro و in vivo. كما كانت فترة المتابعة قصيرة نسبياً، مما حد من دقة تقدير البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل. وعلى الرغم من إجراء تحليلات Kaplan–Meier وانحدار Cox، إلا أن النتائج قد تكون تأثرت بفترة المتابعة القصيرة نسبياً. وتجري حالياً متابعة ممتدة للتحقق من القيمة الإنذارية لـ miR-1298 في CRC. علاوة على ذلك، فإن مسارات الإشارات السفلية (SMAD, PI3K/AKT, EMT) التي ينظمها محور miR-1298/BMP7 في التحكم في سلوك خلايا CRC لم يتم التحقق منها تجريبياً في هذه الدراسة وتتطلب مزيداً من الاستكشاف. لم تقم هذه الدراسة بإجراء تجارب الإنقاذ العكسي (miR-1298 inhibitor + BMP7 siRNA)، حيث من شأن هذه التجارب أن توفر أدلة تكميلية حول ما إذا كان تثبيط BMP7 يمكن أن يعكس التأثيرات المعززة للأورام الناتجة عن تثبيط miR-1298. إن غياب هذا النوع من تجارب الإنقاذ يضعف استنتاجاتنا الآلية. لذا تبرز الحاجة إلى دراسات مستقبلية تدمج تصميم تجارب الإنقاذ العكسي هذا مع التحقق في الجسم الحي لإثبات وظيفة محور miR-1298/BMP7 في CRC بشكل كامل.
باختصار، قد يكون miR-1298 مرتبطاً بتطور سرطان القولون والمستقيم (CRC). ومن الناحية الوظيفية، قد يثبط miR-1298 تكاثر خلايا سرطان القولون والمستقيم وغزوها وهجرتها. وقد يكون BMP7 وسيطاً وظيفياً محتملاً لـ miR-1298 في سرطان القولون والمستقيم.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي مصالح مالية أو غير مالية ذات صلة للإفصاح عنها.
شكر وتقدير
يصرح المؤلفون بعدم تلقي أي تمويل أو منح أو أي دعم آخر أثناء إعداد هذه المخطوطة.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| محلول البنفسج البلوري بتركيز 0.1% | Sigma-Aldrich | C0775 | |
| طقم الفصل الكهربائي للهلام بتركيز 10% SDS-PAGE | إبيزايم (Epizyme) | PG112 | |
| بارافورمالدهيد بنسبة 4% | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| طبق زراعة خلايا بـ 6 آبار | Corning | 3516 | |
| لوح زراعة خلايا ذو 96 بئراً | Corning | 3599 | |
| طقم الكشف عن الموت الخلوي المبرمج باستخدام Annexin V-FITC/PI | متنوعة (على سبيل المثال: Elabscience، BD Biosciences) | E-CK-A211 (Elabscience) أو 556547 (BD) | |
| مضاد BMP7 | Abcam | ab176707 | |
| مضاد GAPDH | Abcam | ab181602 | |
| طقم BCA | سانغون (Sangon) | C503021 | |
| الطفرة الثالثة لبروتين BMP7‘بلازميد مراسل لـ UTR | مُصنَّع خصيصاً (تم استنساخه في pmirGLO) | مخصص | |
| بادئات BMP7 | Sangon Biotech (شنغهاي، الصين) | تخليق مخصص | |
| النمط البري 3 لبروتين BMP7‘بلازميد مراسل لـ UTR- | مُصنّع خصيصاً (مُستنْسَخ في pmirGLO) | مخصص | |
| طقم عد الخلايا-8 (CCK-8) | Dojindo (اليابان) | CK04 | |
| دورق زراعة خلايا (T-25) | Corning | 430639 | |
| وسط دولبيكو المعدل لزراعة الخلايا (DMEM)‘وسط إيغل المعدل (Modified Eagle Medium) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 11995065 | |
| مصل جنين البقر (FBS) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 16140071 | |
| خط خلايا FHC (خلايا طلائية طبيعية من القولون البشري) | ATCC | CRL-1831 | |
| مقياس التدفق الخلوي | BD Biosciences | FACSCanto™ ٢ | |
| برنامج FlowJo V10 | FlowJo, LLC | — | |
| بادئات GAPDH (ضابط داخلي للـ mRNA) | Sangon Biotech (شنغهاي، الصين) | تخليق مخصص | |
| خط الخلايا HCT-116 (سرطان القولون والمستقيم البشري) | ATCC | CCL-247 | |
| جسم مضاد ثانوي مقترن بإنزيم HRP | Beyotime | A0208 | |
| مجهر مقلوب | نيكون (أو ما يعادلها) | Eclipse Ts2 | |
| كاشف ترانسفكشن Lipofectamin 3000 | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | L3000015 | |
| نظام مقايسة اللوسيفيريز | Promega | E1500 | |
| مصفوفة الغشاء القاعدي ماتريجيل (Matrigel) | Corning | 354230 | |
| قارئ الأطباق الدقيقة | BioTek (Agilent) | تآزر H1 | |
| مثبط miR-1298 | GenePharma (شنغهاي، الصين) | مُصنَّع حسب الطلب (يتم تخليقه عند الطلب) | |
| محاكي miR-1298 | GenePharma (شنغهاي، الصين) | مُخصص (يتم تخليقه بناءً على الطلب) | |
| بادئات miR-1298 | Sangon Biotech (شنغهاي، الصين) | التخليق المخصص | |
| طقم تخليق الشريط الأول لـ miRNA من Mir-X | Takara Bio | 638313 | |
| OE-NC | GenePharma (شنغهاي، الصين) | مُصنّع حسب الطلب (يتم تخليقه عند الطلب) | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| محلول منظم للتحلل السلبي | Promega | E194A | |
| ناقل pcDNA3.1 (مجموعة ضابطة لناقل فارغ) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | V79020 | |
| pcDNA3.1-BMP7 (بلازميد التعبير المفرط OE-BMP7) | GenePharma (شنغهاي، الصين) | مخصص (يُصنّع عند الطلب) | |
| ناقل pmirGLO للتعبير عن أهداف miRNA بنظام اللوسيفيريز المزدوج | Promega | E1330 | |
| فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF) | Beyotime | ST506 | |
| طقم كاشف PrimeScript RT (Perfect Real Time) | Takara (اليابان) | RR037A | |
| طقم كاشف PrimeScript RT مع مزيل gDNA | Takara Bio | RR047A | |
| مزيج مثبطات البروتياز | Thermo | 78429 | |
| بولي تيترافلورو إيثيلين الفينيل (PVDF) | أبسين | abs935 | |
| منظف ريبا (RIPA) | Abcam | ab156034 | |
| أنابيب طرد مركزي دقيقة خالية من الريبانوكلياز (1.5 مل) | Axygen (Corning) | MCT-150-C | |
| رؤوس ماصات خالية من RNase | Axygen (Corning) | T-300 (10 µL)، T-200-Y (200 µL)، T-1000-B (1000 µL) | |
| si-BMP7 | GenePharma (شانغهاي، الصين) | مُصنّع حسب الطلب (يتم تخليقه عند الطلب) | |
| si-NC | GenePharma (شنغهاي، الصين) | مُصنَّع حسب الطلب (يتم تخليقه عند الطلب) | |
| ستاوروسبورين (ضابط إيجابي للموت الخلوي المبرمج) | Sigma-Aldrich | S5921 | |
| سلالة خلايا SW480 (سرطان الغدة في القولون والمستقيم البشري) | ATCC | CCL-228 | |
| مزيج SYBR Green qPCR الرئيسي | Takara (اليابان) | RR036A | |
| غرفة ترانسويل (24 بئراً، 8.0 µm حجم المسام) | Corning (Costar) | 3422 | |
| كاشف TRIzol | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 15596026 | |
| بادئات U6 (الضابط الداخلي لـ miRNA) | Sangon Biotech (شنغهاي، الصين) | التخليق المخصص |
المراجع
- Ali EAM, Altaie AM, Talaat IM, Hamoudi R. Putative role of Tie2-expressing monocytes/macrophages in colorectal cancer progression through enhancement of angiogenesis and metastasis. Cancers (Basel). 2025;17(17):2856.
- Golfinopoulou R, Hatziagapiou K, Mavrikou S, Kintzios S. Unveiling colorectal cancer biomarkers: harnessing biosensor technology for volatile organic compound detection. Sensors (Basel). 2024;24(14):4712.
- Islind AS, et al. Individualized blended care for patients with colorectal cancer: the patient's view on informational support. Support Care Cancer. 2021;29(6):3061-67.
- Sun Y, et al. IGF2BP3 enhances ferroptosis resistance in colon cancer by stabilizing SLC7A11 and is regulated by miR-98-5p. Front Oncol. 2025;15:1576895.
- Du Z, et al. MicroRNA-1298 is downregulated in non-small cell lung cancer and suppresses tumor progression in tumor cells. Diagn Pathol. 2019;14(1):132.
- Qi Y, et al. The dual role of glioma exosomal microRNAs: glioma eliminates tumor suppressor miR-1298-5p via exosomes to promote immunosuppressive effects of MDSCs. Cell Death Dis. 2022;13(5):426.
- Vasan R, et al. High BMP7 expression is associated with poor prognosis in ovarian cancer. J Cell Mol Med. 2023;27(21):3378-87.
- Motoyama K, et al. Clinical significance of BMP7 in human colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 2008;15(5):1530-37.
- Shi Q, et al. Analysis of the role of the BMP7-Smad4-Id2 signaling pathway in SW480 colorectal carcinoma cells. Mol Med Rep. 2011;4(4):627-31.
- Yang YR, et al. MicroRNA-137 inhibits cell migration and invasion by targeting bone morphogenetic protein-7 (BMP7) in non-small cell lung cancer cells. Int J Clin Exp Pathol. 2015;8(9):10847-53.
- Yan T, et al. Oxidative stress gene expression in ulcerative colitis: implications for colon cancer biomarker discovery. Sci Rep. 2025;15(1):22641.
- Zhou Y, et al. Interleukin-17F suppressed colon cancer by enhancing caspase 4 mediated pyroptosis of endothelial cells. Sci Rep. 2024;14(1):18363.
- Ku X, et al. In-depth characterization of mass spectrometry-based proteomic profiles revealed novel signature proteins associated with liver metastatic colorectal cancers. Anal Cell Pathol (Amst). 2019;2019:7653230.
- Wang Y, et al. Overexpression of microRNA-216a inhibits autophagy by targeting regulated MAP1S in colorectal cancer. Onco Targets Ther. 2019;12:4621-29.
- Correa-Gallego C, et al. Circulating plasma levels of microRNA-21 and microRNA-221 are potential diagnostic markers for primary intrahepatic cholangiocarcinoma. PLoS One. 2016;11(9):e0163699.
- Qin Y, Zhou Y. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K in cancer biology and its therapeutic applications (review). Mol Med Rep. 2026;33(5):144.
- Louis L, Chee BS, McAfee M, Nugent M. Electrospun drug-loaded and gene-loaded nanofibres: the holy grail of glioblastoma therapy? Pharmaceutics. 2023;15(6):1649.
- Termini D, Den Hartogh DJ, Jaglanian A, Tsiani E. Curcumin against prostate cancer: current evidence. Biomolecules. 2020;10(11):1536.
- Wu SR, Wu Q, Shi YQ. Recent advances of miRNAs in the development and clinical application of gastric cancer. Chin Med J (Engl). 2020;133(15):1856-67.
- Li X, et al. MiR-1298-5p level downregulation induced by Helicobacter pylori infection inhibits autophagy and promotes gastric cancer development by targeting MAP2K6. Cell Signal. 2022;93:110286.
- Chen W, et al. microRNA-1298 inhibits the malignant behaviors of breast cancer cells via targeting ADAM9. Biosci Rep. 2020;40(12):BSR20201215.
- Zhang X, et al. Circular RNA TAF4B promotes bladder cancer progression by sponging miR-1298-5p and regulating TGFA expression. Front Oncol. 2021;11:643362.
- Leinhauser I, et al. Oncogenic features of the bone morphogenic protein 7 (BMP7) in pheochromocytoma. Oncotarget. 2015;6(36):39111-26.
- Guan J, et al. Bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) mediates ischemic preconditioning-induced ischemic tolerance via attenuating apoptosis in rat brain. Biochem Biophys Res Commun. 2013;441(3):560-66.
- Lim M, Chuong CM, Roy-Burman P. PI3K, Erk signaling in BMP7-induced epithelial-mesenchymal transition (EMT) of PC-3 prostate cancer cells in 2- and 3-dimensional cultures. Horm Cancer. 2011;2(5):298-309.