تقارن هذه الدراسة بين التأثيرات الواقية للكلى لكل من الإيثانول والفومبيزول في نموذج جرذان مصابة بالتسمم بالميثانول ومعالجة مسبقاً بالميثوتركسات، وهو نموذج مصمم لتقليل تصفية الفورمات المعتمدة على الفولات. تم تقييم النتائج الكلوية باستخدام مقاييس وظائف الكلى، والمؤشرات الحيوية لإصابة الكلى، وعلامات الالتهاب، والمؤشرات الحيوية المرتبطة بالأكسدة والاختزال، والنتائج الهيستوباثولوجية.
مقالة بحثية
التأثيرات الواقية للكلى للإيثانول والفومبيزول في نموذج جرذان مصابة بالتسمم بالميثانول ومعالجة مسبقاً بالميثوتريكسيت
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتسبب التسمم بالميثانول في حدوث حمضية أيضية، وإصابة الأعضاء، والوفاة؛ وتعد الإصابة الكلوية مؤشراً على النتائج السلبية. تمت مقارنة الإيثانول والفومبيزول في نموذج من الجرذان المصابة بالتسمم بالميثانول والمعالجة مسبقاً بالميثوتركسيت. تم توزيع ثلاثين من ذكور جرذان ويستار على خمس مجموعات: مجموعة ضابطة، ومجموعة ميثوتركسيت (MTX)، ومجموعة MTX + ميثانول، ومجموعة MTX + ميثانول + فومبيزول، ومجموعة MTX + ميثانول + إيثانول (العدد = 6 لكل مجموعة). تم إعطاء MTX عن طريق التغذية القسرية الفموية بجرعة 0.3 mg/kg/day في الأيام من 1 إلى 7. وتلقت المجموعات الثلاث التي تعرضت للميثانول جرعة 3 g/kg من الميثانول عن طريق التغذية القسرية الفموية في اليوم 8. تم إعطاء الفومبيزول عن طريق الحقن داخل الصفاق بجرعة 15 mg/kg بعد 4 h من إعطاء الميثانول، تلتها جرعة 10 mg/kg عند 12 و24 و36 h. أما الإيثانول فقد أُعطي مرة واحدة عن طريق التغذية القسرية الفموية بجرعة 0.5 g/kg بعد 4 h من إعطاء الميثانول. تم جمع العينات في اليوم 10. لم يتم تحديد نتيجة أولية مسبقاً. تم تقييم وظائف الكلى، وإصابة متجانس الكلى، والمؤشرات الحيوية الالتهابية، والمؤشرات الحيوية المرتبطة بالأكسدة والاختزال المستخلصة من الدم، والنتائج الهيستوباثولوجية. كشف تحليل التباين (ANOVA) عن وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات في مستويات سيستاتين C في متجانس الكلى (p = 0.003)، وإنترلوكين-6 (IL-6؛ p = 0.013)، وجزيء إصابة الكلى-1 (KIM-1؛ p = 0.017)، ويوريا المصل (p = 0.017)، وكرياتينين المصل (p < 0.001). وأظهر اختبار دنكان البعدي (Duncan post hoc) قيماً أقل لهذه المعايير في كلتا مجموعتي الترياق مقارنة بمجموعة MTX + ميثانول. ولم يتم تحديد فروق كيميائية حيوية ذات دلالة إحصائية بين مجموعتي الترياق. كانت درجات الفحص الهيستوباثولوجي أقل في مجموعات الترياق. وعلى الرغم من أن الفومبيزول أظهر نمطاً وصفياً أكثر ملاءمة، إلا أن النتائج لا تثبت تفوقه على الإيثانول. ويحد من تفسير النتائج تباين التجانس، والاختبارات المتعددة، وعدم تساوي أنظمة الترياق، وغياب قياسات الحركية السمية والتوازن الحمضي القاعدي، وقصر فترة المتابعة. يجب أن تتضمن الدراسات المستقبلية قياسات مباشرة للميثانول والفورمات، ونشاط إنزيم كحول ديهيدروجيناز في السيتوسول الكلوي، والارتباطات مع النتائج الكيميائية الحيوية الكلوية، وفترات متابعة أطول، وأنظمة ترياق قابلة للمقارنة.
المقدمة
يعد التسمم بكحول الميثيل (الميثانول) حالة طوارئ سمية كبرى ترتبط بمعدلات مراضة ووفيات كبيرة في جميع أنحاء العالم، لا سيما بعد استهلاك المشروبات الكحولية غير القانونية أو المصنعة بشكل غير مشروع. ورغم أن الميثانول في حد ذاته يتمتع بسمية منخفضة نسبياً، إلا أنه يُستقلب بشكل أساسي في الكبد بواسطة إنزيم alcohol dehydrogenase (ADH) إلى فورمالدهيد، ثم لاحقاً إلى حمض الفورميك؛ ويمكن أن يؤدي تراكم الفورمات الناتج إلى حمض استقلابي بـ high-anion-gap، واعتلال عصبي بصري، وإصابة متعددة الأعضاء1,2. ويُعد الفورمالدهيد وسيطاً قصير العمر، بينما يُعتبر تراكم الفورمات هو المساهم الرئيسي في السميّة عبر تثبيط cytochrome oxidase الميتوكوندري، ونقص الأكسجة الخلوية، والإجهاد التأكسدي 3. ويمثل التشخيص المبكر، وتصحيح الحمض الاستقلابي، والعلاج بالترياق، وديلزة الدم المداخلات العلاجية الرئيسية لتقليل معدلات الوفيات2.
في حالات التسمم بالميثانول، تظهر المظاهر السريرية عادةً بعد فترة كامنة. وقد يتبع الغثيان والقيء وآلام البطن والاكتئاب الطفيف في الجهاز العصبي المركزي حدوث حماض استقلابي بفجوة أنيونية عالية، وضيق في التنفس، وتغير في الحالة العقلية، وأعراض بصرية1,2. ويعد تشوش الرؤية، والرهاب الضوئي، وتوسع حدقة العين، ووذمة القرص البصري، وفي الحالات الشديدة، العمى الدائم، من أبرز التأثيرات السامة المميزة المرتبطة بتثبيط سيتوكروم أكسيداز الميتوكوندريا بوساطة حمض الفورميك1,2. وتشمل استراتيجيات العلاج الحالية الرعاية الداعمة؛ وتصحيح الحماض الاستقلابي باستخدام بيكربونات الصوديوم؛ ومكملات حمض الفولينيك أو حمض الفوليك؛ وتثبيط إنزيم كحول ديهيدروجيناز باستخدام الإيثانول أو الفومبيزول؛ وفي حالات شديدة مختارة، غسيل الكلى لتسريع التخلص من الميثانول والفورمات3,4. ويُنظر إلى الفومبيزول بشكل متزايد كـترياق خط أول بسبب حركيته الدوائية الأكثر قابلية للتنبؤ، وبساطة جرعاته، وانخفاض خطر الآثار الجانبية؛ ومع ذلك، يظل الإيثانول بديلاً مهماً نظراً لتوفرة وانخفاض تكلفته4,5,6,7.
على الرغم من أن إصابة العصب البصري والجهاز العصبي المركزي كانت تُعتبر تقليدياً المظاهر السائدة لتسمم الميثانول، إلا أن الكلى أصبحت تُعرف بشكل متزايد كعضو مستهدف ذي صلة سريرية8,9,10. وفي المجموعات الخاصة بتسمم الميثانول، ارتبطت الإصابة الكلوية الحادة (AKI) بحماض استقلابي أكثر شدة، وفشل تنفسي، وفشل في أعضاء متعددة، والحاجة إلى التهوية الميكانيكية، والعلاج خارج الجسم، وفترات استشفاء أطول، وارتفاع معدلات الوفيات داخل المستشفى؛ كما تم تحديد نقص الحجم، وإنتان الدم، وانحلال العضلات المخططة، والتهاب البنكرياس الحاد كعوامل مرتبطة بتطور الإصابة الكلوية الحادة8,10. وفي المجموعة التي أبلغ عنها Chang et al.، ظلت الإصابة الكلوية الحادة مرتبطة بشكل مستقل بالوفيات داخل المستشفى في تحليل متعدد المتغيرات؛ ومع ذلك، فإن تصميم الدراسة الرصدية الاستعادية لا يثبت أن الإصابة الكلوية الحادة بحد ذاتها كانت سبباً في الوفاة8. وبناءً على ذلك، يجب تفسير الإصابة الكلوية الحادة كعلامة على زيادة شدة المرض وسوء المآل في حالات التسمم بالميثانول. في المقابل، قيمت المراجعة المنهجية التي أجراها Wang et al. نتائج الكلى بعد التسمم بالكحول السام بشكل أوسع، وبشكل أساسي الميثانول وإيثيلين جلايكول؛ لذا فإن استنتاجاتها ليست مقتصرة على الميثانول وحده9. وقد حددت تلك المراجعة معدلات وفيات قصيرة المدى ملموسة وفجوات معرفية مهمة فيما يتعلق بتعافي الكلى على المدى الطويل، وغسيل الكلى المستمر، والتقارير الموحدة عن النتائج الكلوية9.
من المرجح أن تكون العلاقة بين سمية الميثانول وإصابة الكلى الحادة (AKI) متعددة العوامل. فقد يساهم تراكم النواتج الأيضية السامة من خلال تثبيط الميتوكوندريا، ونقص الأكسجة الخلوي، والحماض الأيضي الشديد، واختلال التوازن في تفاعلات الأكسدة والاختزال، بينما قد توفر العوامل الجهازية الموثقة في المجموعات السريرية — بما في ذلك نقص حجم السوائل، والقصور في الديناميكا الدموية، وانحلال العضلات المخططة، وتسمم الدم، والفشل التنفسي، وقصور وظائف أعضاء متعددة — إصابات كلوية إضافية1,2,3,8,10. وتوفر هذه المسارات روابط منطقية بيولوجياً وسريرياً بين التسمم بالميثانول وإصابة الكلى. وقد تنتج الاضطرابات الأيضية الكلوية عن التعرض للفورمات المنتشر في الدورة الدموية، وتثبيط الميتوكوندريا، والحماض الأيضي، والإجهاد الديناميكي الدموي الجهازي. ومع ذلك، لا تزال المساهمة المحددة لأيض الكحول والألدهيد داخل الأنسجة الكلوية غير مؤكدة لأن تركيزات الميثانول والفورمالديهايد والفورمات، ونشاط إنزيم ADH الكلوي، ووظيفة الميتوكوندريا لم يتم تقييمها بشكل مباشر في هذه الدراسة.
يتمثل التحدي المنهجي الرئيسي في الدراسات التجريبية لسمية الميثانول في أن الجرذان تستقلب حمض الفورميك بسرعة أكبر من البشر. وعلى الرغم من أن تراكم حمض الفورميك هو المحدد الرئيسي لسمية الميثانول لدى البشر، إلا أن تحقيق تراكم مماثل وما يترتب عليه من إصابة في الأعضاء لدى الجرذان يعد أكثر صعوبة بسبب استقلاب الفورمات عالي الكفاءة والمعتمد على الفولات لديها. لذا، غالبًا ما تُستخدم العوامل التي تثبط استقلاب الفولات في النماذج التجريبية لسمية الميثانول11,12. وقد استُخدم المعالجة المسبقة بالميثوتريكسيت (MTX) لتقليل تصفية الفورمات المعتمدة على الفولات في الجرذان، مما يؤدي إلى زيادة القابلية للتأثر بسمية الميثانول11,12. ولا يتسبب الميثوتريكسيت في حد ذاته في إحداث سمية الميثانول، كما أن النموذج الناتج لا يعيد إنتاج جميع جوانب التسمم بالميثانول لدى البشر. وبما أن الميثوتريكسيت قد يؤثر بشكل مستقل على النتائج الكلوية والتأكسدية والالتهابية، فقد تم إدراج مجموعة تلقت الميثوتريكسيت فقط لتوصيف التغيرات المرتبطة بالمعالجة المسبقة. وفي حدود هذه القيود، يوفر هذا النموذج منصة قبل سريرية محكمة لمقارنة أنماط النتائج الكلوية بين المجموعات التجريبية التي تلقت نفس بروتوكول المعالجة المسبقة بالميثوتريكسيت والتعرض للميثانول، ولتقييم هذه النتائج على المستويات الكيميائية الحيوية والالتهابية والتأكسدية والنسيجية المرضية.
يمثل تثبيط إنزيم كحول ديهيدروجيناز (alcohol dehydrogenase) حجر الزاوية في العلاج بالترياق للتسمم بالميثانول. والعاملان الأكثر استخداماً لهذا الغرض في الممارسة السريرية هما الإيثانول والفومبيزول (4-methylpyrazole). يعمل الإيثانول على تثبيط تكوين النواتج الأيضية السامة تنافسياً بسبب ألفته الأعلى لإنزيم ADH مقارنة بالميثانول، بينما يمنع الفومبيزول، وهو مثبط قوي وانتقائي لإنزيم ADH، تحول الميثانول مباشرة إلى فورمالديهايد وحمض الفورميك5,6. ومع ذلك، لا يوجد إجماع كامل بشأن الفعالية السريرية المقارنة، والسلامة، وسهولة الإعطاء، والتأثيرات الواقية للأعضاء لهذين الترياقين. ويُعتبر الفومبيزول مفضلاً في العديد من المراكز نظراً لنظام جرعاته الموحد، وعدم الحاجة لمراقبة مستواه في المصل، وغياب تثبيط الجهاز العصبي المركزي، وخصائصه الحركية الدوائية الأكثر قابلية للتنبؤ، بينما يرتبط العلاج بالإيثانول بسلبيات محتملة، بما في ذلك نقص سكر الدم، والسمية الكبدية، وتغير الحالة العقلية، والحاجة إلى مراقبة مكثفة6,7. وعلى العكس من ذلك، أشارت المقارنات السريرية واسعة النطاق إلى أن تأثيري الترياقين على معدلات الوفيات والنتائج السريرية قد يكونان متشابهين. ففي الدراسة التي أجراها Zakharov وآخرون، والتي قيمت حالات تسمم جماعي، لم يُلاحظ وجود فرق معنوي في معدلات البقاء على قيد الحياة بين الفومبيزول والإيثانول5.
على الرغم من الأهمية الإنذارية لإصابة الكلى الحادة (AKI) في حالات التسمم بالميثانول8,9,10، إلا أن إصابة الكلى قد نالت اهتماماً أقل بكثير مقارنة بالسمية العينية والعصبية، ولا تزال التأثيرات الكلوية المقارنة للإيثانول والفومبيزول غير محددة بشكل كافٍ. لذا، فإن إجراء تقييم يركز على الكلى يدمج اختبارات وظائف الكلى التقليدية، والمؤشرات الحيوية المبكرة لإصابة الأنابيب، والسيتوكينات الالتهابية، والمعايير المرتبطة بالاختزال والأكسدة، وعلم الأنسجة المرضي، يعد أمراً ضرورياً لتحديد ما إذا كانت استراتيجيات الترياق المختلفتان ترتبطان بأنماط متباينة من النتائج الكلوية. بالإضافة إلى ذلك، فإن نموذج الجرذان هذا، الذي تمت معالجته مسبقاً بالميثوتريكسيت تحت ظروف مضبوطة، قد يسهل التقييم قبل السريري للتداخلات المرشحة كمضادات للتسمم أو تدخلات موجهة للكلى أو تدخلات داعمة تحت ظروف تجريبية محددة. وتكمن القيمة البحثية لهذا النموذج في التقييم المقارن ضمن سياق تجريبي حاد بدلاً من المحاكاة المباشرة للتعقيد السريري والأيضي للتسمم بالميثانول لدى البشر.
تظل الاختلافات في استقلاب الميثانول بين القوارض والبشر، إلى جانب استخدام المعالجة الدوائية المسبقة لتقليل تصفية الفورمات المعتمدة على الفولات، قيوداً منهجية مهمة. علاوة على ذلك، قد لا تعكس السمية الحادة المستحثة تحت الظروف التجريبية بشكل كامل مدد التعرض المتفاوتة والحالات المرضية المصاحبة التي يتم مواجهتها في الممارسة السريرية. وبناءً على ذلك، يجب اعتبار النتائج المستخلصة من هذا النموذج الحيواني كأدلة قبل سريرية أولية، ولا ينبغي استخدامها مباشرة لدعم قرارات العلاج لدى البشر. كما يتطلب الأمر تأكيداً من خلال دراسات سريرية مصممة بشكل مناسب قبل إمكانية استخلاص استنتاجات سريرية. وفي هذا السياق، تكمن الفجوة المعرفية الأساسية في معرفة ما إذا كان الإيثانول والفومبيزول يرتبطان بأنماط مختلفة من النتائج الكلوية عبر مقاييس وظائف الكلى التقليدية، والمؤشرات الحيوية لإصابة الأنابيب، والسيتوكينات الالتهابية، والمعايير المتعلقة بالتوازن التأكسدي، وعلم الأمراض النسيجي في نموذج جرذان تمت معالجته مسبقاً بالميثوتريكسيت. كانت فرضية الدراسة هي أن تثبيط إنزيم كحول ديهيدروجيناز إما باستخدام الإيثانول أو الفومبيزول سيكون مرتبطاً بتخفيف الإصابة الكلوية، مع وجود اختلافات محتملة بين العلاجين عبر مجالات النتائج التي تم تقييمها. وقد عُرِفت الوقاية الكلوية إجرائياً بأنها نمط من النتائج الكلوية أكثر ملاءمة مما هو عليه في مجموعة MTX + Methanol. وشمل هذا النمط تركيزات أقل من اليوريا والكرياتينين في المصل؛ ومستويات كلوية أقل من جزيء إصابة الكلى-1 (KIM-1)، والسيستاتين C، وعامل نخر الورم ألفا (TNF-α)، والإنترلوكين-6 (IL-6)، والإنترلوكين-1 بيتا (IL-1β)؛ وتركيزات أقل من المالونديألديهيد (MDA) في المصل؛ ونشاطاً أعلى لإنزيم سوبر أكسيد ديسموتاز (SOD) في المصل، ومستويات أعلى من الجلوتاثيون المختزل (GSH) في الدم، ونشاطاً أعلى لإنزيم الكاتالاز (CAT) في الدم؛ ودرجات أقل في الفحص النسيجي المرضي للتنكس الأنبوبي، والنخر الأنبوبي، وإصابة الكبيبات، والاحتقان الوعائي، والالتهاب الخلالي، والتليف. لم يتم حساب الوقاية الكلوية كدرجة مركبة واحدة، بل تم تقييم النتائج الفردية بشكل جماعي عبر هذه المجالات المتكاملة. وبناءً على ذلك، هدفت الدراسة إلى مقارنة تأثيرات الإيثانول والفومبيزول على وظائف الكلى، وإصابة الأنابيب، والالتهاب، وحالة التوازن التأكسدي، وعلم الأمراض النسيجي الكلوي في هذا النموذج.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات المحلية بجامعة Kırşehir Ahi Evran (قرار الموافقة رقم 1، اجتماع رقم 12، تاريخ الموافقة: 12 يونيو 2025)، وأُجريت وفقاً للإرشادات الوطنية والدولية الخاصة برعاية واستخدام حيوانات المختبر. وقد اتُّخذت التدابير طوال فترة الدراسة لتقليل الألم والمعاناة واستخدام أقل عدد ممكن من الحيوانات الضرورية.
تحضير المواد الكيميائية
استُخدم الميثوتريكسيت كعامل معالجة مسبقة لتسهيل إنشاء نموذج سمية الميثانول التجريبي. ونظراً لأن أكسدة الفورمات المعتمدة على الفولات كانت أكثر كفاءة في الجرذان منها في البشر، فقد استُخدمت المعالجة المسبقة بالميثوتريكسيت لتقليل تصفية الفورمات وزيادة الحساسية لسمية الميثانول؛ حيث استُخدم كتدخل لزيادة حساسية النموذج وليس كبديل للتعرض للميثانول11,12. وُفر الميثوتريكسيت في تركيبة بتركيز 500 mg/5 mL، وهو ما يقابل تركيزاً مخزونياً قدره 100 mg/mL. خُففت هذه التركيبة باستخدام محلول كلوريد الصوديوم المعقم بتركيز 0.9% للحصول على تركيز عمل نهائي قدره 0.06 mg/mL. أُعطي محلول العمل عن طريق التغذية القسرية الفموية بجرعة 5 mL/kg، وهو ما يقابل جرعة MTX قدرها 0.3 mg/kg. وبالنسبة للجرذان التي تزن 200–220 g عند بدء الدراسة، تراوح حجم الإعطاء اليومي من 1.00 إلى 1.10 mL لكل حيوان، وحُسب بشكل فردي باستخدام وزن الجسم المسجل عند بدء الدراسة. لم يُعد قياس وزن الجسم خلال فترة المعالجة المسبقة بـ MTX التي استمرت 7 أيام. أُعطي الميثوتريكسيت مرة واحدة يومياً لمدة 7 أيام متتالية (أيام الدراسة 1-7)، ثم أُعطي الميثانول في اليوم الثامن من الدراسة بعد اكتمال بروتوكول المعالجة المسبقة بـ MTX. كان هذا النظام متسقاً مع نماذج المعالجة المسبقة بـ MTX عبر التغذية القسرية الفموية المنشورة سابقاً13.
تم تحضير الميثانول (بنقاء ≥99.8%) حديثاً في يوم الإعطاء كمحلول عمل مائي بتركيز 20% (حجم/حجم) عن طريق التخفيف بماء مقطر معقم. وقد تم تحضير محلول العمل بخلط حجم واحد من الميثانول مع 4 أحجام من الماء المقطر المعقم. ووفقاً لنماذج الجرذان المعالجة مسبقاً بالميثوتريكسات للتسمم بالميثانول الموصوفة سابقاً، تم إعطاء جرعة واحدة من الميثانول للمجموعات 3-5 في اليوم الثامن من الدراسة بتركيز 3 g/kg عن طريق التزقيم الفموي. ولم يتم فرض أي قيود على الغذاء أو الماء قبل إعطاء الميثانول. وقد تم حساب حجم الإعطاء المطلوب لكل حيوان بشكل فردي بناءً على وزن جسمه، وكان حوالي 18.9 mL/kg لمحلول الميثانول بتركيز 20%. وبالنسبة لجرذ يزن حوالي 220 g، فإن هذه الجرعة تعادل 0.66 g من الميثانول وحجم تزقيم نهائي يبلغ حوالي 4.2 mL. وقد اختير نظام التعرض للميثانول هذا للحفاظ على القابلية للمقارنة مع نماذج الجرذان المعالجة مسبقاً بالميثوتريكسات للتسمم الحاد بالميثانول المنشورة سابقاً13,14,15.
تم تحضير محلول التشغيل من fomepizole في محلول كلوريد الصوديوم المعقم بتركيز 0.9% ليصل إلى تركيز نهائي قدره 10 mg/mL. تم إعطاء جرعة تحميل عن طريق الحقن في التجويف البريتوني بمقدار 15 mg/kg بعد 4 ساعات من إعطاء الميثانول، تلتها جرعات صيانة عن طريق الحقن في التجويف البريتوني بمقدار 10 mg/kg عند الساعات 12 و24 و36. عند تركيز التشغيل البالغ 10 mg/mL، كانت أحجام الإعطاء 1.5 mL/kg لجرعة التحميل و1.0 mL/kg لكل جرعة صيانة. وبالنسبة لجرذ يبلغ وزن جسمه عند بدء الدراسة حوالي 220 g، فإن هذه الجرعات تعادل تقريباً 0.33 mL لجرعة التحميل و0.22 mL لكل جرعة صيانة. وقد حُسبت جميع أحجام الإعطاء باستخدام وزن الجسم المسجل عند بدء الدراسة. تم اختيار جرعات التحميل والصيانة من fomepizole بالرجوع إلى توصيات علاج التسمم بالميثانول المعتمدة1,6.
استُخدم الإيثانول كعلاج مقارن للترياق. خُفف الإيثانول المطلق (بنقاوة ≥99.8%) بماء مقطر معقم عن طريق خلط حجم واحد من الإيثانول المطلق مع 4 أحجام من الماء المقطر المعقم للحصول على محلول عمل مائي نهائي بتركيز 20% (v/v). أُعطيت جرعة واحدة من الإيثانول عن طريق التزقيم الفموي بجرعة 0.5 g/kg بعد 4 h من إعطاء الميثانول؛ ولم تُعطَ أي جرعات صيانة من الإيثانول. كان حجم الإعطاء حوالي 3.2 mL/kg. وبالنسبة لجرذ يبلغ وزن جسمه عند بدء الدراسة حوالي 220 g، فقد كان ذلك يعادل حجم تزقيم نهائي قدره 0.70 mL تقريبًا. حُسب حجم الإعطاء باستخدام وزن الجسم المسجل عند بدء الدراسة. وقد تم اختيار تركيز الإيثانول والجرعة وطريقة وتوقيت الإعطاء بناءً على نماذج جرذان معالجة مسبقاً بالميثوتريكسيت ومنشورة سابقاً استخدمت الإيثانول كمقارن للترياق13,14.
تم تحضير جميع المحاليل حديثاً في يوم الإعطاء، وفُحصت للتأكد من مظهرها المتجانس وخلوها من أي جزيئات مرئية. نُفذت عمليات الإعطاء عن طريق الفم باستخدام كانيولا تغذية معدية مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ. وأثناء التغذية المعدية، تم دفع الكانيولا بعناية من التجويف الفمي إلى المريء، مع تجنب حدوث الارتجاع، أو التسرب الفموي، أو الاستنشاق، أو الضيق التنفسي. كما نُفذت الحقونات داخل الصفاق تحت ظروف تعقيم باستخدام محاقن وإبر معقمة مخصصة للاستخدام مرة واحدة. وأجريت جميع الإجراءات المتعلقة بتحضير المواد الكيميائية وإعطائها وفقاً للوائح السلامة المختبرية المؤسسية.
الحيوانات التجريبية، وظروف الإيواء، والتوزيع العشوائي
تم الحصول على إجمالي 30 من ذكور جرذان ويستار البيضاء البالغة، تتراوح أعمارها بين 8 و12 أسبوعاً وتزن 220 ± 20 g، من مختبر أبحاث الحيوانات التجريبية بجامعة أهي إفران، قرشهر، تركيا. تم اختيار جرذان ويستار نظراً لاستخدامها الواسع في دراسات السمية التجريبية وحماية الكلى، وللسماح بمقارنة النتائج مع الدراسات المنشورة سابقاً. أُويت الحيوانات في درجة حرارة 24 ± 2 °C تحت دورة ضوئية مدتها 12 ساعة ضوء/12 ساعة ظلام. ووُفر لها العلف القياسي المكبوس ومياه الصنبور بحرية طوال فترة التجربة التي استمرت 10 أيام. وقبل البدء في الإجراءات التجريبية، خضعت جميع الحيوانات لفترة تأقلم مدتها 7 أيام.
تم توزيع ثلاثين جرذًا على خمس مجموعات تجريبية باستخدام إجراء تخصيص عشوائي بمساعدة الحاسوب، بمعدل ستة حيوانات لكل مجموعة. بالنسبة لكل جرذ، تم توليد عدد صحيح عشوائي بين 1 و5، وتم تعيين الحيوان للمجموعة التجريبية المقابلة. وبمجرد أن تحتوي المجموعة على ستة حيوانات، يتم استبعاد أي سحب لاحق يحدد تلك المجموعة، ويتم توليد رقم عشوائي جديد حتى يتم اختيار مجموعة يتوفر بها شاغر. استمر هذا الإجراء حتى تم تخصيص جميع الجرذان الثلاثين، مما أدى إلى وجود 6 حيوانات في كل مجموعة. قام الباحث نفسه بتوليد التخصيصات العشوائية وتنفيذ عملية التوزيع؛ ولم يتم الاستعانة بمشغل تخصيص منفصل. لم تتلقَّ المجموعة 1 (المجموعة الضابطة) أي علاج دوائي تجريبي، وخضعت الحيوانات لنفس أخذ العينات المجدولة عند نقطة النهاية كما في المجموعات الأخرى. تلقت المجموعة 2 (MTX) عقار methotrexate عن طريق التغذية القسرية الفموية بجرعة 0.3 mg/kg لمدة 7 أيام. تلقت المجموعة 3 (MTX + Methanol) عقار methotrexate لمدة 7 أيام، يليه methanol بجرعة 3 g/kg في اليوم الثامن من الدراسة. تلقت المجموعة 4 (MTX + Methanol + Fomepizole) علاجًا مسبقًا بـ methotrexate يليه methanol، مع بدء العلاج بـ 4-methylpyrazole بعد 4 h. تلقت المجموعة 5 (MTX + Methanol + Ethanol) علاجًا مسبقًا بـ methotrexate يليه methanol، مع إعطاء ethanol بعد 4 h.
تلقت المجموعات الثلاث المعرضة للميثانول نفس بروتوكول المعالجة المسبقة بـ MTX وإعطاء الميثانول، واختلفت فقط فيما يتعلق بالعلاج بالترياق بعد التعرض. وقد تم تلخيص توزيع المجموعات التجريبية، وبروتوكول الإعطاء، وتوقيت العلاج بالترياق، وعملية جمع العينات في الشكل 1. تم إجراء تحليل قوة مسبق لاختبار ANOVA أحادي الاتجاه ذو تأثيرات ثابتة مع خمس مجموعات مستقلة. وبافتراض حجم تأثير معياري كبير (Cohen’s f = 0.70)، ومستوى دلالة 0.05، وقوة إحصائية بنسبة 80%، تم حساب الحد الأدنى المطلوب لإجمالي حجم العينة بـ 30 حيواناً، ما يعادل ستة حيوانات لكل مجموعة. وكانت القوة المحسوبة لإجمالي حجم عينة مكون من 30 حيواناً حوالي 80.9%. وقد تم تحديد حجم التأثير المفترض (Cohen’s f = 0.70) قبل التجربة بناءً على توقعات الباحثين بوجود تأثير إجمالي كبير بين المجموعات في نموذج السُمية الحادة هذا. واستند هذا الافتراض إلى تقدير الباحثين بدلاً من تقدير مستمد من بيانات تجريبية أولية أو دراسة سابقة محددة. لم يتم تعيين نتيجة أولية واحدة مسبقاً لهذه الدراسة؛ حيث استند حساب حجم العينة إلى تأثير إجمالي كبير مفترض في مقارنة شاملة بين المجموعات التجريبية الخمس. ولا يمكن تعيين نتيجة أولية بأثر رجعي كنقطة نهاية محددة مسبقاً. وبناءً على ذلك، فإن حساب حجم العينة لا يوفر قوة كافية لكل نتيجة فردية أو للمقارنات الثنائية.
بروتوكول التسمم بالميثانول والعلاج بالترياق
بعد فترة التأقلم، تلقت الحيوانات في المجموعات 2–5 عقار ميثوتريكسات مرة واحدة يومياً لمدة 7 أيام متتالية (أيام الدراسة 1–7). وفي اليوم الثامن من الدراسة، تلقت الحيوانات في المجموعات 3–5 جرعة واحدة من محلول ميثانول بتركيز 20% بمقدار 3 g/kg عن طريق التغذية القسرية الفموية. لم يتم فرض أي صيام أو قيود أخرى على الغذاء أو الماء قبل إعطاء الميثانول.
في مجموعة MTX + Methanol + Fomepizole، تم إعطاء جرعة تحميل داخل الصفاق بمقدار 15 mg/kg بعد 4 h من إعطاء الميثانول، تلتها جرعات صيانة داخل الصفاق بمقدار 10 mg/kg في الساعات 12 و24 و36 بعد إعطاء الميثانول. وفي مجموعة MTX + Methanol + Ethanol، تم إعطاء جرعة واحدة من الإيثانول عن طريق التغذية الأنبوبية الفموية بمقدار 0.5 g/kg بعد 4 h من إعطاء الميثانول؛ ولم يتم إعطاء أي جرعات صيانة من الإيثانول. تم اختيار نظامي الترياق ليعكسا توصيات جرعات الفومبيزول المعتمدة وبروتوكولات مقارنة الإيثانول المنشورة سابقاً1,6,13,14. لم يتم تصميم هذه الأنظمة لتوفير علاج متطابق من حيث الجرعة أو طريق الإعطاء أو التعرض. وبناءً على ذلك، شكل نظام الفومبيزول المتكرر داخل الصفاق والجرعة الفموية الواحدة من الإيثانول مقارنة فارماكولوجية غير متكافئة. تم التأكد من نجاح الإعطاء عن طريق التغذية الأنبوبية من خلال عدم حدوث ارتجاع أو تسرب فموي أو ضائقة تنفسية أثناء الإجراء. كما تم التأكد من نجاح الإعطاء داخل الصفاق من خلال عدم وجود تسرب أو نزيف أو تورم ملحوظ في موقع الحقن.
بعد الإعطاء، تمت مراقبة الحيوانات بانتظام من حيث الحالة الصحية العامة، والقدرة على الحركة، وتناول الطعام، والوضعية، ومظهر الفراء، وعلامات السمية. وقد صُمم جدول العلاج للسماح ببدء تكوين المستقلبات السامة من الميثانول مع تمكين تقييم الآثار الوقائية والعلاجية للعوامل المضادة للتسمم.
القتل الرحيم، والنهايات الإنسانية، وجمع العينات
طوال فترة التجربة، تم تقييم جميع الحيوانات يومياً من حيث الحالة الصحية العامة، ومدى تناول الغذاء والماء، والقدرة على الحركة، والتغيرات السلوكية. تم تحديد معايير النهاية الإنسانية مسبقاً لتشمل الخمول الشديد، أو عدم القدرة على تناول الغذاء أو الماء، أو فقدان الوزن الشديد، أو محدودية الحركة، أو الوضعية غير الطبيعية للجسم، أو انتصاب الشعر المستمر، أو ظهور علامات واضحة على الضيق. وكان من المقرر إخضاع الحيوانات التي تستوفي أي من هذه المعايير للقتل الرحيم الإنساني. ومع ذلك، لم يصل أي حيوان إلى معايير النهاية الإنسانية المحددة مسبقاً خلال الدراسة.
تم القتل الرحيم لجميع الحيوانات في المجموعات التجريبية الخمس في اليوم العاشر من الدراسة. وبالنسبة لمجموعات MTX + Methanol، وMTX + Methanol + Fomepizole، وMTX + Methanol + Ethanol، فقد تطابقت هذه النهاية مع مرور 48 h بعد إعطاء جرعة واحدة من الميثانول في اليوم الثامن من الدراسة. وبقيت مجموعة Control دون علاج حتى اليوم العاشر من الدراسة، بينما تمت مراقبة مجموعة MTX فقط حتى اليوم العاشر من الدراسة بعد استكمال بروتوكول إعطاء MTX لمدة 7 أيام. وبذلك، كانت لجميع المجموعات الخمس نفس المدة الإجمالية للدراسة، وخضعت للقتل الرحيم وجمع العينات في نفس اليوم من الدراسة.
استُخدم الكيتامين والزايلزين لتحريض التخدير العميق، وتم التأكد من عمق التخدير من خلال فقدان منعكس سحب القدم. وبعد تحقيق التخدير العميق، جُمعت عينات الدم عن طريق الوخز داخل القلب، حيث تم الحصول على 3–5 mL تقريبًا من الدم باستخدام حقنة وإبرة مناسبتين. ونُقل الدم الذي جُمع لقياس تركيزات اليوريا والكرياتينين في المصل، ونشاط SOD في المصل، وتركيز MDA في المصل إلى أنابيب خالية من مضادات التخثر وتُرِك ليتجلط تمامًا. أما الدم المخصص لقياس مستوى GSH ونشاط CAT فقد جُمع بشكل منفصل في أنابيب تحتوي على حمض إيثيلين ثنائي أمين رباعي الخليك (EDTA) وعولج دون خطوة التجلط. وبعد اكتمال تكوين الجلطة، تم طرد عينات المصل مركزياً عند 3,000 × g لمدة 10–15 min عند 4 °C. وخُزن المصل المفصول عند −80 °C حتى وقت التحليل، وتم التأكد من نجاح فصل المصل من خلال مظهره الشفاف غير المتحلل. وبعد جمع الدم، أُتم القتل الرحيم عن طريق استنزاف الدم تحت التخدير العميق، ثم أُجري شق جراحي وسطي في البطن وأُزيلت الكليتان بعناية. وبعد إزالة الدهون والأنسجة الضامة المحيطة، شُطفت الكليتان بمحلول ملحي فسيولوجي بارد. وقُسمت عينات الأنسجة لإجراء التحليلات الهيستوباثولوجية والكيميائية الحيوية؛ حيث وُضعت العينات المخصصة للفحص الهيستوباثولوجي في فورمالدهيد مُنظم متعادل بتركيز 10%، بينما وُسمت العينات المخصصة للتحليلات الكيميائية الحيوية بشكل مناسب وخُزنت عند −80 °C.
تم إجراء جمع العينات، والتحليلات البيوكيميائية، وتقييمات النتائج بواسطة باحثين تم تعميتهم عن المجموعات التجريبية. ولم يتم استبعاد أي من الحيوانات من التحليلات.
التحليلات البيوكيميائية
تم قياس تركيز اليوريا في المصل باستخدام مقايسة حركية إنزيمية تعتمد على اليوريز وغلوتامات ديهيدروجيناز بواسطة محلل بيوكيميائي آلي. حيث تم تحلل اليوريا بواسطة إنزيم اليوريز لإنتاج الأمونيا، والتي تفاعلت لاحقاً مع 2-oxoglutarate ونيكوتيناميد أدينين ثنائي النوكليوتيد المختزل (NADH) في وجود إنزيم غلوتامات ديهيدروجيناز. وقد تم قياس الانخفاض في الامتصاصية الناتج عن استهلاك NADH حركياً. كما تم قياس تركيز الكرياتينين في المصل لونياً باستخدام نفس المحلل البيوكيميائي الآلي.
تم تحديد نشاط إنزيم سوبر أكسيد ديسميوتاز (SOD) في المصل باستخدام مقايسة لونية تعتمد على توليد جذور السوبر أكسيد بواسطة نظام الزانثين-زانثين أوكسيداز وتفاعلها مع 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride لتكوين منتج فورمازان ملون. وتم قياس الامتصاصية النهائية عند 505 nm. كما تم تحديد تركيز المالون داي ألدهيد (MDA) في المصل باستخدام تفاعل حمض الثيوباربيتوريك؛ حيث خُلطت عينات المصل مع حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك البارد لترسيب البروتينات، ثم تم إجراء الطرد المركزي عند 7,500 × g لمدة 5 min عند 4 °C. خُلط الطافي الناتج مع حجم مساوٍ من حمض الثيوباربيتوريك وحُضن عند 90 °C لمدة 60 min، ثم بُرّدت أنابيب التفاعل في حمام مائي بارد لمدة 10 min، وقِيست الامتصاصية عند 532 nm. وحُسبت تركيزات MDA من منحنى المعايرة المقابل. أما الجلوتاثيون المختزل (GSH)، فقد تم قياسه في دم مضاف إليه EDTA كمانع للتخثر باستخدام طريقة إلمان المعدلة؛ فبعد ترسيب البروتين بحمض ثلاثي كلورو الأسيتيك، تم تفاعل العينات منزوعة البروتين مع 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) في محلول منظم Tris بتركيز 500 mM وعند pH 8.2، وقِيست الامتصاصية عند 412 nm. وقِيست فعالية إنزيم الكاتالاز (CAT) في دم مضاف إليه EDTA كمانع للتخثر باستخدام مقايسة لونية من خطوتين، حيث حُضنت العينات مع كمية معلومة من بيروكسيد الهيدروجين، وبعد إنهاء التفاعل الإنزيمي، تم قياس بيروكسيد الهيدروجين المتبقي باستخدام كاشف لوني عند 405 nm.
نظراً لأن نشاط SOD وتركيز MDA قد قيسا في المصل، بينما قيست مستويات GSH ونشاط CAT في الدم المانع للتجلط بـ EDTA بدلاً من متجانسات أنسجة الكلى، فإن تسوية هذه المعايير المتعلقة بالأكسدة والاختزال بناءً على التركيز الكلي لبروتين الأنسجة لم تكن قابلة للتطبيق. ولتفسير ملف المؤشرات الحيوية المتعلقة بالأكسدة والاختزال، اعتبرت التركيزات الأعلى من MDA في المصل متوافقة مع زيادة بيروكسيد الدهون، بينما اعتبر انخفاض نشاط SOD في المصل، ومستويات GSH في الدم، ونشاط CAT في الدم مؤشراً على انخفاض القدرة المضادة للأكسدة؛ أما التغيرات في الاتجاه المعاكس فقد فُسرت على أنها ملف أكثر ملاءمة فيما يتعلق بالأكسدة والاختزال.
لقياسات المقايسة الامتصاصية المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) للأنسجة الكلوية، تم تجنيس حوالي 50 mg من أنسجة الكلية المحفوظة عند −80 °C على الثلج في 500 µL من محلول التجنيس المنظم الذي يحتوي على مزيج من مثبطات البروتياز، بما يتوافق مع نسبة ثابتة من النسيج إلى المحلول المنظم تبلغ 1:10 (w/v). تم تحضير مستخلص تجنيس نسيجي كلوي واحد خاص بكل حيوان لكل جرذ. تمت معالجة العينات من الحيوانات المختلفة بشكل مستقل ولم يتم تجميعها في أي مرحلة. تم طرد مستخلصات التجنيس مركزياً عند 14,000 × g لمدة 10 min عند 4 °C، وجُمع الطافي الناتج من كل حيوان بشكل منفصل وقُسم إلى حصص للتحليلات المخطط لها للأنسجة الكلوية. لم يتم قياس تركيز البروتين الكلي بشكل منفصل؛ وبناءً عليه، لم يتم تطبيع نتائج ELISA للأنسجة وفقاً له. عُبر عن التركيزات النهائية المحسوبة من منحنيات القياس المعيارية الخاصة بكل مقايسة بوحدة ng/L لكل من TNF-α و IL-6 وبوحدة ng/mL لكل من IL-1β و KIM-1 و cystatin C.
تم تقييم جزيء إصابة الكلى-1 (KIM-1) والسيستاتين C كعلامات حيوية لإصابة الكلى، بينما تم تقييم عامل نخر الورم-ألفا (TNF-α)، وإنترلوكين-6 (IL-6)، وإنترلوكين-1 بيتا (IL-1β) كعلامات للالتهاب الكلوي. تم قياس جميع المواد الخمس التي خضعت للتحليل في متجانسات أنسجة الكلى باستخدام أطقم ELISA خاصة بالجرذان وفقاً لبروتوكولات الشركات المصنعة. وبالنسبة للمقايسات المعنية، كانت الحساسيات التحليلية ونطاقات القياس 2.51 ng/L و 5–1,000 ng/L لـ TNF-α، و 0.052 ng/L و 0.1–40 ng/L لـ IL-6، و 0.08 ng/mL و 0.2–60 ng/mL لـ IL-1β، و 0.01 ng/mL و 0.05–10 ng/mL لـ KIM-1، و 0.25 ng/mL و 0.5–100 ng/mL للسيستاتين C، على التوالي. قبل التحليل، تم ترك جميع الكواشف والمعايير والمواد الطافية لأنسجة الكلى لتصل إلى درجة حرارة الغرفة. أُنشئت منحنيات قياسية بشكل منفصل لكل تشغيلة مقايسة وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة. أضيفت المعايير والمواد الطافية لأنسجة الكلى إلى آبار مغلفة مسبقاً بالأجسام المضادة، يليه الجسم المضاد للكشف المبيوتين المماثل ومرافق الستربتافيدين-بيروكسيداز الفجل. تم تحضين العينات وكواشف ELISA لمدة 1 h عند 37 °C. وبعد خمس دورات غسيل باستخدام غسالة أطباق ميكروية آلية، أضيفت محاليل الركيزة A و B وحُضنت لمدة 10 min عند 37 °C. تم إيقاف تفاعل اللون باستخدام محلول إيقاف حمضي، وقيس الامتصاص عند 450 nm. وبالنسبة لكل مادة تم تحليلها، حُوِّلت قيم الامتصاص المصححة للفراغ إلى تركيزات باستخدام المنحنى القياسي الخاص بكل مقايسة.
أُجريت جميع التحاليل الكيميائية الحيوية في ظل ظروف معيارية، وتمت معالجة جميع العينات باستخدام الإجراءات نفسها. كما أُجريت قياسات مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لأنسجة الكلى في مكررات ثنائية. وبالنسبة لكل مادة تحليلية، تم حساب متوسط البئرين المكررين تقنياً للحصول على قيمة واحدة على مستوى الحيوان. ولم تُعتبر الآبار المكررة تقنياً والأجزاء المنفصلة التي تم الحصول عليها من نفس المتجانس الخاص بالحيوان ملاحظات مستقلة. واعتُبر الحيوان الفردي هو الوحدة التجريبية، وأُدرجت نتيجة واحدة على مستوى الحيوان لكل معلمة في التحليل الإحصائي.
المعالجة الهستوباثولوجية وتقدير درجات الإصابة الكلوية
تمت معالجة عينات الأنسجة للتقييم المجهري باستخدام إجراءات الهستوباثولوجيا القياسية. تم تثبيت أنسجة الكلى في فورمالدهيد منظم متعادل بتركيز 10% في درجة حرارة الغرفة لمدة 72 h. وبعد التثبيت، تم تجفيف الأنسجة من الماء عبر تركيزات متدرجة من الإيثانول بنسبة 50%، و70%، و80%، و96%، و100%، مع الحفاظ على كل تركيز لمدة 1 h. لاحقاً، تم ترويق الأنسجة باستخدام إجراء الزيلين المكون من خطوتين ثم طمرها في قوالب البارافين. تم الحصول على مقاطع بسمك 5 µm من قوالب البارافين باستخدام الميكروتوم الدوار.
بالنسبة لصبغة الهيماتوكسيلين والإيوسين، تم إزالة البارافين من المقاطع وإعادة ترطيبها، ثم صبغها بالهيماتوكسيلين لمدة 5 min، وغسلها تحت مياه الصنبور الجارية لمدة 5 min. أُجريت عملية التمايز باستخدام الكحول الحمضي، وبعد ذلك تم حفظ المقاطع في محلول أمونيا لمدة 1 min. ثم صُبغت المقاطع صبغاً مضاداً بالإيوسين لمدة 2 min. وفي وقت لاحق، تم تجفيف المقاطع عبر سلسلة تصاعدية من الكحول، ثم ترويقها باستخدام الزايلين، وتثبيتها باستخدام وسط تثبيت مناسب.
بالنسبة لصبغة ماسون ثلاثية الألوان (Masson’s trichrome staining)، تم إزالة البارافين من المقاطع وإعادة ترطيبها، ثم حضنت في محلول مثبت (mordant solution) عند 56 °C لمدة 60 min وغسلت تحت ماء جارٍ لمدة 10 min. بعد ذلك، عولجت المقاطع بالتتابع باستخدام هيماتوكسيلين الحديد ويجرت (Weigert’s iron hematoxylin) لمدة 10 min، ثم صبغة ببيبريخ سكarlت-حمض الفوكيسين (Biebrich scarlet-acid fuchsin) لمدة 15 min، ثم حمض الفسفو-تنجستيك (phosphotungstic acid) لمدة 10 min، وأخيراً صبغة أنيلين الأزرق (aniline blue) لمدة 10 min. وفي النهاية، حفظت المقاطع في حمض الخليك بتركيز 1% لمدة 5 min، ثم جففت، ونقيت في الزيلين، ثم ثبتت على الشرائح.
تم تأكيد نجاح عملية الصبغ من خلال الصبغ النووي الواضح، والحفاظ على التباين السيتوبلازمي، وبقاء البنية الكلوية، والتصور المتميز لبنى النسيج الضام. خضعت جميع الشرائح المصبوغة للتقييم تحت ظروف معيارية باستخدام مجهر ضوئي مجهز بنظام تصوير رقمي.
أجرى طبيب مرض عام ذو خبرة تقييمات مرضية نسيجية، وكان هذا الطبيب مُعَمى عن المجموعات التجريبية. تم إجراء تسجيل الدرجات المرضية النسيجية عند تكبير 200×. وبالنسبة لكل حيوان وكل معيار مرضي نسيجي، تم فحص 10 حقول مجهرية مختارة عشوائياً. واستُخدم الحقل الذي أظهر التغير الأكثر شدة في المعيار قيد التقييم لتحديد درجة عددية واحدة للحيوان على مقياس من 0 إلى 4. تم تقييم الإصابة الأنبوبية وفقاً لتوسع الأنابيب، وتراكم المواد البروتينية في التجويف الأنبوبي، وتنكس الظهارة الأنبوبية، والنخر الأنبوبي. كما تم تقييم الإصابة الكبيبية وفقاً لتنكس الكبيبات أو ضمورها، واتساع حيز بومان، والاحتقان الوعائي. وقُيمت الإصابة الخلالية بناءً على الالتهاب التخللي والتليف. واستُخدمت مقاطع كلوية بسمك 5 ميكرومتر مصبوغة بالهيماتوكسيلين والإيوزين وبصبغة ماسون ثلاثية الألوان من كل حيوان للتقييم المرضي النسيجي. تم الحصول على صور مجهرية ممثلة عند تكبير 200×، مع أشرطة مقياس تمثل 100 µm. ولم يتسنَّ استرجاع عدد المقاطع النسيجية المنفصلة التي تم فحصها لكل حيوان من سجلات الدراسة، وبالتالي لا يمكن ذكرها.
تم تفسير نتائج صبغة ماسون ثلاثية الألوان (Masson’s trichrome) نسجياً شكلیاً، مع مراعاة موضع ونمط ترسب الكولاجين بدلاً من الاعتماد على كثافة الصبغة الزرقاء وحدها. وقد استندت درجة التليف الخلالي شبه الكمية إلى هذا التقييم النسيجي الشكلي، ولم يتم قياس النسبة المئوية للمساحة الإيجابية للكولاجين كمياً. أُجري التقييم النسيجي المرضي بشكل شبه كمي باستخدام معايير تقييم إصابة الكلى الموصوفة سابقاً16,17. خُصص لكل حيوان درجة عددية صحيحة لكل مؤشر نسيجي مرضي على مقياس من 0 إلى 4، حيث 0 = غائب، 1 = أدنى، 2 = خفيف، 3 = متوسط، و4 = شديد. ومثلت فئات التصنيف التقييم العام لأخصائي علم الأمراض (الذي أجرى الفحص بشكل تعمية) للشدة المورفولوجية لكل آفة بدلاً من القياس المورفومتري المستمر.
احتياطات السلامة وإدارة النفايات
تم استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع الميثانول، والفورمالديهايد، والزايلين، والعينات البيولوجية، والأنسجة الحيوانية. كما تم ارتداء معاطف المختبر، والقفازات، ووسائل حماية العين. ونظراً للسمية الجهازية والتطاير اللذين يتميز بهما الميثانول، فقد نُفذت جميع الإجراءات بحذر. وأُجريت العمليات التي تتضمن الفورمالديهايد والزايلين تحت غطاء سحب الأدخنة الكيميائية كلما أمكن ذلك. جُمعت الأدوات الحادة في حاويات التخلص من الأدوات الحادة المناسبة. وتم التخلص من النفايات الكيميائية والمواد البيولوجية وفقاً لإجراءات السلامة البيولوجية وإدارة النفايات الخطرة المعتمدة في المؤسسة.
التحليل الإحصائي
عُبّر عن المتغيرات الكيميائية الحيوية، والمؤشرات الحيوية لإصابة الكلى، والمتغيرات الالتهابية، ووظائف الكلى، والمتغيرات المتعلقة بالتوازن التأكسدي (redox) المستمرة على شكل المتوسط ± الانحراف المعياري (mean ± SD). تم تقييم طبيعية توزيع البيانات باستخدام اختبار Shapiro–Wilk، كما تم تقييم تجانس التباينات باستخدام اختبار Levene. أُجريت المقارنات بين المجموعات للنتائج الكيميائية الحيوية باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA). وكشفت فحوصات الافتراضات عن انحرافات عن التوزيع الطبيعي في مجموعة واحدة بالنسبة للكرياتينين في المصل، وعدم تجانس التباين لعدة نتائج كيميائية حيوية. تم الإبقاء على نهج ANOVA الأصلي؛ ومع ذلك، فإن هذه الانحرافات قد تكون قد أثرت على موثوقية قيم p-values الناتجة، ولذلك تم تفسير النتائج بحذر.
عندما تم اكتشاف فرق ذو دلالة إحصائية بواسطة تحليل التباين (ANOVA)، أُجريت مقارنات زوجية بين المجموعات باستخدام اختبار دنكان (Duncan) للمقارنات المتعددة البعدية. وكانت القيم التي تحمل نفس الحرف العلوي ضمن كل صف غير مختلفة جوهرياً وفقاً لاختبار دنكان البعدي. لم يتم تطبيق أي تعديل إضافي للتعددية عبر النتائج البيوكيميائية. لم يوفر إجراء دنكان تحكماً قوياً في معدل الخطأ من النوع الأول على مستوى العائلة، كما أدى اختبار نتائج متعددة إلى زيادة خطر ظهور نتائج إيجابية كاذبة. وبناءً على ذلك، تم تفسير المقارنات الجوهرية الفردية بحذر.
تم تقدير أحجام التأثير الإجمالية للنتائج البيوكيميائية باستخدام مربع إيتا (η2)، والتي حُسبت وفق المعادلة (F × df_between)/(F × df_between + df_error)، حيث df_between = 4 و df_error = 25. كما حُسبت فترات الثقة بنسبة 95% ذات الطرفين عن طريق عكس توزيع F غير المركزي وتحويل حدود عدم المركزية (λ) باستخدام λ/(λ + N)، حيث N = 30. وقد أُجريت هذه الحسابات التكميلية باستخدام بيئة حوسبة علمية. وقد اشتُقت التقديرات من إحصائيات F المقربة التي تم الحصول عليها من التحليل الإحصائي الأساسي، وبالتالي فهي تقديرات تقريبية. اعتمدت فترات الثقة على افتراضات التوزيع الطبيعي وتساوي التباين في نموذج ANOVA، ولم يتم تعديلها لتناسب تعدد النتائج.
كانت درجات الفحص النسيجي المرضي عبارة عن ملاحظات شبه كمية ترتيبية، وتم تلخيصها وصفياً في شكل المتوسط ± SD لإظهار متوسط عبء الآفة على مستوى المجموعة والتباين بين الحيوانات. لم يتم إجراء أي اختبارات فرضيات استنتاجية أو مقارنات زوجية لاحقة لدرجات الفحص النسيجي المرضي. وبناءً على ذلك، تم تطبيق تحليل التباين (ANOVA)، واختبار دنكان (Duncan’s post hoc test)، وتقرير قيمة p فقط على النتائج الكيميوحيوية، والمؤشرات الحيوية للإصابة الكلوية، والنتائج الالتهابية، ووظائف الكلى، والنتائج المتعلقة بالاختزال والأكسدة. واعتُبرت قيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.
النتائج
شُملت جميع الحيوانات الثلاثون في التحليلات، بواقع ستة حيوانات في كل مجموعة من المجموعات التجريبية الخمس. وقد أُخضعت جميع الحيوانات في المجموعات الخمس للإعدام الرحيم وأُخذت عيناتها في اليوم العاشر من الدراسة. بالنسبة للمجموعات الثلاث المعرضة للميثانول، يقابل هذا الطرف الزمني 48 ساعة بعد إعطاء الميثانول. وبالتالي، كانت مدة الدراسة الإجمالية وتوقيت جمع العينات متسقة عبر جميع المجموعات التجريبية. تم تقييم إصابات الكلى والعلامات الحيوية الالتهابية، ووظائف الكلى والمعالم المرتبطة بالتوازن الأكسدة-اختزال، والنتائج النسيجية المرضية كما هو موضح أدناه.
النتائج الكيميائية الحيوية: إصابة كلوية وعلامات حيوية للالتهاب
تُعرض النتائج الخاصة بإصابات الكلى والعلامات الحيوية الالتهابية المقاسة في متجانسات أنسجة الكلى في الجدول 1أشار تحليل التباين الأحادي الاتجاه إلى وجود اختلافات كبرى شاملة بين المجموعات الخمس من حيث السيستاتين C [F(4،25) = 5.329، p = 0.003]، IL-6 [F(4,25) = 3.907، p = 0.013]، KIM-1 [F(4,25) = 3.673، p = 0.017]، TNF-α [ف(4،25) = 7.660، p < 0.001]، وIL-1β [ف(4،25) = 11.584، p < 0.001]. تم إجراء المقارنات بين المجموعات بطريقة ما بعد المُعاينة باستخدام دنكان’اختبار المدى المتعدد، مع الإشارة إلى تعيينات المجموعات بواسطة أحرف مرتفعة في الجدول 1كانت مستويات السيستاتين C والإنترلوكين-6 وKIM-1 في متجانس نسيج الكلى أعلى ما يمكن في مجموعة MTX + الميثانول، في حين لم تُلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعات السيطرة، وMTX فقط، وMTX + الميثانول + فوميبيزول، وMTX + الميثانول + الإيثانول بالنسبة لهذه المتغيرات. مستويات متجانس نسيج الكلى من TNF-α وIL-1β كانت أعلى أيضًا في مجموعة MTX + الميثانول. وأظهرت مجموعة MTX فقط مستويات أعلى من TNF-α وIL-1β في مستحلبات نسيج الكلى مقارنةً بالمجموعة الضابطة، في حين أظهرت المجموعات المعالجة بالمضاد الوسيط قيماً بينية (الجدول 1).
الوظيفة الكلوية ومؤشرات مرتبطة بالتوازن الأكسدة-اختزال
تَمَّ عَرْضُ مؤشرات وظائف الكلى في المصل وعوامل الأكسدة-اختزال المشتقة من الدم في الجدول 2أشار تحليل التباين الأحادي الاتجاه إلى وجود اختلافات كبرى شاملة بين المجموعات الخمس من حيث يوريا المصل [F(4،25) = 3.694، p = 0.017]، الكرياتينين في المصل [F(4,25) = 12.988، p < 0.001]، نشاط إنزيم SOD في المصل [F(4,25) = 11.621، p < 0.001]، مستوى الجلوتاثيون في الدم [F(4,25) = 10.164، p < 0.001]، نشاط إنزيم CAT في الدم [F(4,25) = 10.631، p < 0.001]، وتركيز MDA في المصل [F(4,25) = 8.814، p < 0.001]. تم إجراء المقارنات بين المجموعات بطريقة ما بعد المُعاينة (Post hoc) باستخدام اختبار دنكان’اختبار المدى المتعدد، مع الإشارة إلى تعيينات المجموعات بواسطة أحرف مرتفعة في الجدول 2.
كانت تركيزات يوريا المصل، والكرياتينين المصل، ومالوندايالديهايد (MDA) المصل أعلى ما تكون في مجموعة MTX + الميثانول. ولم تختلف تركيزات يوريا المصل ومالوندايالديهايد (MDA) المصل بشكل كبير بين مجموعات السيطرة، وMTX فقط، وMTX + الميثانول + فوميبيزول، وMTX + الميثانول + الإيثانول، في حين كان تركيز الكرياتينين المصل أدنى في مجموعة السيطرة (الجدول 2).
أظهرت مجموعة MTX + الميثانول أيضًا أدنى نشاط لإنزيم SOD في المصل، وأدنى مستوى للـGSH في الدم، وأدنى نشاط لإنزيم CAT في الدم. مقارنةً بمجموعة MTX + الميثانول، أظهرت المجموعة المعالجة بالفوميبيزول زيادةً معنوية في نشاطي SOD في المصل وCAT في الدم، في حين لم تكن الزيادات المقابلة في المجموعة المعالجة بالإيثانول ذات دلالة إحصائية. ولم تختلف مستويات الـGSH في الدم بشكل معنوي بين مجموعة MTX فقط، ومجموعة MTX + الميثانول، والمجموعتين المعالجتين بالمضادات السمّيةالجدول 2).
بالمقارنة مع مجموعة التحكم، أظهرت مجموعة الميثوتريكسات فقط مستويات أعلى من TNF- في متجانس نسيج الكلىα وIL-1β وانخفضت نشاطة SOD في المصل، ومستوى GSH في الدم، ونشاطة CAT في الدم، ولكنها لم تختلف بشكل كبير في مستويات السيستاتين C، أو IL-6، أو KIM-1 في متجانس نسيج الكلى، أو في تركيز اليوريا في المصل، أو الكرياتينين في المصل، أو تركيز MDA في المصل.
النتائج النسيجية المرضية ودرجات إصابة الكلى
تم عرض نتائج التقييم النسيجي النسيجي لأنسجة الكلى في الجدول 3تم ملاحظة تباين وصفي بين المجموعات في توسع الأنابيب، وتراكم المواد البروتينية، وتنكس الظهارة الأنابيبية، ونخر الأنابيب، وتنكس الكبيبات، وتوسع كبسولة بومان’المساحات، احتقان وعائي، التهاب بين خلوي، وتهاب ليفي بين خلوي.
في مجموعة التحكم، حافظ النسيج الكلوي على البنية النسيجية الطبيعية، دون وجود تغيرات مرضية واضحة في التركيبات الكبيبية أو القنية. وفي مجموعة MTX، لوحظ حدوث تنكس قني خفيف، واحتقان وعائي، والتهاب بين خلايا النسيج.
أظهرت مجموعة MTX + الميثانول أعلى درجات الإصابة الملاحظة عبر المعايير المُقيَّمة للأنابيب، والكبيبات، والأوعية الدموية، والنسيج بين الصفائحي. وأظهرت كلتا مجموعتي العلاج المضاد انخفاضًا وَصفيًا في الدرجات الملاحظة مقارنةً بمجموعة MTX + الميثانول. وفي المقارنات الوصفية، أظهرت مجموعة المعالجة بفوميبيزول درجات ملاحظة أقل من مجموعة المعالجة بالإيثانول في معظم المعايير، ولا سيما توسع الأنابيب، والموت الخلوي لأنابيب الكلى، وتنكّس الكبيبات، وتوسّع كبيبة مالبيغي’المساحات، احتقان وعائي، والتهاب نسيجي ليفيالجدول 3). كانت هذه المقارنات وصفية، ولم تُجرَ أي اختبارات إحصائية استدلالية على درجات التغيرات النسيجية المرضية. تم الحصول على صور نسيجية مرضية تمثيلية لكلية باستخدام صبغة الهيماتوكسيلين واليوزين وصبغة ماسون’تُظهر صبغة تريكوم سترومًا في الشكل 2.
بشكل عام، أظهرت مجموعة MTX + الميثانول أعلى قيم لإصابة الكلى والعلامات الحيوية الالتهابية، وأقل الملامح تفضيلاً لوظيفة الكلى والتوازن الأكسدة-اختزال، بالإضافة إلى أعلى درجات تقييم الإصابة النسيجية المرضية. وقد أظهرت كلتا مجموعتي العلاج المضاد نمطاً أكثر تفضيلاً من حيث النتائج الكلوية مقارنةً بمجموعة MTX + الميثانول، مع ظهور نمط أكثر اتساقاً في التحسن في المجموعة المعالجة بالفوميبيزول عبر المجالات المُقيَّمة. كما أظهرت مجموعة MTX فقط تغيرات في بعض المعايير الالتهابية ومرتبطة بالتوازن الأكسدة-اختزال مقارنةً بمجموعة السيطرة.
توفّر البيانات:
تُقدَّم البيانات الأولية على مستوى الحيوانات والداعمة للتحاليل الكيميائية الحيوية، وعلامات إصابة الكلى، والالتهاب، ووظيفة الكلى، والتحاليل المرتبطة بالتوازن الأكسدة-اختزال في الملف التكميلي 1.
الشكل 1: تصميم التجربة وجدول العلاج الزمني تمثيل تخطيطي لنموذج الفأر التجريبي لتسمم الميثانول. تم توزيع فئران ويستار البكورة الذكور البالغة على خمس مجموعات: مجموعة التحكم، والميثوتريكسات (MTX) فقط، وMTX + ميثانول، وMTX + ميثانول + فوميبيزول، وMTX + ميثانول + إيثانول (ن = 6/مجموعة). كانت العلف الحبيبي القياسي والماء الصنبوري متاحة بحرية طوال مدة الدراسة التي استمرت 10 أيام، ولم يُفرض حرمان من الطعام أو أي قيود أخرى على الطعام أو الماء قبل أو بعد إعطاء الميثانول. لم تتلقَّ مجموعة التحكم أي علاج تجريبي. تلقت الحيوانات في المجموعات 2–5 تلقوا ميثوتريكسات عن طريق المعدة بجرعة 0.3 ملغ/كغ مرة واحدة يوميًا لمدة سبعة أيام متتالية (أيام الدراسة 1–7). الحيوانات في المجموعات 3–تلقى الحيوان رقم 5 جرعة واحدة من الميثانول بجرعة 3 غم/كغ عن طريق التغذية بالأنبوب الفموي في اليوم الثامن من الدراسة. في مجموعة MTX + الميثانول + الفوميبيزول، أُعطيت جرعة تحميلية من الفوميبيزول بجرعة 15 مغ/كغ عن طريق الحقن داخل الصفاق بعد 4 ساعات من إعطاء الميثانول، تبعتها جرعات صيانة بجرعة 10 مغ/كغ عند 12 و24 و36 ساعة. في مجموعة MTX + الميثانول + الإيثانول، أُعطِي الإيثانول بجرعة واحدة مقدارها 0.5 غم/كغ عن طريق التغذية بالأنبوب الفموي بعد 4 ساعات من إعطاء الميثانول. تم تهشيش جميع الحيوانات في اليوم العاشر من الدراسة. للمجموعات 3–5، وكان هذا النهاية بعد 48 ساعة من إعطاء الميثانول. جُمعت عينات الدم والكلى لتحليل وظيفة الكلى، وعلامات إصابة الكلى، والسيتوكينات الالتهابية، والعلامات البيولوجية المرتبطة بالتوازن الأكسدة-اختزال، والتحسس النسيجي الكلوي. الاختصارات: MTX = ميثوتريكسات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: النتائج النسيجية المرضية الممثلة في الأنسجة الكلوية من المجموعات التجريبية تُعرض مقاطع كلوية تمثيلية من مجموعات السيطرة، MTX، MTX + ميثانول، MTX + ميثانول + فوميبيزول، وMTX + ميثانول + إيثانول. الصف العلوي يعرض صبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&هـ) التلوين، في حين تعرض الصف السفلي تلوين ماسون’الصبغة الثلاثية. أظهرت مجموعة التحكم الحفاظ على بنية الكلى الطبيعية مع مظهر كبيبي ونبيبّي سليم. اعتبر التلون الأزرق للكلوريد الموجود في الأغشية القاعدية الكبيبية والنبيبّية، وجدران الأوعية الدموية، والنسيج الضام بين النبيبّات في مجموعة التحكم تلونًا فسيولوجيًا للكلوريد وليس دليلاً على التليف المرضي. أظهرت مجموعة MTX تدهورًا نبيبّيًا خفيفًا، واحتقانًا وعائيًا، وتغيرات التهابية. أظهرت مجموعة MTX + الميثانول إصابة كلوية أكثر وضوحًا، تتميز بالتدهور النبيبّي (*)، والاحتقان الوعائي (+)، واتساع كبسولة بومان’المسافة الفراغية (x)، تنخر أنبوبي (↑)، التهاب بين الخلايا (↕، وتراكم الكولاجين حول الكبيبات متسقًا مع تغير ليفي ذو طابع هيستومورفولوجي (‡)، كما لوحظ في صبغة ماسون’مقطع مصبوغ بصبغة التري كروم. أظهرت المجموعة المعالجة بالفومبيزول درجات أقل من إصابات الأنسجة المرضية مقارنةً بالمجموعة المعالجة بالميتوتريكسات والميثانول، مع تراكيب أنبوبية وكبيبية محفوظة نسبيًا، ونخر وألتهاب واحتقان وعائي وتغيرات مرتبطة بالكولاجين أقل انتشارًا. كما أظهرت المجموعة المعالجة بالإيثانول درجات أقل من الإصابات المرضية مقارنةً بالمجموعة المعالجة بالميتوتريكسات والميثانول؛ ومع ذلك، كانت التغيرات الباقية في الأنبوبية والكبيبية والأوعية أكثر وضوحًا مقارنةً بالمجموعة المعالجة بالفومبيزول. تم الحصول على الصور المجهرية عند تكبير 200× تكبير، وتمثل شرائط المقياس 100 µم. ماسون’تم تقييم صبغة التري كروم كدليل نسيجي شكلي داعم؛ ولم تُستخدم الاختلافات في شدة الصبغة الزرقاء بين الشرائح كمقياس كمي للمقارنة بين المجموعات من حيث التليف. الرموز: * تحلل أنبوبى؛ + احتقان وعائى؛ x توسع كبيبة بومان’مساحة فارغة ↑ النخر الأنبوبي؛ ↕ التهاب بين الخلايا؛ ‡ تراكم الكولاجين حول الكبيبات متسق مع تغير ليفي نسيجي شكلي. MTX، ميثوتريكسات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| متغير | التحكم (ن = 6) | MTX (ن = 6) | MTX + ميثانول (ن = 6) | MTX + ميثانول + فوميبيزول (ن = 6) | MTX + ميثانول + إيثانول (ن = 6) | p | η² (95% فاصل ثقة) |
| سيستاتين C (نا نوغرام/مليلتر) | 26.07 ± 12.05a | 32.01 ± 1.86a | 45.23 ± 10.51b | 32.49 ± 1.60a | 31.27 ± 4.60a | 0.003 | 0.460 (0.084 – 0.597) |
| IL-6 (نانوغرام/لتر) | 7.66 ± 1.38a | 8.72 ± 2.45a | 11.02 ± 0.83b | 7.96 ± 1.54a | 8.12 ± 1.77a | 0.013 | 0.385 (0.023 – 0.535) |
| KIM-1 (نانوغرام/مليلتر) | 2.21 ± 1.00a | 2.47 ± 0.24a | 3.45 ± 0.81b | 2.28 ± 0.58a | 2.32 ± 0.37a | 0.017 | 0.370 (0.013 – 0.522) |
| عامل نخر الورم-α (نا نوغرام/لتر) | 118.66 ± 22.95a | 190.51 ± 5.84b | 238.29 ± 34.68ج | 147.10 ± 24.31أب | 168.41 ± 75.41أب | <0.001 | 0.551 (0.181 – 0.668) |
| IL-1β (ناجم/مل) | 8.43 ± 0.59a | 12.53 ± 1.05ج | 15.26 ± 1.46د | 10.05 ± 2.86أب | 11.17 ± 2.37بي سي | <0.001 | 0.650 (0.316 – 0.743) |
الجدول 1: مؤشرات إصابة الكلى والعلامات الحيوية للالتهاب في المجموعات التجريبية. تُعرض البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD)، مع وجود ستة حيوانات لكل مجموعة. تم قياس جميع العلامات البيولوجية في مستحلبات أنسجة الكلى. السيستاتين C، KIM-1، والـIL-1β تُعبَّر التراكيز بوحدة نانوغرام/مليلتر؛ IL-6 وTNF-α تُعبَّر التراكيز بوحدة نانوغرام/لتر (ng/L). تم الإبلاغ p القيم مستمدة من تحليل التباين الأحادي الشامل (ANOVA) عبر المجموعات الخمس. وبعد إجراء اختبار شامل ذي دلالة إحصائية، أُجريت مقارنات لاحقة باستخدام اختبار دنكان’اختبار المدى المتعدد. ضمن كل صف، لا تختلف المجموعات التي تشترك في حرف رفيع واحد على الأقل بشكل معنوي، في حين تختلف المجموعات التي لا تشترك في أي حرف بشكل معنوي عند مستوى 0,05. لم يتم تطبيق أي تعديل إضافي على التعددية عبر العلامات البيولوجية. تم التعرف على تباين التباين بين بعض العلامات البيولوجية؛ لذلك، ينبغي تفسير نتائج تحليل التباين (ANOVA) واختبار دانكان بحذر. الاختصارات: MTX = ميثوتريكسات؛ KIM-1 = جزيء إصابة الكلى-1؛ IL-6 = إنترلوكين-6؛ TNF-α عامل نخر الورم-ألفا؛ إنترلوكين-1β = إنترلوكين-1 بيتا؛ SD = الانحراف المعياري؛ ANOVA = تحليل التباين؛ CI = الفاصل الثقة. η2 يمثل الحجم التأثيري الكلي عبر المجموعات الخمس. تعتمد فترات الثقة الثنائية الاتجاه 95% على النموذج، وتفترض أن الأخطاء تتبع توزيعًا طبيعيًا وتتساوى تبايناتها، ولا يتم تعديلها لمراعاة النتائج المتعددة. لذلك، ينبغي تفسير فترات الثقة بحذر في الحالات التي تُنتهك فيها هذه الافتراضات.
| متغير | التحكم | MTX | MTX + ميثانول | MTX + ميثانول + فوميبيزول | MTX + ميثانول + إيثانول | p | η² (95% فاصل ثقة) |
| اليوريا في المصل (ملغ/دل) | 39.64 ± 13.69a | 46.88 ± 9.49a | 98.75 ± 59.24b | 48.03 ± 19.64a | 60.44 ± 18.53a | 0.017 | 0.371 (0.014–0.523) |
| الكرياتينين في المصل (ملغ/دل) | 0.50 ± 0.10a | 0.54 ± 0.05أب | 0.72 ± 0.03ج | 0.54 ± 0.03أب | 0.60 ± 0.05b | <0.001 | 0.675 (0.356–0.762) |
| نشاط إنزيم سوبر أوكسيد ديسموتاز في المصل (وحدة/مللتر) | 470.40 ± 40.49د | 371.16 ± 17.64ج | 219.29 ± 85.06a | 319.38 ± 107.20ب.س | 256.22 ± 67.89أب | <0.001 | 0.650 (0.317–0.743) |
| الغلوتاثيون في الدم (ملليمول/لتر) | 58.74 ± 31.90b | 26.36 ± 5.92a | 11.10 ± 3.73a | 19.56 ± 1.66a | 13.66 ± 5.32a | <0.001 | 0.619 (0.272–0.720) |
| النشاط الإنزيمي لإنزيم الكاتاليز (وحدة/مللتر) | 220.82 ± 74.08ج | 160.88 ± 55.18b | 68.90 ± 13.41a | 129.45 ± 7.49b | 110.14 ± 20.18أب | <0.001 | 0.630 (0.287–0.728) |
| مدا في المصل (نانومول/مل) | 13.17 ± 2.03a | 17.29 ± 6.36a | 31.83 ± 9.94b | 17.93 ± 2.04a | 19.34 ± 4.65a | <0.001 | 0.585 (0.225–0.694) |
الجدول 2: وظائف الكلى والمعالم المرتبطة بالتوازن الأكسدة-اختزال في المجموعات التجريبية. تُعرض البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD)، مع وجود ستة حيوانات لكل مجموعة. تم قياس يوريا المصل، وكرياتينين المصل، ونشاط سوبر أوكسيد ديسموتاز (SOD)، وتركيز مالوندايلديهايد (MDA) في المصل، في حين تم قياس مستوى الجلوتاثيون المختزل (GSH) ونشاط الكاتالاز (CAT) في الدم المُعاصر بحمض الإيثيلين دي أمين تيترا خلّي (EDTA). ويُعبّر عن تركيزات يوريا المصل والكرياتينين بوحدة ملليغرام/ديسيلتر (mg/dL)، ونشاط SOD وCAT بوحدة وحدة/مل (U/mL)، ومستويات GSH بوحدة مليمول/لتر (mmol/L)، وتركيزات MDA بوحدة نانومول/مل (nmol/mL). تم الإبلاغ p القيم مستمدة من تحليل التباين الأحادي الشامل (ANOVA) عبر المجموعات الخمس. وبعد إجراء اختبار شامل ذي دلالة إحصائية، أُجريت مقارنات لاحقة باستخدام اختبار دنكان’اختبار مدى متعدد. ضمن كل صف، لا تختلف المجموعات التي تشترك في حرف رفيع واحد على الأقل بشكل معنوي، في حين تختلف المجموعات التي لا تشترك في أي حرف بشكل معنوي عند مستوى 0.05. لم يتم تطبيق أي تعديل إضافي على التعدد عبر العلامات البيولوجية. تم التعرف على تباين التباين لبعض النتائج؛ لذلك، ينبغي تفسير نتائج تحليل التباين (ANOVA) واختبار دانكان بحذر. العلامات البيولوجية المرتبطة بالتوازن الأكسدة-الاختزال مؤشرات غير مباشرة ولا تمثل قياسات مباشرة لوظيفة الميتوكوندريا أو الآليات الجزيئية للإصابة. η2 يمثل الحجم التأثري الكلي عبر المجموعات الخمس. تعتمد فترات الثقة 95% ثنائية الاتجاه على النموذج، وتفترض أن الأخطاء تتوزع توزيعًا طبيعيًا وبتباينات متساوية، ولا يتم تعديلها بالنسبة للنتائج المتعددة. لذلك، ينبغي تفسير فترات الثقة بحذر في الحالات التي تُنتهك فيها هذه الافتراضات. الاختصارات: MTX = ميثوتريكسات؛ SOD = سوبر أكسيد ديسموتاز؛ GSH = جلوتاثيون مختزل؛ CAT = كاتالاز؛ MDA = مالون داي ألديهايد؛ EDTA = إيثيلين دي أمين تيترا خلّي؛ SD = الانحراف المعياري؛ ANOVA = تحليل التباين؛ CI = فاصل الثقة.
| متغير | التحكم | MTX | MTX + ميثانول | MTX + ميثانول + فوميبيزول | MTX + ميثانول + إيثانول |
| توسع أنبوبي | 0.16 ± 0.40 | 1.50 ± 0.54 | 3.50 ± 0.54 | 0.83 ± 0.40 | 1.66 ± 0.51 |
| تَراكم المواد البروتينية | 0.00 ± 0.00 | 1.33 ± 0.51 | 3.16 ± 0.40 | 0.66 ± 0.51 | 1.33 ± 0.51 |
| تنكس الظهارة الأنبوبية | 0.16 ± 0.40 | 1.83 ± 0.40 | 3.83 ± 0.40 | 1.00 ± 0.00 | 2.00 ± 0.00 |
| النخر الأنبوبي | 0.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 | 3.33 ± 0.51 | 0.83 ± 0.40 | 1.33 ± 0.51 |
| تنكس كبيبي | 0.16 ± 0.40 | 1.33 ± 0.51 | 3.33 ± 0.51 | 1.00 ± 0.00 | 1.66 ± 0.51 |
| بوومان'توسع الفراغ | 0.00 ± 0.00 | 1.16 ± 0.40 | 3.00 ± 0.00 | 0.83 ± 0.40 | 1.66 ± 0.51 |
| احتقان وعائي | 0.00 ± 0.00 | 1.33 ± 0.51 | 3.16 ± 0.40 | 0.83 ± 0.40 | 1.66 ± 0.51 |
| التهاب بين خلوي | 0.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 | 3.00 ± 0.63 | 0.83 ± 0.40 | 1.16 ± 0.40 |
| التليف الخلالي | 0.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 | 2.83 ± 0.40 | 0.66 ± 0.51 | 1.16 ± 0.40 |
الجدول 3: الدرجات الوصفية للتحاليل النسيجية المرضية في المجموعات التجريبية. تُعرض البيانات بشكل وصفي على هيئة المتوسط ± الانحراف المعياري (SD)، مع وجود ستة حيوانات لكل مجموعة. تم الحصول على درجات التغيرات النسيجية المرضية من مقاطع الكلى الملونة بهيماتوكسيلين وإيوزين (H&هـ) ومسون’تري كروما؛ والنتائج لا بُعدية. تم تعيين نتيجة صحيحة واحدة لكل حيوان بالنسبة لكل معلمة نسيجية مرضية على مقياس من 0–4، حيث 0 = غير موجود، 1 = ضعيف جدًا، 2 = خفيف، 3 = متوسط، و4 = شديد. تمثل القيم العشرية الواردة في الجدول المتوسطات الحسابية للنقاط الصحيحة الفردية التي تم الحصول عليها من الحيوانات الستة في كل مجموعة تجريبية، ولا تمثل نقاطًا مخصصة لحيوان فردي أو نظام تقييم مستمر. تمثل الانحرافات المعيارية التباين بين الحيوانات داخل كل مجموعة. لم يتم إجراء أي اختبارات إحصائية استدلالية أو مقارنات زوجية لاحقة (post hoc) على درجات التقييم النسيجي؛ وبالتالي، ينبغي تفسير الأنماط الملاحظة بين المجموعات بشكل وصفي بدلًا من اعتبارها فروقًا ذات دلالة إحصائية. تضمن التقييم النسيجي التضخم الأنبوبي، تراكم المواد البروتينية، التنكس الظهاري الأنبوبي، النخر الأنبوبي، التنكس الكبيبي، وتوسع كبسولة بومان’المساحات، احتقان وعائي، التهاب بين خلوي، وتهاب ليفي بين خلوي.
الملف التكميلي 1: البيانات الأولية التي تدعم التحاليل الكيميائية الحيويةتحتوي هذه المصنفة على القيم الأولية على مستوى الحيوان التي استُخدمت في التحليلات الكيميائية الحيوية، وعلامات إصابة الكلى، والالتهاب، والتحليلات المرتبطة بالتوازن الأكسدة-اختزال، المذكورة في المخطوطة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
المناقشة
كانت النتيجة الرئيسية لهذه الدراسة هي أن مجموعة MTX + Methanol أظهرت الملف الأكثر سوءاً من حيث الإصابة الكلوية عبر النتائج الوظيفية، والالتهابية، والمتعلقة بالأكسدة والاختزال، والنتائج الهيستوباثولوجية. سجلت هذه المجموعة أعلى قيم لـ serum urea و serum creatinine و renal cystatin C و KIM-1 و TNF-α و IL-6 و IL-1β و MDA، وأدنى مستويات لنشاط SOD و GSH و نشاط CAT، إلى جانب أعلى درجات الإصابة الهيستوباثولوجية الملاحظة. وأظهرت كلتا المجموعتين المعالجتين بالترياق أنماط نتائج كلوية أكثر إيجابية من مجموعة MTX + Methanol، حيث أظهرت المجموعة المعالجة بـ fomepizole نمطاً أكثر إيجابية واتساقاً عبر المجالات التي تم تقييمها. ومع ذلك، تم الحصول على هذه النتائج في نموذج جرذان معالجة مسبقاً بـ MTX بشكل حاد باستخدام أنظمة ترياق غير متكافئة: إدارة fomepizole المتكررة عن طريق الصفاق مقابل جرعة فموية واحدة من ethanol. تحد هذه الاختلافات في طريق الإعطاء وتكرار الجرعات من المقارنة المباشرة لفعالية الحماية الكلوية، ولا تثبت أنماط النتائج الملاحظة تفوق fomepizole على ethanol. أظهرت مجموعة MTX وحدها مستويات أعلى من TNF-α و IL-1β ونشاطاً أقل لـ SOD و GSH و CAT مقارنة بمجموعة Control، بينما ظلت مستويات renal cystatin C و IL-6 و KIM-1 و serum urea و serum creatinine و MDA متقاربة إحصائياً بين المجموعتين. يشير هذا النمط إلى أن المعالجة المسبقة بـ MTX ساهمت في تشكيل الملف الالتهابي والمتعلق بالأكسدة والاختزال الأساسي. وبناءً على ذلك، فإن التغيرات الإضافية الملاحظة في مجموعة MTX + Methanol حدثت على خلفية معالجة مسبقة بـ MTX ولا يمكن عزوها إلى methanol وحده. وبما أنه لم يتم تضمين مجموعة methanol وحدها، تعذر الفصل التام بين المساهمة المستقلة لـ methanol والتفاعلات المحتملة بين MTX و methanol.
بناءً على علم سموم الميثانول الراسخ، يمثل تراكم النواتج الأيضية السامة مساهماً محتملاً في حدوث الإصابة الكلوية. يُستقلب الميثانول بشكل أساسي في الكبد بواسطة إنزيم ADH إلى فورمالدهيد، ثم لاحقاً إلى حمض الفورميك1,3,18,19,20. وبناءً عليه، يمكن أن تكون الكلية قد تأثرت بشكل أساسي بالفورمات المنتشر في الدورة الدموية والاضطرابات الأيضية الجهازية الناتجة عن ذلك، بدلاً من تأثرها بعمليات استقلاب الميثانول الموضعية الواسعة. ومع ذلك، لا يمكن استبعاد مساهمة استقلاب الكحول أو الألدهيد في الأنسجة الكلوية، حيث لم يتم قياس تركيزات الميثانول والفورمالدهيد والفورمات، ولا نشاط إنزيم ADH الكلوي. يثبط حمض الفورميك إنزيم cytochrome c oxidase الميتوكوندري، مما يؤدي إلى ضعف الفسفرة التأكسدية، وتقليل إنتاج ATP، وتحفيز نقص الأكسجة السمي النسيجي؛ وقد تؤدي هذه العملية في النهاية إلى الحماض اللبني، وزيادة توليد أنواع الأكسجين التفاعلية، وتلف الأغشية1,2,3,19,20. وبالمقارنة مع الكبد، الذي يعد الموقع الرئيسي لاستقلاب الميثانول، قد تكون الكلية أكثر عرضة للتأثيرات اللاحقة للفورمات والاضطرابات الأيضية الجهازية. تمتلك الخلايا الظهارية للأنابيب القريبة احتياجات عالية من الطاقة، وتكون عرضة بشكل خاص للاختلال الوظيفي في الميتوكوندريا، والإجهاد التأكسدي، وضعف الدورة الدموية الدقيقة. وبالتالي، قد يساهم نقص الأكسجة المتوسط بالفورمات، والحماض الأيضي، والالتهاب في حدوث الإصابة الكلوية2,8,9,21,22,23. وقد أشارت الدراسات السريرية التي أظهرت ارتباطات بين الإصابة الكلوية الحادة والحماض الأيضي، والفشل التنفسي، وانحلال العضلات المخططة، وتسمم الدم، وقصور وظائف أعضاء متعددة، إلى أن الإصابة الكلوية قد تعكس العبء السمي الجهازي8,9,10,21. ومثّل الأكسدة المعتمدة على الفولات للفورمات في الجرذان، والتي تكون أسرع منها في البشر، قصوراً هاماً في النماذج التجريبية1,11,12. وبناءً على ذلك، استُخدم العلاج المسبق بالميثوتريكسات لتقليل تصفية الفورمات وزيادة القابلية للتسمم بالميثانول، بدلاً من إعادة إنتاج السمات السريرية والأيضية الكاملة للتسمم بالميثانول لدى البشر.
تم إثبات حدوث خلل في وظائف الكلى من خلال التقييم المشترك للمعايير الكيميائية الحيوية التقليدية والمؤشرات الحيوية لإصابة الكلى. وقد دعمت التركيزات المرتفعة من اليوريا والكرياتينين في المصل في مجموعة MTX + Methanol وجود ضعف في الترشيح الكلوي والقدرة الإفرازية. كما أشارت زيادة مستويات cystatin C وKIM-1 في الكلى إلى أن إصابة النبيبات صاحبت الضعف الوظيفي. ونظراً لارتباط KIM-1 بإصابة النبيبات القريبة، فإن هذه الزيادة تتفق مع تنكس الظهارة النبيبية، وتوسعها، ونخرها24,25. كما دعمت زيادة مستويات cystatin C وجود ضعف في وظائف الكلى26,27. وأشارت المستويات المنخفضة من هذه المؤشرات الحيوية في المجموعات المعالجة بـ fomepizole والإيثانول إلى تخفيف إصابة الكلى، مع ملاحظة نمط أكثر اتساقاً في المجموعة المعالجة بـ fomepizole. وكان نمط المؤشرات الحيوية المرتبطة بـ redox متسقاً مع كون الإجهاد التأكسدي مساهماً محتملاً في إصابة الكلى بدلاً من كونه دليلاً على آلية مؤكدة. ويُستخدم MDA عادةً كمؤشر لبيروكسيد الدهون، بينما يساهم GSH في الحفاظ على التوازن التأكسدي الخلوي28,29. وفي النماذج التجريبية للتسمم بالميثانول واعتلال العصب البصري المرتبط بالميثانول، ارتبط الإجهاد التأكسدي وبيروكسيد الدهون وانخفاض القدرة المضادة للأكسدة أيضاً بإصابة الأنسجة10,15,20. وكان انخفاض نشاط SOD في المصل، وارتفاع تركيزات MDA في المصل، وانخفاض مستويات GSH في الدم ونشاط CAT في مجموعة MTX + Methanol متسقاً مع انخفاض القدرة المضادة للأكسدة وزيادة بيروكسيد الدهون؛ ومع ذلك، لم تحدد هذه القياسات آلية ميتوكوندرية أو جزيئية كامنة. وكانت تركيزات MDA المنخفضة في المصل والاستعادة الجزئية لنشاط SOD في المصل ونشاط CAT في الدم في المجموعات المعالجة بالترياق متوافقة مع ملف مؤشرات حيوية مرتبط بـ redox أكثر إيجابية، مع ملاحظة نمط إيجابي أكثر اتساقاً في المجموعة المعالجة بـ fomepizole.
كانت القيم المرتفعة لـ TNF-α وIL-6 وIL-1β في مجموعة MTX + Methanol متوافقة مع نمط كلوي محفز للالتهاب. وبما أن هذه السيتوكينات لم تكن خاصة بمسار معين، وكان MTX نفسه مرتبطاً بتغيرات في علامات التهابية مختارة، فإن النتائج دعمت الالتهاب كعامل مساهم محتمل بدلاً من كونه آلية مؤكدة للإصابة الكلوية. وقد يوفر الخلل الوظيفي الميتوكوندري الناجم عن حمض الفورميك، ونقص الأكسجة الخلوية، والإجهاد التأكسدي أساساً لتنشيط المسارات الالتهابية؛ وبالتالي، قد يتطور الإجهاد التأكسدي والالتهاب كعمليات يعزز كل منهما الآخر في تسمم الميثانول1,2,3,15. وقد أفادت النماذج التجريبية للتسمم بالميثانول بوجود ارتباطات بين التعرض للميثانول وتسلل الخلايا الالتهابية، والتلف الهيستوباثولوجي، وزيادة مستويات العلامات المحفزة للالتهاب مثل IL-1β وTNF-α13,15. وكانت هذه النتائج متوافقة مع زيادة مستويات السيتوكينات المحفزة للالتهاب وارتفاع درجات الالتهاب الخلالي، والتنكس النبيبي، والنخر النبيبي الملاحظة في مجموعة MTX + Methanol. وبشكل جماعي، كانت النتائج متوافقة مع عملية متعددة العوامل تشمل تأثيرات النواتج الأيضية السامة، والإجهاد التأكسدي، والالتهاب، وضعف الدورة الدموية الدقيقة، والعبء السمي الجهازي؛ ومع ذلك، لم يتم تقييم هذه المسارات بشكل مباشر. وأشارت المستويات المنخفضة من TNF-α وIL-6 وIL-1β في المجموعات المعالجة بالترياق إلى أن تثبيط تكوين النواتج الأيضية السامة قد يكون قد حد أيضاً من الاستجابة الالتهابية. وقد قدمت النتائج الهيستوباثولوجية ارتباطات على مستوى الأنسجة للإصابة الكلوية، حيث أظهرت مجموعة MTX + Methanol أعلى درجات الإصابة الملاحظة عبر المعايير النبيبية والكبيبية والوعائية والخلالية. وأظهرت كلتا المجموعتين المعالجتين بالترياق درجات إصابة هيستوباثولوجية أقل وصفياً، كما أظهرت المجموعة المعالجة بـ fomepizole درجات أقل وصفياً من المجموعة المعالجة بالإيثانول في معظم المعايير. ومع ذلك، وبسبب عدم إجراء اختبارات إحصائية استدلالية على الدرجات الهيستوباثولوجية، فإن هذه الملاحظات لم تثبت حماية هيستوباثولوجية ذات دلالة إحصائية أو تفوقاً لأي من الترياقين16,17.
تعتمد التأثيرات المضادة للسموم لكل من الإيثانول والفومبيزول في حالات التسمم بالميثانول على تثبيط عملية التمثيل الغذائي التي يتوسطها إنزيم alcohol dehydrogenase، مما يقلل من تكوين الفورمالديهايد وحمض الفورميك. يعمل الإيثانول كركيزة تنافسية، بينما يعمل الفومبيزول كمثبط مباشر وقوي لإنزيم alcohol dehydrogenase1,3,4,6,7,30,31,32. وتتوافق أنماط النتائج الكلوية الأكثر إيجابية التي لوحظت في كلتا المجموعتين المعالجتين بمضادات السموم مع التأثيرات المتوقعة لتثبيط إنزيم alcohol dehydrogenase. ومع ذلك، لا تثبت الأدبيات الحالية تفوقاً سريرياً حاسماً للفومبيزول على الإيثانول. ورغم أن الفومبيزول غالباً ما يكون مفضلاً بسبب سهولة تحديد الجرعات، والحركية الدوائية المتوقعة، وانخفاض معدل الآثار الجانبية، إلا أن الإيثانول يظل بديلاً فعالاً1,3,4,6,7,30,32. وفي بيانات التسمم الجماعي بالميثانول التي أوردها Zakharov وآخرون، لم يُلاحظ فرق واضح بين مضادي السموم من حيث معدل الوفيات، أو مدة الرعاية المركزة، أو الحاجة إلى غسيل الكلى؛ ولذلك، فإن التفسيرات المتعلقة بالتفوق السريري تتطلب الحذر5. ولم يتم تحديد فروق مباشرة ذات دلالة إحصائية بين المجموعات المعالجة بالفومبيزول والإيثانول فيما يخص النتائج البيوكيميائية باستخدام اختبار Duncan’s post hoc. علاوة على ذلك، تم إعطاء الفومبيزول في جرعات متكررة، بينما تم إعطاء الإيثانول كجرعة واحدة. كما لم تكن الأنظمة العلاجية متطابقة من حيث طريقة الإعطاء، أو تكرار الجرعات، أو التعرض الجهازي. وبناءً على ذلك، فإن النمط الأكثر إيجابية من الناحية الوصفية المرتبط بالفومبيزول قد يكون انعكاساً للاختلافات في جدول الجرعات، أو طريقة الإعطاء، أو التعرض للدواء، بالإضافة إلى الاختلافات بين عوامل مضادات السموم، ولم يثبت ذلك فعالية بيوكيميائية أكبر، أو تفوقاً سريرياً، أو تفضيلاً علاجياً سريرياً5,6,30,32. وتمثلت إحدى نقاط القوة الرئيسية في هذه الدراسة في التقييم المتكامل لليوريا والكرياتينين في المصل، والسيستاتين C، وKIM-1، والسيتوكينات المحفزة للالتهابات، والمؤشرات الحيوية المرتبطة بالأكسدة والاختزال، ودرجات الفحص الهيستوباثولوجي عبر المجالات الوظيفية والأنبوبية والالتهابية والمتعلقة بالأكسدة والاختزال والمجالات الهيكلية المتكاملة. وقد يوفر هذا النموذج الذي يركز على الإصابة الكلوية إطاراً قبل سريري مفيداً لتقييم أنظمة مضادات السموم، والتدخلات المساعدة لحماية الكلى، والمؤشرات الحيوية للإصابة الكلوية في ظل ظروف انخفاض تصفية الفورمات المعتمدة على الفولات8,9,10,21.
أثرت عدة قيود على تفسير النتائج. فقد كان تعميم النتائج بشكل مباشر على حالات التسمم السريري بالميثانول محدوداً بسبب نموذج الحيوان التجريبي والاختلافات الأيضية بين الأنواع. وقد يؤثر الميثوتركسيت بشكل مستقل على النتائج الكلوية والالتهابية والأكسدية33، كما أن غياب مجموعة تعرضت للميثانول وحده حال دون الفصل التام بين آثار الميثانول والتفاعلات المحتملة بين MTX والميثانول. ولم يتم قياس تركيزات الميثانول، والفورمالديهايد، والفورمات، والإيثانول، والفوميبيزول في المصل أو الأنسجة، كما لم يتم تقييم نشاط ADH في الجزء السيتوزولي الكلوي الخام؛ وبناءً على ذلك، تعذر التحقق بشكل مباشر من التحسس الأيضي، وتكون النواتج الأيضية السامة، والتعرض للترياق، وتثبيط استقلاب الميثانول، كما تعذر إجراء تحليلات الارتباط مع النتائج الكيميائية الحيوية الكلوية. بالإضافة إلى ذلك، لم يتم قياس متغيرات التوازن الحمضي القاعدي، بما في ذلك pH، والبيكربونات، وفائض القاعدة، وفجوة الأنيونات. وسمحت فترة المتابعة التي استمرت 48 h بتقييم النتائج الكلوية الحادة فقط، ولم تحدد مدى التعافي الكلوي، أو استمرارية الإصابة أو قابليتها للعكس، أو التغيرات الهيكلية المزمنة. كما تم تقييم صبغة ماسون ثلاثية الألوان (Masson’s trichrome) نسيجياً دون قياس كمي للمساحة الإيجابية للكولاجين، ولم يتم تقييم مؤشرات التليف الجزيئية أو الكيميائية الحيوية، بما في ذلك تعبير α-smooth muscle actin، ومحتوى الكولاجين، وتركيز 4-hydroxyproline. وحال قيام عالم أمراض واحد (أعمى) بالتقييم الهيستوباثولوجي دون إمكانية تقييم التوافق بين المراقبين، وظل تصنيف الآفات شبه الكمي عرضة للتصنيف المعتمد على المراقب. كما كانت أنظمة إعطاء الترياق غير متكافئة من الناحية الفارماكولوجية؛ ولم يتم تطبيع تركيزات ELISA في الأنسجة الكلوية بالنسبة لتركيز البروتين الكلي؛ ولم تُجرَ تحليلات جزيئية لوظيفة الميتوكوندريا ومسارات موت الخلايا؛ وكان حجم العينة محدوداً؛ كما شملت الدراسة ذكور الجرذان فقط. يجب أن تتضمن الدراسات المستقبلية مجموعات تعرضت للميثانول وحده ولـ MTX وحده، وأنظمة ترياق قابلة للمقارنة، وقياسات متسلسلة لتركيزات الميثانول والفورمات والترياق، ونشاط ADH الكلوي، وقياسات التوازن الحمضي القاعدي، وتقييماً كمياً للتليف، وفترة متابعة أطول، وتحققاً سريرياً مصمماً بشكل مناسب. وفي الختام، ارتبط التعرض للميثانول في نموذج الجرذان المعالجة مسبقاً بالميثوتركسيت بضعف الوظيفة الكلوية، وزيادة المؤشرات الحيوية للإصابة الكلوية والالتهاب، وملف غير ملائم يتعلق بالتوازن الاختزالي الأكسدي، وإصابة هيستوباثولوجية. وأظهرت كلتا المجموعتين المعالجتين بالترياق أنماط نتائج كلوية أكثر ملائمة من مجموعة MTX + Methanol. وأظهر الفوميبيزول نمطاً وصفياً أكثر ملائمة واتساقاً عبر المجالات التي تم تقييمها؛ ومع ذلك، فإن غياب الفروق الكيميائية الحيوية المباشرة ذات الدلالة بين مجموعات الترياق، والطبيعة الوصفية للمقارنات الهيستوباثولوجية، وعدم تكافؤ أنظمة الترياق، وغياب قياسات الحركية السمية، حال دون استخلاص استنتاجات بشأن تفوقه على الإيثانول. تقتصر هذه النتائج على نموذج الجرذان المعالجة مسبقاً بالميثوتركسيت، ولا تحدد الآثار الكلوية لأي من الترياقين بعد التعرض للميثانول دون علاج مسبق بالميثوتركسيت أو في حالات التسمم بالميثانول لدى البشر. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات التي تتضمن قياسات مباشرة للحركية السمية، وتقييمات ميكانيكية، وأنظمة جرعات ترياق قابلة للمقارنة، ومتابعة أطول لتقييم مدى تكرار هذه النتائج وقابلية تطبيقها على نطاق أوسع.
الإفصاحات
يصرح المؤلفون بعدم وجود أي تضارب في المصالح. وأثناء إعداد هذه المخطوطة، تم استخدام الأدوات المساعدة بالذكاء الاصطناعي حصرياً لتحرير اللغة وتصحيح القواعد النحوية. ولم تُستخدم أي أدوات ذكاء اصطناعي لتوليد البيانات أو تحليلها أو تفسيرها، ولا لإنشاء أي أشكال أو جداول أو عناصر رسومية. ويتحمل المؤلفون المسؤولية الكاملة عن محتوى المخطوطة.
شكر وتقدير
تم دعم هذه الدراسة من قبل وحدة تنسيق مشاريع البحث العلمي في جامعة Kırşehir Ahi Evran (مشروع رقم: TIP.A3.26.011). ولم يكن لجهة التمويل أي دور في تصميم الدراسة، أو جمع البيانات، أو تحليل البيانات، أو تفسير البيانات، أو كتابة المخطوطة.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| فورمالين منظم متعادل بنسبة 10% | Merck | غير مسجل | تثبيت الأنسجة للمعالجة الهيستوباثولوجية. |
| إيثانول مطلق (≥99.8%) | Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكية | لم يتم تسجيله | يُخفف بالماء المقطر المعقم للحصول على محلول نهائي بتركيز 20% (حجم/حجم)؛ ويُعطى كجرعة واحدة عن طريق التغذية القسرية الفموية بمقدار 0.5 جم/كجم بعد 4 ساعات من إعطاء الميثانول. |
| جهاز طرد مركزي مكتبي | نüve | NF048 | تحضير العينات والطرد المركزي. |
| جسم مضاد مقترن بالبيوتين | مكونات مجموعة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) من BT Lab | مرفق في الطقم | الجسم المضاد للكشف |
| طقم تحليل الكاتالاز (CAT) | Otto Scientific | أوتو 3051 | القياس اللوني لنشاط إنزيم الكاتالاز (CAT) في الدم المانع للتجلط بـ EDTA. |
| مزيج مثبطات البروتياز الشامل الصغير الخالي من EDTA | Roche / Sigma-Aldrich | 11836170001 | تُضاف إلى محلول التجانُس أثناء تحضير متجانسات أنسجة الكلى لتحليلات مقايسة الممتص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). |
| طقم فحص الكرياتينين | Otto Scientific | OttoBC139 | تقييم مستويات الكرياتينين في المصل. |
| المجانس الرقمي | Daihan Scientific | HG-15D | تجانس الأنسجة |
| جهاز غسل الشرائط الآلي ELx50 Auto Strip Washer | Bio-Tek Instruments، الولايات المتحدة الأمريكية | ELx50 | غسل مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) |
| قارئ الأطباق الدقيقة ELx800 | Bio-Tek Instruments، الولايات المتحدة الأمريكية | ELx800 | قياس الامتصاصية لمقايسات ELISA والمقايسات اللونية؛ تم قياس امتصاصية ELISA عند 450 نانومتر. |
| إيوسين Y (مائل للاصفرار) | Merck | 1.15935.0025 | التصبيغ الهيستوباثولوجي |
| فومبيزول (4-ميثيل بيرازول) | هـüيبدو أن النص الذي قدمته غير مكتمل أو يتكون من رمز فقط ("sn"). يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي الكامل الذي ترغب في ترجمته لكي أتمكن من تحويله إلى اللغة العربية بدقة واحترافية وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المطلوبة.ü أرسان <نص بديل للصورة="المعادلة 1" يرجى تزويدي بالنص المصدر (src) لكي أتمكن من ترجمته إلى اللغة العربية وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة."/files/ftp_upload/73284/73284eq1.jpg" النمط="الهامش: تلقائي؛"/> أ.<نص بديل للصورة="المعادلة 2" يرجى تزويدي بالنص المصدر (src) الذي ترغب في ترجمته، وسأقوم فوراً بنقله إلى اللغة العربية وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية الدقيقة المذكورة في التعليمات."/files/ftp_upload/73284/73284eq2.jpg" النمط="الهامش: تلقائي؛"/>.، أنقرة، تüتركيا | لم يتم تسجيله | تُحضّر في محلول كلوريد الصوديوم المعقم بتركيز 0.9% ليصل التركيز النهائي إلى 10 مجم/مل؛ وتُعطى عن طريق الحقن داخل الصفاق كجرعة تحميل مقدارها 15 مجم/كجم بعد 4 ساعات من إعطاء الميثانول، تليها جرعات صيانة مقدارها 10 مجم/كجم بعد 12 و24 و36 ساعة من إعطاء الميثانول. |
| طقم قياس GSH (الجلوتاثيون) | أوتو ساينتيفيك (Otto Scientific) | أوتو 3053 | القياس اللوني لمستويات الجلوتاثيون المختزل (GSH) في الدم المانع للتجلط بـ EDTA. |
| محلول هيماتوكسيلين هاريس | مختبر السلامة البيولوجية (BSLAB) | BS-002 | التصبيغ الهيستوباثولوجي |
| حمض الهيدروكلوريك (HCl) | Merck | 7647-01-0 | ضبط الأس الهيدروجيني (pH) |
| IBM SPSS Statistics | IBM Corp. | IBM SPSS Statistics الإصدار 29.0 | التحليل الإحصائي؛ RRID:SCR_016479. |
| هيدروكلوريد الكيتامين (Ketalar) | Pfizer، الولايات المتحدة الأمريكية | لم يتم تسجيله | تخدير عام قبل جمع عينات الدم وأنسجة الكلى. |
| المجهر الضوئي | Nikon Eclipse | ني-يو | الفحص الهيستوباثولوجي |
| طقم صبغ ماسون ثلاثي الألوان (Masson's Trichrome Staining Kit) | MOSLAB (Medical Olympus Sanayi Tic. Ltd. <نص بديل للصورة="المعادلة ٢" يرجى تقديم النص المصدر لترجمته."/files/ftp_upload/73284/73284eq2.jpg" النمط="هامش: تلقائي؛"/>العنوان، Tüتركيا) | BKMTO001 | التصبيغ الهيستوباثولوجي |
| طقم فحص المالونديلديهيد (MDA) | أوتو ساينتيفيك (Otto Scientific) | أوتو 1001 | القياس اللوني لمستويات المالونديالدهيد (MDA) في المصل كمؤشر على بيروكسيد الدهون. |
| ميثانول (≥99.8%) | Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكية | 322415 | يتم إعطاؤه عن طريق الفم (3 جم/كجم) لاستحثاث التسمم الميثانولي التجريبي. |
| ميثوتريكسيت (Emthexate 500 ملغ/5 مل) | Teva Pharma Belgium | لم يتم تسجيله | يتم تخفيف تركيبة تجارية بتركيز 100 ملجم/مل باستخدام محلول كلوريد الصوديوم المعقم بتركيز 0.9% للحصول على تركيز عمل نهائي قدره 0.06 ملجم/مل؛ وتُعطى عن طريق التزقيم الفموي بجرعة 5 مل/كجم، وهو ما يعادل 0.3 ملجم/كجم، مرة واحدة يومياً لمدة 7 أيام متتالية. |
| محلل الكيمياء من Mindray | Mindray | BS-400 | قياس اليوريا والكرياتينين في المصل. |
| شمع البارافين، بدرجة نسيجية | لم يتم تسجيله | غير مسجل | طمر الأنسجة. |
| المحلول الملحي الموقوف بالفوسفات (PBS) | Merck | P4417 | شطف/غسل الأنسجة |
| طقم مقايسة الممتز المائي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لبروتين Cystatin-C في الجرذان | مختبر BT، الصين | E0145Ra | تقدير مستويات سيستاتين C في متجانسات أنسجة الكلى؛ الحساسية التحليلية، 0.25 نانوغرام/مل؛ نطاق الكشف، 0.5–١٠٠ نانوغرام/مل. |
| إنترلوكين-1 للجرذان (Rat IL-1)β طقم مقايسة الممتز المتربط بالإنزيم (ELISA Kit) | مختبر BT، الصين | E0119Ra | تقدير كمية IL-1β المستويات في متجانسات أنسجة الكلية؛ الحساسية التحليلية، 0.08 نانوجرام/مل؛ نطاق الكشف، 0.2–60 نانوجرام/مل. |
| طقم مقايسة الممتز المائي الإنزيمي (ELISA) لـ IL-6 في الجرذان | مختبر BT، الصين | E0135Ra | تحديد كمية مستويات IL-6 في متجانسات أنسجة الكلى؛ الحساسية التحليلية، 0.052 نانوغرام/لتر؛ نطاق الكشف، 0.1–٤٠ نانوغرام/لتر. |
| طقم مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لبروتين KIM-1 في الجرذان | مختبر BT، الصين | E0549Ra | تقدير مستويات KIM-1 في متجانسات أنسجة الكلى؛ الحساسية التحليلية، 0.01 نانوجرام/مل؛ نطاق الكشف، 0.05–١٠ نانوجرام/ملل. |
| عامل نخر الورم في الجرذان (Rat TNF-α)α طقم مقايسة الممتز المترابط لإنزيم (ELISA Kit) | مختبر BT، الصين | E0764Ra | تقدير كمية TNF-αα المستويات في متجانسات أنسجة الكلى؛ الحساسية التحليلية، 2.51 نانوجرام/لتر؛ نطاق الكشف، 5–1,000 نانوغرام/لتر. |
| منظم استخلاص وتحلل RIPA | Thermo Scientific | 89900 | تجانس أنسجة الكلى وتحللها لتحليلات مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). |
| طقم فحص سوبر أكسيد ديسميوتاز (SOD) | أوتو ساينتيفيك (Otto Scientific) | أوتو 3047 | القياس اللوني لنشاط إنزيم سوبر أكسيد ديسميوتاز (SOD) في المصل. |
| سترات الصوديوم | Merck | 03-04-6132 | تحضير المحلول المنظم |
| هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) | Merck | 1310-73-2 | ضبط الأس الهيدروجيني (pH) |
| إبرة تغذية من الفولاذ المقاوم للصدأ (قنية تغذية فموية قياس 22 G) | مختبرات Instech، الولايات المتحدة الأمريكية | لم يتم تسجيله | كانيولا من الفولاذ المقاوم للصدأ قابلة لإعادة الاستخدام، تُستخدم للإعطاء عن طريق التغذية القسرية الفموية في الجرذان. |
| محلول الإيقاف | مكونات طقم مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) من BT Lab | مُضمن في الطقم | إنهاء تفاعل إليزا (ELISA) |
| ستريبتفيدين بيروكسيداز | Thermo Scientific | SHRP248-B | نظام الكشف بمقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) |
| محلول ركيزة TMB | مكونات طقم مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) من BT Lab | مدرج في الطقم | ركيزة مولدة للون |
| Tris-HCl | Thermo Scientific | 1185-53-1 | تحضير المحلول المنظم |
| طقم تحليل اليوريا | أوتو ساينتيفيك (Otto Scientific) | OttoBC157 | قياس مستويات اليوريا في المصل. |
| محلول غسيل مركز | مكونات طقم مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) من BT Lab | مضمن في الطقم | غسل الأطباق المختبرية |
| جرذان ويستار البيضاء | مختبر أبحاث الحيوانات التجريبية بجامعة Ahi Evran، <نص بديل للصورة="المعادلة 3" يرجى تقديم النص المصدر الذي ترغب في ترجمته."/files/ftp_upload/73284/73284eq3.jpg" النمط="هامش: تلقائي؛"/>، Tüتركيا | رقم ترخيص التربية/الإنتاج 184 | ذكر؛ 8–عمر 12 أسبوعاً؛ وزن الجسم 220 ± ٢٠ جم |
| هيدروكلوريد الزيلازين (Rompun) | Bayer، ألمانيا | غير مسجل | تخدير عام قبل جمع عينات الدم وأنسجة الكلى. |
| زايلين، درجة نسيجية | لم يتم تسجيله | لم يتم التسجيل | المعالجة النسيجية للأنسجة والترويق. |
المراجع
- Barceloux DG et al. American Academy of Clinical Toxicology practice guidelines on the treatment of methanol poisoning. J Toxicol Clin Toxicol. 2002;40(4):415-446.
- Nekoukar Z et al. Methanol poisoning as a new world challenge: a review. Ann Med Surg (Lond). 2021;66:102445.
- Mégarbane B, Borron SW, Baud FJ. Current recommendations for treatment of severe toxic alcohol poisonings. Intensive Care Med. 2005;31(2):189-195.
- McMartin K, Jacobsen D, Hovda KE. Antidotes for poisoning by alcohols that form toxic metabolites. Br J Clin Pharmacol. 2025;91(3):662-671.
- Zakharov S et al. Fomepizole versus ethanol in the treatment of acute methanol poisoning: comparison of clinical effectiveness in a mass poisoning outbreak. Clin Toxicol (Phila). 2015;53(8):797-806.
- Rietjens SJ, de Lange DW, Meulenbelt J. Ethylene glycol or methanol intoxication: which antidote should be used, fomepizole or ethanol? Neth J Med. 2014;72(2):73-79.
- Brent J. Fomepizole for ethylene glycol and methanol poisoning. N Engl J Med. 2009;360(21):2216-2223.
- Chang ST et al. Acute kidney injury and the risk of mortality in patients with methanol intoxication. BMC Nephrol. 2019;20(1):205.
- Wang C et al. Kidney outcomes after methanol and ethylene glycol poisoning: a systematic review and meta-analysis. Clin Toxicol (Phila). 2023;61(5):326-335.
- Thongprayoon C et al. Acute kidney injury in hospitalized patients with methanol intoxication: National Inpatient Sample 2003-2014. Hosp Pract (1995). 2021;49(3):203-208.
- Johlin FC, Fortman CS, Nghiem DD, Tephly TR. Studies on the role of folic acid and folate-dependent enzymes in human methanol poisoning. Mol Pharmacol. 1987;31(5):557-561.
- Noker PE, Tephly TR. The role of folates in methanol toxicity. Adv Exp Med Biol. 1980;132:305-315.
- Taşlı NG et al. Protective effects of rutin against methanol-induced acute toxic optic neuropathy: an experimental study. Int J Ophthalmol. 2018;11(5):780-785.
- Konuk ŞG et al. Evaluation of the protective role of melatonin in methanol-induced optic neuropathy. Int Ophthalmol. 2025;45(1):182.
- Gursul C et al. Amelioration of oxidative damage parameters by carvacrol on methanol-induced liver injury in rats. Exp Anim. 2022;71(2):224-230.
- Kara Ö, Kilitci A, Dağlıoğlu G. Protective effect of resveratrol on cisplatin induced damage in rat kidney. Cukurova Med J. 2022;47(3):990-995.
- Pandir D, Kara Ö. Cisplatin-induced kidney damage and the protective effect of bilberry (Vaccinium myrtillus L.): an experimental study. Turk J Med Sci. 2013;43(6):951-956.
- Jacobsen D, McMartin KE. Methanol and ethylene glycol poisonings. Mechanism of toxicity, clinical course, diagnosis and treatment. Med Toxicol. 1986;1(5):309-334.
- Alrashed M et al. The perils of methanol exposure: insights into toxicity and clinical management. Toxics. 2024;12(12):924.
- Yazgan ÜC et al. Effect of caffeic acid phenethyl ester on oxidant and anti-oxidant status of liver and serum in a rat model with acute methanol intoxication. Ir J Med Sci. 2017;186(2):519-523.
- Gharaeikhezri MH et al. Prevalence and predicting factors of acute kidney injury due to methanol intoxication; a systematic review. J Renal Inj Prev. 2024;13(2):e32195.
- Allata Y et al. The role of nephrologists in the management of methanol poisoning. Cureus. 2023;15(4):e37471.
- Mullins ME, Kraut JA. The Role of the Nephrologist in Management of Poisoning and Intoxication: Core Curriculum 2022. Am J Kidney Dis. 2022;79(6):877-889.
- Ichimura T et al. Kidney injury molecule-1 (KIM-1), a putative epithelial cell adhesion molecule containing a novel immunoglobulin domain, is up-regulated in renal cells after injury. J Biol Chem. 1998;273(7):4135-4142.
- Han WK et al. Kidney injury molecule-1 (KIM-1): A novel biomarker for human renal proximal tubule injury. Kidney Int. 2002;62(1):237-244.
- Dharnidharka VR, Kwon C, Stevens G. Serum cystatin C is superior to serum creatinine as a marker of kidney function: a meta-analysis. Am J Kidney Dis. 2002;40(2):221-226.
- Herget-Rosenthal S et al. Early detection of acute renal failure by serum cystatin C. Kidney Int. 2004;66(3):1115-1122.
- Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem. 1979;95(2):351-358.
- Sedlak J, Lindsay RH. Estimation of total, protein-bound, and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman's reagent. Anal Biochem. 1968;25:192-205.
- Mégarbane B. Treatment of patients with ethylene glycol or methanol poisoning: focus on fomepizole. Open Access Emerg Med. 2010;2:67-75.
- Brent J et al. Fomepizole for the treatment of methanol poisoning. N Engl J Med. 2001;344(6):424-429.
- Najari F, Baradaran I, Najari D. Methanol poisoning and its treatment. Int J Med Toxicol Forensic Med. 2020;10(1):26639.
- Rajamani R, Muthuvel A, Senthilvelan M, Sheeladevi R. Oxidative stress induced by methotrexate alone and in the presence of methanol in discrete regions of the rodent brain, retina and optic nerve. Toxicol Lett. 2006;165(3):265-273.