يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحضين In vitro مع سائل الكرش والصبغ النسيجي لمكونات مختارة من الجدار الخلوي في سيقان البرسيم الحجازي (Medicago sativa L.)

122 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/73286

⸱

سبتمبر 18, 2026

 , 
1Department of Agronomy and Plant Genetics, University of Minnesota - Twin Cities, 2United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا البروتوكول ترسيب مكونات جدار الخلية من اللجنين والبكتين في مقاطع عرضية لسيقان البرسيم الحجازي (Medicago sativa L.). والهدف من ذلك هو تحديد أنسجة معينة في الساق يمكن استهدافها لتطوير سلالات جديدة من البرسيم الحجازي تتميز بخصائص مرغوبة فيما يتعلق بقابلية هضم الساق.

الملخص

يحد تراكم مكونات الجدار الخلوي مع نمو النباتات من القيمة الغذائية للأعلاف المخصصة للمجترات. وبوجه خاص، يعيق ترسيب اللجنين في أنسجة النبات تكسير كربوهيدرات الجدار الخلوي، مثل السليلوز والهيميسليلوز، مما يقلل من كمية الطاقة المتاحة من العلف. ومع ذلك، فإن مكون البكتين في الجدار الخلوي، والذي يتميز بقابلية عالية للهضم، متاح بسهولة للتحلل. وقد توفر المعلومات المتعلقة بترسيب اللجنين والبكتين في أنواع مختلفة من خلايا الساق رؤى ميكانيكية حول العوامل الكامنة وراء التباين في قابلية هضم الساق بين سلالات البرسيم الحجازي. تحاكي عملية الحضانة In vitro للمقاطع العرضية للساق في سائل الكرش العمليات التي تمر بها أنسجة الساق داخل الكرش. وتتيح هذه الطريقة، المقترنة بالتلوين النسيجي والمجهري، تصور التغيرات في تحلل الأنسجة بمرور الوقت وتحديد موقع اللجنين والبكتين في الساق. يتفاعل صبغ ويسنر (Wiesner stain) مع وحدات ألدهيد الغواياسيل (G) في اللجنين، ويلونها باللون الفوشيا. وبالمثل، يتفاعل الروديوم الأحمر مع مجموعات الكربوكسيل في البكتين، مما يلون البكتين في الساق بدرجات تتراوح من الوردي إلى البرتقالي والبني. يصف هذا البروتوكول عملية هضم المقاطع العرضية لساق البرسيم الحجازي بعد تعريضها لميكروبات الكرش، يلي ذلك التلوين لتصوير أنماط اللجنين والبكتين في الجدران الخلوية. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد أنسجة الساق التي يتواجد أو يغيب فيها اللجنين والبكتين، مما يسهل المقارنات بين سلالات البرسيم الحجازي.

المقدمة

يحيط جدار خلوي بكل خلية نباتية. وتعد السليلوز، والهيميسليلوز، واللجنين، والبكتين من مكونات الجدار الخلوي وتساهم في تكوين الألياف النباتية، وهي جزء ضروري من نظام غذاء المجترات. وبينما تعتبر البكتينات عديدات تسكر قابلة للهضم (ذائبة) للغاية1، فإن اللجنين بوليمر غير قابل للهضم يحد من تحلل الألياف2. وبناءً على ذلك، يقلل اللجنين من قابلية النبات للهضم، مما يؤدي في النهاية إلى خفض الطاقة المتاحة للمجترات من العلف. ومع ذلك، يدعم اللجنين وظائف فسيولوجية نباتية هامة، مثل توصيل المياه في جميع أنحاء النبات عن طريق تعزيز عناصر القصيبات3. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن التغيرات في ألياف الساق التي تقلل من اللجنين أو تزيد من البكتين يمكن أن تعزز قابلية الساق للهضم والقيمة الغذائية للعلف4. لذا، يركز هذا البروتوكول على هذين المكونين من الجدار الخلوي. إن تركيزات اللجنين والبكتين الإجمالية في الجدار الخلوي للساق لا توفر معلومات كافية لشرح الآليات الكامنة وراء قابلية ألياف الساق للهضم5. ويمكن أن يوفر التحضين In vitro باستخدام سائل الكرش والصبغ النسيجي رؤى على المستوى الخلوي من خلال تصور الاختلافات في مكونات الجدار الخلوي بين النباتات ذات القابلية المتفاوتة لهضم ألياف الساق4,6. في البروتوكول الحالي، تُستخدم برسيم alfalfa (Medicago sativa L.)، وهو بقولي علفي معمر شائع، كنوع نموذجي لتوضيح أنماط اللجنين والبكتين في أنسجة الساق، والتي تحتوي على لجنين أكثر وبكتين أقل مقارنة بالأوراق.

In vitro التحضين باستخدام سائل الكرش يحاكي عملية هضم العلف في معدة المجترات، مما يسمح بمراقبة تأثيرات تشريح العلف على القابلية للهضم. ومن خلال تهيئة ظروف في أنبوب اختبار مشابهة لتلك الموجودة في الكرش، يمكن إزالة المقاطع العرضية للساق الملتصقة بشرائح زجاجية في نقاط زمنية مختلفة لتقييم درجة تحلل الأنسجة بعد التعرض لسائل الكرش6. وتوفر هذه الطريقة نهجًا بسيطًا وسريعًا وغير مكلف نسبيًا لتصور البنى التشريحية لسيقان البرسيم الحجازي7 وفحص كيفية تغير أنواع الخلايا التي تحتوي على مكونات مختلفة من جدار الخلية أثناء هضم الساق.

يتيح التلوين النسيجي للمقاطع العرضية للساق رؤية مكونات الجدار الخلوي. يتحد الفلوروغلوسينول وحمض الهيدروكلوريك (HCl) لتكوين صبغة ويزنر (Wiesner stain)، والتي تبرز أنسجة الساق التي تحتوي على وحدات لغنين غنية بالغواياكيل8 من خلال التفاعل مع مونومرات ألدهيد G C6C3 (coniferaldehyde)9. يتكون اللغنين من عدة وحدات فرعية مونومرية؛ ومع ذلك، يشير مصطلح "اللغنين" في جميع أنحاء هذا المقال حصرياً إلى مونومر وحدة-G، لأنه المونومر الذي يتفاعل مع صبغة ويزنر10 وبالتالي يتم تصويره باستخدام هذا البروتوكول. هناك بعض الأنسجة، مثل أوعية الخشب، تكون ملجننة دائماً6. وبخلاف ذلك، يبدأ ترسيب اللغنين في أنسجة ساق البرسيم الحجازي بمجرد بدء النمو الثانوي (الكمبيومي) ويتزامن ذلك مع توقف استطالة السلاميات في الساق6. يرتبط اللون الأحمر الروسي (Ruthenium red) بالمواد البكتينية، التي تحتوي على مجموعات كربوكسيل تكون أحياناً مأسترة وتشترك في بعض السلاسل الجانبية11. تتفاعل مجموعات الكربوكسيل في البكتينات الموجودة في الصفيحة المتوسطة وجدران الخلايا الأولية مع اللون الأحمر الروسي11. يشارك البكتين في استطالة الخلايا وبالتالي يتواجد في الخلايا أثناء النمو الأولي. ويشير مصطلح "البكتين" في جميع أنحاء المخطوطة بشكل عام إلى مجموعة البكتينات التي قد تكون موجودة. إن الجمع بين التلوين النسيجي والتحضين المخبري in vitro لكرش الحيوان يسهل مراقبة موقع مكونات الجدار الخلوي في الساق ويوضح كيف تتغير أنواع الخلايا المختلفة أثناء الهضم في الكرش. وفي النهاية، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد خلايا الساق التي تحتوي على اللغنين والبكتين وتوصيف الأنماط عبر سلالات البرسيم الحجازي وأوقات التحضين المختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أُجري هذا البحث وفقاً للإرشادات المؤسسية الخاصة بالحيوانات الخاضعة للتجارب (IACUC 2301-40689B).

1. تمييز أنابيب العينات

  1. تجهيز وتوسيم أنابيب العينات لعمليات الحضن والتخزين والتصبيغ
    1. قم بالتوسيم المسبق لخمس مجموعات منفصلة من أنابيب الطرد المركزي المخروطية ذات الغطاء اللولبي والقابلة للتخلص منها بسعة 50 mL لكل عينة. أضف معرف العينة ووقت الحضن إلى كل أنبوب للاستخدامات الموضحة أدناه.
    2. قم بتوسيم أنابيب الحفظ ما قبل الحضن وأضف 35 mL من الماء فائق النقاء.
    3. قم بتوسيم أنابيب الحضن لاستخدامها في القسمين 3 و4. نظم الأنابيب في حاملات منفصلة حسب وقت الحضن (0، 4، 8، 24، 48، أو 96 h).
      ملاحظة: استخدم قلم تحديد دائم من الدرجة الصناعية لمنع زوال الملصقات أثناء وضعها في الحمام المائي.
    4. قم بتوسيم أنابيب التخزين ما بعد الحضن وأضف 35 mL من خليط بنسبة 50:50 من الجلسرين بتركيز 100% والماء فائق النقاء. استخدم هذه الأنابيب لتخزين المقاطع العرضية المهضومة على الشرائح حتى عملية التصبيغ.
    5. قم بتوسيم أنابيب ما قبل التصبيغ وأضف 35 mL من خليط بنسبة 50:50 من الإيثانول بتركيز 200-proof والماء فائق النقاء. استخدم هذه الأنابيب لاستخلاص الجلسرين من المقاطع العرضية قبل التصبيغ.
    6. قم بتوسيم أنابيب الترطيب وأضف 35 mL من الماء فائق النقاء.

2. تقطيع ساق النبات بالعرض وتثبيتها على الشرائح

  1. باستخدام الملقط، اختر قطعة واحدة من الساق في كل مرة من سيقان العينة واستأصل مركز القطعة.
    ملاحظة: استخدم أربع سيقان لكل عينة كمكررات تقنية لكل مكرر بيولوجي. اختر السيقان الأربع عشوائياً من بين جميع السيقان الممكنة لكل عينة. استخدم مجموعة إضافية من السيقان القياسية كعينة ضابطة عبر جميع دورات التحضين.
  2. اقطع مستطيلين من رغوة البوليسترين المبثوق الصلبة العازلة، بطول 2.5 cm تقريباً وسمك 0.6 cm. اقطع وتداً صغيراً على طول كل قطعة بحيث تستقر السلمية بين قطعتي الرغوة بإحكام.
  3. ثبّت "شطيرة" الساق على منصة الميكروتوم المنزلق القادر على إنتاج مقاطع بسمك 100 μm. باستخدام فرشاة رسم دقيقة السن، ضع قطرة من الماء على الساق وشفرة الميكروتوم لتسهيل عملية القطع النظيف.
  4. اقطع مقاطع عرضية من الساق بسمك 100 μm. استخدم فرشاة الرسم لنقل كل مقطع عرضي إلى طبق بتري مُصنف مسبقاً يحتوي على ماء فائق النقاء للتخزين المؤقت، وأزل أي بقايا من الرغوة من الطبق.
    ملاحظة: استبدل شفرة الميكروتوم إذا تمزقت الرغوة، حيث قد يشير التمزق إلى أن الشفرة أصبحت ثلمة.
  5. قم بتصنيف شريحتين زجاجيتين قياسيتين 25 mm × 75 mm يدوياً لكل عينة عند كل وقت تحضين (صبغتان × 6 نقاط زمنية = 12 شريحة لكل عينة لكل من المكررات البيولوجية). قم بتضمين معرف العينة، ووقت التحضين، ونوع الصبغة على كل ملصق.
  6. اقطع قطعة بطول 2.5 cm وعرض 2 mm من شريط لاصق مزدوج الوجه. ضع الجانب القصير من الشريط على بُعد 0.5 cm من أسفل الشريحة، بحيث يكون الجانب اللاصق متجهاً للأسفل، واضغط بقوة على جانب الورق الشمعي للشريط أثناء ارتداء القفازات لضمان الالتصاق.
    ملاحظة: نفذ هذه الخطوة على سطح مستوٍ لتجنب كسر الشرائح الزجاجية.
  7. استخدم مجهر تشريحي لتوجيه جميع المقاطع العرضية في الاتجاه نفسه. انزع الورق الشمعي من الشريط اللاصق مزدوج الوجه، ومع الحفاظ على توجيه المقاطع العرضية، انقلها إلى الشريط الموجود على الشريحة الزجاجية المصنفة مسبقاً باستخدام فرشاة رسم مبللة دقيقة السن. حافظ على رطوبة المقاطع العرضية قليلاً.
  8. ضع الورق الشمعي فوق المقاطع العرضية ومرر فرشاة الرسم فوقه بخفة لتثبيت المقاطع العرضية بإحكام على الشريط اللاصق مزدوج الوجه. انزع الورق الشمعي وضع الشريحة المثبتة التي تحتوي على أربعة مقاطع عرضية في أنبوب الحفظ المصنف مسبقاً الموصوف في الخطوة 1.1.2، مع التأكد من أن الماء فائق النقاء يغطي المقاطع العرضية المثبتة.
  9. للتصبيغ باستخدام كل من صبغة ruthenium red وصبغة Wiesner، ضع شريحتين ظهراً لظهر في كل أنبوب حفظ بحيث يكون الشريط اللاصق مزدوج الوجه متجهاً للخارج.
    ملاحظة: بعد تثبيت جميع الشرائح ووضعها في أنابيب تحتوي على ماء فائق النقاء، خزن الشرائح طوال الليل في درجة حرارة الغرفة إذا لزم الأمر.

3. التحضير للتحضين in vitro للمقاطع العرضية للساق

  1. استخدم أنابيب الطرد المركزي ذات السعة 50 mL ذات الغطاء اللولبي والمعدة للتحضين (انظر 1.1.3). قم بتجميع كافة أنابيب العينات الخاصة بكل فترة تحضين على حامل بلاستيكي واحد.
  2. استخدم ميزانًا تحليليًا بدقة أربعة منازل عشرية لوزن 0.2 g من مادة قياسية لساق ذرة مطحونة بحجم 1 mm على ورق وزن، وانقل المادة بعناية إلى كل أنبوب تحضين باستثناء أنابيب 0 h، والتي تعمل كمجموعة ضابطة غير محُضنة. أغلق الأنابيب بالأغطية واتركها جانبًا حتى وقت الاستخدام.
    ملاحظة: توفر المادة القياسية لساق الذرة الطاقة اللازمة لاستدامة ميكروبات الكرش أثناء التحضين لأن الكتلة الحيوية للمقاطع العرضية للساق غير كافية للحفاظ على النشاط الميكروبي.
  3. املأ حمامًا مائيًا دوارًا بكمية كافية من الماء وقم بموازنته عند 39 °C قبل بدء التحضين. اضبط عمق الماء ليغطي علامة 35 mL في أنابيب 50 mL، واستخدم جهاز تهوية إذا لزم الأمر للحفاظ على تدوير منتظم للمياه ودرجة حرارة ثابتة.
  4. تحضير محلول منظم McDougall لمحلول التلقيح
    1. قم بتحضير محلول منظم McDougall في مدة لا تزيد عن يومين قبل بدء عمليات التحضين.
      ملاحظة: اخلط محلول منظم McDougall مع سائل الكرش بنسبة 4:1 لتحضير محلول التلقيح. اضبط حجم المحلول المنظم ليتناسب مع عدد العينات، وحضّر كمية كافية من محلول التلقيح لتوفير 30 mL لكل أنبوب.
    2. قِس 1,600 mL من الماء فائق النقاء. انقل 1 L إلى دورق إرلنماير مسطح سعة 3 L واحتفظ بـ 600 mL لنقل وشطف الكواشف.
    3. ضع قضيب تحريك مغناطيسي في دورق إرلنماير وضع الدورق على لوحة تحريك.
    4. ضع قمعًا بلاستيكيًا في دورق إرلنماير. أضف 15.7 g من بيكربونات الصوديوم (NaHCO₃)، و 5.9 g من فوسفات الصوديوم ثنائية القاعدة اللامائية (Na₂HPO₄)، و 0.91 g من كلوريد البوتاسيوم (KCl)، و 0.75 g من كلوريد الصوديوم (NaCl)، و 0.19 g من كبريتات المغنيسيوم سباعية الهيدرات (MgSO₄·7H₂O)، و 0.06 g من كلوريد الكالسيوم ثنائي الهيدرات (CaCl₂)، مع إضافة كاشف واحد في كل مرة والسماح لكل كاشف بالذوبان قبل إضافة التالي. استخدم أجزاءً من الـ 600 mL من الماء فائق النقاء المحفوظ لشطف القمع بعد كل إضافة.
    5. بعد إضافة كلوريد الكالسيوم ثنائي الهيدرات، أدخل ناشر CO₂ لتسهيل الذوبان وقم بتمرير الغاز في المحلول. بمجرد أن يصبح المحلول رائقًا، استمر في تمرير الغاز لمدة إضافية تتراوح بين 10–15 min.
    6. أغلق الدورق بإحكام وثبّت السدادة بشريط لاصق لأن تسخين المحلول المنظم قد يؤدي إلى زيادة الضغط داخل الوعاء.
    7. خزن المحلول عند 20 °C لمدة تصل إلى يومين. ضع المحلول في حمام مائي عند 39 °C في اليوم السابق للاستخدام، أو ضعه مباشرة في الحمام المائي عند 39 °C إذا كان سيُستخدم في اليوم التالي.

4. تحضين مقاطع عرضية من الساق In vitro

  1. في يوم التحضين، ضع 47 مل من الماء و4 مل من هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بتركيز 1 عياري في دورق سعة 100 مل داخل خزانة استخلاص الغازات، ثم أضف 0.625 جم من السيستئين-HCl. وفي دورق ثانٍ سعة 100 مل، أضف 0.625 جم من كبريتيد الصوديوم إلى 47 مل من الماء، واحتفظ بالمحلولين منفصلين حتى يتم تحضير محلول التلقيح.
  2. املأ ترمساً عازلاً بالماء الساخن لإنشاء بيئة دافئة لنقل ميكروبات الكرش من البقرة إلى المختبر. وأحضر دلواً سعة خمسة جالونات لنقل الماء الساخن من الترمس.
  3. انتقل إلى الحظيرة لجمع سائل الكرش من البقرة ذات القنية المخصصة للتجربة من قبل إدارة الحظيرة.
    ملاحظة: اجمع سائل الكرش في الوقت نفسه تقريباً من اليوم ومن البقرة نفسها طوال التجربة لتقليل التباين. نسّق مع إدارة الحظيرة لتقديم إشعار مسبق بموعد تواجدك في الحظيرة لجمع سائل الكرش.
  4. تحديد البقرة التجريبية وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك معطف المختبر، وواقي العينين، وأغطية الأحذية، وقفازات تصل إلى الكتف.
    ملاحظة: تقتصر الإجراءات الواردة في الخطوات 4.4-4.8 على الموظفين المصرح لهم بموجب بروتوكول لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) المعمول به.
  5. انقل الماء الدافئ من الترمس إلى الدلو سعة خمسة جالونات. جهز طبقتين من الشاش درجة 50 (قماش الجبن) لترشيح مواد الكرش.
  6. جمع سائل الكرش من البقرة ذات القنية
    1. افتح الكانيولا (الأنبوب) بعناية وضع السدادة في الدلو سعة خمسة جالونات الذي يحتوي على ماء دافئ لتجنب تلوث السدادة. وباستخدام يد ترتدي قفازًا، قم بإزالة كمية كافية من مواد الكرش للوصول إلى الواجهة الفاصلة بين المواد الصلبة والسائلة في الكرش.
    2. بمجرد الوصول إلى الواجهة الصلبة-السائلة، اجمع عدة حفنات من المادة واضغطها عبر طبقتين من الشاش من درجة 50، بمساحة 45 سم مربع تقريباً لكل منهما، داخل ترمس ذي غطاء لولبي مسخن مسبقاً. تخلص من المادة المستهلكة بعد عصر سائل الكرش عبر الشاش.
    3. كرر الخطوة 4.6.2 حتى يتم الحصول على 1 لتر من سائل الكرش في الترمس لكل مجموعة مكونة من 60 أنبوب تلقيح، مع ضبط الحجم حسب الحاجة بناءً على عدد العينات المراد حضنها.
      ملاحظة: هناك قيود محددة على كمية سائل الكرش التي يمكن استخراجها من الأبقار ذات القنيات في أسبوع معين. يرجى التواصل مع مدير الحظيرة للتأكد من أن كمية سائل الكرش المسحوبة لا تتجاوز الحد المسموح به للبقرة.
  7. عند جمع كمية كافية من سائل الكرش، أغلق الوعاء الحراري (thermos) بإحكام للحفاظ على درجة حرارته. أعد تركيب الكانيولا، واستخدم الماء الدافئ الموجود في الدلو سعة خمسة غالونات للتنظيف.
  8. تخلص من أغطية الأحذية والقفازات والشاش المتسخة في وعاء التخلص المناسب عند مغادرة الحظيرة. عُد إلى المختبر في أسرع وقت ممكن للحفاظ على درجة حرارة سائل الكرش والظروف اللاهوائية.
  9. عند العودة إلى المختبر، ادمج محلولي العامل المختزل (انظر 4.1) داخل خزانة استخلاص الغازات، وامزجهما لتحضير محلول الاختزال.
  10. ضع دورقاً زجاجياً بسعة 2 لتر على الأقل يحتوي على قضيب تحريك مغناطيسي كبير فوق لوح تحريك ساخن مضبوط على <30 °C، ووضع CO₂ ناشر فوق السائل. أضف 1,600 مل من محلول مكدوغال المنظم (McDougall’s buffer) وحرك ببطء دون السماح لثاني أكسيد الكربون (CO2)₂ الموزّع لملامسة السائل.
    ملاحظة: استخدم كأساً من البولي بروبيلين إذا رغبت في ذلك عند درجة الحرارة المنخفضة هذه. استخدم CO₂ لإزاحة O₂ وتساعد في الحفاظ على الظروف اللاهوائية.
  11. قم بتبطين قمع كبير بطبقتين من شاش الجبن عيار 50، وضعه فوق مخبار مدرج سعة 2 لتر. قم بترشيح 400 مل من سائل الكرش وأضفه إلى محلول McDougall المنظم (انظر 3.4.7) لتحضير محلول التلقيح.
  12. أضف 80 مل من محلول الاختزال (راجع 4.9) إلى محلول التلقيح وامزجهما ببطء. حافظ على الـ CO₂ منع الناشر من ملامسة السائل.
  13. داخل خزانة استخلاص الأبخرة، قم بإزالة الأغطية من أنابيب الحضانة ونظمها في رفوف منفصلة حسب زمن الحضانة. ثم قم بإزالة أغطية أنابيب الاحتفاظ في مرحلة ما قبل الحضانة تمهيداً لنقل الشرائح (راجع 1.1.2).
  14. اختر أنبوب احتجاز واحدًا من أنابيب ما قبل الحضانة بشكل عشوائي في كل مرة، واستخدم الملاقط لنقل الشرائح الزجاجية المثبتة إلى أنبوب الحضانة المقابل (انظر 1.1.3). ضع كل أنبوب حضانة يحتوي على الشرائح المثبتة في حامل عينات صغير، وضع أنبوب احتجاز ما قبل الحضانة جانبًا.
    ملاحظة: استعن بشخصين لتنفيذ الخطوتين 4.14-4.15. وعند الإمكان، قلل من تبريد خليط سائل الكرش والمحلول المنظم.
  15. اسحب 30 ملل من محلول التلقيح باستخدام حقنة سعة 60 ملل مزودة بإبرة كبيرة القطر وغير مدببة. صب المحلول ببطء على جدار أنبوب الحضن، ثم قم بتطهير الأنبوب باستخدام غاز CO2.₂ لمدة 20 ثانية تقريباً، غطِّ الأنبوب، ثم أعِده إلى الحامل.
  16. ضع الرفوف التي تحتوي على الأنابيب الملقحة في 39 °C حمام مائي. قم بتدوير الأنابيب بلطف مرة واحدة يومياً على الأقل، وغير مواضع الحامل يومياً لتقليل التسخين غير المتكافئ.
    ملاحظة: يشير تكون فقاعات غازية في الأنابيب إلى حدوث تخمر نشط.
  17. في نهاية كل فترة تحضين، أخرج الحامل المقابل من الحمام المائي. افتح الأنابيب واحدًا تلو الآخر، وأخرج كل شريحة، ثم اشطف المواد الصلبة ومحلول التلقيح المتبقي برفق باستخدام ماء عالي النقاوة.
  18. ضع الشرائح المغسولة في أنابيب التخزين لما بعد الحضن التي تحتوي على خليط الجلسرول والماء الموضح في الخطوة 1.1.4.

5. صبغ المقطع العرضي للكشف عن اللجنين

  1. إذا كانت الشرائح قد خُزنت في خليط من الجلسرول والماء بنسبة 50:50، فانقل كلتا الشريحتين اللتين تحتويان على المقاطع العرضية المثبتة إلى أنابيب شطف ما قبل التلوين التي تحتوي على محلول الإيثانول والماء فائق النقاء (انظر 1.1.5). تُحفظ الأنابيب طوال الليل في الثلاجة لإزالة الجلسرول قبل التلوين.
  2. حضّر محلول فلوروغلوسينول (PG) بتركيز 3% عن طريق إذابة 0.3 g من PG في 10 mL من الإيثانول المطلق في دورق إرلنماير سعة 25 mL ملفوف بورق ألومنيوم لحماية الكاشف الحساس للضوء من الضوء. أغلق الدورق بإحكام وضع عليه ملصقاً يتضمن اسم المحلول، وتاريخ التحضير، واسم المُحضّر، ثم خزنه في درجة حرارة 20 °C.
  3. أخرج الشرائح من الأنابيب المبردة وانقلها مؤقتاً إلى أنابيب الترطيب الموصوفة في الخطوة 1.1.6، والتي تحتوي على ماء فائق النقاء بنسبة 100%.
    ملاحظة: حافظ على ترطيب المقاطع العرضية أثناء التعامل معها لتقليل الأكسدة، والتي قد تتلف المقاطع وتؤثر على التصوير اللاحق.
  4. حضّر صبغة فيسنر (Wiesner) داخل خزانة استنشاق الغازات باستخدام ماصة عن طريق خلط 50 μL من PG بتركيز 3% في الإيثانول (انظر 5.2) مع 25 μL من حمض الهيدروكلوريك (HCl) في بيكر سعة 50 mL.
    ملاحظة: اضبط الكميات لتتناسب مع عدد الشرائح مع الحفاظ على نسبة 2:1 بين PG و HCl.
    تحذير: تعامل مع حمض الهيدروكلوريك داخل خزانة استنشاق الغازات لأنه مسبب للتآكل في المعادن، ويسبب حروقاً جلدية شديدة وتلفاً للعين، وقد يسبب تهيجاً للجهاز التنفسي. تجنب استنشاق الأبخرة أو الرذاذ، وارتدِ القفازات الواقية والملابس وحماية العين والوجه المناسبة، واغسل الجلد المعرض للمادة جيداً بعد التعامل معها.
  5. أخرج شريحة واحدة من الأنبوب وجفف الزجاج المحيط بالشريط اللاصق مزدوج الوجه بلطف باستخدام منديل منخفض الوبر لمنع تدفق الصبغة بعيداً عن الشريط. ضع الشريحة على صينية بلاستيكية صغيرة واستخدم ماصة لوضع عدة قطرات من صبغة فيسنر فوق المقاطع العرضية. 
  6. اضبط المؤقت على 12 min وغطِّ الشرائح بورق ألومنيوم لحمايتها من الضوء. افحص المقاطع العرضية أثناء التلوين وأعد وضع الصبغة حسب الضرورة لمنع الجفاف.
    ملاحظة: امنع جفاف المقاطع العرضية لأن الأكسدة يمكن أن تتلف الأنسجة وتؤثر على التصوير اللاحق.
  7. بعد مرور 12 min، أزل صبغة فيسنر الزائدة بلطف باستخدام منديل منخفض الوبر. اغسل النسيج قبل التثبيت لتقليل تعرض عدسة الشيئية للمجهر لأبخرة HCl المسببة للتآكل.
  8. ضع 1–2 قطرة من خليط الجلسرول والماء فائق النقاء بنسبة 50% فوق كل مقطع عرضي وغطِّه بغطاء شريحة مقاس 24 mm × 30 mm (سمك No. 1.5). انتقل فوراً إلى التحليل المجهري والتصوير.
    ملاحظة: التقط الصور خلال 6–8 h لأن تلوين فيسنر حساس للوقت وقد يتحول إلى اللون الأصفر وينتشر خارج المقطع العرضي بمرور الوقت.

6. صبغ المقطع العرضي للبكتين

  1. اتبع الخطوة 5.1 لإزالة خليط الجلسرول والماء فائق النقاء من الشرائح المخزنة قبل البدء في عملية الصبغ.
  2. حضّر محلول روتينيوم ريد بتركيز 0.02% عن طريق إذابة 0.02 g من الروتينيوم ريد في 100 mL من الماء فائق النقاء داخل دورق إرلنماير سعة 125 mL ملفوف برقائق الألومنيوم لحماية الكاشف الحساس للضوء من الإضاءة. أغلق الدورق بإحكام وضع عليه ملصقاً يتضمن اسم المحلول وتاريخ التحضير واسم المُحضّر، ثم خزنه في درجة حرارة 20 °C.
  3. أخرج الشرائح من أنابيب الإيثانول والماء فائق النقاء المبردة، وانقل الشرائح التي تحمل الملصقات الصحيحة وتحتوي على المقاطع المثبتة إلى أنابيب تحتوي على ماء فائق النقاء بتركيز 100% (انظر 1.1.6) للحفظ المؤقت.
    ملاحظة: اتبع احتياطات الترطيب المذكورة في الخطوة 5.3.
  4. انقل شريحة واحدة من الماء فائق النقاء باستخدام ملقط، وجفف الماء الموجود حول الشريط باستخدام منديل خالي من الوبر لمنع تدفق الصبغة على الزجاج. ضع الشريحة في صينية بلاستيكية صغيرة.
  5. ضع عدة قطرات من محلول روتينيوم ريد (انظر 6.2) لتغطية المقاطع العرضية بالتساوي. غطِّ الشرائح برقائق الألومنيوم لمدة 10 min لحمايتها من الضوء، ثم اشطف الصبغة برفق من الشريحة باستخدام الماء فائق النقاء لمدة 2 min.
  6. جفف الماء الزائد من الشريحة وضع 1–2 قطرة من خليط الجلسرول والماء فائق النقاء بتركيز 50% فوق كل مقطع عرضي. غطِّ المقاطع العرضية بغطاء شرائح قياس 24 mm × 30 mm (سُمك No. 1.5)، ثم انتقل إلى التحليل المجهري والتصوير.
    ملاحظة: أجْرِ التحليل المجهري في نفس اليوم للحصول على أفضل النتائج.

7. التصوير بالمجال المضيء

  1. افحص المقاطع العرضية تحت إضاءة المجال المضيء باستخدام المجهر بتكبيرات 10× و20× و40×. راجع الجدول 1 لمعرفة معايير وإعدادات التقاط الصور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أتاح استخدام أنابيب الطرد المركزي لمحاكاة ظروف الكرش إجراء عملية هضم in vitro سريعة وغير مكلفة نسبيًا للمقاطع العرضية لسوق نبات Medicago sativa. وباستخدام الميكروتوم المنزلق، تم تحضير مقاطع عرضية من سوق M. sativa بسمك 100 μm (الشكل 1A). ثُم ثُبِّتت المقاطع العرضية للسوق على شرائح زجاجية باستخدام شريط لاصق مزدوج الوجه (الشكل 1B) وغُمرت في محلول تلقيح سائل الكرش لفترات حضانة تتراوح من 4 h إلى 96 h (الشكل 1C)...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تألفت مادة البرسيم الحجازي المستخدمة في الدراسة الحالية من مستنبتات من خمسة سلالات من البرسيم الحجازي. تم اختيار سلالتين تجريبيتين بعد دورتين من الانتخاب التباعدي لقابلية هضم الألياف المنظفة المتعادلة في المختبر (in vitro neutral detergent fiber digestibility (IVNDFD)) من نباتات أم ذات قيم منخفضة لـ 16 h IVNDFD ومنخفضة لـ 96 h IVNDFD، أو قيم مرتفعة لـ 16 h IVNDFD ومرتفعة لـ 96 h IVNDFD12. كما تضمنت الدراسة ثلاث سلالات تجارية ذات خلفيات وراثية غير معروفة، واختيرت النباتات الأم بناءً ع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أن البحث قد أُجري دون وجود أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح. إن ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذا المنشور هو لغرض تقديم معلومات محددة فقط، ولا يعني توصية أو تأييداً من قبل وزارة الزراعة الأمريكية (USDA). وتعد وزارة الزراعة الأمريكية جهة توظيف ومزوداً للفرص المتكافئة. وقد امتثلت جميع التجارب للقوانين الحالية في الولايات المتحدة، وهي الدولة التي أُجريت فيها هذه التجارب.

شكر وتقدير

يقر المؤلفون بفضل R. Ted Jeo على رؤاه حول الأعمال السابقة ذات الصلة. والشكر موجه إلى مركز التصوير الجامعي في جامعة مينيسوتا - توين سيتييز لتوفير إمكانية الوصول إلى برامج الحصول على صور المجهر وتحليلها لإعداد الصور للنشر. تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الزراعة في الولايات المتحدة – خدمة الأبحاث الزراعية [062-21500-001-000D] واتفاقية التعاون غير المساعد (رقم 58-5062-2-016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ورق ألومنيومممشى خشبي7106BW١٨ بوصة × ١٠٠٠ قدم؛ تُستخدم لحماية محاليل الصبغ الحساسة للضوء من الضوء
كلوريد الكالسيوم ثنائي الهيدرات، بنقاء 99% كحد أدنىSigma Life ScienceC7902-500Gرقم CAS 10035-04-8؛ كاشف لـ McDougall’المحلول المنظم s
برمجيات الكاميراNikonNIS-Elements AR 5.42.04برنامج تصوير بنظام 64 بت يُستخدم لالتقاط الصور وتحليلها
غاز ثاني أكسيد الكربونMathesonUN1013درجة الاستخدام العام؛ تُستخدم للحفاظ على الظروف اللاهوائية أثناء التحضير والحضانة
حمام مائي دوّارالدقة—حمام مائي دوار مضبوط الحرارة يُستخدم للحفاظ على العينات عند 39 °C
معيار ساق الذرةجامعة مينيسوتالا يوجد نص لترجمته.حُصِدَت في خريف عام 2023 في سانت بول، مينيسوتا، الولايات المتحدة الأمريكية؛ وطُحِنَت إلى حجم 1 مم واستُخدِمَت كركيزة ميكروبية
غطاء زجاجيThermo Scientific341924 مم × 30 مم، سمك رقم 1.5، 1 أونصة
كاميرا المجهر الملونة Digital Sight 10 المزودة بمستشعر صور CMOS بتنسيق FX الكبيرNikonMQA20000كاميرا ألوان رقمية تُستخدم لالتقاط صور مجهرية بالمجال المضيء
مجهر تشريحيNikonSMZ18مجهر ستيريو يستخدم لتوجيه وتحديد موضع المقاطع العرضية للساق
شريط لاصق من الجهتينشريط SelloTape Office Vinyl لاصق من الجهتين4270٢ ملم × 53 م؛ تُستخدم لتثبيت المقاطع العرضية للساق على شرائح زجاجية
ميزان كهربائيوGH-202ميزان تحليلي بدقة قراءة تصل إلى أربعة منازل عشرية
دورق إرلنماير (125 مل)Kimax25600دورق سعة 125 مل؛ متوافق مع سدادة رقم 5
دورق إرلنماير (25 مل)بايركس (Pyrex)4980دورق سعة 25 مل؛ متوافق مع سدادة رقم 0
إيثانول (200 درجة نقاوة)Fisher Scientific04-355-720إيثانول مطلق يُستخدم لتحضير محاليل الصبغ وعمليات الشطف التي تسبق الصبغ
عزل الرغوة الصلبة من البوليسترين المبثوقOwens Corning1407788١ بوصة × ٢ قدم × لوح رغوي مقاس 2 قدم، من النوع R-5، وبضغط 15 PSI؛ يُستخدم لدعم السلالم البينية للساق أثناء عملية التقطيع
ملاقطFisher Scientific10-316Aملاقط مختبرية تُستخدم للتعامل مع قطع الساق، والشرائح، والمقاطع المثبتة
شرائح زجاجيةFisherBrand125503٢٥ مم × ٧٥ ملم × 1 مم؛ تُستخدم لتثبيت المقاطع العرضية للساق
دورق كروي (6 لتر)PyrexCLS43205L-4EAدورق زجاجي سعة 6 لتر يُستخدم لتحضير أو مناولة أحجام أكبر من المحاليل
جليسيرين، سائل بدرجة مخبريةفيشر للتعليم العلمي525342Cرقم CAS 56-81-5؛ الغليسرول المستخدم في محاليل التثبيت والتخزين
شاش جبني مزدوج الطبقات بدرجة 50متجر JINIOHEEB0FL27KXRNقطن بنسبة 100%، مبيّض باللون الأبيض؛ يُستخدم لترشيح مواد الكرش وسوائل الكرش
مخبار مدرج (10 مل)بايركس (Pyrex)700024مخبار مدرج سعة 10 مل يُستخدم لقياس أحجام السوائل
حمض الهيدروكلوريكفيشرA1445-500رقم التسجيل الكيميائي (CAS No.) 7647-01-0؛ يُستخدم مع الفلوروغلوسينول لتحضير صبغة ويزنر (Wiesner stain)
قلم تحديد دائم فائق الجودة للاستخدامات الصناعيةقلم شاربي (Sharpie)13601رأس دقيق؛ يستخدم لتعليم أنابيب الحضن بعلامات مقاومة للماء
هيدرات هيدروكلوريد L-سيستينSigma-AldrichC121800-10Gرقم تسجيل خدمة المستخلصات الكيميائية (CAS No.) 345909-32-2؛ عامل مختزل يُستخدم في تحضير محلول الحضن
مناديل منخفضة الوبرKimberly-Clark34155٤.٥ بوصة × ٨.٥ بوصة؛ تُستخدم لتجفيف السوائل الزائدة من الشرائح دون ترك ألياف
شفرة ميكروتوم منخفضة البروفيلLeica 81963065-LPشفرة بديلة منخفضة البروفيل تُستخدم لتحضير مقاطع عرضية موحدة للساق
كبريتات المغنيسيوم سباعية الهيدراتFisher ChemicalM80-500رقم تسجيل خدمة ملخصات المواد الكيميائية (CAS No.) 10034-99-8؛ كاشف لطريقة McDougall’محلول منظم s
قضيب تحريك مغناطيسيFisher Scientific03-411-783٧٦ مم × 12 مم؛ تُستخدم لخلط المحلول المنظم ومحاليل التلقيح
ملصقات عناوين المراسلةأفيري51671/2 بوصة × 1 3/4 بوصة؛ تُستخدم لتحديد هوية العينات والشرائح
فرشاة طلاءلو-كورنيل—فرشاة مستديرة ناعمة من سلسلة 7000، رقم 3؛ تُستخدم لنقل المقاطع العرضية للساق والتعامل معها
أطباق بتري مع أغطيتهاأدوات مختبر Becton Dickinson81731119٦٠ مم × 15 مم؛ تُستخدم للتخزين المؤقت للمقاطع العرضية للساق في ماء فائق النقاء
فلوروغلوسينول، 1،3،5-تراي هيدروكسي بنزينSigma-AldrichP3502-25Gرقم تسجيل ملخصات المواد الكيميائية (CAS No.) 108-73-6؛ كاشف يُستخدم لتحضير صبغة ويزنر (Wiesner stain)
ماصة (100 μL)GilsonP 1000؛ 767547Mماصة ذات حجم قابل للتعديل تُستخدم لتوزيع محاليل الصبغ
قمع بلاستيكي متعدد الاستخداماتNalgene10-437-23E150 ملم؛ تُستخدم لنقل الكواشف والترشيح
كأس بيكر من البولي بروبيلين (4 لتر)Nalgene1201-4000كأس زجاجي سعة 4 لتر مقاوم للمواد الكيميائية، يُستخدم لتحضير وخلط محاليل التلقيح
كلوريد البوتاسيومFisher ChemicalP217-500رقم CAS 7447-40-7؛ كاشف لطريقة ماكدوغال (McDougall)’محلول منظم s
شفرات الحلاقةبرسونا (Personna)66-0089بِسُمك 0.009 بوصة؛ تُستخدم للتقليم اليدوي لمواد الساق
أحمر الروديوم، أوكسي كلوريد الروديوم الأمونيوميسيجما (Sigma)R-2751رقم CAS 11103-72-3؛ صبغة نسيجية تُستخدم لتصوير المواد البكتينية
مقصFiskars1063071مقصات عامة الأغراض تُستخدم لقص الشريط والرغوة والمواد الاستهلاكية الأخرى
أنابيب طرد مركزي مخروطية ذات غطاء لولبي (50 مل)Corning430828بولي بروبيلين، غير مولد للحمى؛ يُستخدم لحفظ العينات، والتحضين، والشطف، والتخزين
ميكروتوم سلدج (Sledge microtome)Leica2000Rميكروتوم منزلق/زلاقة يُستخدم لتحضير 100 μm-مقاطع عرضية سميكة للساق
بيكربونات الصوديوم، درجة ACSFisher ChemicalS233-3رقم CAS 144-55-8؛ كاشف لطريقة ماكدوغال (McDougall)’محلول منظم (buffer)
كلوريد الصوديومFisher Chemical—رقم تسجيل خدمة المواد الكيميائية (CAS No.) 7647-14-5؛ كاشف لطريقة ماكدوغال (McDougall)’محلول منظم s
هيدروكسيد الصوديومFisher ChemicalS318-500رقم تسجيل خدمة ملخصات الكيماويات (CAS No.) 1310-73-2؛ يُستخدم في تحضير المحلول المختزل
فوسفات الصوديوم ثنائية القاعدة اللامائية (Na2التحسين الفائق للمعلمات4)Sigma AldrichS-9763CAS 7558-79-4
كبريتيد الصوديوم اللامائي، ACS، بنسبة 98.0% كحد أدنىOakwood Chemicals245960رقم CAS 1313-84-4؛ عامل مختزل يُستخدم في تحضير محلول الحضن
ملعقة مختبر من نوع SpoonulaFisher Scientific14-375-10ملعقة مختبرية تُستخدم لنقل الكواشف المسحوقة
لوح تحريكThermolyne من شركة Sybron7200لوح تحريك مغناطيسي يستخدم لخلط المحاليل المنظمة ومحاليل التلقيح
حقنة (60 مل) ذات إبرة عريضةMonoject935401028حقنة سعة 60 مل مع إبرة واسعة التجويف تُستخدم لتوزيع محلول التلقيح
حوامل أنابيب الاختبارThermo Scientific14-809-44حوامل تُستخدم لتنظيم ودعم أنابيب حضن سعة 50 مل
ميزان الحرارةFisherBrand13201663ميزان حرارة مختبري يُستخدم للتحقق من درجة حرارة المحلول والحمام المائي
مجهر قائمNikonإيكليبس Niمجهر المجال المضيء القائم المستخدم لتصوير ومعاينة المقاطع العرضية المصبوغة للساق
مضخة خدمات عامةشركة Little Giant Pump Co.502203طراز 2E-38N؛ 115 فولت تيار متردد، 60 هرتز، 1.7 أمبير؛ يُستخدم لتدوير المياه والحفاظ على درجة حرارة موحدة للحمام المائي
ورق وزنVWR Scientific Products12578-165ورق وزن مخصص للاستخدام مرة واحدة، يُستخدم لوزن ونقل الكاشفات الصلبة وركيزة سيقان الذرة

المراجع

  1. Cosgrove DJ. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2005;6(11):850-861.
  2. Moore KJ, Jung H-JG. Lignin and fiber digestion. Journal of Range Management. 2001;54(4):420-430.
  3. Barros J, Serk H, Granlund I, Pesquet E. The cell biology of lignification in higher plants. Annals of Botany. 2015;115(7):1053-1074.
  4. Jung HG, Engels FM. Alfalfa stem tissues: cell wall deposition, composition, and degradability. Crop Science. 2002;42(2):524-534.
  5. Jung HG, Lamb JFS. Stem morphological and cell wall traits associated with divergent in vitro neutral detergent fiber digestibility in alfalfa clones. Crop Science. 2006;46(5):2054-2061.
  6. Engels FM, Jung HG. Alfalfa stem tissues: cell-wall development and lignification. Annals of Botany. 1998;82(5):561-568.
  7. Akin DE. Section to slide technique for study of forage anatomy and digestion. Crop Science. 1982;22(2):444-446.
  8. Jung HG, Deetz DA. Cell wall lignification and degradability. In: Jung HG, Buxton DR, Hatfield RD, Ralph J, eds. Forage Cell Wall Structure and Digestibility. American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, Soil Science Society of America; Madison, WI; 1993:315-346.
  9. Blaschek L, et al. Cellular and genetic regulation of coniferaldehyde incorporation in lignin of herbaceous and woody plants by quantitative Wiesner staining. Frontiers in Plant Science. 2020;11:109.
  10. Blaschek L, et al. Different combinations of laccase paralogs nonredundantly control the amount and composition of lignin in specific cell types and cell wall layers in Arabidopsis. The Plant Cell. 2023;35(2):889-909.
  11. Nevins DJ. Analysis of forage cell wall polysaccharides. In: Jung HG, Buxton DR, Hatfield RD, Ralph J, eds. Forage Cell Wall Structure and Digestibility. American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, Soil Science Society of America; Madison, WI; 1993:105-132.
  12. Xu Z, Heuschele DJ, Lamb JFS, Jung H-JG, Samac DA. Improved forage quality in alfalfa (Medicago sativa L.) via selection for increased stem fiber digestibility. Agronomy. 2023;13(3):770.
  13. Pradhan Mitra P, Loqué D. Histochemical staining of Arabidopsis thaliana secondary cell wall elements. Journal of Visualized Experiments. 2014;(87):51381.
  14. De Micco V, Aronne G. Combined histochemistry and autofluorescence for identifying lignin distribution in cell walls. Biotechnic & Histochemistry. 2007;82(4–5):209-216.
  15. Kraus JE, et al. Astra Blue and Basic Fuchsin double staining of plant materials. Biotechnic & Histochemistry. 1998;73(5):235-243.
  16. Ursache R, Andersen TG, Marhavý P, Geldner N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 2018;93(2):399-412.
  17. Baldacci-Cresp F, et al. A rapid and quantitative safranin-based fluorescent microscopy method to evaluate cell wall lignification. The Plant Journal. 2020;102(5):1074-1089.
  18. Casero PJ, Knox JP. The monoclonal antibody JIM5 indicates patterns of pectin deposition in relation to pit fields at the plasma-membrane-face of tomato pericarp cell walls. Protoplasma. 1995;188(1-2):133-137.
  19. Pesquet E, Cesarino I, Kajita S, Pawlowski K. Physiological roles of lignins – tuning cell wall hygroscopy and biomechanics. New Phytologist. 2025;248(6):2674-2706.
  20. Jung HG, Engels FM. Alfalfa stem tissues: rate and extent of cell-wall thinning during ruminal degradation. NJAS: Wageningen Journal of Life Sciences. 2001;49(1):3-13.
  21. Yeung EC. A beginner’s guide to the study of plant structure. Tested Studies for Laboratory Teaching. 1998;19:125-142.
  22. Jensen, W.A. Botanical Histochemistry: Principles and Practice. Freeman W.H. & Co. San Francisco, CA. (1962).
  23. Ruzin, SE. Plant Microtechnique and Microscopy. Oxford University Press; New York, NY; 1999.
  24. Gronwald JW, Bucciarelli B. Comparison of stem morphology and anatomy of two alfalfa clonal lines exhibiting divergent cell wall composition. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2013;93(11):2858-2863.
  25. Dai R, et al. Overexpression MsJAR1 gene increased lateral branches and plant height in alfalfa (Medicago sativa L.). Scientific Reports. 2025;15(1):16956.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الحضن في سائل الكرشسيقان البرسيم الحجازيترسب اللجنينترسب البكتينقابلية هضم الساقصبغة ويزنرأحمر الروبيديومتغذية الأعلاف

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.