يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

سير عمل موحد لجمع عينات البراز البشرية واستخلاص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين آلياً باستخدام معالج الجسيمات المغناطيسية

252 مشاهدة

⸱

سبتمبر 11, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Gut Microbiome Division, SKAN Research Trust, 2Stem Cells Division, SKAN Research Trust

في هذه المقالة

ملخص

الهدف من هذا البروتوكول هو توحيد معايير جمع عينات البراز البشرية واستخلاص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (deoxyribonucleic acid) بشكل آلي باستخدام معالج الجسيمات المغناطيسية.

الملخص

أصبح تسلسل الميكروبيوم المعوي نهجاً مهماً لاستقصاء ديناميكيات المجتمعات الميكروبية في الحالات الصحية والمرضية. وقد ارتبطت التغيرات في التركيبة الميكروبية بالعديد من الاضطرابات المرتبطة بنمط الحياة والعمر، بما في ذلك السكري، وابيضاض الدم، والأمراض التنكسية العصبية. ونظراً لأن الكائنات الدقيقة المختلفة تظهر خصائص فسيولوجية ومتطلبات بيئية متباينة، فإن توحيد عمليات جمع عينات البراز ونقلها ومعالجتها يعد أمراً أساسياً للحفاظ على سلامة العينة وتقليل التباين التقني. ويمكن أن تؤثر الاختلافات التي تحدث أثناء المناولة ما قبل التحليلية واستخلاص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) على تحليلات الميكروبيوم اللاحقة وتؤثر على تفسير البيانات. يهدف هذا البروتوكول إلى تقديم سير عمل موحد لجمع عينات البراز البشرية والاستخلاص الآلي لـ DNA باستخدام MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit (طقم استخلاص الأحماض النووية) ونظام KingFisher Flex System (معالج الجسيمات المغناطيسية الآلي). يدمج سير العمل هذا بين المناولة المنضبطة للعينات والاستخلاص الآلي للأحماض النووية لتقليل التباين اليدوي وتحسين اتساق الإجراءات. يتضمن البروتوكول عمليات موحدة لجمع عينات البراز، وتخزينها، وتحضيرها، والاستخلاص الآلي، واستعادة الأحماض النووية من مصفوفات البراز المعقدة. وتظهر النتائج التمثيلية استعادة ناجحة لـ DNA مناسب للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك تسلسل جين 16S ribosomal ribonucleic acid (rRNA) وتسلسل الميتاجينوم العشوائي (shotgun metagenomic sequencing). يدعم سير العمل الموحد معالجة العينات القابلة للتكرار، ويسهل إمكانية التوسع في دراسات الميكروبيوم، ويعز قدراً أكبر من الاتساق عبر التجارب. يوفر العرض المرئي إرشادات عملية لتنفيذ معالجة موحدة لعينات البراز واستخلاص آلي للأحماض النووية لأبحاث الميكروبيوم المعوي.

المقدمة

يُعد ميكروبيوم الأمعاء نظاماً بيئياً ميكروبياً معقداً يؤثر على عملية التمثيل الغذائي للمضيف، والمناعة، والوظيفة العصبية، وترتبط صلتُه بشكل متزايد بأمراض متنوعة، بما في ذلك الاضطرابات الأيضية، ومرض باركنسون، والسرطان، والتنكس العصبي1,2. وهو يلعب دوراً هاماً في الحفاظ على الفسيولوجيا الخاصة بالمضيف من خلال التأثير على عملية التمثيل الغذائي، والوظيفة المناعية، وامتصاص العناصر الغذائية، والمقاومة ضد الكائنات الحية الدقيقة الممرضة3,4. وتعتبر قياسات الميكروبيوم القوية والقابلة للتكرار ضرورية لتحويل هذه الارتباطات إلى رؤى ميكانيكية وتطبيقات سريرية. لقد أحدثت التطورات في تقنيات تسلسل الجيل القادم (NGS) ثورة في فهمنا للمجتمعات الميكروبية المعقدة التي تستوطن الجهاز الهضمي. ومع ذلك، فإن المتغيرات السابقة للتحليل، مثل إجراءات جمع عينات البراز، وظروف التخزين، والمناولة، والنقل، وطرق استخلاص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA)، يمكن أن تؤدي إلى تغيير انتقائي في بنية المجتمع الميكروبي، وحصيلة الـ DNA، ونتائج التسلسل5,6. وغالباً ما تؤدي هذه التضاربات المنهجية إلى تعقيد المقارنات بين الدراسات المختلفة.

من بين الخطوات التحليلية الأولية الحرجة، يمثل استخلاص الـ DNA أحد أكثر العوامل تأثيراً في جودة بيانات الميكروبيوم7,8. يجب أن يعمل بروتوكول الاستخلاص المثالي باستمرار على إنتاج DNA عالي الجودة وذو وزن جزيئي مرتفع مع الحد الأدنى من التلوث عبر عدد كبير من العينات. ويمكن لمنصات استخلاص الأحماض النووية المؤتمتة أن تحسن من إمكانية تكرار النتائج، وتقلل من أخطاء المناولة اليدوية، وتخفض مخاطر التلوث، وتزيد من إنتاجية العمل. ويعتمد أداء منصات الاستخلاص المؤتمتة هذه بشكل كبير على معايير البروتوكول، بما في ذلك تجانس العينة، وظروف الطرق بالخرز (bead-beating)، وكيمياء التحلل، وظروف الحضن، والتعامل مع الخرز المغناطيسي9,10. لذا، فإن وضع سير عمل معياري يدمج الجمع الموحد لعينات البراز مع استخلاص الـ DNA المؤتمت يعد أمراً ضرورياً لتوليد مجموعات بيانات ميكروبيوم موثوقة وقابلة للتكرار.

نقدم هنا سير عمل موحد لجمع عينات البراز البشرية وتداولها واستخلاص الحمض النووي DNA آلياً باستخدام طقم استخلاص الأحماض النووية ومعالج الجسيمات المغناطيسية الآلي الموصوفين أعلاه. يركز البروتوكول على التداول المنضبط للعينات، والتحلل الميكانيكي والكيميائي الفعال، وإزالة المثبطات، وتدابير مراقبة الجودة المناسبة للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك تسلسل الأمبليكون لجين الحمض الريبوزي النووي الريبوسومي 16S (rRNA)، وتسلسل الجينوم الكامل، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (PCR)، وتسلسل الميتاجينوم العشوائي (shotgun metagenomic sequencing). يوفر العرض المرئي إرشادات عملية لمعالجة عينات البراز الموحدة واستخلاص الأحماض النووية آلياً لدعم أبحاث ميكروبيوم الأمعاء القابلة للتكرار والتوسع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أُجريت هذه الدراسة وفقاً لإرشادات لجنة أخلاقيات المؤسسة في صندوق SKAN للأبحاث، وحصلت على موافقة اللجنة (رقم الموافقة SKAN/IEC/2025/04). كما تم الحصول على موافقات مستنيرة مكتوبة من جميع المشاركين قبل جمع العينات.

ملاحظة: جميع الكواشف والمواد الاستهلاكية والمعدات مدرجة في جدول المواد.

1. تجميع طقم جمع عينات البراز

  1. قم بتجهيز طقم جمع عينات البراز الذي يحتوي على لاقط براز معقم، وأنبوب جمع معقم بغطاء لولبي (سعة 30–50 mL) ومعه ملعقة ملحقة، وأنبوب جمع مملوء مسبقاً بمحلول تثبيت منظم، وقفازات مخصصة للاستخدام مرة واحدة، ومواد ماصة، وكيس نقل قابل للإغلاق يحمل ملصق المخاطر البيولوجية، وورقة تعليمات (الشكل 1).
  2. ضع ملصقاً على كل أنبوب جمع يتضمن معرفاً فريداً للعينة، والتاريخ، ووقت الجمع باستخدام قلم تحديد دائم أو ملصق مطبوع مسبقاً.
  3. أرفق ورقة تعليمات تصف إجراءات جمع العينة، واحتياطات المناولة، وظروف التخزين، ومتطلبات النقل.
    ملاحظة: يتم توفير محلول التثبيت المنظم مملوءاً مسبقاً في أنبوب جمع البراز كجزء من طقم جمع البراز. لا تفصح الشركة المصنعة عن تركيب أو حجم محلول التثبيت المنظم. اجمع ما يقرب من 2–5 g من مادة البراز مباشرة في أنبوب الجمع المملوء مسبقاً وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

طقم جمع عينات البراز الذي يحتوي على قفازات، وأنبوب، وكيس للمواد الخطرة البيولوجية، وجهاز تجميع، وكتيب للتحليل.
الشكل 1. مكونات طقم جمع عينات البراز. 
يشتمل طقم جمع عينات البراز على قفازات تستخدم لمرة واحدة، وجهاز تجميع براز معقم، وأنبوب جمع براز معقم بغطاء لولبي ملحق به ملعقة مسطحة، وكيس نقل قابل للإغلاق يحمل علامة مخاطر بيولوجية، وكتيب تعليمات مقدم للمشاركين لجمع عينات البراز وتداولها وتخزينها ونقلها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. تحضير المشارك لجمع العينات

  1. وجّه المشارك لغسل يديه قبل جمع العينة.
  2. وجّه المشارك لإفراغ المثانة قبل عملية التبرز لتجنب تلوث عينة البراز بالبول.

3. جمع عينة البراز باستخدام جامع البراز

  1. ضع جامع براز معقماً على مقعد المرحاض لمنع التلامس بين عينة البراز ومياه المرحاض.
  2. بالنسبة لجامعات البراز اللاصقة، قم بطي الجهاز بعناية على طول الحواف المحددة دون تمزيقه. اتبع تعليمات الشركة المصنعة المرفقة مع جامع البراز، وثبّت الجهاز بإحكام في الجزء الخلفي من مقعد المرحاض لإنشاء سطح تجميع مستقر.
  3. بالنسبة لجامعات البراز غير اللاصقة، ضع الجهاز عبر وعاء المرحاض وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة لتوفير دعم مستقر.
  4. تأكد من عدم ملامسة جامع البراز لمياه المرحاض أثناء عملية جمع العينة.
  5. وجه المشارك لإتمام عملية الإخراج مباشرة فوق جامع البراز.
  6. ارتدِ القفازات المخصصة للاستخدام مرة واحدة والموجودة في مجموعة الجمع قبل التعامل مع العينة.
  7. افتح أنبوب الجمع المعقم واستخدم الملعقة الملحقة لجمع مادة البراز من أربع إلى خمس مناطق متميزة على الأقل من البراز، بما في ذلك السطح الخارجي واللب الداخلي. تؤدي هذه الطريقة عادةً إلى الحصول على ما يقرب من 2–5 g من مادة البراز، وهي كمية كافية لاستخلاص DNA.
  8. تجنب جمع مادة البراز التي لامست حواف جامع البراز أو أي أسطح خارجية.
  9. أغلق أنبوب الجمع بإحكام فور الانتهاء من جمع العينة.
  10. امزج عينة البراز جيداً مع محلول التثبيت (stabilization buffer) عن طريق رج أنبوب الجمع المغلق يدوياً وبقوة حتى يتم تعليق العينة بشكل متجانس ولا تبقى أي تكتلات كبيرة.
  11. ضع أنبوب الجمع المختوم في حقيبة نقل مضادة للتسرب وموسومة بعلامة المخاطر البيولوجية (biohazard) وتحتوي على مادة ماصة.
  12. أطلق جامع البراز بعناية في المرحاض مع البراز، مع التأكد من عدم انسكاب المحتويات. قم بتشغيل سيفون المرحاض للتخلص من جامع البراز والبراز معاً.

4. تخزين ونقل عينات البراز

  1. يتم تخزين العينات وفقاً لمواصفات محلول التثبيت المستخدم.
  2. تُحفظ العينات في درجة حرارة الغرفة إذا كان محلول التثبيت يدعم الحفظ في الظروف المحيطة. بدلاً من ذلك، تُخزن العينات عند 4°C للتخزين قصير المدى (≤24–48 h) أو عند −20°C إلى −80°C للتخزين طويل المدى.
  3. تُخزن العينات وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة. وتظل العينات التي تم جمعها باستخدام محلول التثبيت المستخدم في هذه الدراسة مستقرة لمدة تصل إلى سنتين في درجة حرارة الغرفة.
  4. تُنقل العينات في أكياس مخاطر بيولوجية مانعة للتسرب تحتوي على مواد ماصة لمنع التسرب والتلوث.
  5. يجب الحفاظ على العينات في ظروف درجة الحرارة الموصى بها أثناء النقل، مع استخدام حاويات معزولة وعناصر تبريد عند الحاجة.
  6. يجب ضمان الامتثال لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية واللوائح المحلية المعمول بها لنقل العينات البيولوجية.

5. استلام العينات وتسجيلها

  1. افحص كل عينة عند استلامها في المختبر للتأكد من دقة الملصقات التعريفية، وسلامة الأنبوب، وعدم وجود أي دليل على التسرب.
  2. خصص معرفاً خاصاً بالمختبر، إذا لزم الأمر، وسجل تاريخ ووقت الجمع، وظروف التخزين، ومدة النقل.
  3. استبعد العينات التي تظهر تسرباً، أو ملصقات تعريفية غير صحيحة، أو خللاً في السلامة.

6. تحضير الأطباق

ملاحظة: قم بتجهيز جميع الأطباق قبل البدء في سير عمل الاستخلاص. نَفِّذ جميع الخطوات التي تتضمن كواشف وعينات بيولوجية في بيئة نظيفة مع ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات وواقي العينين. الشكل 2 يظهر معالج الجسيمات المغناطيسية الآلي (الشكل 2أ)، ومواقع تحميل الطبق (الشكل 2ب)، ومحول طبق ذو آبار عميقة (الشكل 2ج)، وجهاز طرد مركزي متوافق مع الأطباق (الشكل 2D)، وجهاز تكسير بالخرز (الشكل 2هـ)، ودعم تبطييني (الشكل 2F)، وحامل الأطباق (الشكل 2G)، لوحة خرزات ذات 96 بئراً (الشكل 2H)، طبق ذو آبار عميقة (الشكل 2I)، ولوحة الشطف (الشكل 2J).

إعداد المعدات المختبرية لتحضير العينات وتحليلها، بما في ذلك جهاز الطرد المركزي وجهاز تحلل الأنسجة.
الشكل 2. المعدات والمواد الاستهلاكية المستخدمة في الاستخلاص الآلي للحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) من البراز. 
(A) معالج الجسيمات المغناطيسية الآلي. (B) موضع تحميل اللوحة داخل معالج الجسيمات المغناطيسية الآلي. (C) مهيئ اللوحة ذات الآبار العميقة للطرد المركزي. (D) جهاز طرد مركزي متوافق مع اللوحات. (E) مجانس مطحنة الخرز. (F) دعامة تبطين مستخدمة أثناء عملية الضرب بالخرز. (G) حامل (مهيئ) للوحة ذات الآبار العميقة لعملية الضرب بالخرز. (H) لوحة خرز ذات 96 بئراً مرفقة مع طقم استخلاص الأحماض النووية. (I) لوحة ذات آبار عميقة تحتوي على 96 بئراً. (J) لوحة استخلاص (Elution Plate) ذات 96 بئراً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

  1. أخرج لوحة مشط الرؤوس من عبوتها وجهزها لتحميلها في الجهاز.
  2. جهز لوحة الاستخلاص (الشكل 2J) بإضافة 200 µL من محلول الاستخلاص المرفق مع مجموعة استخلاص الأحماض النووية إلى كل بئر من آبار لوحة ذات 96 بئراً. أغلق اللوحة بغشاء لاصق شفاف لمنع التلوث، وأبقِ اللوحة مغلقة حتى يتم تحميلها في معالج الجسيمات المغناطيسية الآلي. ضع ملصقاً على اللوحة باسم "لوحة الاستخلاص".
  3. جهز لوحة الغسيل 4 بإضافة 1 mL من الإيثانول بتركيز 80% إلى كل بئر من آبار لوحة ذات آبار عميقة. أغلق اللوحة بغشاء لاصق لمنع التبخر والتلوث.
  4. جهز لوحة الغسيل 3 بإضافة 1 mL من الإيثانول بتركيز 80% المحضر حديثاً إلى كل بئر من آبار لوحة منفصلة ذات آبار عميقة. أغلق اللوحة بغشاء لاصق.
  5. جهز لوحة الغسيل 2 بإضافة 1 mL من محلول الغسيل إلى كل بئر من آبار لوحة ذات آبار عميقة. أغلق اللوحة بغشاء لاصق.
  6. جهز لوحة الغسيل 1 بإضافة 1 mL من محلول الغسيل إلى كل بئر من آبار لوحة ذات آبار عميقة. أغلق اللوحة بغشاء لاصق.

7. إعداد معالج الجسيمات المغناطيسية الآلي

  1. قم بتشغيل معالج الجسيمات المغناطيسية الآلي. تحقق من تثبيت الرأس المغناطيسي الصحيح ذو الـ 96 بئراً عميقاً وكتلة التسخين ذات الـ 96 بئراً عميقاً.
  2. قم بتشغيل بروتوكول فحص الجهاز المناسب (على سبيل المثال، بروتوكول Check_96dw_tip) باستخدام مشط رؤوس نظيف وصفحة آبار متوافقة وفارغة قبل معالجة العينات.
  3. تأكد من توفر برنامج الاستخلاص المطلوب على معالج الجسيمات المغناطيسية الآلي.
    ملاحظة: قد يؤدي استخدام رأس مغناطيسي أو كتلة تسخين غير صحيحة إلى تقليل حصيلة الحمض النووي وإتلاف الجهاز.

8. إجراء تحلل العينة

  1. قم بإعداد مخطط للصفيحة لتسجيل موقع كل عينة في صفيحة ذات 96 بئراً.
  2. قم بمركزة صفيحة الخرزات ذات 96 بئراً (Figure 2H) عند 2,750 × g لمدة 10 s باستخدام جهاز طرد مركزي متوافق مع الصفائح (Figure 2D) ومحول (Figure 2C) لتجميع الخرزات في قاع كل بئر.
    ملاحظة: تمنع هذه الخطوة فقدان الخرزات أثناء إزالة غطاء إغلاق الصفيحة.
  3. أزل غطاء إغلاق الصفيحة بعناية دون تحريك الخرزات.
  4. أضف 800 µL من محلول التحلل (lysis buffer) إلى كل بئر في صفيحة الخرزات.
  5. تجنب سحب الخرزات أثناء عملية الماصّة.
  6. قم بإذابة عينات البراز المجمدة في درجة حرارة الغرفة حتى تذوب تماماً. اخلط العينات برفق لجعها متجانسة، ثم ابدأ فوراً في استخلاص DNA. تجنب دورات التجميد والإذابة المتكررة لأنها قد تقلل من جودة وكمية DNA.
    ملاحظة: بالنسبة للعينات الطازجة، قم برج كل أنبوب عينة براز يحتوي على محلول التثبيت باستخدام جهاز vortex لمدة 5–10 s لضمان تجانس العينة.
  7. انقل 200 µL من كل عينة متجانسة إلى البئر المقابل في صفيحة الخرزات.
  8. استخدم ماصّة أحادية القناة مزودة برؤوس ماصّة (Tips) معقمة ومفلترة وواسعة الفتحة (مقطوعة) لنقل العينات. تجنب السحب المتكرر بالماصّة لتقليل فقدان الخرزات وما يتبع ذلك من انخفاض في كمية DNA المستخلصة.
  9. أغلق الصفيحة بإحكام باستخدام فيلم لاصق، مع التأكد من إغلاق جميع الآبار وحواف الصفيحة تماماً.

9. إجراء التحلل الميكانيكي (الطحن بالخرز)

  1. ثبّت الطبق المختوم في جهاز طحن الخرز (الشكل 2E) باستخدام حامل الطبق المناسب (الشكل 2G) ودعامة التبطين (الشكل 2F).
  2. وازن الجهاز بوضع طبق مساوٍ في الوزن مقابل طبق العينة.
  3. اضبط الجهاز على 30 Hz لمدة 2 min وابدأ التشغيل.
  4. اترك عملية التشغيل تستمر دون انقطاع.
  5. أخرج الطبق بعناية بعد انتهاء التشغيل دون المساس بالختم.
    ملاحظة: استخدم دعامة التبطين لمنع تلف الطبق أثناء عملية طحن الخرز.

10. إجراء معالجة ما بعد التحلل

  1. قم بطرد الطبق مركزياً عند 2,750 × g لمدة 5 min في درجة حرارة الغرفة باستخدام توزيع متوازن.
  2. انقل بعناية 400 µL من السائل الطافي من كل بئر إلى طبق آبار عميقة جديد مخصص كطبق العينات (Sample Plate).
  3. تجنب نقل أي خرزات خلال هذه الخطوة.
    ملاحظة: لا يحتوي طبق العينات على خرزات ولا يتطلب عملية طرد مركزي مسبقة.
  4. أحكم إغلاق طبق العينات إذا لم يتم المتابعة فوراً.
    ملاحظة: قم بتخزين طبق المستخلصات المغلق عند 4°C طوال الليل، إذا لزم الأمر. بدلاً من ذلك، قم بتخزين طبق العينات المغلق عند −20°C لمدة تصل إلى 3 أشهر. قم بإذابة العينات وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة قبل متابعة المعالجة.

11. تحضير خليط حبيبات الربط

  1. قم بتحضير خليط حبيبات الربط مباشرة قبل الاستخدام عن طريق دمج 500 µL من محلول ربط الأحماض النووية مع 20 µL من الحبيبات المغناطيسية لكل عينة. اخلط جيداً للحصول على معلق متجانس.
  2. احسب الحجم الإجمالي المطلوب من خليط حبيبات الربط بناءً على عدد العينات.
  3. بالنسبة لصفيحة كاملة مكونة من 96 بئراً، قم بتحضير خليط حبيبات الربط بإضافة 48.00 mL من محلول ربط الأحماض النووية و 1.92 mL من الحبيبات المغناطيسية إلى أنبوب مخروطي معقم. اخلط جيداً للحصول على حجم نهائي قدره 49.92 mL (520 µL لكل بئر).
    ملاحظة: قم بتحضير حجم كافٍ لبئر واحد أو بئرين إضافيين لتعويض التباين في عملية السحب والضخ بالماصة.
  4. اخلط معلق حبيبات الربط برفق عن طريق القلب حتى يصبح متجانساً.
  5. انقل خليط حبيبات الربط إلى خزان كواشف نظيف.
  6. مباشرة قبل التوزيع، أعد تعليق الحبيبات المغناطيسية عن طريق سحب وضخ المعلق بالماصة من ثلاث إلى أربع مرات لمنع ترسيب الحبيبات.
  7. وزع 520 µL من خليط حبيبات الربط في كل بئر من صفيحة العينات المجهزة باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  8. قم بالسحب والضخ بالماصة ببطء بسبب لزوجة المحلول، وتجنب تكون الفقاعات. أعد تعليق خليط حبيبات الربط برفق في خزان الكواشف قبل كل خطوة توزيع للحفاظ على توزيع موحد للحبيبات في جميع الآبار.

12. تعديل برنامج الجهاز MagMAX_Microbiome_Stool_Flex (برنامج الاستخلاص المعدل)

  1. قم بتنزيل وتثبيت برنامج BindIt (برنامج تحرير البروتوكولات) وفقاً لإرشادات الشركة المصنعة.
  2. قم بتنزيل برنامج الجهاز من الموقع الإلكتروني للشركة المصنعة.
  3. قم بتشغيل برنامج تحرير البروتوكول وانتظر حتى تكتمل عملية التهيئة.
  4. انقر فوق "فتح" (Open) واختَر برنامج الجهاز الذي تم تنزيله.
  5. عدّل معاملات البروتوكول كما هو موضح في الجدول ١.
  6. احفظ البروتوكول المعدل وأغلق البرنامج.
  7. قم بتوصيل الكمبيوتر بمعالج الجسيمات المغناطيسية الآلي باستخدام كابل USB أو كابل تسلسلي من نوع RS-232C.
    ملاحظة: تأكد من إيقاف تشغيل معالج الجسيمات المغناطيسية الآلي قبل توصيل الكمبيوتر.
  8. قم بتشغيل معالج الجسيمات المغناطيسية الآلي واتركه حتى يكمل عملية التهيئة.
  9. قم بتشغيل برنامج تحرير البروتوكول وتأكد من أنه يتعرف على معالج الجسيمات المغناطيسية الآلي.
  10. انقل برنامج الاستخلاص المعدل إلى معالج الجسيمات المغناطيسية الآلي.
  11. تأكد من نجاح نقل برنامج الاستخلاص المعدل، ثم أوقف تشغيل معالج الجسيمات المغناطيسية الآلي.
الخطوةإجراءالمعايير
1ارتباطامزج؛ 5 دورات تجميع؛ 37°C
2جمع الحبيبات5 دورات تجميع مغناطيسية
3غسلة 1امزج لمدة 20 ثانية × 3 دورات؛ 37°C
4الغسيل ٢اخلط لمدة 20 ثانية × 3 دورات؛ 37°C
5غسيل 3امزج لمدة 20 ثانية × دورتين؛ 37°C
6الغسل 4امزج؛ دورة واحدة؛ 37°C
7تجفيفاتركه ليجف في الهواء لمدة دقيقتين
8الاستخلاص (Elution)75°C؛ 6 دورات خلط؛ ميزة التسخين المسبق مفعلة
9جمع الخرزات3 دورات تجميع مغناطيسية
10انقل ناتج الشطفانقل الحمض النووي المنقى إلى لوحة الاستخلاص (Elution Plate)

الجدول 1: برنامج الاستخلاص الآلي لمعالج الجسيمات المغناطيسية.
ملخص لبرنامج الاستخلاص الآلي الذي ينفذه معالج الجسيمات المغناطيسية الآلي أثناء استخلاص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA). يتضمن البرنامج ربط الحمض النووي، وجمع الحبيبات المغناطيسية، وخطوات الغسل المتتالية، والتجفيف بالهواء، والاستخلاص، ونقل DNA المنقى إلى لوحة الاستخلاص. تدرج معاملات التشغيل لكل خطوة آلية.

13. إجراء استخلاص الحمض النووي الآلي

  1. قم بتشغيل معالج الجسيمات المغناطيسية الآلي (الشكل 2A) عن طريق تشغيل مصدر الطاقة الرئيسي متبوعاً بزر تشغيل الجهاز. انتظر حتى يكتمل نظام التهيئة.
  2. باستخدام لوحة تحكم الجهاز، اختر برنامج الاستخلاص المعدل وابدأ عملية التشغيل.
  3. عندما يطلب منك الجهاز ذلك، ضع لوحة مشط الرؤوس (tip comb plate) في الموضع 7 واضغط على Start للمتابعة. ارجع إلى الجدول 2 لمعرفة مواضع تحميل الألواح (الشكل 2B).
  4. قم بإزالة غشاء الختم من لوحة الاستخلاص (Elution Plate) وضعها في الموضع 6، مع التأكد من التوجيه الصحيح (محاذاة البئر A1 مع الموضع المخصص). اضغط على Start للمتابعة.
  5. قم بإزالة غشاء الختم من لوحة الغسيل 4 (Wash Plate 4) التي تحتوي على ethanol بتركيز 80%، وضع اللوحة في الموضع 5 بالتوجيه الصحيح، ثم اضغط على Start.
  6. قم بإزالة غشاء الختم من لوحة الغسيل 3 (Wash Plate 3) التي تحتوي على ethanol بتركيز 80%، وضع اللوحة في الموضع 4، ثم اضغط على Start.
  7. قم بإزالة غشاء الختم من لوحة الغسيل 2 (Wash Plate 2)، وضع اللوحة في الموضع 3، ثم اضغط على Start.
  8. قم بإزالة غشاء الختم من لوحة الغسيل 1 (Wash Plate 1)، وضع اللوحة في الموضع 2، ثم اضغط على Start.
  9. عندما يطلب منك الجهاز ذلك، ضع لوحة العينات (Sample Plate) في الموضع 1، مع التأكد من التوجيه الصحيح.
  10. أغلق غطاء الجهاز واضغط على Start لبدء عملية الاستخلاص الآلية.
  11. اترك البرنامج يعمل دون انقطاع حتى يكتمل (حوالي 35–40 min).
    ملاحظة: يلخص الجدول 1 برنامج الاستخلاص الآلي الذي ينفذه الجهاز.
طبقالموضعنوع الطبقكاشفالحجم لكل بئر
طبق العينات1لوحة ذات 96 بئراً عميقةخليط محلل العينة + خرز الربط920 µL
لوحة الغسيل 12طبق بـ 96 بئرًا عميقًامحلول الغسل المنظم1,000 µL
غسل اللوحة 23صفيحة ذات 96 بئراً عميقةمحلول الغسل المنظم1,000 µL
غسل اللوحة 34لوحة ذات 96 بئراً عميقاًإيثانول بتركيز 80%1,000 µL
غسل اللوحة 45صفيحة ذات 96 بئراً عميقةإيثانول بتركيز 80%1,000 µL
صفيحة الاستخلاص6صفيحة ذات 96 بئراًمحلول الاستخلاص المنظم200 µL
لوحة مشط الرؤوس7لوحة ذات آبار عميقة قياسيةمشط رؤوس الماصات لـ 96 بئراً عميقاًنظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدنا بالنص الإنجليزي المطلوب ترجمته إلى اللغة العربية وفقًا للمعايير المذكورة.

الجدول 2: تكوين تحميل الطبقة لاستخلاص الحمض النووي الآلي.
مواضع تحميل الطبقة، وأنواع الطبقات، والكواشف، وأحجام الكواشف المستخدمة لاستخلاص DNA الآلي باستخدام معالج الجسيمات المغناطيسية. تحتوي طبقة العينات (Sample Plate) على خليط محلل العينة وخرزات الربط. تشير N/A إلى عدم إضافة أي كاشف سائل إلى طبقة مشط الرؤوس (Tip Comb Plate).

​14. استخلاص وتخزين الأحماض النووية

  1. افتح الجهاز بعد اكتمال التشغيل وقم بإزالة لوحة الاستخلاص (Elution Plate) بعناية لتجنب انسكاب المستخلصات.
    ملاحظة: في حالة وجود آثار مرئية لحبيبات مغناطيسية منقولة في لوحة الاستخلاص، انقل المستخلصات إلى لوحة قياسية ذات 96 بئراً وضع اللوحة على حامل مغناطيسي لمدة 5–10 min. انقل السائل العلوي المصفى إلى لوحة 96 بئراً جديدة أو أنابيب مصنفة بشكل مناسب باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  2. انقل الحمض النووي DNA المستخلص إلى أنابيب أو لوحات تخزين مصنفة بشكل مناسب.
  3. خزن الحمض النووي DNA المستخلص عند 4°C للاستخدام قصير المدى، أو عند −20°C للتخزين لمدة تصل إلى 6 أشهر، أو عند −80°C للتخزين طويل المدى.

15. إجراء عملية التنظيف بعد التشغيل

  1. قم بإزالة جميع الأطباق المستخدمة وأمشاط الرؤوس من معالج الجزيئات المغناطيسية الآلي.
  2. تخلص من جميع المواد الاستهلاكية وفقاً لإرشادات السلامة البيولوجية والتخلص من النفايات الكيميائية المعتمدة في المؤسسة.
  3. نظف أي انسكابات باستخدام مطهر مختبري مناسب.
  4. أغلق معالج الجزيئات المغناطيسية الآلي، ثم أغلق مصدر الطاقة الرئيسي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم جمع عينات براز من سبعة مشاركين بنجاح باستخدام سير عمل الجمع الموصوف، مما نتج عنه عينات ذات كتلة كافية وقوام مناسب للمعالجة اللاحقة. خُزنت العينات في درجة حرارة الغرفة بعد عملية الجمع. أظهرت غالبية العينات ملمساً ولوناً موحداً، بما يتفق مع ظروف الجمع والتخزين المناسبة، بينما أظهرت مجموعة فرعية صغيرة تبايناً طفيفاً في القوام، وهو ما قد يعكس الاختلافات البيولوجية بين المشاركين. لم يلاحظ وجود أي تلوث أو تسرب مرئي أثناء النقل، وتمت معالجة جميع العينات ضمن نافذة الاستقرار المعتمدة لطقم الجمع (تصل إلى سنتين في درجة حرارة الغ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر البروتوكول الموصوف هنا سير عمل موحد لجمع عينات البراز البشري واستخلاص الحمض النووي (DNA) آليًا لدراسات الميكروبيوم. وتشمل الخطوات الحرجة أخذ عينات براز ممثلة من مناطق متعددة من البراز، والتجانس التام باستخدام محلول التثبيت المنظم، والتخزين والنقل السليمين وفقًا للشروط الموصى بها، والتحلل الميكانيكي الفعال، والتعامل الدقيق أثناء الاستخلاص الآلي. ويؤدي الالتزام المستمر بهذه الخطوات إلى تقليل التباين التقني ودعم استعادة DNA بشكل قابل للتكرار. وقد حددت دراسات سابقة بشكل مماثل جمع العينات، وشروط التخزين، والتجانس، واستخل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود أي تضارب في المصالح مالية أو غير مالية.

شكر وتقدير

نعرب عن خالص امتناننا لصندوق SKAN Research Trust (الهند) لتوفير الموارد والبيئة التعاونية التي جعلت هذا العمل ممكناً. كما نشكر الدكتورة Anushree Kogje على مساعدتها في مراجعة الحقائق والدعم التحريري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
إيثانول بتركيز 80% (مُحضّر من الإيثانول المطلق)MerckET016100يُحضّر حديثاً من الإيثانول المطلق وفقاً لما هو موضح في البروتوكول.
مادة ماصةKimtech34256مُدرج في حقيبة النقل.
غشاء إحكام إغلاق الصفائح اللاصقApplied Biosystems4306311غشاء MicroAmp اللاصق الشفاف.
معالج الجسيمات المغناطيسية الآلي (نظام KingFisher Flex Purification System برأس يحتوي على 96 بئراً عميقة)Thermo Fisher Scientific5400630نظام مؤتمت لاستخلاص الأحماض النووية.
حقيبة نقل قابلة للإغلاق وموسومة بعلامة الخطر البيولوجيZymo ResearchR180حقيبة نقل مانعة للتسرب لنقل العينات.
برنامج BindItThermo Fisher Scientific5189009البرمجيات المستخدمة لتعديل ونقل بروتوكول الاستخلاص الآلي.
أنبوب تجميع مزود بملعقة (30–٥٠ مل)Zymo ResearchR180أنبوب جمع معقم بغطاء لولبي.
دعم التوسيدQIAGEN69984مجموعة محولات TissueLyser (تُستخدم كدعامة تخميد أثناء عملية الطحن بالكرات).
طبق عميق الآبار (96 بئراً)Thermo Fisher Scientific95040460لوحة KingFisher ذات الآبار العميقة سعة 96 بئراً.
قفازات تستخدم لمرة واحدةZymo ResearchR180يُوصى باستخدام قفازات خالية من المسحوق.
محلول استخلاصApplied BiosystemsA42357مُزوّد مع مجموعة MagMAX Microbiome Ultra لعزل الأحماض النووية.
جامع البرازZymo ResearchR180جهاز جمع عينات معقم.
كتلة تسخين (96 بئراً عميقة)Thermo Fisher Scientificمُورّد مع الجهازمكون من نظام تنقية KingFisher Flex.
معطف المختبرمورد محلينظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته من الإنجليزية إلى العربية وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة.معدات الوقاية الشخصية.
محلول التحلل المنظمApplied BiosystemsA42357مرفق مع طقم MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
الخرز المغناطيسيApplied BiosystemsA42357موردة مع طقم MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
رأس مغناطيسي (96 بئراً عميقاً)Thermo Fisher Scientificمرفق مع 540630رأس مغناطيسي بـ 96 بئراً عميقة مُزوَّد مع نظام KingFisher Flex.
حامل مغناطيسي (96 بئراً)Thermo Fisher Scientific1232Dمطلوب فقط في حال ملاحظة انتقال للخرزات المغناطيسية.
ماصة متعددة القنواتEppendorf3125000052متوافق مع الأطباق ذات الـ 96 بئراً.
مقياس الطيف الضوئي NanoDropThermo Fisher ScientificND-ONE-Wتُستخدم لتحديد نسب الامتصاص A260/280 وA260/230.
منظم ربط الأحماض النوويةApplied BiosystemsA42357مُورّد مع طقم MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
قلم تحديد دائمSharpie3002وبدلاً من ذلك، استخدم ملصقات مطبوعة مسبقاً.
رؤوس الماصات، مُفلترة ومعقمة (10 µL)Tarsons528100رؤوس ترشيح مدرجة معقمة.
رؤوس ماصات، معقمة ومفلترة (200 µL)Tarsons528104رؤوس مرشحات مدرجة معقمة.
رؤوس ماصات، معقمة ومُرشحة (1,000 µL)Tarsons529106رؤوس ترشيح معقمة؛ تُقص لتحضير رؤوس واسعة الفتحة حيثما يُشار إلى ذلك في البروتوكول.
محول أطباق لجهاز الطرد المركزيEppendorf5820710004مهايئ الصفائح ذات الآبار العميقة للدوار A-2-DWP-AT.
جهاز طرد مركزي متوافق مع الأطباق المخبريةEppendorf5810متوافق مع المهايئ Rotor A-2-DWP-AT.
حامل أطباق للطحن بالخرزQIAGEN69984مجموعة محولات TissueLyser 2 × 96.
ملصقات مطبوعة مسبقاً (اختياري)براديBBP12بديل للقلم الدائم.
مقايسة Qubit dsDNA HSThermo Fisher ScientificQ3231مقايسة فلورية تُستخدم لتقدير كمية الحمض النووي DNA.
مقياس الفلورية QubitThermo Fisher ScientificQ327الجهاز المستخدم للتقدير الكمي للحمض النووي DNA باستخدام القياس الفلوري.
خزان الكواشفThermo Fisher Scientific8093خزان كاشف المصفوفة.
محلول منظم لتثبيت العيناتZymo ResearchR180طقم جمع عينات البراز DNA/RNA Shield.
أنبوب مخروطي معقمHiMediaTCP106Hتُستخدم لتحضير خليط حبيبات الربط.
جهاز التجانس بالكرات TissueLyser IIIQIAGEN9003240جهاز التحلل الميكانيكي.
لوحة مشط الرؤوسThermo Fisher Scientific97002534مشط رؤوس KingFisher 96 للمغناطيسات ذات الآبار العميقة.
محلول غسيل منظمApplied BiosystemsA42357موردة مع طقم MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.

المراجع

  1. Joshi D, et al. Roles of human gut microbiota in metabolic, neurodegenerative, cardiovascular and gastrointestinal diseases. Discov Biotechnol. 2026;3(1):8. doi:10.1007/s44340-026-00053-2.
  2. Jin X, et al. Gut microbiota and Parkinson’s disease: exploring pathogenesis and potential therapeutic strategies from a gut-brain axis perspective. iScience. 2026;29(2):114185. doi:10.1016/j.isci.2025.114185.
  3. Hou K, et al. Microbiota in health and diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):135. doi:10.1038/s41392-022-00974-4.
  4. Valencia S, et al. Human gut microbiome: a connecting organ between nutrition, metabolism, and health. Int J Mol Sci. 2025;26(9):4112. doi:10.3390/ijms26094112.
  5. Panek M, et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota: effects of collection, storage, DNA extraction and next-generation sequencing technologies. Sci Rep. 2018;8(1):5143. doi:10.1038/s41598-018-23296-4.
  6. Ece G, et al. Basic microbiome analysis: analytical steps from sampling to sequencing. Microorganisms. 2026;14(2):387. doi:10.3390/microorganisms14020387.
  7. Bharti R, Grimm DG. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Brief Bioinform. 2021;22(1):178-193. doi:10.1093/bib/bbz155.
  8. Zoruk P, et al. Impact of DNA extraction techniques and sequencing approaches on microbial community profiling accuracy. Front Microbiomes. 2025;4:1688681. doi:10.3389/frmbi.2025.1688681.
  9. Wallinger C, et al. Evaluation of an automated protocol for efficient and reliable DNA extraction of dietary samples. Ecol Evol. 2017;7(16):6382-6389. doi:10.1002/ece3.3197.
  10. Kwa WT, Sim CK, Low A, Lee JWJ. A comparison of three automated nucleic acid extraction systems for human stool samples. Microorganisms. 2024;12(12):2417. doi:10.3390/microorganisms12122417.
  11. Demkina A, et al. Benchmarking DNA isolation methods for marine metagenomics. Sci Rep. 2023;13(1):22138. doi:10.1038/s41598-023-48804-z.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

استخلاص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجينميكروبيوم الأمعاءتسلسل الميكروبيومتداول العيناتاستعادة الحمض النوويتسلسل جين 16S rRNAالميتاجينوميات العشوائيةتخزين العينات

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.