تقدم هذه الدراسة الحاسوبية سير عمل مدرك للأقسام المرجعية لمقارنة المجموعات النسخية للفيروسات التنفسية المتاحة علنًا، مما يثبت أن استجابات المضيف في الأنف والدم تظهر توافقاً محدوداً على مستوى الجينات، ولكنها تنتج وحدات محددة لكل قسم، قابلة للتكرار وذات تفسير بيولوجي عبر مجموعات بيانات مستقلة، ومقارنات سريرية، وتعافٍ طولي، وتحليلات المتانة.
مقالة بحثية
تقييم معياري مدرك للمقاصير لترانسكريبتومات الفيروسات التنفسية لوحدات استجابة المضيف في الأنف والدم: دراسة حوسبية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تُعد بيانات ترانسكريبتوم الفيروسات التنفسية العامة ذات قيمة كبيرة لدراسة استجابات المضيف، إلا أن الاختلافات في مصدر الأنسجة، وتعريف المجموعة الضابطة، وتصميم الدراسة يمكن أن تؤدي إلى تضارب في التحليلات المجمعة. لقد طورنا سير عمل حاسوبي مدرك للمقصورات الحيوية لتحديد ما إذا كان يمكن تحديد نشاط استجابة المضيف القابل للتكرار مع الحفاظ على السياق البيولوجي للأنف والدم. استُخدمت مجموعة GSE117827 المقترنة للأطفال كمجموعة بيانات مرجعية، والتي ضمت ترانسكريبتومات لمسحات أنفية ودم كامل من حالات الإصابة بالفيروسات البيكورناوية ذات الأعراض، والإصابة بالفيروس المخلوي التنفسي ذات الأعراض، والكشف عن الفيروسات البيكورناوية بدون أعراض، وضوابط سلبية للفيروسات. بعد التصفية بناءً على لجنة تسمية الجينات البشرية (HGNC)، تم تحليل 27,685 جينًا. تم تحديد وحدات منفصلة مكونة من 50 جينًا مشفرًا للبروتين للأنف والدم من أعلى الاستجابات الإيجابية وتم تثبيتها قبل التقييم الخارجي. كانت التأثيرات على مستوى الجينات في الأنف والدم مستقلة تقريبًا (Pearson r = 0.015)، وتشاركت الوحدات في ستة جينات متداخلة استكشافية في التصنيف (Jaccard index = 0.064). ومع ذلك، فصلت وحدة الأنف بين الإصابة والمجموعات الضابطة في مجموعات مستقلة للمجاري التنفسية العلوية، بمساحات تحت منحنى خصائص تشغيل المستقبل (AUROCs) بلغت 0.749 و 0.693 و 0.609، بينما حققت وحدة الدم AUROCs بلغت 0.832 و 0.924 و 0.870 في مجموعات دم خارجية. وفي بيانات الإصابة الطبيعية الطولية، انخفضت الدرجات المتطابقة من مرحلة المرض الحاد إلى مرحلة الخروج من المستشفى، مع فروق مقترنة بلغت 0.436 للعينات الأنفية و 0.330 للدم. حددت ثلاث مجموعات بيانات مرجعية إضافية تضم 666 عينة خارجية، إلى جانب قيم صفرية لجينات عشوائية، ومسحات لحجم الوحدات، واستقرار البوتستراب، وارتباطات برامج العلامات، وتقسيم التباين، مدى قوة وقيود سير العمل. ظلت مجموعة Pandya المكونة من 33 حمض ريبونوكلييك رسول (mRNA) أقوى في التمييز بين الإصابات الفيروسية والبكتيرية، بينما ارتفعت وحدة الدم أيضًا في حالات الالتهاب الرئوي البكتيري. تدعم هذه النتائج استخدام الوحدات الخاصة بالمقصورات كدرجات نشاط استجابة مضيف قابلة لإعادة الاستخدام لمقارنة المجموعات وتتبع التعافي، بدلاً من كونها مؤشرات حيوية عالمية شاملة للأنسجة أو مصنفات ممرضات مستقلة.
المقدمة
تُستخدم البصمات النسخية للمضيف على نطاق واسع لتصنيف المتلازمات المعدية ومقارنة الاستجابات المناعية عبر مسببات الأمراض المختلفة1,2,3,4,5. وغالباً ما تنشط الفيروسات التنفسية جينات محفزة للإنترفيرون (ISGs) متداخلة، ووسطاء التهابيين، ومسارات عرض المستضدات6,7,8,9,10. كما تُظهر الدراسات المزدوجة والطولية الحديثة أن الاستجابات المحلية في الممرات الهوائية والاستجابات الجهازية قد تختلف من حيث التوقيت، والتركيب الخلوي، والقدر11. وتمتد هذه المسألة إلى ما هو أبعد من الإنفلونزا، والفيروس المخلوي التنفسي (RSV)، والفيروس الأنفي، وSARS-CoV-2. ولا يزال الفيروس الميتابنيوموي البشري سبباً مهماً للأمراض التنفسية، ومع ذلك فإن الأدبيات المتعلقة باستجابة المضيف والتدخلات العلاجية الخاصة به لا تزال في طور التطوير12,13. وتؤكد هذه الملاحظات عبر إصابات الفيروسات التنفسية بشكل أكبر على وجود اختلافات بين استجابات المضيف المحلية في الممرات الهوائية والاستجابات الجهازية14. وبالنسبة للدراسات الحسابية الخاصة بالعلاقة بين المضيف والفيروس، فإن السؤال العملي لا يقتصر فقط على ما إذا كانت الاستجابة موجودة، بل يتعلق بما إذا كان يمكن إعادة استخدام البيانات العامة من خلال سير عمل شفاف يحافظ على سياق الأنسجة ويؤدي إلى درجات استجابة للمضيف قابلة للتكرار.
لم يتم تصميم معظم مجموعات بيانات النسخ (transcriptome) للفيروسات التنفسية المتاحة للعموم من أجل استدلال دقيق عبر الفيروسات المختلفة أو الأنسجة المختلفة. فغالباً ما تتباين مصادر الأنسجة، والتوقيت، والشدة، والعمر، وتعريف المجموعة الضابطة، والمنصة المستخدمة بشكل متزامن. كما أن مجموعات بيانات التعبير عالية الإنتاجية عرضة للتغيرات التقنية غير المرغوب فيها والتغيرات على مستوى الدراسة15,16. وبناءً على ذلك، يمكن للتحليل التجميعي أن يكشف عن بصمة قوية للإنترفيرون أو استجابة التهابية مع طمس مصدرها. تلتقط عينات الأنف البيولوجيا المناعية الظهارية والمخاطية، بينما يعكس الدم الكامل استجابات كريات الدم البيضاء الجهازية. إن معاملة هذه المقصورات على أنها قابلة للتبادل يجعل حساب الدرجة سهلاً ولكنه يجعل تفسيرها صعباً.
لقد بنينا التحليل حول GSE117827، وهي مجموعة متوافقة من عينات الأنف والدم من دراسة واحدة، بدلاً من أكبر مجموعة اكتشاف متاحة17. هذه المجموعة صغيرة، ولكنها تقلل من العوامل المربكة بين الدراسات عند مقارنة أحجام التأثير في الأنف والدم. وتشمل المجموعة حالات الإصابة بفيروس بيكورنافيروس المصحوبة بأعراض، والإصابة بفيروس RSV المصحوبة بأعراض، والكشف عن فيروس بيكورنافيروس بدون أعراض، وعينات ضابطة سلبية للفيروسات. وبناءً على ذلك، استخدمناها فقط كمرجع لوحدات منفصلة خاصة بكل مقصورة. وقد تم تثبيت عضوية الوحدات قبل إجراء الاختبارات الخارجية. كما تم فحص استقرار اختيار المجموعة الصغيرة من خلال إعادة أخذ العينات بطريقة البوتستراب الطبقية، والقيم الصفرية للجينات العشوائية، وتحليلات الحساسية لحجم الوحدة.
أضفنا طبقة قياس مرجعية تتضمن مقارنات بكتيرية وغير معدية. تحتوي مجموعة GSE63990 على عينات من الدم الكامل لحالات أمراض الجهاز التنفسي الحادة المصنفة كفيروسية أو بكتيرية أو غير معدية18. وتحتوي مجموعة GSE40012 على حالات التهاب رئوي حاد مكتسب من المجتمع، ومتلازمة الاستجابة الالتهابية الجهازية (SIRS)، وعينات ضابطة من أصحاء19. وتختبر هذه المجموعات ما إذا كانت الوحدة تعكس نشاط الاستجابة العامة للعائل أم أنها محددة لفئة معينة من المسببات المرضية. أما مجموعة GSE53543 فقد تم تحليلها بشكل منفصل كمعيار مرجعي لاختلال الخلايا اللمفاوية أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) خارج الجسم الحي نتيجة الإصابة بالفيروس الأنفي. وهي تقيس استجابة الكريات البيضاء تحت تأثير محفز مضبوط، ولكنها لا تعادل العدوى الطبيعية.
إن فرضيتنا محافظة عن قصد؛ فنحن لا نحاول إثبات وجود بصمة مضادة للفيروسات عالمية من بيانات عامة غير متجانسة. وبدلاً من ذلك، نتساءل عما إذا كان سير العمل المدرك للمقصورة (compartment-aware workflow) يمكن أن ينتج درجات وحدات تظل مفيدة بعد الاختبار الخارجي. والغرض المقصود من هذا الاستخدام هو أن يكون مكملاً للمصنفات التشخيصية مثل Pandya 33-mRNA. وتقوم هذه الوحدات بقياس نشاط استجابة المضيف في الأنف والدم عبر المجموعات، ومراحل التعافي، وتدرجات الأعراض، وهي ليست مصممة لتحديد فئة الممرض.
البروتوكول
أعادت هذه الدراسة تحليل بيانات مجهولة الهوية ومتاحة للعامة، ولم تتضمن أي عمليات توظيف جديدة أو تدخلات أو جمع عينات. وبناءً على ذلك، لم تكن هناك حاجة إلى موافقة أخلاقية مؤسسية أو موافقة مستنيرة جديدة لهذا التحليل الثانوي الحالي. وقد ذكر منشئو البيانات المعنيون الحصول على الموافقة الأخلاقية والموافقة المستنيرة للدراسات الأصلية.
تصميم الدراسة ومنطق سير العمل
أجرينا دراسة معلوماتية حيوية استرجاعية للبيانات العامة باستخدام مجموعات بيانات مودعة في قاعدة بيانات Gene Expression Omnibus20,21. لم يتم استخراج عينات مرضى جديدة، أو إجراء تجارب زراعة خلوية، أو نماذج حيوانية، أو عمليات تحقق مخبرية. اعتمد سير العمل تصميماً يرتكز على "المرساة أولاً" (anchor-first design)؛ حيث استُخدمت مجموعة البيانات GSE117827 لتقدير حجم التأثير، وبناء الوحدات (modules)، والتوافق بين المقصورات، وتحليل تدرج الأعراض. ولم يتم إدخال مجموعات البيانات المستقلة إلا بعد تحديد عضوية الوحدات. تضمن سير العمل تثبيت المقصورات المزدوجة، ورسم الخرائط وفق نظام HGNC والتصفية للبروتينات المشفرة، وبناء وحدات منفصلة للأنف والدم، والتحقق من التطابق النسيجي والطولي، والمعايرة السريرية، وتحليلات المتانة. وشملت التحليلات التأكيدية الاختبارات المقفلة للتطابق النسيجي والطولي، بينما كانت تحليلات الجينات المتداخلة، وتدرج الأعراض، وبرنامج العلامات، وتحليلات التباين استكشافية أو وصفية.
المجموعة المرجعية والتباين الأساسي
تتضمن مجموعة البيانات GSE117827 ملفات تعبير جيني من مسحات أنفية وعينات دم كاملة لـ 26 طفلاً: 9 حالات مصابة بفيروس بيكورنافيروس (picornavirus) ظهرت عليها أعراض، و5 حالات تم فيها الكشف عن فيروس بيكورنافيروس دون أعراض، و6 حالات مصابة بالفيروس المخلوي التنفسي (RSV) ظهرت عليها أعراض، و6 عينات ضابطة سلبية للفيروسات دون أعراض17. افتقرت حالتان من حالات RSV إلى عينات دم. وبناءً على ذلك، تضمن التصميم المرجعي الكامل 50 عينة، واحتوى التباين الأساسي بين "المصابين" و"المجموعة الضابطة" على 40 عينة بعد استبعاد حالات الكشف عن بيكورنافيروس غير المصحوبة بأعراض من بناء الوحدات (module construction). بالنسبة للتباين الأساسي، تم تصنيف عينات بيكورنافيروس ذات الأعراض وعينات RSV ذات الأعراض على أنها "مصابة"، بينما صُنفت العينات السلبية للفيروسات دون أعراض على أنها "ضوابط". ولم تُعامل حالات الكشف عن بيكورنافيروس غير المصحوبة بأعراض كضوابط لأن الكشف عن الفيروس في غياب الأعراض يختلف بيولوجياً عن الحالة الصحية السلبية للفيروسات. وقد استُبعدت هذه العينات من بناء الوحدات واستُخدمت لاحقاً لتحليل تدرج الأعراض.
تخطيط المسابر والمعالجة المسبقة
تم تحليل ملف GSE117827 على منصة GPL23126. وقد تم ربط معرفات العناقيد النسخية برموز الجينات باستخدام ملف التعليقات التوضيحية Clariom D Human na36, hg38 الموزع عبر منصة GEO GPL24539. تم الاحتفاظ فقط بالرموز المعتمدة من HGNC22. كما تم استبعاد مسابر التحكم، ومسابر ERCC، والعناقيد النسخية غير المخططة، والرموز غير المعتمدة. وفي حال وجود عناقيد نسخية متعددة مرتبطة بنفس الرمز المعتمد، تم دمجها عن طريق حساب وسيط التعبير. وبعد عمليات التصفية والدمج، توفرت 27,685 جينة لتحليل المرساة. تم تطبيق تحويل log₂(x + 1) فقط عندما تجاوز المئوي 95 من مصفوفة التعبير قيمة 50، مما يشير إلى مقياس شدة غير لوغاريتمي. تم استبعاد الجينات التي تحتوي على قيم مفقودة بنسبة تزيد عن 20%؛ واستُبدلت القيم المفقودة المتبقية بالوسيط الخاص بكل جينة. بعد ذلك، تم توحيد كل جينة عبر جميع العينات في تلك المجموعة من البيانات وفق المعادلة z = (x − mean)/sample standard deviation (ddof = 1). وقد خُصصت قيمة معيارية قدرها 0 للجينات ذات التباين الصفري. واقتصر بناء الوحدات (Module construction) على المدخلات المصنفة كجينات مشفرة للبروتين في مجموعة HGNC الكاملة.
تحليل حجم التأثير وبناء الوحدة
تم تحليل الحجيرات الأنفية والدموية بشكل منفصل. وقورنت العينات الفيروسية ذات الأعراض مع ضوابط سلبية للفيروس باستخدام فروق المتوسطات المعيارية لـ Hedges g واختبارات Welch ثنائية الجانب23. تم حساب Hedges g كفرق المتوسط بين المصاب والضابط مقسوماً على الانحراف المعياري المجمع ومضروباً في تصحيح العينات الصغيرة 1 − 3/(4df − 1)، حيث df = ninfected + ncontrol − 2. تم تنفيذ اختبارات Welch مع تباينات غير متساوية. كما تم حساب معدلات الاكتشاف الخاطئة لـ Benjamini–Hochberg عبر جميع الجينات المختبرة داخل كل حجيرة24. ونظراً لأنه لم يستوفِ أي جين مشفر للبروتين المزيج الصارم المحدد مسبقاً من FDR < 0.05 و Hedges g > 0.8 في مجموعة المرتكز الصغيرة، فقد تم ترتيب الجينات ذات التأثير الإيجابي أولاً حسب القيمة الاحتمالية P التصاعدية لاختبار Welch ثنائي الجانب، ثم حسب Hedges g التنازلية، مع استخدام رمز الجين كفاصل نهائي حتمي في حال التساوي. شكلت أفضل 50 جيناً كل وحدة أساسية. تم اختيار خمسين جيناً مسبقاً كحجم وحدة متوسط يحافظ على الاتساع البيولوجي مع الحد من فقدان الجينات المفقودة عبر المنصات. لم يتم ضبط حجم هذه الوحدة وفقاً لـ AUROC خارجي. وأدت تحليلات الحساسية باستخدام 10 و 25 و 50 و 100 و 200 جين إلى نفس نتيجة فصل المرتكز النوعية. كان الهدف هو إمكانية التكرار على مستوى الوحدة، وليس اكتشاف جين واحد.
التوافق عبر الحجرات
تمت مواءمة تقديرات Hedges g للأنف والدم حسب الجين ومقارنتها باستخدام ارتباطات بيرسون وسبيرمان. وتم تلخيص التداخل بين أهم 50 وحدة في الأنف وأهم 50 وحدة في الدم من خلال عدد التداخل ومؤشر جاكارد. وقد تم تفسير الجينات المتداخلة كمرشحات استكشافية لتداخل الرتب عبر الحجرات بدلاً من كونها مؤشرات حيوية محفوظة ومثبتة.
التحقق الخارجي المطابق للأنسجة
استخدم التحقق من درجات الوحدة مجموعات بيانات عامة مستقلة ذات مجموعات مصدرية قابلة للتفسير. شمل التحقق من المسالك الهوائية العلوية عينات غسيل أنفي لـ RSV من مجموعة GSE41374 ومجموعات بيانات SARS-CoV-2 رقم GSE152075 وGSE156063. وشمل التحقق من الدم مجموعة GSE171110 ووحدتين من GSE38900 تم تطبيعهما بشكل منفصل: GPL10558 (36 عينة؛ 28 RSV و8 ضوابط) وGPL6884 (138 عينة؛ 107 RSV و31 ضابطاً). وفي كل مجموعة بيانات خارجية، تم ربط المجسات برموز HGNC، وتم دمج الرموز المكررة عن طريق متوسط التعبير. كما طُبقت قواعد التحويل ذاتها، وتصفية القيم المفقودة، والتعويض بالوسيط، وقواعد التقييس z لكل جين المستخدمة في مجموعة البيانات المرجعية ضمن كل مجموعة بيانات. وحُسبت درجة الوحدة كمتوسط غير موزون لقيم التعبير المقيسة لجينات الوحدة الممثلة. وتم تسجيل AUROC، ومتوسط الدقة، وFDR لاختبار Welch كمقاييس للقابلية للنقل، وليس كتقديرات للأداء التشخيصي السريري.
مجموعات بيانات مرجعية سريرية كبيرة ومجموعات بيانات اضطرابات خارج الجسم (ex vivo)
استُخدمت مجموعتان من بيانات الدم الكامل كمرجعيات سريرية بدلاً من أن تكون مجموعات استكشافية. في مجموعة GSE63990، صُنفت العينات بناءً على البيانات الوصفية لحالة العدوى المودعة إلى عدوى تنفسية فيروسية (n = 117)، أو عدوى تنفسية بكتيرية (n = 73)، أو مرض غير معدٍ (n = 90)؛ واستُبعدت العينات التي لم تحمل أحد هذه التصنيفات الواضحة18. وفي مجموعة GSE40012، تم تعيين حقول التشخيص المودعة إلى الالتهاب الرئوي الناجم عن إنفلونزا A (n = 39)، أو الالتهاب الرئوي البكتيري بدون إنفلونزا (n = 61)، أو متلازمة الاستجابة الالتهابية الجهازية (SIRS) بدون التهاب رئوي (n = 40)، أو ضوابط صحية (n = 36)، أو التهاب رئوي بكتيري/إنفلونزا مختلط (n = 14)19. وقد وُصفت العينات المختلطة البكتيرية/الإنفلونزا ولكن استُبعدت من مقارنات المرجعية الثنائية.
تحتوي GSE53543 على 196 ملف تعريف لخلايا PBMC مستخلصة خارج الجسم من 98 فرداً. قدم كل فرد عينة واحدة تحتوي على الوسط الغذائي فقط وعينة واحدة تعرضت لفيروس rhinovirus 16 لمدة 24 h؛ وقد أكدت معرفات الأشخاص وجود 98 زوجاً كاملاً. سجل المقياس المرجعي الرئيسي قيمة AUROC عبر العينات المحفزة البالغ عددها 98 والعينات غير المحفزة البالغ عددها 98 لأن AUROC هو مقياس لفصل الرتب. تم الاحتفاظ بازدواج الأشخاص في البيانات الوصفية واستُخدم ذلك في تحليل حساسية مزدوج لفروق الدرجات. تم تحليل هذه التجربة بشكل منفصل عن العدوى السريرية الطبيعية ولم تُستخدم لدعم ادعاءات التشخيص السريري.
تم تنزيل مصفوفات سلسلة GEO الخام لكل من GSE63990 وGSE40012 وGSE53543. واستُخدم GPL571 لـ GSE63990، وGPL6947 لـ GSE40012، وGPL10558 لـ GSE53543. تم تعيين المجسات إلى الرموز المعتمدة من HGNC، وتم دمج التعيينات المكررة باستخدام متوسط التعبير. كما استُخدمت المصفوفات الموحدة المودعة مسبقاً. أدت قاعدة المئين 95 العامة إلى تفعيل تحويل log₂(x + 1) فقط للمصفوفات ذات المقياس غير اللوغاريتمي. أما GSE53543 فقد خضعت بالفعل لتحويل log₂، وتوحيد غير متغير الرتبة، وتعديل بناءً على يوم المعالجة من قبل الباحثين الأصليين، لذا لم يتم تطبيق أي تحويل لوغاريتمي إضافي. وبعد إزالة الجينات التي تحتوي على قيم مفقودة بنسبة تزيد عن 20% وتعويض القيم المفقودة المتبقية باستخدام الوسيط، تم إجراء تقييس z لكل جين عبر جميع العينات ضمن مجموعة البيانات الخاصة به. واحتوت طبقة المعيار المرجعي على 470 عينة سريرية من الدم الكامل و196 عينة من خلايا PBMC المستخلصة خارج الجسم (ex vivo).
قياس أداء البصمة المرجعية
تم قياس أداء وحدات الأنف والدم المرجعية مقابل ثلاث مجموعات مرجعية غير موزونة. تم نقل مجموعة Pandya الرسمية المكونة من 33 mRNA من الجدول التكميلي 1 في تقرير المصنف الأصلي5. وتكون مقارن Andres-Terre من 33 جيناً موجهاً بالإنترفيرون تم اختيارها من البصمة المذكورة للفيروسات المتعددة3. أما مقارن Hallmark فقد تكون من مجموعة فرعية أساسية من 33 جيناً للإنترفيرون-ألفا مرتبطة بمجموعة MSigDB HALLMARK_INTERFERON_ALPHA_RESPONSE25,26. وتتوفر قوائم الجينات الكاملة للمجموعات المرجعية الثلاث في البيانات التكميلية 1. لا تعيد درجات المرجع هذه إنشاء المصنفات الموزونة الأصلية. وبالنسبة لكل مجموعة بيانات، تم حساب الدرجة كمتوسط غير موزون لدرجات z المتاحة لكل جين؛ وكان يشترط وجود ثلاثة جينات ممثلة على الأقل، كما تم تسجيل عدد الجينات الممثلة. وكانت مقارنات قياس الأداء هي: الفيروسية مقابل البكتيرية، والفيروسية مقابل غير المعدية، والفيروسية مقابل البكتيرية-أو-غير المعدية، والفيروسية مقابل السليمة/المجموعة الضابطة، والبكتيرية مقابل السليمة/المجموعة الضابطة حيثما توفرت المجموعات المطلوبة. وتم تفسير AUROC ومتوسط الدقة كمقاييس لقياس الأداء. كما تم تعديل قيم P لاختبار Welch باستخدام إجراء Benjamini–Hochberg عبر جميع تركيبات مجموعة البيانات-المقارنة-الوحدة الصحيحة في جدول قياس الأداء.
التحقق الطولي المستقل
استُخدمت مجموعات البيانات المقترنة للمرحلة الحادة مقابل مرحلة الخروج GSE97741 وGSE97742 لأغراض التحقق الطولي فقط27. شكلت العينات المصنفة كعدوى مفردة بـ RSV (RSVsi) أو فيروس الأنف (hRV) في البيانات الوصفية المودعة أساس التحليل الأولي؛ بينما تم الإبقاء على حالات العدوى المشتركة بـ RSV (RSVco) في المخرجات التكميلية فقط. تم استخلاص تسميات المرحلة الحادة والخروج من عناوين العينات. تمت مطابقة العينات حسب مجموعة البيانات، والحيز التشريحي، ومجموعة الفيروسات، ومعرف الشخص، وتم الإبقاء فقط على الأشخاص الذين توفرت لديهم كلتا النقطتين الزمنيتين. تألفت المجموعة المدمجة الأساسية من 38 زوجًا من RSVsi و30 زوجًا من hRV (68 زوجًا لكل حيز تشريحي).
لم يتم استخدام اختيار الجينات، أو تحسين الوحدات، أو ضبط العتبة باستخدام GSE97741 أو GSE97742، حيث خُصصت هذه المجموعات من البيانات للتحقق الخارجي. تم تعيين معرفات المسبار إلى رموز HGNC المعتمدة، وتم دمج الرموز المكررة عن طريق متوسط التعبير. طُبقت قاعدة تحويل اللوغاريتم عند المئوية 95، ومرشح القيم المفقودة، والتعويض بالوسيط، وإجراءات توحيد z القياسي لكل جين داخل مجموعة البيانات قبل حساب درجات وحدة GSE117827 الثابتة.
لكل نسيج ووحدة، تم إقران درجات المرحلة الحادة ومرحلة الخروج حسب الخاضع للتجربة ومجموعة الفيروس. حُسب الفرق بين المرحلة الحادة ومرحلة الخروج لكل زوج. وتم حساب قيمة Cohen dz كمتوسط الفرق المزدوج مقسوماً على الانحراف المعياري للعينة. كما تم تسجيل نتائج اختبارات t المزدوجة ثنائية الجانب واختبارات ويلكوكسون لترتيب الرتب الموقعة ثنائية الجانب، جنباً إلى جنب مع مساحة تحت منحنى خصائص التشغيل للمستقبل (AUROC) للفصل بين درجات المرحلة الحادة ومرحلة الخروج. وحُسبت قيم معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) وفق منهجية بنجاميني-هوشبرغ عبر جميع اختبارات t المزدوجة العشرين الصالحة في المخرجات الطولية الكاملة (مجموعتان من البيانات، ومصدران للوحدات، وخمسة ملخصات محددة مسبقاً لمجموعات الفيروسات).
تحليل تدرج الأعراض والتحليل البعدي
بعد تحديد عضوية الوحدات، استُخدمت عمليات الكشف عن الفيروسات البيكورناوية غير المصحوبة بأعراض والمستبعدة من GSE117827 لتحليل تدرج الأعراض فقط. كانت الدرجة السريرية الترتيبية 0 لعينات التحكم السلبية للفيروس، و1 لحالات الكشف عن الفيروسات البيكورناوية غير المصحوبة بأعراض، و2 للعدوى المصحوبة بأعراض. قَيّم معامل ارتباط Spearman الاتجاه الترتيبي، بينما قَيّم اختبار Kruskal–Wallis الفروق العامة بين المجموعات الثلاث. وقورنت أزواج المجموعات الثلاث باستخدام اختبارات Mann–Whitney U البعدية ثنائية الاتجاه. طُبق تصحيح Benjamini–Hochberg بشكل منفصل داخل كل مقصورة على مجموعة المقارنات الزوجية الثلاث الخاصة بها.
الإثراء الوظيفي
تم تحليل جينات وحدات الأنف والدم باستخدام Enrichr عبر gseapy، وذلك بالاستعانة بمكتبات MSigDB Hallmark 2020، وReactome 2022، وGO Biological Process 2023.25,26,28,29,30,31استخدم برنامج Enrichr إطار عمل التمثيل المفرط القياسي القائم على اختبار فيشر الدقيق (Fisher's exact test). وقد تم تعديل القيم المبلغ عنها في المكتبة وفقاً لمنهجية بنجاميني-هوخبيرج (Benjamini–Hochberg). P القيم < اعتُبرت القيم التي بلغت 0.05 ذات دلالة إحصائية. وقد صُنفت المصطلحات الثمانية الأكثر دلالة لكل وحدة عبر المكتبات الثلاث المستعلم عنها وفقاً للقيمة المعدلة P القيمة. واستُخدمت نتائج الإثراء لأغراض التفسير فقط.
تحليلات المتانة، وبرنامج الواسمات، والتباين
اختبرت تحليلات المتانة ما إذا كانت النتائج تعتمد على حجم الوحدة أو الاختيار العشوائي. تم تقييم أحجام وحدات مكونة من 10 و25 و50 و100 و200 جين. وبالنسبة لتحليل العدم للجينات العشوائية، تضمن الكون المؤهل جينات HGNC المشفرة للبروتين والممثلة في مصفوفة GSE117827 المعالجة. تم أخذ عينات من خمسمائة مجموعة، كل منها تضم 50 جيناً، دون استبدال باستخدام بذرة NumPy العشوائية 20260622. اقتصرت إعادة اختيار Bootstrap على 1,000 جين مشفر للبروتين ذي تأثير إيجابي، وهي الأعلى تصنيفاً في تحليل الارتكاز الأصلي لكل مقصورة. وفي كل إعادة أخذ عينات، تم ترتيب الجينات المشفرة للبروتين ذات التأثير الإيجابي تصاعدياً وفقاً لقيمة P لـ Welch ثنائية الجانب، ثم تنازلياً وفقاً لمتوسط الفرق. تم اختيار أفضل 50 جيناً. وحُسب استقرار الجينات كعدد مرات الاختيار مقسوماً على 100. كما عُرضت الـ 20 جيناً ذات أعلى تردد اختيار في كل مقصورة.
استُخدمت درجات برامج المؤشرات كأدوات وصفية بدلاً من استخدامها لتقدير كسور الخلايا. تم تقييم ستة برامج منسقة: الظهارية (EPCAM, KRT8, KRT18, KRT19, MUC1, KRT5, KRT14, SCGB1A1, FOXJ1)، والوحيدات/البلعمية (LYZ, LST1, S100A8, S100A9, FCGR3A, FCGR1A, CD14, MS4A7, CTSS)، والعدلات (S100A8, S100A9, MPO, ELANE, CEACAM8, FCGR3B, OLFM4, MMP8)، والخلايا التائية/القاتلة الطبيعية (CD3D, CD3E, TRAC, NKG7, GNLY, PRF1, GZMB, KLRD1, IL7R)، والخلايا البائية/البلازمية (MS4A1, CD79A, CD79B, MZB1, JCHAIN, IGHG1, SDC1)، والإنترفيرون النخاعي (SIGLEC1, IFI27, IFI44L, ISG15, MX1, OAS1, RSAD2, IFIT3). تم حساب درجة كل برنامج كمتوسط لدرجات z المتاحة لكل جين، مع اشتراط وجود ثلاثة جينات ممثلة على الأقل. تم تعديل قيم P لـ Spearman باستخدام إجراء Benjamini–Hochberg عبر العائلة الكاملة من ارتباطات مجموعة البيانات والوحدة والبرنامج. تم حساب مربع إيتا أحادي الاتجاه كقسمة مجموع المربعات بين المجموعات على مجموع المربعات الكلي لكل زوج من الوحدة والعامل. استُبعدت الصفوف التي تفتقر إلى العامل ذو الصلة من هذا الحساب. كان هذا التحليل وصفياً ولم يتم تعديله بالنسبة للعوامل المرتبطة تبادلياً.
إمكانية التكرار
أُجريت جميع التحليلات باستخدام سير عمل مبرمج في لغة Python 3.12.13، مع حزم البرامج وإصداراتها الموضحة في جدول المواد. استخدمت الإجراءات العشوائية بذرة ثابتة (seed) بقيمة 20260622. تمت معالجة مصفوفات التعبير الجيني العامة من GEO باستخدام هيكل مشروع متسق يفصل بين المدخلات الخام، والبيانات المعالجة، والمخرجات الإحصائية، والجداول، والأشكال. كما تم الاحتفاظ بتعريفات الوحدات (Modules)، وسجلات تنسيق العينات، وتقديرات حجم التأثير، وإحصائيات التحقق، ونتائج الإثراء، وتحليلات المتانة، والبيانات المصدرية للأشكال لدعم التحقق المستقل. يتوفر كود التحليل، ومواصفات التبعيات، والبيانات المشتقة الداعمة كما هو موضح في بيان توفر البيانات.
النتائج
أدت المقارنة المرجعية القائمة على خطوات الارتكاز إلى الفصل بين تأثيرات الجينات الخاصة بالأنسجة وتلك الشاملة للأنسجة
احتوت مصفوفة الارتكاز المنسقة GSE117827 على 27,685 جينًا معتمدًا من HGNC. شملت المقارنة الأنفية الأولية 15 عينة مصابة تظهر عليها الأعراض و6 عينات ضابطة سلبية للفيروس؛ بينما شملت مقارنة الدم 13 عينة مصابة تظهر عليها الأعراض و6 عينات ضابطة (الجدول 1). ونظرًا لأن هذه المجموعة الصغيرة من العينات لا يمكنها دعم اكتشاف جينات مفردة مستقرة، فقد استُخدمت كمرتكز للمقصورات المقترنة. تم تقييم الاستقرار على مستوى الوحدة (module) من خلال إعادة أخذ العينات بطريقة bootstrap، واختبارات العدم للجينات العشوائية، والتحقق الخارجي، وتحليلات حساسية حجم الوحدة.
| يرجى تزويدي بالنص المصدر الذي ترغب في ترجمته. | مجموعة | الحالة | التباين الأساسي | ن |
| الدم | الفيروس المخلوي التنفسي (RSV) | مُصاب بالعدوى | نعم | 4 |
| الدم | فيروس بيكورنا بدون أعراض | ثانوي | لا | 5 |
| الدم | فيروس بيكورنا المسبب للأعراض | مُصَاب | نعم | 9 |
| الدم | ضابط سلبي للفيروس | مجموعة ضابطة | نعم | 6 |
| أنفي | الفيروس المخلوي التنفسي | مُصابة | نعم | 6 |
| أنفي | فيروس بيكورنا بدون أعراض | ثانوي | لا | 5 |
| أنفي | الفيروسات البيكورناوية المسببة للأعراض | مُصاب بالعدوى | نعم | 9 |
| أنفي | ضابط سلبي للفيروس | مجموعة ضابطة | نعم | 6 |
الجدول 1: تصميم المرساة لـ GSE117827 بعد تنقية التباين الأولي. توزيع العينات عبر الحجيرات الدموية والأنفية في مجموعة بيانات المرساة المقترنة بعد تنقية التباين الأولي. صُنفت عينات الفيروس المخلوي التنفسي (RSV) المصحوبة بأعراض وعينات الفيروسات البيكورنية المصحوبة بأعراض على أنها مصابة وأُدرجت في التباين الأولي، بينما صُنفت الضوابط السلبية للفيروسات على أنها ضوابط وأُدرجت في التباين الأولي. خُصصت عينات الفيروسات البيكورنية غير المصحوبة بأعراض كعينات ثانوية واستُبعدت من بناء الوحدة؛ حيث استُخدمت فقط في تحليل تدرج الأعراض الاستكشافي. افتقرت حالتان من حالات RSV إلى عينات دم، مما أدى إلى وجود أربع عينات دم وست عينات أنفية لـ RSV.
عبر الجينات المشتركة البالغ عددها 27,685 جينًا، كانت تقديرات g لـ Hedges في الأنف والدم غير مرتبطة تقريبًا (معامل ارتباط بيرسون r = 0.015؛ الشكل 1). ظهرت هذه النتيجة ضمن دراسة واحدة، وهي أقل عرضة للاختلافات بين الدراسات مقارنة بالمقارنة المجمعة عبر المجموعات. وتُظهر السحابة المركزية الكثيفة أن معظم الجينات لم تتحرك بشكل مماثل في كلا القسمين. وكانت الجينات المتداخلة المظللة هي الاستثناءات في أعلى كلتا قائمتي التصنيف. ويدعم هذا النمط بناء وحدات منفصلة للأنف والدم.
الشكل 1. أحجام تأثير الجينات في الأنف والدم ضمن مجموعة الارتكاز المزدوجة GSE117827. تقارن قيم Hedges g بين العدوى ذات الأعراض والضوابط السلبية للفيروس لـ 27,685 جينًا. تظهر تقديرات الأنف (15 مصابًا، 6 ضوابط) على المحور السيني (x-axis)، وتظهر تقديرات الدم (13 مصابًا، 6 ضوابط) على المحور الصادي (y-axis). يشير تظليل السداسيات إلى عدد الجينات في كل خلية. تشير النقاط الحمراء إلى الجينات الستة المشتركة بين أعلى 50 وحدة نمطية في الأنف والدم. Pearson r = 0.015. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
أدى بناء الوحدات إلى ظهور تداخل صغير متمحور حول الإنترفيرون
تشاركت أفضل 50 وحدة من وحدات الأنف والدم في ستة جينات هي: ISG15 وACRBP وIFIT1 وRSAD2 وCCRL2 وXAF1 (مؤشر جاكارد = 0.064؛ الجدول 2; الشكل 2). وتتوافق الجينات ISG15 وIFIT1 وRSAD2 وXAF1 مع البيولوجيا المضادة للفيروسات المرتبطة بالإنترفيرون32,33,34. أما CCRL2 فيُفضل تفسيره في سياق هجرة الكريات البيضاء الالتهابية35. في حين أن ACRBP ليس له دور مثبت في مضادات الفيروسات. وقد تم ذكر الجينات الستة جميعاً من أجل الشفافية، ولكن لم يتم اعتبار أي منها كمؤشر حيوي مُثبت عبر الأنسجة. كما أن قيم معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) لكل جين على حدة لم تكن ذات دلالة إحصائية في مجموعة الارتكاز الصغيرة. وبناءً على ذلك، فإن الاستنتاج الرئيسي يستند إلى التحقق من الصحة على مستوى الوحدات المقفلة، وليس على قائمة التداخل.
| الجين | حجم التأثير الأنفي g | معدل الاكتشاف الكاذب (FDR) الأنفي | حجم التأثير في الدم g | معدل الاكتشاف الكاذب (FDR) في الدم | التفسير |
| ISG15 | 2.215 | 0.213 | 1.369 | 0.442 | جين مضاد للفيروسات محفز بالإنترفيرون؛ تداخل استكشافي |
| ACRBP | 1.69 | 0.205 | 1.748 | 0.429 | لا يوجد دور مثبت كمضاد للفيروسات؛ تم الإبقاء عليه من أجل الشفافية |
| IFIT1 | 1.875 | 0.213 | 1.35 | 0.442 | جين مضاد للفيروسات محفز بالإنترفيرون؛ تداخل استكشافي |
| RSAD2 | 1.663 | 0.213 | 1.532 | 0.442 | جين مضاد للفيروسات محفز بالإنترفيرون؛ تداخل استكشافي |
| CCRL2 | 1.396 | 0.217 | 1.782 | 0.442 | سياق هجرة الكريات البيضاء الالتهابية؛ غير محدد للفيروسات |
| XAF1 | 1.603 | 0.226 | 1.47 | 0.442 | عامل موت خلوي مبرمج مرتبط بالإنترفيرون؛ تداخل استكشافي |
الجدول 2: التداخل الاستكشافي الكامل بين الوحدات الأنفية والدموية الأعلى تصنيفاً. تم إدراج جميع الجينات الستة المشتركة مع قيم Hedges g للأنف والدم وقيم FDR الخاصة بكل جين. تُعامل جميع الجينات الستة كمرشحات تداخل في التصنيف الاستكشافي لأن قيم FDR الخاصة بالجينات لم تكن ذات دلالة إحصائية في مجموعة الارتكاز الصغيرة. تم الإبقاء على ACRBP من أجل الشفافية رغم افتقاره لدور مضاد للفيروسات مثبت. لا يتم تقديم أي من الجينات الستة كعلامة بيولوجية عالمية موثقة؛ حيث تستند الأدلة الأساسية إلى التحقق الخارجي على مستوى الوحدة.
الشكل 2. أحجام تأثير الجينات الستة الاستكشافية المتداخلة بين الأنف والدم. تظهر تقديرات Hedges g للأنف والدم لكل من ACRBP وCCRL2 وIFIT1 وISG15 وRSAD2 وXAF1 في GSE117827. تشير القيم الموجبة إلى تعبير أعلى في حالات العدوى ذات الأعراض مقارنة بالمجموعات الضابطة السلبية للفيروس. تم عرض التداخل الكامل من أجل الشفافية؛ لم تكن قيم FDR للجينات المنفردة ذات دلالة إحصائية، ولا يتم تقديم هذه الجينات كمؤشرات حيوية عالمية تم التحقق من صحتها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
قدم الإثراء الوظيفي تحققاً بيولوجياً من محتوى الوحدات
أظهرت كلتا الوحدتين إثراءً في مسارات الإنترفيرون ومسارات مضادات الفيروسات، على الرغم من اختلاف تكوين الجينات وقوة الإثراء (الشكل 3). يتم عرض المصطلحات الثمانية الأكثر أهمية لكل وحدة. بالنسبة للوحدة الأنفية، صُنفت المصطلحات التالية ضمن المصطلحات الرائدة: استجابة إنترفيرون-غاما Hallmark (قيمة P المعدلة = 2.23 × 10⁻24)، واستجابة إنترفيرون-ألفا Hallmark (قيمة P المعدلة = 1.40 × 10⁻22)، وإشارات إنترفيرون-ألفا/بيتا Reactome (قيمة P المعدلة = 3.64 × 10⁻19)، والاستجابة الدفاعية للفيروس GO (قيمة P المعدلة = 5.47 × 10⁻15). أما وحدة الدم فقد أظهرت نفس البيولوجيا العامة ولكن بقوة إثراء أقل: استجابة إنترفيرون-ألفا (قيمة P المعدلة = 3.87 × 10⁻6)، وإشارات إنترفيرون-ألفا/بيتا Reactome (قيمة P المعدلة = 5.70 × 10⁻6)، واستجابة إنترفيرون-غاما (قيمة P المعدلة = 8.89 × 10⁻6)، والاستجابة الدفاعية للفيروس (قيمة P المعدلة = 1.07 × 10⁻4). تدعم هذه النتائج التماسك البيولوجي دون أن تعني تماثلاً في ترتيب الجينات داخل المقصورات.
الشكل 3مصطلحات الإثراء المختارة لوحدات الأنف والدم. أُجري تحليل التمثيل الزائد (Over-representation analysis) باستخدام Enrichr مع Hallmark 2020 وReactome 2022 وGO Biological Process 2023. وكانت المصطلحات الثمانية ذات أقل قيمة مُعدلة وفقاً لاختبار بنجاميني-هوشبيرج (Benjamini–Hochberg-adjusted) P تظهر القيم الخاصة بكل وحدة. ويمثل طول الشريط قيمة −log10(معدلة) P القيمة). وتُظهر اللوحتان اليسرى واليمنى وحدتي الأنف والدم، على التوالي. وتُعرض المصطلحات بصيغة حالة الجملة (sentence case). ولم يؤدِ تحليل الإثراء إلى تغيير العضوية في الوحدات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
اختُبرت النماذج المغلقة في عملية تحقق خارجية متطابقة نسيجياً
حقق النموذج الأنفي المغلق قيم AUROCs بلغت 0.749 في GSE41374، و0.693 في GSE152075، و0.609 في GSE156063 (جدول 3; شكل 4). وحقق نموذج الدم المغلق قيم AUROCs بلغت 0.832 في GSE171110، و0.924 في وحدة GPL10558 في GSE38900، و0.870 في وحدة GPL6884. وقد تم حذف أداء المرساة الداخلية لأنه منحاز بشكل تفاؤلي بسبب طريقة البناء. وتُعامل قيم AUROCs الخارجية كملخصات للقابلية للنقل، وهي لا تثبت الحساسية السريرية، أو النوعية، أو الجاهزية للتشخيص.
| المجموعة | العينة/الفيروس | الوحدة | عدد الإيجابيات | عدد السلبيات | الجينات الممثلة | AUROC | متوسط الدقة | معدل الاكتشاف الكاذب لاختبار Welch |
| GSE152075 | SARS-CoV-2 المجرى التنفسي العلوي | أنفي | 430 | 54 | 50 | 0.693 | 0.935 | 2.20 × 10⁻⁴ |
| GSE156063 | SARS-CoV-2 المجرى التنفسي العلوي | أنفي | 93 | 100 | 49 | 0.609 | 0.551 | 1.38 × 10⁻² |
| GSE171110 | SARS-CoV-2 دم كامل | دم | 44 | 10 | 50 | 0.832 | 0.959 | 7.94 × 10⁻⁴ |
| GSE38900-GPL10558 | RSV دم كامل | دم | 28 | 8 | 50 | 0.924 | 0.979 | 7.94 × 10⁻⁴ |
| GSE38900-GPL6884 | RSV دم كامل | دم | 107 | 31 | 49 | 0.87 | 0.962 | 3.47 × 10⁻¹⁵ |
| GSE41374 | RSV غسول أنفي | أنفي | 76 | 10 | 50 | 0.749 | 0.951 | 2.63 × 10⁻² |
الجدول 3: التحقق الخارجي من درجة الوحدة المطابقة للأنسجة. تم اختبار وحدة الأنف المقفلة في GSE41374 وGSE152075 وGSE156063، واختبار وحدة الدم المقفلة في GSE171110 ووحدات منصة GSE38900 وهي GPL10558 وGPL6884. يوضح الجدول أعداد العينات الإيجابية والسلبية، وجينات الوحدة الممثلة، ومساحة المنطقة تحت منحنى خصائص التشغيل (AUROC)، والدقة المتوسطة، ومعدل الاكتشاف الكاذب (FDR) لاختبار Welch. تم حذف أداء المرساة الداخلي. تم تقديم AUROC والدقة المتوسطة كملخصات لقابلية النقل وليس كتقديرات لأداء التشخيص السريري.
الشكل 4. قابلية نقل درجة الوحدة المطابقة للأنسجة خارجياً. تُعرض قيم AUROCs للوحدة الأنفية في GSE41374 (76 RSV، و10 ضوابط)، وGSE152075 (430 SARS-CoV-2، و54 ضابطاً)، وGSE156063 (93 SARS-CoV-2، و100 ضابط)، وللوحدة الدموية في GSE171110 (44 SARS-CoV-2، و10 ضوابط)، وGSE38900-GPL10558 (28 RSV، و8 ضوابط)، وGSE38900-GPL6884 (107 RSV، و31 ضابطاً). تمثل الدرجات المتوسطات غير المرجحة لقيم z لكل جين ممثل. يشير الخط المتقطع إلى AUROC = 0.5. القيم هي ملخصات لقابلية النقل، وليست تقديرات تشخيصية سريرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
اختبر التحقق الطولي ما إذا كانت الدرجات تنخفض أثناء مرحلة التعافي
وفرت مجموعات البيانات المصاحبة GSE97741/GSE97742 بيئة تحقق مستقلة للعدوى الطبيعية، تضمنت عينات من المرحلة الحادة وعند الخروج من المستشفى لأطفال منومين27. ولم تُستخدم هذه العينات كبيانات اكتشاف للمجموعة الضابطة السليمة، بل استُخدمت لتقييم ما إذا كانت درجات الوحدات المشتقة من المراسي تنخفض من مرحلة المرض الحاد وصولاً إلى وقت الخروج من المستشفى.
بالنسبة لمجموعة العدوى المنفردة المحددة مسبقاً بالفيروس المخلوي التنفسي (RSV) وفيروس الأنف (rhinovirus) مجتمعة، تم تحليل 68 شخصاً في كل نسيج (الجدول 4; الشكل 5). وقد انخفضت وحدة الدم من مرحلة المرض الحاد إلى مرحلة الخروج في الدم (mean delta = 0.330; Cohen dz = 0.740; paired-test FDR = 1.98 × 10⁻7; AUROC = 0.765). كما انخفضت وحدة الأنف أيضاً في عينات البلعوم الأنفي (mean delta = 0.436; Cohen dz = 0.477; paired-test FDR = 3.06 × 10⁻4; AUROC = 0.679). وتُظهر المسارات المزدوجة وأخطاؤها المعيارية أن الانخفاض على مستوى المجموعة لم يكن مدفوعاً بعدد قليل من القيم المتطرفة غير المزدوجة.
| مجموعة البيانات | عينة المصدر | وحدة تعليمية | متطابق نسيجياً | أزواج n | متوسط دلتا تفريغ الحالات الحادة | كوهين بما أن النص المقدم يتكون من حرفين فقط ("dz")، ولا يمثل سياقاً علمياً أو تعليمياً أو جملة مكتملة للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الكامل المراد ترجمته من الإنجليزية إلى العربية وفقاً للمعايير المهنية المذكورة. | المساحة تحت منحنى خصائص تشغيل المستقبل (AUROC) | معدل الاكتشاف الخاطئ للاختبارات المزدوجة |
| GSE97741 | الدم | الدم | نعم | 68 | 0.330 | 0.740 | 0.765 | 1.98 × 10⁻⁷ |
| GSE97741 | الدم | أنفي | لا | 68 | 0.479 | 0.721 | 0.755 | 3.19 × 10⁻⁷ |
| GSE97742 | البلعومي الأنفي | الدم | لا | 68 | 0.361 | 0.914 | 0.845 | 9.42 × 10⁻¹⁰ |
| GSE97742 | البلعومي الأنفي | أنفي | نعم | 68 | 0.436 | 0.477 | 0.679 | 3.06 × 10⁻⁴ |
الجدول 4: التحقق الطولي المستقل بين المرحلة الحادة ومرحلة الخروج. يوضح الجدول عدد الأزواج الكاملة، ومتوسط الفرق في درجات المرحلة الحادة ناقص درجة الخروج، وCohen dz، وAUROC، ومعدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) للاختبار المزدوج للوحدات الثابتة في GSE97741 وGSE97742. تشير قيمة دلتا الموجبة إلى درجة وحدة أعلى أثناء المرض الحاد. قيم FDR للاختبار المزدوج هي قيم P لاختبار t المزدوج ثنائي الجانب والمعدلة وفق طريقة Benjamini–Hochberg، والتي تم حسابها عبر جميع اختبارات t المزدوجة العشرين الصحيحة في المخرجات الطولية الكاملة.
الشكل 5. التغيرات المقترنة في درجات الوحدات من المرض الحاد حتى الخروج. (A) درجات وحدة الدم في الدم الكامل (GSE97741). (B) درجات وحدة الأنف في عينات البلعوم الأنفي (GSE97742). يحتوي كل لوح على 68 زوجاً كاملاً من الأشخاص: 38 إصابة منفردة بـ RSV و30 إصابة بالفيروس الأنفي. تربط الخطوط الرفيعة بين القياسات المطابقة للشخص الواحد. تشير النقاط البرتقالية إلى متوسطات المجموعات، وتشير أشرطة الخطأ البرتقالية إلى الخطأ المعياري للمتوسط. تم إجراء اختبارات t المقترنة ثنائية الطرف واختبارات ويلكوكسون للرتب الموقعة؛ كما تم تطبيق تصحيح Benjamini–Hochberg FDR عبر 20 اختبار t مقترناً طولياً صالحاً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
كشفت اختبارات المقارنة بين المقصورات عن فارق دقيق ومفيد؛ حيث حققت وحدة الدم المطبقة على عينات البلعوم الأنفي قيمة AUROC بلغت 0.845، على الرغم من أن أحجام التأثير الفردية للأنف والدم كانت متوافقة بشكل ضعيف في المخطط المرجعي. وأظهر فحص المسارات المزدوجة انخفاضاً مستمراً في الدرجات بدلاً من انعكاس في توزيع التصنيفات. وبالتالي، فإن هذه النتيجة لا تعد دليلاً على أن الجينات الفردية نفسها هي المهيمنة في كلا النسيجين، بل تشير إلى أن برنامج الإنترفيرون/الالتهاب المنسق يمكن تلخيصه من خلال مجموعات جينية مختلفة ولكنها متكررة جزئياً. وتكون خصوصية المقصورة في أقوى حالاتها على مستوى ترتيب الجينات، وهي ليست مطلقة على مستوى المسار أو الدرجة.
اختبار سلوك تدرج الأعراض باستخدام كشوفات غير عرضية مستبعدة
تم استبعاد كشوفات فيروسات البيكورنافيروس (picornavirus) غير العرضية في GSE117827 من عملية بناء الوحدات (module construction) لتجنب إدراجها في مجموعة التحكم الأساسية. وقد وفرت هذه المجموعة المستبعدة لاحقًا تحققًا بيولوجيًا. وفي كلا القسمين، ارتفعت درجات الوحدات عبر المجموعات المرتبة من ضوابط سلبية للفيروس، ثم كشوفات البيكورنافيروس غير العرضية، وصولاً إلى العدوى العرضية (الشكل 6A،B).
الشكل 6. درجات النماذج عبر تدرج الأعراض المستبعد. (A) نموذج الأنف: 6 ضوابط سلبية للفيروس، و5 حالات كشف عن فيروسات بيكورناوية بدون أعراض، و15 حالة عدوى مصحوبة بأعراض. (B) نموذج الدم: 6 ضوابط سلبية للفيروس، و5 حالات كشف عن فيروسات بيكورناوية بدون أعراض، و13 حالة عدوى مصحوبة بأعراض. تمثل النقاط العينات الفردية. تشير الخطوط المركزية إلى الوسيط؛ وتمتد الصناديق من المئين 25 إلى المئين 75؛ وتصل الشعيرات إلى القيم الأكثر تطرفاً ضمن 1.5 مرة من المدى الربيعي. توضح التصنيفات مقارنات Mann–Whitney U اللاحقة ثنائية الجانب مع تصحيح Benjamini–Hochberg عبر ثلاث مقارنات لكل مقصورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
ارتبطت الوحدة الأنفية بدرجة الأعراض الترتيبية (Spearman rho = 0.818, P = 3.28 × 10⁻7; Kruskal-Wallis P = 1.57 × 10⁻4). وأظهرت وحدة الدم تدرجاً مماثلاً (rho = 0.861, P = 6.89 × 10⁻8; Kruskal-Wallis P = 1.92 × 10⁻4). وبعد التصحيح ضمن كل مجموعة من ثلاث مقارنات، اختلفت العدوى المصحوبة بأعراض عن مجموعات الضبط وعن حالات الكشف غير المصحوبة بأعراض في كلا القسمين. ولم تختلف حالات الكشف غير المصحوبة بأعراض عن مجموعات الضبط السلبية للفيروس (nasal FDR = 0.792; blood FDR = 0.082). وبناءً على ذلك، تتبعت هذه الوحدات نشاط استجابة المضيف المصحوبة بأعراض بشكل أكثر وضوحاً من مجرد الكشف عن الفيروس وحده.
حددت المعايير السريرية المرجعية الحد الفاصل بين استجابة المضيف وخصوصية الممرض
حددت المعايير السريرية المرجعية التمييز بين نشاط استجابة المضيف وتصنيف الممرض (الجدول 5; الشكل 7). في GSE63990، حققت وحدة الأنف قيم AUROCs بلغت 0.782 للمرض الفيروسي مقابل البكتيري، و0.791 للمرض الفيروسي مقابل غير المعدي. بينما حققت وحدة الدم قيم AUROCs بلغت 0.678 و0.753 على التوالي. وكان أداء مقارن Pandya 33-mRNA أفضل، حيث بلغت قيم AUROCs 0.867 و0.852 على التوالي. وتعتبر هذه النتيجة متوقعة لمجموعة صُممت للتمييز بين الإصابات الفيروسية وغير الفيروسية، وتوضح أن الوحدات المرجعية لا ينبغي تقديمها كبدائل للمصنفات التشخيصية.
| مجموعة البيانات | التباين | تثبيت أنفي | تثبيت الدم | mRNA لـ Pandya 33 | Andres-Terre ISG | إنترفيرون ألفا المميز |
| GSE63990 | الفيروسية مقابل البكتيرية | 0.782 | 0.678 | 0.867 | 0.833 | 0.831 |
| GSE63990 | الفيروسي مقابل غير المعدي | 0.791 | 0.753 | 0.852 | 0.851 | 0.848 |
| GSE40012 | الالتهاب الرئوي الفيروسي مقابل الالتهاب الرئوي البكتيري | 0.755 | 0.789 | 0.893 | 0.867 | 0.872 |
| GSE40012 | الالتهاب الرئوي الفيروسي مقابل متلازمة الاستجابة الالتهابية الجهازية (SIRS) | 0.897 | 0.907 | 0.985 | 0.965 | 0.956 |
| GSE40012 | الالتهاب الرئوي الفيروسي مقابل الحالة السليمة | 0.804 | 0.986 | 0.923 | 0.906 | 0.891 |
| GSE40012 | الالتهاب الرئوي البكتيري مقابل الحالة السليمة | 0.476 | 0.917 | 0.465 | 0.391 | 0.378 |
| GSE53543 | خلايا PBMC المحفزة بفيروس الأنف (rhinovirus) مقابل غير المحفزة خارج الجسم (Ex vivo) | 1 | 0.957 | 1 | 1 | 1 |
الجدول 5: معيار AUROC لنماذج الارتكاز ومجموعات استجابة المضيف المرجعية. تمثل GSE63990 و GSE40012 مجموعات سريرية من الدم الكامل. أما GSE53543 فهي تجربة اضطراب للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) خارج الجسم الحي تشمل 98 شخصاً مقترناً، وقد تم إدراجها بشكل منفصل عن المجموعات السريرية الطبيعية. تم تسجيل المجموعات المرجعية كمتوسطات جينية غير مرجحة بدلاً من مصنفاتها المرجحة الأصلية. تم تقديم قيم AUROC كمقاييس معيارية وليس كتقديرات للأداء التشخيصي السريري.
الشكل 7. القياس المرجعي لـ AUROC للنماذج المرجعية ومجموعات استجابة المضيف المرجعية. تمثل الصفوف تباينات محددة مسبقًا في GSE63990 وGSE40012 وGSE53543؛ وتمثل الأعمدة النموذجين المرجعيين وثلاث مجموعات مرجعية غير موزونة. تم تصنيف GSE53543 على أنها خلايا PBMC محفزة بالفيروس الأنفي ex vivo مقابل غير محفزة، وعُرضت بشكل منفصل عن المجموعات السريرية الطبيعية. تم تصنيف المقارن Hallmark على أنه Hallmark interferon-alpha. تشير قيم الخلايا إلى AUROCs المستخدمة للقياس المرجعي للطريقة ولا ينبغي تفسيرها كتقديرات للأداء التشخيصي السريري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
قام GSE40012 بتحديد هذا الحد الفاصل بدقة أكبر. حيث حقق مقارن Pandya قيم AUROCs بلغت 0.893 للالتهاب الرئوي الفيروسي مقابل البكتيري، و0.985 للالتهاب الرئوي الفيروسي مقابل متلازمة الاستجابة الالتهابية الجهازية (SIRS). وقد فصلت وحدة الدم الالتهاب الرئوي الناتج عن الإنفلونزا A عن الضوابط السليمة (AUROC = 0.986) وعن SIRS (AUROC = 0.907)، ولكنها فصلت أيضاً الالتهاب الرئوي البكتيري عن الضوابط السليمة (AUROC = 0.917). وبناءً على ذلك، تقيس وحدة الدم نشاطاً التهابياً جهازياً واسعاً ونشاطاً مرتبطاً بالإنترفيرون. لذا، فهي ليست نوعية للفيروسات، ولا يمكن للنتيجة المرتفعة أن تحدد فئة المسبب المرضي.
في المعيار المرجعي المنفصل GSE53543 لخلايا PBMC خارج الجسم الحي، حقق النموذج الأنفي ومقارنات الإنترفيرون قيمة AUROC بلغت 1.000 لخلايا PBMC المحفزة بالفيروس الأنفي مقابل تلك المحفزة بالوسط الغذائي فقط؛ بينما حقق نموذج الدم قيمة AUROC بلغت 0.957. وقد ساهم جميع الأشخاص البالغ عددهم 98 شخصاً بظروف مزدوجة. تدعم هذه النتيجة المنضبطة استجابة البرامج المسجلة للتحفيز بالفيروس الأنفي، وهي لا تعطي تقديراً لأداء التشخيص السريري.
اختبرت فحوصات المتانة حجم الوحدة، والبدائل العشوائية، واستقرار الاختيار
ظل فصل المرساة دون تغيير عبر أفضل 10 و25 و50 و100 و200 جين مرتبة (الشكل 8A). لا تُعد قيم AUROCs الداخلية هذه تحققاً خارجياً، ولكنها توضح أن النتيجة النوعية لم تعتمد على اختيار 50 جيناً بالضبط. في 500 مجموعة عشوائية مكونة من 50 جيناً، كانت وسيطات AUROC الصفرية 0.489 للأنف و0.705 للدم؛ وكانت المئويات 99 المقابلة 0.722 و0.872 (الشكل 8B). وقد تجاوزت الوحدات الملحوظة هذه التوزيعات الصفرية. توزعت ترددات اختيار Bootstrap بدلاً من أن تتركز في قائمة ثابتة واحدة (الشكل 8C). تعكس هذه النتيجة بشكل مباشر صغر عينة المرساة، وهي تدعم إشارة إجمالية مستقرة مع التحذير من التعامل مع كل جين مختار على أنه ثابت.
الشكل 8تحليلات متانة حجم الوحدة، والجينات العشوائية، والتمهيد (bootstrap). (A(قيمة AUROC المرجعية عبر أحجام وحدات تتكون من 10 و25 و50 و100 و200 جين؛ وتمثل هذه القيم فحوصات الحساسية الداخلية.)Bتوزيعات المساحة تحت منحنى خصائص تشغيل المستقبل (AUROC) لـ 500 مجموعة عشوائية مكونة من 50 جيناً مشفراً للبروتين، تم سحبها دون إرجاع من الجينات الممثلة في GSE117827 (البذرة = 20260622). تشير النقاط البرتقالية إلى قيم AUROC المرصودة للوحدة (module). تشير الخطوط الأفقية داخل كل مخطط كمان (violin plot) إلى المئوية 25، والوسيط، والمئوية 75.سياقتصرت إعادة الاختيار بطريقة "بوتستراب" (Bootstrap) على أعلى 1,000 جين مشفر للبروتين ذات تأثير إيجابي، وفقاً لترتيبها في تحليل المرتكز (anchor analysis) الأصلي لكل مقصورة. وتوضح الأعمدة الجينات العشرين ذات أعلى تردد اختيار في كل مقصورة؛ حيث حُسب تردد الاختيار بقسمة عدد مرات الاختيار على 100. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
أوضحت تحليلات برنامج العلامات والتباين ما تقيسه الدرجات
عبر GSE40012 وGSE53543 وGSE63990، ارتبط كلا الموديولين بشكل أكثر اتساقاً مع برنامج الإنترفيرون النخاعي (الشكل 9A). وكانت ارتباطات الموديول الأنفي 0.812 و0.878 و0.882؛ بينما كانت ارتباطات موديول الدم 0.517 و0.843 و0.774. وكان تقسيم التباين وصفياً (الجدول 6; الشكل 9B). بالنسبة لموديول الدم، فسر كل من الحالة والمجموعة التفصيلية تبايناً أكبر (إيتا المربعة = 0.282 و0.250، على التوالي) مقارنة بمجموعة البيانات (0.066)، أو نوع العينة (0.026)، أو مجموعة المصدر (0.025). وبالنسبة للموديول الأنفي، فسر كل من المجموعة التفصيلية والحالة أيضاً تبايناً أكبر من مجموعة البيانات أو نوع العينة أو مجموعة المصدر. وبالتالي، كانت الحالة البيولوجية والمجموعة التفصيلية مسؤولة عن أجزاء أكبر من تباين درجات الموديول مقارنة بمجموعة البيانات أو نوع العينة، على الرغم من أن تأثيرات مجموعة البيانات والتركيبة غير الصفرية تظل قيداً في إعادة استخدام البيانات العامة الضخمة.
الشكل 9. ارتباطات المؤشر-البرنامج وتقسيم التباين الوصفي. (A) ارتباطات Spearman بين درجات الوحدات وست درجات للمؤشر-البرنامج في GSE40012 وGSE53543 وGSE63990. تطلبت البرامج وجود ثلاثة جينات ممثلة على الأقل. تم تعديل قيم P عبر جميع ارتباطات مجموعة البيانات-الوحدة-البرنامج. تشير الخلايا الفارغة إلى تركيبات غير متاحة أو غير قابلة للتقدير بعد استيفاء متطلبات الجينات والعينات. (B) إيتا تربيع أحادية الاتجاه (η2؛ مجموع مربعات ما بين المجموعات/مجموع المربعات الكلي) للحالة، والمجموعة التفصيلية، ومجموعة البيانات، ونوع العينة، ومجموعة المصدر. شمل التحليل 934 درجة لوحدة الدم و1,469 درجة لوحدة الأنف، وهو تحليل وصفي وليس سببياً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| الوحدة | العامل | إيتا تربيع (Eta-squared) | عدد العينات (n) |
| دم مرجعي | الحالة | 0.282 | 934 |
| دم مرجعي | المجموعة التفصيلية | 0.25 | 934 |
| دم مرجعي | مجموعة البيانات | 0.066 | 934 |
| دم مرجعي | نوع العينة | 0.026 | 934 |
| دم مرجعي | مجموعة المصدر | 0.025 | 934 |
| مسحة أنفية مرجعية | المجموعة التفصيلية | 0.17 | 1469 |
| مسحة أنفية مرجعية | الحالة | 0.13 | 1469 |
| مسحة أنفية مرجعية | مجموعة البيانات | 0.021 | 1469 |
| مسحة أنفية مرجعية | نوع العينة | 0.006 | 1469 |
| مسحة أنفية مرجعية | مجموعة المصدر | 0.002 | 1469 |
الجدول 6: تقسيم التباين الوصفي لدرجات الوحدات الوظيفية. يتم توفير صف واحد لكل زوج من (الوحدة الوظيفية-العامل)، مع قيمة eta-squared وحجم العينة المقابلين. تم حساب eta-squared بقسمة مجموع المربعات بين المجموعات على مجموع المربعات الكلي بعد استبعاد الصفوف التي تفتقر إلى درجة الوحدة الوظيفية أو العامل ذي الصلة. تم تقييم العوامل بشكل فردي؛ ولذلك، فإن التحليل وصفي، ولا يتم تعديله للعوامل المرتبطة ببعضها البعض، ولا ينبغي تفسيره بشكل سببي.
توافر البيانات:
جميع مجموعات البيانات النسخية التي تم تحليلها في هذه الدراسة متاحة للعامة عبر مستودع Gene Expression Omnibus تحت أرقام الوصول GSE117827 و GSE41374 و GSE152075 و GSE156063 و GSE171110 و GSE38900 و GSE97741 و GSE97742 و GSE63990 و GSE40012 و GSE53543. تتوفر البيانات المستمدة من التحليل والتي تستند إليها الأشكال والجداول الرئيسية وكود التحليل من المؤلف المسؤول عند تقديم طلب معقول. لم يتم استخدام أي بيانات مقيدة أو بيانات مستحدثة على مستوى المشاركين في هذه الدراسة.
المناقشة
الدرس الرئيسي هو درس تشغيلي: ابدأ بالمقصورة التي تم أخذ العينات منها، وليس بالمصفوفة المجمعة الأكبر. إن مجموعة البيانات GSE117827 صغيرة، ولكن تصميمها المزدوج يسمح بإجراء مقارنة مباشرة بين الأنف والدم ضمن دراسة واحدة. ويظهر ارتباط تأثير المستوى الجيني القريب من الصفر أن قائمة ترتيب مجمعة لجميع الأنسجة من شأنها أن تخفي بنية مقصورية جوهرية. وبناءً على ذلك، كانت الوحدات الوظيفية (modules) المنفصلة هي التصميم الأكثر قابلية للدفاع عنه. ويدعم أداؤها الخارجي والطولي وجود نشاط استجابة مضيفة قابل للتكرار على مستوى الوحدة الوظيفية، وليس قائمة جينية عالمية.
تختلف القابلية للنقل على مستوى الجين عنها على مستوى الوحدة (module). فقد أظهرت وحدة الدم أداءً جيداً في العينات الطولية المأخوذة من البلعوم الأنفي (AUROC 0.845)، على الرغم من ضعف التوافق بين أحجام التأثير الفردية في الأنف والدم. ولم تظهر المسارات المزدوجة أي انعكاس في التصنيف. والتفسير الأكثر ترجيحاً هو تكرار المسارات (pathway redundancy): حيث يمكن تلخيص نشاط الإنترفيرون والنشاط الالتهابي المنسق من خلال مجموعات فرعية مختلفة من الجينات في مقصورات مختلفة6,7,8,9,10,11,32,33,34. وهذا هو السبب في وصفنا للوحدات بأنها مدركة للمقصورة (compartment-aware) بدلاً من كونها حصرية للمقصورة. تختلف التصنيفات الدقيقة، ولكن يظل هناك مكون مشترك على مستوى المسار يمكن اكتشافه. كما تدمج ملفات التعبير الجيني الشاملة (Bulk profiles) بين التغيرات في التعبير والتغيرات في تكوين الخلايا. ويمكن لارتباطات برنامج العلامات (Marker-program correlations) أن تشير إلى هذه المشكلة، لكنها لا تستطيع تقديم آليات محددة على مستوى الخلية36,37.
تحدد المعايير السريرية حدًا ثانيًا. وكانت مقارنات Pandya 33-mRNA والإنترفيرون أقوى في التمييز بين الإصابات الفيروسية والبكتيرية. أما الوحدات المرجعية فتجيب عن سؤال مختلف: ما مدى قوة تعبير العينة عن برنامج الاستجابة الحادة للمضيف؟ كما ارتفعت وحدة الدم أيضًا في حالات الالتهاب الرئوي البكتيري. وبناءً على ذلك، يجب تفسيرها على أنها درجة عامة لنشاط الالتهاب الجهازي/الإنترفيرون، وليست مصنِّفًا خاصًا بالفيروسات. قد تدعم الدرجة العالية مقارنة المجموعات، أو تتبع الاستجابة، أو وصف الحالة الالتهابية، ولكنها لا تستطيع تحديد المسبب المرضي. كما أن الأهمية السريرية المتزايدة لفيروسات مثل الفيروس الميتابنيوموي البشري تدعم ضرورة إجراء تحقق يتضمن مسببات مرضية متنوعة وأنسجة متوافقة، بدلًا من الاستقراء من مجموعة فيروسية محدودة12,13.
تعتبر الجينات الستة المتداخلة استكشافية؛ حيث تمتلك الجينات ISG15 وIFIT1 وRSAD2 وXAF1 أدواراً محتملة مرتبطة بالإنترفيرون32,33,34، ويرتبط CCRL2 بهجرة الكريات البيضاء الالتهابية35، بينما لا يوجد تفسير مضاد للفيروسات مثبت لـ ACRBP. وتمنع المجموعة الصغيرة وقيم FDR غير الدالة إحصائياً على مستوى الجينات تقديم ادعاءات أقوى. يكمن الابتكار المنهجي في جوانب أخرى: استخدام مرساة مزدوجة في نفس الدراسة، ووحدات محددة مخصصة لمقصورات مغلقة، واختبارات خارجية مطابقة للأنسجة، وتحليل استعادة مزدوج، ومقارنة معيارية سريرية، وفحوصات صريحة للعشوائية والحجم والتمهيد (bootstrap) والعلامات والتباين. يوفر هذا التسلسل الهرمي للأدلة إطاراً تحفظياً لتفسير النتائج.
لا تزال هناك عدة قيود. تضم المجموعة المرجعية 15 عينة أنفية مصابة و6 عينات ضابطة، و13 عينة دم مصابة و6 عينات ضابطة. وتؤكد نتائج الـ Bootstrap أن عضوية الجينات الفردية ليست مستقرة تماماً. كما تم دمج حالات RSV ذات الأعراض مع الفيروسات البيكورناوية، لذا فإن تأثيرات المجموعة المرجعية ليست محددة بنوع الفيروس. وتختلف المجموعات الخارجية من حيث العمر، والمنصة المستخدمة، وشدة المرض، والتوقيت، وتعريف المجموعة الضابطة. وتعتبر الدراسة GSE53543 دراسة اضطراب مزدوجة خارج الجسم (ex vivo). وتوفر الدراستان GSE63990 وGSE40012 مقارنات سريرية مفيدة ولكن دون أخذ عينات مزدوجة من الأنف والدم. ولم تكن بيانات الحمل الفيروسي، ومدة الأعراض، والحاجة إلى الأكسجين، وشدة الحالة متاحة بشكل متسق. ومن شأن تصميم استباقي أقوى أن يجمع مسحات أنفية وعينات دم من نفس المشاركين في نقاط زمنية متطابقة، مع قياسات الحمل الفيروسي والأعراض، ومقارنات سلبية للفيروسات ذات الأعراض والبكتيريا، وتحقق بدقة الخلية11,14,36,37.
في الختام، تدعم المجموعات النسخية (transcriptomes) العامة الحالية وحدات نشاط استجابة المضيف في الأنف والدم القابلة للتكرار عند الحفاظ على سياق النسيج. وهي لا تدعم وجود بصمة جينية موحدة قابلة للتبادل عبر جميع الأنسجة. وقد أظهر المرساة المزدوج (paired anchor) توافقاً ضئيلاً على مستوى الجينات، بينما انتقلت درجات الوحدات المقفلة (locked module scores) ضمن الأنسجة المتطابقة وانخفضت أثناء مرحلة التعافي. إن استجابة وحدة الدم في حالات الالتهاب الرئوي البكتيري، والأداء المتفوق لمصنف معتمد في التمييز بين الفيروسات والبكتيريا، يحددان الغرض من الاستخدام: حيث تصف هذه الوحدات نشاط استجابة المضيف وتدعم المقارنة المرجعية الشفافة للمجموعات؛ وهي ليست مصنفات مستقلة للمسببات المرضية. يتوفر كود التحليل والبيانات المستمدة كما هو موضح في بيان توفر البيانات لدعم التحقق المستقل وإعادة استخدام سير العمل.
الإفصاحات
يقر المؤلفون بعدم وجود أي تضارب في المصالح مالي أو غير مالي ذي صلة بهذا العمل.
شكر وتقدير
يتوجه المؤلفون بالشكر إلى الباحثين والمشاركين في دراسات GEO العامة التي تمت إعادة تحليلها في هذا العمل. لم يستوفِ أي أفراد إضافيين معايير التأليف. لم يتلق هذا البحث أي منحة محددة من أي وكالة تمويل في القطاعات العامة أو التجارية أو غير الربحية.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مجموعة جينات Andres-Terre المحفزة بالإنترفيرون والمتعددة الفيروسات | أندريس-تير وآخرون. | مقارن الـ 33 جيناً؛ البيانات التكميلية 1 | مقارن موجه نحو الإنترفيرون وغير موزون، تم تنسيقه من البصمة متعددة الفيروسات المُبلغ عنها؛ تتوفر القائمة الكاملة للجينات في البيانات التكميلية 1. |
| Enrichr | مختبر معيان | تم الدخول في 18 أغسطس 2026؛ RRID:SCR_001575 | مورد تحليل الإثراء الزائد لمجموعات الجينات الذي يتم الوصول إليه عبر gseapy. |
| مخزن التعبير الجيني (Gene Expression Omnibus) | المركز الوطني لمعلومات التقانة الحيوية | GEO؛ RRID:SCR_005012 | مستودع عام للترانسكريبتوم يُستخدم للوصول إلى مجموعات البيانات التي تم تحليلها. |
| الوجودية الجينية (Gene Ontology) | اتحاد الأنطولوجيا الجينية | العملية البيولوجية حسب أنطولوجيا الجينات (GO Biological Process) 2023؛ معرف الموارد البحثية (RRID):SCR_002811 | مكتبة التعليق الوظيفي المستخدمة عبر Enrichr. |
| GPL10558 | قاعدة بيانات NCBI GEO | GPL10558 | المنصة الخاصة بـ GSE53543 ووحدة التحقق GSE38900 المكونة من 36 عينة. |
| GPL23126 | قاعدة بيانات NCBI GEO | GPL23126 | منصة التعبير لـ GSE117827. |
| GPL24539 | قاعدة بيانات NCBI GEO | Clariom_D_Human.na36.hg38. مجموعة_المجسات.csv | استُخدم توصيف Clariom D Human na36, hg38 لرسم خرائط العناقيد النسخية لـ GSE117827. |
| GPL571 | قاعدة بيانات NCBI GEO | GPL571 | تطبيق توصيف المنصة على GSE63990. |
| GPL6884 | قاعدة بيانات NCBI GEO | GPL6884 | منصة وحدة التحقق من الدم الكامل لـ 138 عينة من مجموعة البيانات GSE38900 الخاصة بالفيروس المخلوي التنفسي (RSV). |
| GPL6947 | قاعدة بيانات NCBI GEO (أرشيف التعبير الجيني لـ المركز الوطني لمعلومات التقانة الحيوية) | GPL6947 | تم تطبيق تعليق المنصة (Platform annotation) على GSE40012. |
| GSE117827 | قاعدة بيانات NCBI GEO | GSE117827 | مجموعة بيانات مرجعية أولية مزدوجة من مسحات الأنف ودم كامل. |
| GSE152075 | NCBI GEO | GSE152075 | مجموعة بيانات تحقق خارجية لـ SARS-CoV-2 من الجهاز التنفسي العلوي. |
| GSE156063 | مستودع التعبير الجيني (GEO) التابع للمركز الوطني لمعلومات التقانة الحيوية (NCBI) | GSE156063 | مجموعة بيانات تحقق خارجية لـ SARS-CoV-2 من المسالك التنفسية العلوية. |
| GSE171110 | مستودع NCBI GEO | GSE171110 | مجموعة بيانات التحقق الخارجية من الدم الكامل لفيروس SARS-CoV-2. |
| GSE38900 | مستودع تعبيرات الجينات (GEO) التابع للمركز الوطني لمعلومات التقانة الحيوية (NCBI) | GSE38900؛ وGPL10558 وGPL6884 | التحقق الخارجي من عينات دم كاملة مصابة بالفيروس المخلوي التنفسي (RSV)، والتي حُللت كوحدات منصة منفصلة ومعيرة تتكون من 36 عينة و 138 عينة. |
| GSE40012 | قاعدة بيانات NCBI GEO | GSE40012 | الالتهاب الرئوي السريري الناجم عن إنفلونزا A، والالتهاب الرئوي البكتيري، ومتلازمة الاستجابة الالتهابية الجهازية (SIRS)، ومعيار المجموعة الضابطة السليمة. |
| GSE41374 | NCBI GEO | GSE41374 | مجموعة بيانات خارجية للتحقق من صحة غسول الأنف للفيروس المخلوي التنفسي (RSV). |
| GSE53543 | قاعدة بيانات NCBI GEO | GSE53543 | معيار مرجعي لاضطراب الفيروس الأنفي في الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) خارج الجسم الحي والمزدوج، يشمل 98 شخصاً و196 عينة. |
| GSE63990 | مستودع NCBI GEO (أرشيف التعبير الجيني للمركز الوطني لمعلومات التقانة الحيوية) | GSE63990 | مقياس مرجعي للدم الكامل السريري للإصابات الفيروسية والبكتيرية وغير المعدية. |
| GSE97741 | أرشيف التعبير الجيني (GEO) التابع للمركز الوطني لمعلومات التقانة الحيوية (NCBI) | GSE97741 | مجموعة بيانات التحقق الطولية للدم الكامل عند الحالة الحادة مقابل وقت الخروج. |
| GSE97742 | مستودع NCBI GEO | GSE97742 | مجموعة بيانات التحقق الطولي للبلعوم الأنفي المقارنة بين الحالة الحادة وحالة الخروج. |
| gseapy | مطورو gseapy | الإصدار 1.3.1 | واجهة Python المستخدمة للاستعلام من Enrichr. |
| مورد رموز الجينات الخاص بـ HGNC | لجنة تسمية الجينات التابعة لمنظمة HUGO | تم الدخول في 18 أغسطس 2026؛ RRID:SCR_002827 | مورد معتمد لتوحيد رموز الجينات وتصنيف البروتينات المشفرة. |
| مكتبة Matplotlib | فريق تطوير Matplotlib | الإصدار 3.11.1 | إنشاء الأشكال. |
| مجموعات جينات العلامة المميزة لـ MSigDB | معهد برود (Broad Institute) | Hallmark 2020؛ معرف المصدر RRID:SCR_016863 | مكتبة إثراء السمات المميزة (Hallmark enrichment library) التي يتم الوصول إليها عبر Enrichr. |
| مجموعة جينات الاستجابة لإنترفيرون-ألفا المميزة من MSigDB | معهد برود (Broad Institute) | العلامة_المميزة_لإنترفيرون_ألفا_ الاستجابة؛ المجموعة الأساسية المكونة من 33 جينًا في البيانات التكميلية 1 | مقارن غير مُثقّل للإنترفيرون-ألفا؛ تم توفير المجموعة الفرعية الدقيقة في البيانات التكميلية 1. |
| NumPy | مطورو NumPy | الإصدار 2.5.2 | الحوسبة العددية وأخذ العينات العشوائية المحددة ببذرة. |
| بانداز (pandas) | فريق تطوير pandas | الإصدار 3.0.5 | معالجة البيانات الجدولية. |
| مجموعة جينات الاستجابة المضيفة لـ mRNA الخاصة بـ Pandya 33 | بانديا وآخرون. | الجدول التكميلي 1؛ البيانات التكميلية 1 | طقم الجينات الرسمي المكون من 33 جينًا والمحتسب كمقارن غير موزون. |
| بايثون | مؤسسة برمجيات بايثون (Python Software Foundation) | الإصدار 3.12.13 | بيئة التحليل الحوسبي. |
| رياكتوم (Reactome) | ريأكتوم (Reactome) | Reactome 2022; RRID:SCR_003485 | مكتبة إثراء المسارات التي يتم الوصول إليها عبر Enrichr. |
| scikit-learn | مطورو scikit-learn | الإصدار 1.9.0 | حسابات المساحة تحت منحنى خصائص التشغيل للمستقبل (AUROC) ومتوسط الدقة. |
| SciPy | مطورو SciPy | الإصدار 1.18.0 | اختبار ويلش، اختبار t المزدوج، اختبار ويلكوكسون، اختبار مان–اختبار ويتني، واختبارات الارتباط. |
| سيبورن (Seaborn) | فريق تطوير Seaborn | الإصدار 0.13.2 | الرسوم البيانية الإحصائية. |
| statsmodels | مطورو statsmodels | الإصدار 0.14.6 | الأدوات الإحصائية. |
المراجع
- Zaas AK, et al. Gene expression signatures diagnose influenza and other symptomatic respiratory viral infections in humans. Cell Host Microbe. 2009;6(3):207-17.
- Woods CW, et al. A host transcriptional signature for presymptomatic detection of infection in humans exposed to influenza H1N1 or H3N2. PLoS One. 2013;8(1):e52198.
- Andres-Terre M, et al. Integrated, multi-cohort analysis identifies conserved transcriptional signatures across multiple respiratory viruses. Immunity. 2015;43(6):1199-211.
- Herberg JA, et al. Diagnostic test accuracy of a 2-transcript host RNA signature for discriminating bacterial vs viral infection in febrile children. JAMA. 2016;316(8):835-45.
- Pandya R, et al. A machine learning classifier using 33 host immune response mRNAs accurately distinguishes viral and non-viral acute respiratory illnesses in nasal swab samples. Genome Med. 2023;15(1):64.
- Ioannidis I, et al. Plasticity and virus specificity of the airway epithelial cell immune response during respiratory virus infection. J Virol. 2012;86(10):5422-36.
- Mejias A, et al. Whole blood gene expression profiles to assess pathogenesis and disease severity in infants with respiratory syncytial virus infection. PLoS Med. 2013;10(11):e1001549.
- Blanco-Melo D, et al. Imbalanced host response to SARS-CoV-2 drives development of COVID-19. Cell. 2020;181(5):1036-45.e9.
- Hadjadj J, et al. Impaired type I interferon activity and inflammatory responses in severe COVID-19 patients. Science. 2020;369(6504):718-24.
- Mick E, et al. Upper airway gene expression reveals suppressed immune responses to SARS-CoV-2 compared with other respiratory viruses. Nat Commun. 2020;11(1):5854.
- Yoshida M, et al. Local and systemic responses to SARS-CoV-2 infection in children and adults. Nature. 2022;602(7896):321-7.
- Jamali MC, et al. Respiratory infections by human metapneumovirus: epidemiological evidence and treatment prospects. Res J Pharm Technol. 2026;19(8):3905-12. doi:10.52711/0974-360X.2026.00549.
- Gao G, Lin R, Ma D. Human metapneumovirus: pathogenesis, epidemiology, diagnostic technologies, and potential intervention strategies. Virol J. 2025;22(1):376.
- Lim FY, et al. homeRNA self-blood collection enables high-frequency temporal profiling of presymptomatic host immune kinetics to respiratory viral infection: a prospective cohort study. EBioMedicine. 2025;112:105531.
- Johnson WE, Li C, Rabinovic A. Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostatistics. 2007;8(1):118-27.
- Leek JT, et al. The sva package for removing batch effects and other unwanted variation in high-throughput experiments. Bioinformatics. 2012;28(6):882-3.
- Yu J, et al. Host gene expression in nose and blood for the diagnosis of viral respiratory infection. J Infect Dis. 2019;219(7):1151-61.
- Tsalik EL, et al. Host gene expression classifiers diagnose acute respiratory illness etiology. Sci Transl Med. 2016;8(322):322ra11.
- Parnell GP, et al. A distinct influenza infection signature in the blood transcriptome of patients with severe community-acquired pneumonia. Crit Care. 2012;16(4):R157.
- Edgar R, Domrachev M, Lash AE. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Res. 2002;30(1):207-10.
- Barrett T, et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets-update. Nucleic Acids Res. 2013;41(D1):D991-5.
- Tweedie S, et al. Genenames.org: the HGNC and VGNC resources in 2021. Nucleic Acids Res. 2021;49(D1):D939-46.
- Welch BL. The generalization of Student's problem when several different population variances are involved. Biometrika. 1947;34(1-2):28-35.
- Benjamini Y, Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J R Stat Soc Series B Stat Methodol. 1995;57(1):289-300.
- Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(43):15545-50.
- Liberzon A, et al. The Molecular Signatures Database Hallmark Gene Set Collection. Cell Syst. 2015;1(6):417-25.
- Do LAH, et al. Host transcription profile in nasal epithelium and whole blood of hospitalized children under 2 years of age with respiratory syncytial virus infection. J Infect Dis. 2018;217(1):134-46.
- Ashburner M, et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 2000;25(1):25-9.
- The Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology resource: enriching a GOld mine. Nucleic Acids Res. 2021;49(D1):D325-34.
- Gillespie M, et al. The Reactome pathway knowledgebase 2022. Nucleic Acids Res. 2022;50(D1):D687-92.
- Kuleshov MV, et al. Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Res. 2016;44(W1):W90-7.
- Schoggins JW, et al. A diverse range of gene products are effectors of the type I interferon antiviral response. Nature. 2011;472(7344):481-5.
- Schneider WM, Chevillotte MD, Rice CM. Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses. Annu Rev Immunol. 2014;32:513-45.
- Perng YC, Lenschow DJ. ISG15 in antiviral immunity and beyond. Nat Rev Microbiol. 2018;16(7):423-39.
- Schioppa T, et al. Molecular basis for CCRL2 regulation of leukocyte migration. Front Cell Dev Biol. 2020;8:615031.
- Avila Cobos F, et al. Benchmarking of cell type deconvolution pipelines for transcriptomics data. Nat Commun. 2020;11(1):5650.
- Maden SK, et al. Challenges and opportunities to computationally deconvolve heterogeneous tissue with varying cell sizes using single-cell RNA-sequencing datasets. Genome Biol. 2023;24(1):288.