يصف هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار لعزل وزراعة خلايا العضلات الملساء الأبهرية الأولية للفئران من منطقتي الصدر والبطن. وتنتج هذه الطريقة خلايا حيوية مناسبة للدراسات in vitro حول إعادة تشكيل الأوعية الدموية والبيولوجيا المرتبطة بتمدد الأوعية الدموية.
مقالة منهجية
عزل وزراعة خلايا العضلات الملساء الأبهرية الفأرية الأولية للدراسات In vitro ذات الصلة بإعادة تشكيل الأوعية الدموية وبيولوجيا تمدد الأوعية الدموية الأبهرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يوفر عزل واستزراع خلايا العضلات الملساء الأبهرية الأولية (SMCs) نهجاً قيماً لاستقصاء الآليات الخلوية الكامنة وراء الأمراض الوعائية، بما في ذلك تمدد الأوعية الدموية الأبهرية. تصف هذه المقالة بروتوكولاً مفصلاً ومحسناً لعزل واستزراع خلايا SMCs الأبهرية الفأرية من قطاعات الأبهر الصدرية والبطنية. تتضمن الإجراءات الحالية تشريحاً دقيقاً للشريان الأبهر، وإزالة الأنسجة المحيطة، وهضماً إنزيمياً من خطوتين باستخدام الكولاجيناز والإيلاستاز ومثبط التربسين من فول الصويا، يليه تفكيك ميكانيكي وتوسيع للخلايا في ظل ظروف استزراع محددة. يتم التركيز بشكل خاص على الخطوات التي تحسن إنتاجية الخلايا ونقاءها وقابلية تكرار النتائج، بما في ذلك إزالة الغلالة الخارجية وتوقيت الهضم المنضبط. باستخدام هذا النهج، يمكن عزل وتوسيع خلايا SMCs الأولية بنجاح، حيث تظهر المورفولوجيا وأنماط النمو المميزة. يوفر هذا البروتوكول نهجاً قابلاً للتكرار والتكيف لتوليد خلايا SMCs الأبهرية الأولية، ويعمل كمنصة للدراسات in vitro ذات الصلة بإعادة تشكيل الأوعية الدموية وبيولوجيا تمدد الأوعية الدموية الأبهرية.
المقدمة
تعد خلايا العضلات الملساء الأبهرية (SMCs) مكونات أساسية في الجدار الوعائي، حيث تساهم في كل من السلامة الهيكلية والتنظيم الوظيفي للشريان الأبهر. وفي الأوعية السليمة، تحافظ خلايا العضلات الملساء على نمط ظاهري تقلصي يتميز بالتعبير عن بروتينات تقلصية مثل α-smooth muscle actin (α-SMA) وسلسلة الميوزين الثقيلة للعضلات الملساء (MYH11)1,2,3. ويدعم هذا النمط الظاهري التوتر الوعائي ويحافظ على تنظيم المصفوفة خارج الخلوية. ومع ذلك، في الحالات المرضية مثل تمدد الشريان الأبهر البطني (AAA)، تخضع خلايا العضلات الملساء لتعديل في النمط الظاهري نحو حالة تخليقية ومحفزة للالتهاب1,2,3. ويرتبط هذا التحول بزيادة التكاثر، وإفراز السيتوكينات، وإنتاج الإنزيمات التي تحلل المصفوفة، مما يساهم في نهاية المطاف في إضعاف جدار الشريان الأبهر4,5.
لقد ساهمت النماذج الحيوانية، بما في ذلك تكوين تمدد الأوعية الدموية الأبهر المستحث بواسطة angiotensin II (Ang II)، بشكل كبير في تعزيز فهم إمراضية AAA1,6,7,8,9,10,11. ومع ذلك، فإن هذه النماذج لا تسمح بالتحكم الدقيق في المسارات الخلوية أو الملاحظة المباشرة للآليات الخاصة بالخلايا العضلية الملساء (SMC). وتوفر أنظمة In vitro التي تستخدم خلايا SMC الأولية نهجاً تكميلياً، مما يتيح استقصاءً تفصيلياً لمسارات التأشير، والتنظيم الجيني، والاستجابات الخلوية في ظل ظروف مضبوطة12.
على الرغم من فائدتها، فإن عزل الخلايا العضلية الملساء (SMCs) الأولية من الشريان الأبهر للفئران يمثل تحدياً تقنياً. فحجم الشريان الأبهر الصغير في الفئران، ووجود الأنسجة الدهنية والضامة المحيطة، واحتمال التلوث بالأرومات الليفية الغشائية قد يؤثر جميعاً على نقاء الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، يجب التحكم في الهضم الإنزيمي بدقة لتحقيق التوازن بين تفكيك الأنسجة والحفاظ على حيوية الخلايا. وغالباً ما يؤدي التباين في هذه الخطوات إلى نتائج غير متسقة بين التجارب والمختبرات المختلفة.
نُشرت العديد من البروتوكولات التي تصف عزل وزراعة الخلايا العضلية الملساء الأولية للشريان الأورطي لدى الفئران، ويعتمد معظمها على الإزالة الميكانيكية الكاملة للغلالة البرانية قبل الهضم الإنزيمي، وتركز بشكل أساسي على الأورطى الكامل أو قطاعات من الأورطى الصدري13,14. يعتمد البروتوكول الحالي على هذه الطرق من خلال دمج عدة تحسينات تقنية، بما في ذلك خطوة هضم إنزيمي تمهيدية قصيرة لتسهيل فصل الطبقتين البرانية والوسطى قبل التفكك النسيجي الكامل، وظروف هضم معيارية مع تفكيك ميكانيكي لطيف ومتقطع، وسير عمل لعزل وزراعة الخلايا العضلية الملساء للأورطى الصدري (THX) والبطني (ABD) بشكل منفصل. تهدف هذه التحسينات مجتمعة إلى تحسين اتساق وقابلية تكرار معالجة الأنسجة مع تسهيل الدراسات الخاصة بمناطق معينة من إعادة تشكيل الأوعية الدموية وبيولوجيا تمدد الأوعية الدموية. وتعد مستنبتات الخلايا العضلية الملساء الناتجة مناسبة لمجموعة واسعة من التطبيقات اللاحقة، بما في ذلك إسكات الجينات، والدراسات الدوائية، والتحقيقات الميكانيكية ذات الصلة بإعادة تشكيل الأوعية الدموية وبيولوجيا تمدد الأوعية الدموية. ورغم أن الخلايا العضلية الملساء الأولية المعزولة من أورطى غير مصاب لا تظهر بطبيعتها الأنماط الظاهرية لتمدد الأوعية الدموية، إلا أنها توفر نظامًا مضبوطًا in vitro لاستقصاء المسارات الخلوية المتورطة في تطور تمدد الأوعية الدموية بعد التلاعب التجريبي المستهدف.
البروتوكول
استُخدمت إناث فئران من سلالة C57BL/6J بالغة، تتراوح أعمارها بين 8 إلى 10 أسابيع وتزن ما بين 18 و20 جم، في الإجراء الموضح أدناه. وقد استُخدم فأران لكل عملية عزل. نُفذت جميع الإجراءات الحيوانية وفقاً لإرشادات لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية (IACUC) في جامعة كنتاكي، وتم اعتمادها بموجب البروتوكول رقم 2022-4153. وتدرج تفاصيل جميع الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواديظهر مخطط عام لسير عمل عملية العزل والزراعة الكاملة في الشكل 1.
تنبيه: يُعد الكيتامين والزيلازين من المواد الخاضعة للرقابة، ويجب التعامل معها وتخزينها والتخلص منها وفقاً لسياسات المؤسسة واللوائح المعمول بها. كما أن الكولاجيناز من النوع الثاني والإيلاستاز هما إنزيمان محللان للبروتين قد يسببان تهيجاً للجلد والعين والجهاز التنفسي. ويُعد صبغة تريبان الزرقاء صبغة خطرة يجب التعامل معها باستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة مع تجنب ملامستها للجلد والعين. كما يجب التعامل مع جميع الكواشف الخطرة والتخلص منها وفقاً لإرشادات السلامة المؤسسية وتعليمات الشركات المصنعة.
1. تحضير الكواشف وأوساط الزرع
- قم بتحضير 10 mL من محلول الهضم الإنزيمي حديثاً في يوم العزل داخل أنبوب مخروطي معقم سعة 15 mL:
- أضف 10 mg من collagenase type II (التركيز النهائي 1 mg/mL) (انظر جدول المواد).
- أضف 10 mg من مثبط التربسين من فول الصويا (التركيز النهائي 1 mg/mL) (انظر جدول المواد).
- أضف 71 µL من معلق elastase (التركيز النهائي 0.744 U/mL) (انظر جدول المواد).
- حضر المحلول في HBSS يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم وبدون phenol red (انظر جدول المواد).
- أضف 100 µL من penicillin/streptomycin (1% من الحجم النهائي) (انظر جدول المواد).
- اخلط المحلول جيداً وقم بتعقيمه بالترشيح باستخدام مرشح حقنة نايلون بمسامية 0.2 µm (انظر جدول المواد).
- حضر وسط استزراع SMC كاملاً (500 mL)
- أضف 385 mL من Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) بدون phenol red (انظر جدول المواد) كوسط أساسي.
- عزز الوسط بإضافة 100 mL من مصل جنين البقر المعالج بالفحم/الديكستران (20% من الحجم النهائي) (انظر جدول المواد).
- أضف 10 mL من penicillin/streptomycin (2% من الحجم النهائي) (انظر جدول المواد).
- أضف 5 mL من amphotericin B (1% من الحجم النهائي) (انظر جدول المواد)
- عقم الأوساط بالترشيح واحفظها عند درجة حرارة 4 °C.
- قم بتدفئة جميع الكواشف مسبقاً إلى 37 °C قبل الاستخدام.
2. التحضير لمعالجة الأنسجة
- قم بتقسيم محلول الهضم الإنزيمي مسبقاً وبشكل متساوٍ على 4 آبار (2.5 mL لكل بئر) في طبق زراعة مكون من 6 آبار، وقم بتسخينها مسبقاً في الحاضنة عند 37 °C مع 5% CO₂ قبل معالجة الأنسجة. يجب تخصيص بئرين لـ 'THX' وبئرين لـ 'ABD' لقطع الشريان الأورطي. يمكن معالجة عدة قطع من المنطقة التشريحية نفسها في بئر واحد.
- قم بتجهيز طبقين منفصلين للزراعة (راجع جدول المواد) يحتويان على وسط زراعة خلايا العضلات الملساء الوعائية (SMC) الكامل، وقم بتمييزهما بـ THX و ABD.
- قم بتسخين أطباق الزراعة التي تحتوي على الأوساط مسبقاً في حاضنة مرطبة.
- قم بتجهيز 20 mL من محلول HBSS المعقم مسبقاً لعملية تروية الأوعية الدموية والتعامل مع الأنسجة.
- قم بتجهيز طبقين إضافيين للزراعة يحتوي كل منهما على 3 mL من HBSS للتنظيف المتسلسل للشرايين الأورطية المعزولة.
- قم بتجهيز أنابيب مخروطية سعة 15 mL مميزة (راجع جدول المواد) تحتوي كل منها على 5 mL من HBSS للتخزين المؤقت وفصل قطع الشريان الأورطي THX و ABD.
- قم بتعقيم الأدوات الجراحية بين الحيوانات عن طريق استخدام المنظف، والشطف بالماء المقطر، والتطهير بـ 70% ethanol، والتعقيم باستخدام جهاز تعقيم بالخرز (راجع جدول المواد).
3. تحضير الحيوان وتشريح الأبهر
- تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP) بالكيتامين (300 mg/kg) والزيلازين (30 mg/kg) (انظر جدول المواد) وفقاً لبروتوكول IACUC بجامعة كنتاكي رقم 2022-4153 الخاص بالإجراءات النهائية.
- التأكد من عمق التخدير الكافي من خلال غياب الاستجابة الانعكاسية عند قرص إصبع القدم.
- تعقيم منطقة الجراحة باستخدام ethanol بتركيز 70%.
- أثناء التخدير الجراحي العميق، يتم القتل الرحيم للفئران عن طريق نزف الدم عبر وخز القلب، يليه تروية عبر القلب باستخدام HBSS، وذلك وفقاً للإرشادات المؤسسية وإرشادات AVMA.
- فتح التجويف الصدري وإجراء وخز للقلب لجمع الدم.
- تروية الأوعية الدموية من خلال البطين الأيسر باستخدام حقنة سعة 10 mL مزودة بإبرة مقاس 25-gauge لحقن 10 mL من HBSS المعقم ببطء. يوصى بمعدل تروية يبلغ حوالي 0.5 mL/s لضمان الإزالة الفعالة لبقايا الدم.
- إزالة الأعضاء المحيطة بعناية (الكبد، والرئتين، والطحال، والقناة الهضمية، والكليتين). ترك قطعة من الحجاب الحاجز متصلة بالأبهر.
- عزل الشريان الأبهر من جذر الأبهر إلى التفرع الحرقفي مع الحفاظ على الحجاب الحاجز سليماً. يعمل الحجاب الحاجز كحد تشريحي بين منطقتي THX و ABD (الشكل 2B).
- نقل الشريان الأبهر فوراً إلى HBSS معقم (الشكل 2A).
4. تنظيف الشريان الأورطي وتقسيمه
- ضع طبق الزرع المعقم الذي يحتوي على الشريان الأورطي تحت مجهر تشريحي (راجع جدول المواد).
- أزل الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة بعناية باستخدام ملاقط دقيقة (راجع جدول المواد).
- افصل الشريان الأورطي إلى قطعتين: الصدرية (THX) والبطنية (ABD).
ملاحظة: تمتد القطعة الصدرية (THX) من منطقة الشريان الأورطي فوق الحجاب الحاجز مباشرة وصولاً إلى جذر الشريان الأورطي، بينما تمتد القطعة البطنية (ABD) من منطقة الشريان الأورطي تحت الحجاب الحاجز مباشرة نزولاً إلى تفرع الشريان الحرقفي (الشكل 2B). - انقل القطع المنظفة إلى أنابيب مخروطية منفصلة سعة 15 mL تحتوي على محلول HBSS طازج لمزيد من المعالجة.
5. الهضم الإنزيمي وعزل الخلايا
- يتم تحضين قطع الشريان الأبهر في محلول الإنزيم عند 37 °C لمدة 8–10 دقائق.
- تُزال قطع الشريان الأبهر من محلول الإنزيم.
- تُنقل القطع إلى أطباق زراعة منفصلة تحتوي على وسط SMC الكامل المخصص لعينات THX وABD.
- تُزال الطبقة البرانية من الشريان الأبهر باستخدام ملاقط خشنة ودقيقة. ويتم التأكد من الإزالة الكاملة للطبقة البرانية عندما يظهر السطح الخارجي للشريان الأبهر أملسًا وشفافًا، مع عدم وجود أنسجة ضامة أو أنسجة دهنية متبقية مرئية (الشكل 2C).
- تُنقل قطع الشريان الأبهر إلى محلول إنزيمي جديد، ويتم فرم الطبقة الوسطى إلى شظايا صغيرة مباشرة داخل المحلول (الشكل 3A).
- تُحضن شظايا الأنسجة عند 37 °C في حضانة رطبة تحتوي على 5% CO₂ لمدة ساعة واحدة.
- يتم إجراء تفكيك ميكانيكي لطيف عن طريق السحب والضخ بالماصة حوالي 10–15 مرة لتسهيل تحرر الخلايا (الشكل 3B).
- تُكرر خطوة التفكيك الميكانيكي على فترات زمنية تتراوح بين 30–60 دقيقة أثناء استمرار التحضين، ليصل إجمالي وقت الهضم إلى 2–3 ساعات أو حتى يتم الحصول على معلق خلوي متجانس.
6. جمع الخلايا، وغسلها، وزراعتها، والاستزراع الأولي
- انقل محلول الهضم الإنزيمي الذي يحتوي على الخلايا المفككة إلى أنابيب مخروطية سعة 15 mL منفصلة (انظر جدول المواد) مخصصة لعينات THX و ABD.
- اشطف كل بئر هضم بـ 5 mL من وسط الزرع واجمع السائل مع الأنابيب المقابلة.
- قم بطرد مركزي لمعلق الخلايا عند 400 × g لمدة 5 min في درجة حرارة الغرفة.
- كرر عملية الطرد المركزي إذا كان تكوين الرواسب غير كافٍ.
- أزل السائل الطافي دون تعكير راسب الخلايا (الشكل 3C).
- أعد تعليق الخلايا باستخدام 5 mL من وسط زرع جديد وأجرِ خطوة غسيل إضافية يتبعها طرد مركزي تحت نفس الظروف.
- أزل السائل الطافي وأعد تعليق راسب الخلايا النهائي في حجم مناسب (عادةً 6 mL) من وسط زرع SMC الكامل.
- ازرع معلق الخلايا بالكامل الذي تم الحصول عليه من قطعة الشريان الأورطي الصدري أو البطني في بئرین من طبق زرع يحتوي على 6 آبار (3 mL من الوسط المعلق لكل بئر) واحضنها عند 37 °C مع 5.0% CO₂. تُزرع الخلايا فوراً بعد العزل دون إجراء عد مسبق للخلايا؛ لذا لا يتم استخدام كثافة استزراع مستهدفة في هذه المرحلة.
- حافظ على المزارع دون إزعاج لمدة 5–7 أيام للسماح بالتصاق الخلايا وتوسعها الأولي.
نقطة توقف: بعد الزراعة، يمكن الحفاظ على المزارع في الحاضنة لمدة 5–7 أيام قبل الانتقال إلى خطوات صيانة الخلايا وتوسيعها في القسم 7.
7. صيانة الخلايا وتوسيعها
- استبدل أوساط المزرعة كل 3-4 أيام.
- راقب شكل الخلايا ومدى تلاقيها (confluence) بانتظام.
- قم بنقل الخلايا (Passage) عندما تصل نسبة تلاقيها إلى 80-90% تقريباً.
- قم بشفط أوساط المزرعة واغسل الخلايا بمحلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) مُدفأ مسبقاً (راجع جدول المواد).
- أضف 0.05% trypsin-EDTA واحضن الخلايا عند 37 °C لمدة 5-10 دقائق.
- تابع الخطوات عندما ينفصل 80%–90% من الخلايا.
- انقر على طبق المزرعة برفق لتسهيل عملية الانفصال.
- أضف حجماً مساوياً من أوساط المزرعة الكاملة لمعادلة مفعول التريبسين (trypsin).
- استخدم الماصة برفق لفصل الخلايا المتبقية.
- انقل معلق الخلايا إلى أنابيب مخروطية وقم بالطرد المركزي عند 400 × g لمدة 5 دقائق.
- أزل السائل الطافي وأعد تعليق كريس الخلايا (cell pellet) في أوساط مزرعة جديدة.
- ازرع الخلايا بنسبة تقسيم 1:2 (أو الكثافة التجريبية المطلوبة) واحضنها عند 37 °C مع 5% CO₂. اترك الخلايا تلتصق دون إزعاج لمدة 24-48 ساعة.
ملاحظة: بالنسبة للتجارب اللاحقة، استخدم الخلايا بين الممرات من 3 إلى 7 (P3–P7) لتقليل الانحراف المظهري الناتج عن المزرعة. الخلايا التي تتجاوز الممر 7 تكون أكثر عرضة للانحراف المظهري وقد تظهر تغيراً في الشكل والوظيفة.
8. التحقق من خلال صبغ التألق المناعي لـ α-SMA
- زراعة الخلايا على مادة مناسبة للفحص بالمجهر الفلوري.
- وزع الخلايا في طبق بصري القاع بـ 96 بئراً بمعدل 15,000 خلية لكل بئر. اترك الخلايا تنمو حتى تصل إلى درجة الالتحام المطلوبة.
- تحضير الخلايا للتثبيت
- اشفط أوساط الزراعة من الخلايا الملتصقة. اغسل الخلايا 3 مرات باستخدام 200 µL لكل بئر من محلول ملحي منظم بالتريس مع 0.1% Tween 20 (TBS-T) لمدة 5 دقائق لكل غسلة، ثم اشفط السائل باستخدام مكنسة شفط غطاء بيولوجي.
- تثبيت الخلايا
- أضف 200 µL لكل بئر من محلول 4% بارافورمالدهيد (PFA) في 1x PBS. حضن العينات لمدة 10–20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم اشفط السائل.
- النفاذية
- أضف 200 µL لكل بئر من محلول 0.1% Triton X-100 في 1x PBS. حضن العينات لمدة 10–15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم اشفط السائل.
- حجب الارتباط غير النوعي
- اغسل الخلايا 3 مرات باستخدام 200 µL لكل بئر من TBS-T لمدة 5 دقائق لكل غسلة. أضف 200 µL لكل بئر من محلول 5% ألبومين مصل بقري (BSA) في TBS-T.
- ضع الطبق على هزاز مداري بسرعة 200 rpm تقريباً لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
- التلوين بالأجسام المضادة الأولية
- حضّر الجسم المضاد الأولي α-SMA بتخفيف 1:1,000 في 5% BSA في TBS-T.
- أخرج الطبق من الهزاز المداري واشفط محلول الحجب من الآبار المخصصة لتلوين α-SMA. بالنسبة لعينة التحكم التي تحتوي على الجسم المضاد الثانوي فقط، استغنِ عن الجسم المضاد الأولي وأبقِ بئر التحكم في محلول 5% BSA في TBS-T.
- أضف 200 µL لكل بئر من الجسم المضاد الأولي α-SMA المخفف إلى الآبار التجريبية. حضن الآبار التجريبية وآبار تحكم الجسم المضاد الثانوي فقط طوال الليل عند 4 °C على هزاز مداري خفيف.
- التلوين بالأجسام المضادة الثانوية
- حضّر الجسم المضاد الثانوي الفلوري بتخفيف 1:2,500 في TBS-T يحتوي على 0.1% Tween 20.
- أخرج الطبق من الهزاز المداري واشفط جميع الآبار.
- اغسل جميع الآبار 3 مرات باستخدام 200 µL لكل بئر من TBS-T لمدة 5 دقائق لكل غسلة، ثم اشفط السائل.
- أضف 200 µL لكل بئر من الجسم المضاد الثانوي الفلوري المخفف إلى جميع الآبار، بما في ذلك عينة تحكم الجسم المضاد الثانوي فقط.
- احمِ الطبق من الضوء وحضنه على هزاز مداري بسرعة 200 rpm تقريباً لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
- تلوين النواة والتصوير الفلوري
- حضّر محلول Hoechst 33342 بتركيز 2 µg/mL.
- اغسل الخلايا 3 مرات باستخدام 200 µL لكل بئر من TBS-T لمدة 5 دقائق لكل غسلة. أضف كمية كافية من محلول تلوين Hoechst 33342 لتغطية الخلايا وحضنها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الحماية من الضوء.
- التقط الصور الفلورية باستخدام مجهر فلوري مقلوب بتكبير 20x لمستنبتات THX وABD الملونة بـ α-SMA، وبتكبير 10x لعينات تحكم الجسم المضاد الثانوي فقط، باستخدام إثارة بطول موجي 385 nm لـ Hoechst 33342 وإثارة بطول موجي 475 nm للجسم المضاد الثانوي المقترن بالفلوروفور. تم تصوير عينات تحكم الجسم المضاد الثانوي فقط بتكبير 10x لتشمل عدداً كافياً من النوى ضمن مجال الرؤية.
- تقدير كمية الخلايا الموجبة لـ α-SMA.
- قيم إيجابية α-SMA عن طريق عد النوى الموجبة لـ Hoechst المرتبطة بخلايا تظهر تلويناً سيتوبلازمياً مغزلي الشكل واضح الإيجابية لـ α-SMA. صنف الخلايا ذات الإشارة الفلورية الغامضة أو غير المحددة كموجبة لـ α-SMA بشكل تحفظي (أي سلبية).
- احسب نسبة إيجابية α-SMA بقسمة عدد الخلايا الموجبة لـ α-SMA على العدد الإجمالي للنوى الموجبة لـ Hoechst التي تم عدها في المجالات المجهرية التي تم تقييمها، ثم اضرب الناتج في 100.
النتائج
في غضون 24–48 ساعة بعد العزل، تبدأ مجموعة فرعية من الخلايا في الالتصاق بسطح المزرعة والانتشار، حيث تظهر في البداية بشكل مورفولوجي مستدير. قد يكون التصاق الخلايا متفاوتاً في النقاط الزمنية المبكرة، وقد تبدو المزارع متناثرة نظراً للعدد المحدود من الخلايا الحية المستعادة أثناء عملية العزل الأولية. وبحلول الأيام 3–5، تتبنى الخلايا الملتصقة تدريجياً مورفولوجيا مغزلية الشكل ومستطيلة مميزة لخلايا العضلات الملساء الوعائية (SMCs)، وتبدأ في التكاثر مكونةً تجمعات صغيرة. يوضح الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية لسير العمل التجريبي، بما في ذلك عزل الشريان الأورطي، والتقسيم، والهضم الإنزيمي، والتفكيك الميكانيكي، وزراعة الخلايا.
تظهر الصور التمثيلية لعزل الشريان الأورطي، والتقسيم التشريحي إلى منطقتي الصدر (THX) والبطن (ABD)، وإزالة الطبقة البرانية في الشكل 2. تم التمييز بين منطقتي الشريان الأورطي الصدري (THX) والبطني (ABD) بناءً على الموقع التشريحي بالنسبة للحجاب الحاجز، كما هو موضح في الشكل 2B. وتظهر الصور التمثيلية للهضم الإنزيمي، والتفكيك الميكانيكي، وتكوين كتلة خلوية مرئية بعد عملية الطرد المركزي في الشكل 3.
تم تقييم عدد الخلايا وحيويتها في الممر 3 باستخدام استبعاد Trypan blue بنسبة (1:1) وجهاز Countess Automated Cell Counter. تم الحصول على البيانات من 3 عمليات عزل مستقلة باستخدام 6 فئران إجمالاً (فأران لكل عملية عزل). سجلت مستنبتات THX متوسط عدد خلايا بلغ 5.10 × 105 ± 7.81 × 104 خلية (المدى، 4.20 × 105–5.60 × 105) وحيوية بنسبة 66.33 ± 18.18% (المدى، 46–81%). بينما سجلت مستنبتات ABD متوسط عدد خلايا بلغ 4.63 × 105 ± 2.31 × 104 خلية (المدى، 4.50 × 105–4.90 × 105) وحيوية بنسبة 61.66% ± 12.01% (المدى، 50%–74%) (الجدول 1).
بحلول الأيام 5-7، تصل المزارع عادةً إلى درجة تلاقي تتراوح تقريبًا بين 70% و90%، مكونةً طبقة أحادية كثيفة ومنتظمة نسبيًا. وتصطف الخلايا عادةً في اتجاهات متوازية، مما يعكس سلالتها التقلصية. وقد تُلاحظ اختلافات في معدل التكاثر وكثافة الخلايا بين خلايا SMCs في منطقتي THX وABD، وهو ما يتفق مع التباين الإقليمي المعروف في الشريان الأبهر. وتظهر صور مجهر تباين الطور ممثلة لشكل خلايا SMCs الأولية من قطاعي الشريان الأبهر THX وABD عند تكبير منخفض (10x) وتكبير أعلى (20x) في الشكل 4.
أظهرت خلايا SMCs المورفولوجيا المميزة المتمثلة في الشكل المغزلي المستطيل، والاصطفاف المتوازي المنظم عند التلاقي، ونمط نمو موحد، بينما تظهر الخلايا الشبيهة بالأرومات الليفية عادةً مورفولوجيا أكثر تسطحاً وغير منتظمة مع توجيه أقل تنظيماً وانتشار غير متجانس. توفر هذه الخصائص المورفولوجية والنموية منهجاً عملياً وقابلاً للتكرار لتحديد مجتمعات SMC في المزارع الأولية في حالة عدم وجود تحقق جزيئي. ويُستدل على نجاح العزل من خلال التصاق الخلايا المبكر خلال 24–48 h، والاكتساب التدريجي للمورفولوجيا مغزلية الشكل، وتكوين طبقة أحادية متلاقية بحلول الأيام 5–7. وعادةً ما تصطف الخلايا في مصفوفات متوازية عند مستويات التلاقي الأعلى، وهو ما يتفق مع النمط الظاهري للعضلات الملساء. قد تشمل النتائج غير المثالية ضعف التصاق الخلايا، أو انخفاض إنتاجية الخلايا، أو وجود خلايا مسطحة غير منتظمة الشكل، مما قد يشير إلى هضم غير كامل، أو تعرض إنزيمي مفرط، أو تلوث بمجتمعات خلوية ليست من العضلات الملساء.
يدعم استمرار حيوية الخلايا والحد الأدنى من التلوث بالخلايا الشبيهة بالأرومات الليفية نجاح عملية العزل. ولتأكيد هوية SMC بشكل أكبر، تم إجراء صبغ مناعي لعينات ممثلة من المزارع الأولية لـ α-SMA (الشكل 5) باستخدام الإجراء الموضح في القسم 8. أظهرت كل من مزارع THX وABD نمط صبغ خيطي مميز لـ α-SMA وهو المتوقع من SMC الوعائية. وقد حدد القياس الكمي عبر أربعة حقول مجهرية وجود 69 خلية موجبة لـ α-SMA من بين 72 خلية موجبة لـ Hoechst تم تقييمها، وهو ما يتوافق مع إيجابية إجمالية لـ α-SMA بنسبة 95.8% (95% CI، 88.5%–98.9%). وتحديداً، كانت 20/20 من خلايا THX و49/52 من خلايا ABD موجبة لـ α-SMA. يوضح الشكل 5 حقولاً ممثلة من تلك التي تم تقييمها.
خلال الممرات المبكرة، تحافظ الخلايا على شكل مستقر وقدرة تكاثرية. ومع ذلك، ومع استمرار الزرع، قد تظهر الخلايا تدريجياً سمات التعديل المظهري، بما في ذلك زيادة الانتشار، وانخفاض الاصطفاف، وتغير أنماط النمو.
تحت هذه الظروف، تعد مزارع خلايا العضلات الملساء (SMC) الأولية مناسبة للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك إسكات الجينات، والمعالجات الدوائية، والدراسات الميكانيكية للمسارات المشاركة في إعادة تشكيل الأوعية الدموية وتطور تمدد الشريان الأورطي.
الشكل 1نظرة عامة تخطيطية لسير العمل. تمثيل تخطيطي لسير عمل عزل خلايا العضلات الملساء للشريان الأبهر الأساسي لدى الفئران. اللوحة 1 يوضح عملية القتل الرحيم وعزل الشريان الأورطي. اللوحة 2 يوضح فصل قطاعات الشريان الأورطي من منطقتي THX وABD في محلول الهضم الإنزيمي. اللوحة 3 يوضح إزالة الغلالة الخارجية وعزل الطبقة المتوسطة. اللوحة 4 يوضح إعادة شرائح الأنسجة إلى محلول إنزيمي طازج والفرم. اللوحة 5 يوضح عملية الفصل الميكانيكي عن طريق السحب والضخ بالمصّة كل 30 دقيقة لمدة تتراوح بين 2 و3 ساعات. اللوحة 6 يوضح عملية استعادة الخلايا وزرعها، بما في ذلك 6أ الطرد المركزي، و6ب إزالة الراشح، و6ج إعادة تعليق الراسب وزرعه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: عزل وتحضير قطع من الأبهر لدى الفئران. (A) الأبهر كاملاً بعد عزله ووضعه في طبق زراعة. (B) الأبهر بعد تنظيفه مع توضيح المعالم التشريحية التي تشير إلى منطقتي THX و ABD، بما في ذلك الحجاب الحاجز وتفرع الشريان الحرقفي. (C) صور تمثيلية لإزالة الغلالة الخارجية من قطعتي THX (في الأعلى) و ABD (في الأسفل) باستخدام ملاقط دقيقة وخشنة، مما يكشف عن الطبقة الوسطى الكامنة والضرورية لعزل خلايا العضلات الملساء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3الهضم الإنزيمي والتفكيك الميكانيكي لأنسجة الأبهر. (Aبعد إزالة الطبقة الخارجية (البرانية)، تُنقل الطبقة الوسطى إلى محلول إنزيمي جديد وتُقطع باستخدام مقص صغير.B) مثال على التفكيك الميكانيكي لشظايا الأبهر عن طريق السحب اللطيف باستخدام الماصة. (سيبعد الهضم الإنزيمي والطرد المركزي، تظهر كتلة خلوية مرئية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: المورفولوجيا التمثيلية لخلايا العضلات الملساء الأبهرية الفأرية الأولية (SMCs). تم استزراع خلايا SMCs الأولية المعزولة من أجزاء الأبهر الصدري والبطني في ظروف قياسية وتصويرها في الممر 4. تظهر صور تباين الطور التمثيلية بتكبير منخفض (10x) وتكبير أعلى (20x). تظهر الخلايا مورفولوجيا مغزلية الشكل ومستطيلة ومحاذات متسقة مع النمط الظاهري لـ SMC التقلصي. قد تلاحظ اختلافات في كثافة الخلايا وتنظيمها بين خلايا SMCs المشتقة من THX وABD، مما يعكس التباين الإقليمي. أشرطة القياس = 100 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: التحقق بالفلورة المناعية من خلايا العضلات الملساء الأبهرية الفأرية الأولية. (A) صور تمثيلية للفلورة المناعية لخلايا SMCs الأولية المعزولة من الأبهر الصدري THX (يساراً) والأبهر البطني ABD (يميناً) والمصبوغة بـ α-SMA (باللون الأخضر). صُبغت النوى بصبغة Hoechst 33342 (باللون الأزرق). تم التقاط الصور بتكبير 20x. (B) صور تمثيلية لعينة ضابطة استخدم فيها الجسم المضاد الثانوي فقط لخلايا SMCs الأولية من THX (يساراً) وABD (يميناً)، حيث تمت معالجتها بدون الجسم المضاد الأولي α-SMA وصُبغت بالنوى بصبغة Hoechst 33342 (باللون الأزرق). تم التقاط الصور بتكبير 10x. حدد القياس الكمي عبر أربعة مجالات مجهرية أن 69/72 خلية كانت إيجابية لـ α-SMA (95.8%). أشرطة المقياس = 100 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| عدّ الخلايا وحيويتها في مستنبتات الخلايا العضلية الملساء الشريانية الأولية للفئران | |||
| قطعة أبهريّة | عمليات عزل مستقلة، n | تعداد الخلايا (المتوسط ± الانحراف المعياري (SD)* | حيوية الخلايا (المتوسط ± الانحراف المعياري)† |
| شكراً | 3 | 5.10 × 105 ± 7.81 × 104 خلايا | 66.33 ± 18.18 % |
| نقص الألبومين في الدم | 3 | 4.63 × 105 ± 2.31 × 104 خلايا | 61.66 ± 12.01 % |
| تَمّ الحصول على تعدادات الخلايا في الممر الثالث من 3 عمليات عزل مستقلة. | |||
| †تم تحديد عدد الخلايا وحيويتها باستخدام طريقة استبعاد صبغة Trypan blue بنسبة 1:1 بواسطة عداد الخلايا الآلي Countess. | |||
الجدول 1: عدد الخلايا وحيويتها في مزارع الخلايا العضلية الملساء الأساسية للشريان الأورطي الفأري
| الخطوة | المشكلة | السبب المحتمل | الحل الموصى به |
| تشريح الأبهر | انخفاض حصيلة الخلايا | استرداد غير كامل للأبهر أو تلف الأنسجة أثناء التشريح | ضمان العزل الكامل من جذر الأبهر حتى التفرع الحرقفي؛ التعامل مع الأنسجة برفق لتجنب التلف |
| تنظيف الأبهر | تلوث بالخلايا الليفية | إزالة غير كاملة للنسيج الغمدي | نزع الغمد بعناية بعد الهضم الأولي؛ وهذا أمر بالغ الأهمية لنقاء SMC |
| الهضم الأولي | صعوبة إزالة الغمد | عدم كفاية التفكك الإنزيمي | ضمان التحضين المناسب (8-10 min) قبل محاولة النزع الميكانيكي |
| الهضم الإنزيمي | انخفاض حصيلة الخلايا | نقص هضم الأنسجة | تمديد وقت الهضم قليلاً أو زيادة تكرار التفكيك الميكانيكي |
| الهضم الإنزيمي | ضعف حيوية الخلايا | فرط الهضم أو التعرض المفرط للإنزيم | تقليل وقت الهضم وتجنب التحضين المطول |
| التفكيك الميكانيكي | ضعف تحرر الخلايا | عدم كفاية عملية الماصة | إجراء سحب وإخراج لطيف ومتكرر بالماصة كل 30-60 min |
| التصاق الخلايا | ضعف الالتصاق بالطبق | تلف الخلايا أو برودة الوسط المغذي | استخدام أوساط مغذية مدفأة مسبقاً وتقليل إجهاد التعامل مع الخلايا |
| الزراعة الأولية | عدم نمو الخلايا | انخفاض الحيوية أو التلوث | التأكد من ظروف الهضم والتعقيم؛ وتكرار عملية العزل إذا لزم الأمر |
| مورفولوجيا الخلايا | شكل غير مغزلي (استمرار وجود خلايا مستديرة/مسطحة) | تلوث أو انحراف نمطي | التحقق من إزالة الغمد؛ وتجنب النمو المفرط والزراعة المطولة |
| نمو الخلايا | تضاعف بطيء | تركيز مصل غير مثالي | استخدام 20% FBS خلال مرحلة التوسع الأولية |
| الاندماج الخلوي | صعوبة نقل الخلايا شديدة الاندماج | تأخر عملية التقسيم | نقل الخلايا عند وصول الاندماج إلى 80-90% |
| النقل (Passaging) | ضعف الانفصال | خلايا شديدة الاندماج أو عدم كفاية المعالجة بالتريبسين | زيادة مدة التعرض للتريبسين قليلاً والمساعدة في الانفصال ميكانيكياً |
| الزراعة طويلة المدى | فقدان النمط الظاهري لـ SMC | عدد نقلات عالٍ أو زراعة مطولة | استخدام الخلايا بين النقلات 3-7 |
| القابلية للتكرار | تفاوت بين عمليات العزل | اختلافات في التقنية أو تباين بيولوجي | توحيد تحضير الإنزيم والتوقيت والتعامل في جميع التجارب |
الجدول 2: دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها لعزل واستنبات خلايا العضلات الملساء الأبهرية الفأرية الأولية. ملخص للمشكلات التقنية الشائعة التي تواجه عملية عزل وهضم واستنبات خلايا العضلات الملساء الأبهرية الفأرية الأولية، بما في ذلك الأسباب المحتملة والحلول الموصى بها لتحسين إمكانية تكرار النتائج.
المناقشة
يوفر هذا البروتوكول طريقة قوية وقابلة للتكرار لعزل واستزراع خلايا العضلات الملساء الأبهرية الأولية للفئران (SMCs) للدراسات المختبرية in vitro. وبالإضافة إلى فائدته التقنية، فإن هذا النهج وثيق الصلة بالبحث في الآليات الكامنة وراء إعادة التشكيل الوعائي وتطور تمدد الأوعية الدموية الأبهرية. ونظرًا للدور الراسخ لنظام الرينين-أنجيوتنسين (RAS) و Ang II في الالتهابات الوعائية وتكون تمدد الأوعية الدموية15,16، فإن عزل خلايا SMCs الأبهرية الأولية يوفر نهجًا قيمًا لاستقصاء هذه المسارات على المستوى الخلوي.
يعد الإزالة التامة للنسيج الغشائي الخارجي محدداً رئيسياً للنجاح. إذ يحتوي الغشاء الخارجي على أرومات ليفية ومجموعات خلوية أخرى غير الخلايا العضلية الملساء (SMCs)، والتي يمكن أن تتكاثر وتطغى على الخلايا العضلية الملساء في المزرعة إذا لم تتم إزالتها بشكل كافٍ. وتعمل خطوة الهضم الإنزيمي الأولية الموجزة على تسهيل الفصل الميكانيكي للغشاء الخارجي عن الطبقة الوسطى، مما يسمح بإجراء تشريح أكثر دقة. ويُعد الإخفاق في تنفيذ هذه الخطوة بفعالية أحد أكثر الأسباب شيوعاً للتلوث والتفاوت في بروتوكولات عزل الخلايا العضلية الملساء (SMC).
يجب أيضاً تحسين ظروف الهضم الإنزيمي بدقة. حيث يتيح الجمع بين collagenase type II و elastase و soybean trypsin inhibitor التفكيك الفعال لمكونات المصفوفة خارج الخلية مع الحفاظ على حيوية الخلايا. ومع ذلك، يجب مراقبة عملية الهضم عن كثب؛ إذ يؤدي الهضم غير الكافي إلى تفكك غير كامل للأنسجة وانخفاض في حصيلة الخلايا، بينما يمكن أن يؤدي الهضم المفرط إلى إتلاف الخلايا وإضعاف قدرتها على الالتصاق وتقليل حيويتها. لذا، يعد التفكيك الميكانيكي عن طريق السحب والضخ المتكرر واللطيف باستخدام الماصة خطوة تكميلية أساسية، مما يعزز تحرر الخلايا مع تقليل التعرض المفرط للإنزيمات. وتسلط هذه الخطوات مجتمعة الضوء على أهمية الموازنة بين المعالجة الإنزيمية والميكانيكية لتحسين كل من حصيلة الخلايا وحيويتها. كما أن الحفاظ على اتساق أوقات الهضم والتعامل مع الأنسجة والتفكيك الميكانيكي طوال الإجراء أمر بالغ الأهمية لتحسين إمكانية تكرار النتائج بين عمليات العزل المختلفة.
تلعب ظروف الزرع دوراً محورياً في الحفاظ على النمط الظاهري ووظيفة الخلايا العضلية الملساء (SMC). تدعم الأوساط الغنية بالمصل (20% fetal bovine serum) الالتصاق الأولي وتكاثر الخلايا الأولية بعد العزل. وقد استُخدم المصل المعالج بالفحم/الديكستران لتقليل التباين الناتج عن الهرمونات ومكونات الدهون الموجودة في تحضيرات المصل القياسية. ومع ذلك، فإن التعرض المطول للمصل بتركيزات عالية أو زيادة مدة الزرع يمكن أن يحفز الانجراف النمطي نحو حالة اصطناعية أو حالة شبيهة بالخلايا الليفية. وللحد من هذه التأثيرات، يوصى باستخدام الخلايا في الممرات المبكرة إلى المتوسطة (P3–P7) وتجنب ظروف التكدس المفرط، والتي يمكن أن تؤدي إلى تغيير المورفولوجيا وتقليل القدرة التكاثرية.
يوفر المظهر المورفولوجي للخلايا المعزولة مؤشراً أولياً هاماً لجودة المزرعة الخلوية. تظهر خلايا SMCs السليمة مورفولوجيا مغزلية الشكل ومستطيلة مميزة، وتصطف في مصفوفات متوازية عند وصولها إلى مستويات تلاقي عالية. وقد تشير الانحرافات عن هذه المورفولوجيا، بما في ذلك الخلايا المفلطحة أو غير منتظمة الشكل، إلى حدوث تلوث، أو ظروف زراعة غير مثالية، أو انزياح نمطي. وتشمل السمات المورفولوجية التي تشير إلى التحول النمطي من الحالة الانقباضية إلى الحالة الاصطناعية زيادة في انتشار الخلايا، وتراجع المورفولوجيا مغزلية الشكل، وفقدان الاصطفاف المتوازي، وأنماط نمو أكثر تبايناً.
بينما يعد التقييم المورفولوجي مفيداً، إلا أنه غير كافٍ لتحديد النمط الظاهري للخلايا العضلية الملساء (SMC) بشكل نهائي، ويجب استكماله بالتحقق الجزيئي باستخدام علامات مثل α-SMA وMYH11، اعتماداً على التطبيق. في الدراسة الحالية، أكد الفلورة المناعية لـ α-SMA هوية الخلايا المعزولة وأظهر نسبة عالية من الخلايا الموجبة لـ α-SMA في كل من مزارع THX وABD (الشكل 5). وتتمثل الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول في القدرة على عزل الخلايا العضلية الملساء من مناطق أورطية متميزة، بما في ذلك قطاعات THX وABD. وتُظهر هذه المناطق اختلافات بيولوجية جوهرية، بما في ذلك التباين في تركيب المصفوفة خارج الخلوية، والأصل الجنيني، والقابلية للإصابة بالأمراض. يتيح عزل الخلايا العضلية الملساء الخاصة بكل منطقة استقصاء التغاير المكاني في البيولوجيا الوعائية وقد يوفر رؤية حول القابلية النوعية لكل منطقة لتكوين تمدد الأوعية الدموية (aneurysm)16,17,18. تستخدم طرق عزل الخلايا العضلية الملساء الوعائية (VSMC) من الأورطي الفأري الحالية إما الهضم بالكولاجيناز طوال الليل13 أو الهضم الإنزيمي لمدة 4-6 h، حيث أُفيد بأن مدة 5-6 h توفر استرداداً أفضل للخلايا14، مقارنة بالهضم لمدة 2-3 h الذي يلي عملية هضم مسبق لمدة 8-10 min المستخدمة في البروتوكول الحالي، مع وقت معالجة إجمالي يبلغ حوالي 4 h من القتل الرحيم حتى زراعة الخلايا. ذكر Adhikari وزملاؤه الحصول على 25–35 × 103 خلية حية/mL بعد 5 أيام من الزراعة ونسبة إيجابية تتراوح بين 97%–99% لـ sm22α وActa2، بينما أنتج البروتوكول الحالي تعداد خلايا في الممر الثالث (passage-3) بلغ 5.10 × 105 ± 7.81 × 104 خلية لـ THX و4.63 × 105 ± 2.31 × 104 خلية لـ ABD، مع إيجابية إجمالية لـ α-SMA بلغت 95.8%. استخدم Hubert وزملاؤه الهضم طوال الليل ولكنهم لم يذكروا إنتاجية كمية للخلايا أو نسبة نقاء13,14. وفي المقابل، تطلبت الطريقة القائمة على المستنبتات (explant-based method) التي اتبعها McMurray وزملاؤه فترة كمون متوسطة تبلغ حوالي 7.6 يوم قبل نمو الخلايا العضلية الملساء من مستنبتات الأورطي الطبيعية، حيث أظهرت >90% من المستنبتات نمواً بحلول اليوم 10 و>95% بحلول اليوم 12، بينما تسمح الطريقة الإنزيمية الحالية بالزراعة المباشرة للخلايا المعزولة في يوم العزل18. يجمع البروتوكول الحالي بين خطوة هضم مسبق وجيزة تسهل إزالة الغلالة الخارجية (adventitia) مع ظروف هضم وتفكيك ميكانيكي معيارية لتعزيز اتساق معالجة الأنسجة واسترداد الخلايا. وبالاشتراك مع العزل النوعي للمناطق لخلايا THX وABD SMCs، فإن وقت المعالجة الأقصر والتوصيف الكمي لاسترداد الخلايا وإيجابية α-SMA يوفران مزايا عملية للدراسات المكررة in vitro.
تعد هذه الطريقة مناسبة جداً للدراسات الميكانيكية التي تتضمن تدخلات جينية ودوائية. ويمكن استخدام مزارع خلايا SMC الأولية في نهج إسكات الجينات، بما في ذلك التثبيط بوساطة siRNA، وكذلك في دراسات الإفراط في التعبير الجيني والمعالجات الدوائية. وتسمح هذه النهج بالاستقصاء المباشر لمسارات التأشير المشاركة في التحول المظهري لخلايا SMC، والالتهاب، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلوية، وهي عمليات مركزية في تطور وتفاقم تمدد الشريان الأورطي1,5.
من المهم مراعاة قيود هذا البروتوكول في سياق نمذجة الأمراض. يتم عزل خلايا العضلات الملساء في هذا البروتوكول من أبهرات فئران غير مصابة، وبالتالي فهي لا تظهر بطبيعتها الأنماط الظاهرية المرتبطة بتمدد الأوعية الدموية. وبناءً على ذلك، يتطلب الأمر اتباع مناهج تجريبية إضافية، بما في ذلك التحفيز الدوائي، أو التلاعب الجيني، أو التكامل مع النماذج الحية، لإعادة إنتاج العمليات ذات الصلة بالمرض مثل التنشيط الالتهابي، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلوية، والتحول في النمط الظاهري. وبالإضافة إلى الاعتبارات المذكورة أعلاه، هناك عدة قيود لهذا البروتوكول؛ فقد يحدث تباين في حصيلة الخلايا وحركية النمو بين عمليات العزل نتيجة للاختلافات البيولوجية بين الحيوانات أو تباينات طفيفة في التقنية المستخدمة. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤثر العزل القائم على الهضم الإنزيمي على تعبير مستقبلات سطح الخلية أو مسارات الإشارات، وهو أمر يجب مراعاته عند تفسير الدراسات الوظيفية اللاحقة. كما تفقد خلايا SMC الأولية تدريجياً نمطها الظاهري التقلصي مع زيادة عدد الممرات، مما قد يؤثر على النتائج التجريبية. ويمكن أن يساعد التوحيد الدقيق للإجراءات واستخدام الخلايا في الممرات المبكرة في التخفيف من هذه القيود. وقد تم تلخيص التحديات التقنية الشائعة والحلول الموصى بها لهذا البروتوكول في الجدول 2.
باختصار، يوفر هذا البروتوكول إطاراً موثوقاً وقابلاً للتكيف لعزل واستزراع الخلايا العضلية الملساء الشريانية الأولية من الفئران. وعند دمجه مع النماذج الحيوية، يتيح هذا النهج إجراء استقصاء شامل للآليات الخلوية والجزيئية التي تكمن وراء إعادة تشكيل الأوعية الدموية والنشوء المرضي لتمدد الشريان الأورطي.
الإفصاحات
يقر المؤلفون بعدم وجود أي تضارب في المصالح. تم استخدام Grammarly لتحرير اللغة وتصحيح القواعد النحوية؛ بينما قام المؤلفون بإعداد كافة المحتويات والتفسيرات العلمية.
شكر وتقدير
قُدم الدعم المالي، جزئياً، من قبل كلية الطب بجامعة كنتاكي. تم إنشاء الملخص الرسومي (الشكل 1) باستخدام BioRender.com بموجب ترخيص نشر أكاديمي، باتفاقية نشر رقم GI2A3W9TY8.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مرشحات حقنة نايلون 0.2 μm | VWR | 76439-080 | الترشيح المعقم |
| أنابيب مخروطية 15 mL | VWR | — | لنقل الشريان الأورطي بعد التنظيف ولجمع الخلايا |
| أطباق زراعة ذات 6/12 عينات (غير معالجة) | Corning | — | زراعة الخلايا |
| أنابيب مخروطية 50 mL | VWR | — | جمع الخلايا |
| صفيحة دقيقة ذات قاع بصري و96 عينات | Thermo Fisher Scientific | 165305 | للتحقق من خلايا SMC |
| جسم مضاد α-Smooth Muscle Actin (أحادي النسيلة) | Cell Signaling Technology | 19245S | للتحقق من خلايا SMC؛ تخفيف تشغيلي 1:1000 |
| جسم مضاد ثانوي Alexa Fluor 488 IgG (متعدد النسائل) | Invitrogen | A-11008 | للتحقق من خلايا SMC؛ تخفيف تشغيلي 1:2500 |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | مضاد للفطريات |
| ألبومين المصل البقري (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | للتحقق من خلايا SMC |
| حضانة CO2 (37 °C) | Various | — | ظروف زراعة الخلايا |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004174 | للهضم الإنزيمي؛ استُخدم بتركيز 260 U/mg |
| عداد الخلايا الآلي Countess | Invitrogen | C10281 | لعد الخلايا |
| مجهر تشريحي | Various | — | تنظيف الأنسجة |
| وسط DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 21041-025 | وسط زراعة أساسي |
| Elastase | Worthington Biochemical | LS002279 | لتفكيك المصفوفة؛ استُخدم بتركيز 4.17 U/mg من البروتين |
| مصل جنين البقر (المعالج بالفحم/ديكستران) | Cytiva (Hyclone) | SH30068.03 | يُستخدم بنسبة 20% للزراعة |
| HBSS مع Ca2+ و Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | يُستخدم كمحلول منظم للهضم |
| محلول Hoechst 33342 | BD Pharmingen | 561908 | للتحقق من خلايا SMC |
| معقم خرزات حراري | Fine Science Tools | 18000-45 | لاستخراج الشريان الأورطي |
| Ketamine | Dechra | — | لتخدير الفئران |
| بنسلين/ستربتومايسين | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | مضاد حيوي |
| محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012-027 | محلول غسيل منظم |
| كلوريد الصوديوم | Fisher Scientific | BDH9286 | للتحقق من خلايا SMC؛ تركيز تشغيلي 150 mM (8.8 g لكل 1 L) |
| مثبط التربسين من فول الصويا | Worthington Biochemical | LS003570 | يمنع الهضم المفرط |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152 | للتحقق من خلايا SMC؛ تركيز تشغيلي 20 mM (2.4 g لكل 1 L) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | للتحقق من خلايا SMC؛ تركيز تشغيلي 0.1% |
| صبغة Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | لعد الخلايا |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | للمرور الخلوي |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | للتحقق من خلايا SMC؛ تركيز تشغيلي 0.1% |
| Xylazine | Covetrus | 61035 | لتخدير الفئران |
| مواد اختيارية (في حال استخدامها) | |||
| دوارق زراعة (T25/T75) | Corning | — | توسيع الخلايا |
المراجع
- Ensor M, et al. Nicotine promotes Ang II-induced abdominal aortic aortopathies in female and male mice: role of sex hormones. Clin Sci (Lond). 2025;139(8):411-429.
- Ailawadi G, et al. Smooth muscle phenotypic modulation is an early event in aortic aneurysms. J Thorac Cardiovasc Surg. 2009;138(6):1392-1399.
- Frismantiene A, Philippova M, Erne P, Resink TJ. Smooth muscle cell-driven vascular diseases and molecular mechanisms of VSMC plasticity. Cell Signal. 2018;52:48-64.
- Alsiraj Y, et al. Female mice with an XY sex chromosome complement develop severe angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms. Circulation. 2017;135(4):379-391.
- Thatcher SE, et al. Exogenous 17-β estradiol administration blunts progression of established angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms in female ovariectomized mice. Biol Sex Differ. 2015;6:12.
- Daugherty A, Manning MW, Cassis LA. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. J Clin Invest. 2000;105(11):1605-1612.
- AlSiraj Y, et al. Monosomy X in female mice influences the regional formation and augments the severity of angiotensin II-induced aortopathies. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(1):269-283.
- Alsiraj Y, et al. Sex chromosome complement defines diffuse versus focal angiotensin II-induced aortic pathology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2018;38(1):143-153.
- Alsiraj Y, et al. Therapeutic assessment of combination therapy with a neprilysin inhibitor and angiotensin type 1 receptor antagonist on angiotensin II-induced atherosclerosis, abdominal aortic aneurysms, and hypertension. J Pharmacol Exp Ther. 2021;377(3):326-335.
- AlSiraj Y, et al. Serotonin 3 receptor antagonism reduces angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms: contribution of periaortic fat-derived serotonin. J Pharmacol Exp Ther. 2025;392(2):100533.
- AlSiraj Y et al. Role of adipocyte angiotensinogen or angiotensin type 1A receptors in the development of diet-induced atherosclerosis or angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms. JVS Vasc Sci. 2025;7:100397.
- Alexander MR, Owens GK. Epigenetic control of smooth muscle cell differentiation and phenotypic switching in vascular development and disease. Annu Rev Physiol. 2012;74:13-40.
- Hubert MO, Rodriguez-Vita J, Wiedmann L, Fischer A. Isolation of murine primary aortic smooth muscle cells. Bio Protoc. 2021;11(3):e3907.
- Adhikari N, et al. Guidelines for the isolation and characterization of murine vascular smooth muscle cells. A report from the International Society of Cardiovascular Translational Research. J Cardiovasc Transl Res. 2015;8(3):158-163.
- AlSiraj Y, Woolley C, Thatcher SE, Cassis LA. Sex differences and the role of the renin-angiotensin system in atherosclerosis and abdominal aortic aneurysms. In: Sex Differences in Cardiovascular Physiology and Pathophysiology. Academic Press; 2019:167-184.
- Boese AC, et al. Sex differences in vascular physiology and pathophysiology: estrogen and androgen signaling in health and disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2017;313(3):H524-H545.
- Majesky MW. Developmental basis of vascular smooth muscle diversity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007;27(6):1248-1258.
- McMurray HF, Parrott DP, Bowyer DE. A standardised method of culturing aortic explants, suitable for the study of factors affecting the phenotypic modulation, migration and proliferation of aortic smooth muscle cells. Atherosclerosis. 1991;86(2-3):227-237.
إعادة الطباعة والأذونات
تم نشر هذه المقالة
الفيديو قريباً