مقالة منهجية

تصنيع واستخدام صفيحة مجهرية مدمجة بمصابيح LED مكونة من 32 بئراً للتحكم الديناميكي في علم البصريات الوراثي

23 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/73445

⸱

سبتمبر 22, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Texas A&M University, 2Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول كيفية تصنيع وبرمجة وتشغيل لوحة ميكروية مدمجة بصمامات ثنائية باعثة للضوء (LED) مكونة من 32 بئراً للدراسات البصرية الوراثية (LEMOS 2.0) داخل قارئ الألواح الميكروية، وذلك لتمكين التحفيز البصري الوراثي عالي الإنتاجية وقياسات التعبير الجيني الكمية في المزارع الميكروبية.

الملخص

يتيح التحكم البصري الوراثي (Optogenetic control) تنظيم تعبير الجينات عن طريق التحفيز الضوئي، ويوفر واجهة قابلة للبرمجة بين الخلايا الحية والأنظمة الإلكترونية. ومع ذلك، لا يزال البروتوتايب الروتيني للبنى البصرية الوراثية محدوداً بسبب البنية التحتية؛ حيث تتطلب منصات الحلقة المغلقة الحالية غالباً أجهزة كيموستات (chemostats)، أو أنظمة مائعات دقيقة (microfluidics)، أو مناولة روبوتية، أو مستشعرات بصرية مخصصة، مما قد يؤدي إلى زيادة التكلفة، أو تقليل إمكانية الوصول، أو تقييد أداء القياس.

يتم هنا تقديم LEMOS 2.0، وهو طبق مجهري مُحدث مدمج بصمامات ثنائية باعثة للضوء (LED) للدراسات الوراثية الضوئية، وهو جهاز منخفض التكلفة للتحفيز الوراثي الضوئي وتوصيف الدوائر الجينية داخل أجهزة قراءة الأطباق المجهرية القياسية. يعتمد LEMOS 2.0 على منصة LEMOS الأصلية من خلال زيادة الإنتاجية من 16 إلى 32 بئراً مجهرياً وتقليل تسرب الضوء بين الآبار المجهرية المتجاورة، مما يتيح ظروف العتمة كحالة إضاءة إضافية. يتكون الجهاز من إطار مطبوع ثلاثي الأبعاد (3D)، وصمامات LED قابلة للعنونة بشكل فردي ومتموضعة بجانب كل بئر مجهري، وبطارية قابلة للشحن، ووحدة تحكم دقيقة مدمجة للاتصال اللاسلكي القائم على تقنية Bluetooth. يتم صب الآبار المجهرية المصنوعة من مادة بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS) المتوافقة حيوياً مباشرة في الجهاز عن طريق القولبة المكررة، مما يسمح بتحفيز المزارع البكتيرية من خلال القالب الشفاف. يتناسب الجهاز مع أجهزة قراءة الأطباق القياسية، مما يتيح قياس الكثافة الضوئية والفلورة.

يصف هذا البروتوكول سير عمل LEMOS 2.0 الكامل، بما في ذلك تصنيع الجهاز، وتجميع الدائرة الكهربائية، وبرمجة Arduino، وصب الآبار الدقيقة من PDMS، وإعداد قارئ الأطباق، وتجهيز السلالات والمزارع، والتنفيذ الآلي للتجربة، وتنظيف الجهاز، وتحليل بيانات الفلورة وOD600. وكعرض توضيحي، يستخدم البروتوكول نظام CcaSR للتحكم الضوئي الجيني، حيث يتم تنشيط تعبير sfGFP بواسطة الضوء الأخضر وتثبيطه بواسطة الضوء الأحمر. يهدف LEMOS 2.0 إلى جعل الاضطراب الضوئي الجيني وتوصيف التعبير الجيني أكثر سهولة لمستخدمي المختبرات الرطبة، مما يتيح دورات "تصميم-بناء-اختبار-تعلم" أسرع دون الحاجة إلى بنية تحتية متخصصة للمفاعلات الحيوية أو الموائع الدقيقة.

المقدمة

توفر البصريات الوراثية (Optogenetics) واجهة قابلة للبرمجة بين الخلايا الحية وأنظمة التحكم الإلكترونية. فمن خلال استخدام الضوء لتنظيم التعبير الجيني، يمكن تحفيز السلوك الخلوي بدقة زمنية، وقابلية للانعكاس، وبأقل قدر من الاضطراب في وسط الزرع1. وعندما تقترن هذه الأنظمة بمراسلين فلوريين أو مضيئين، فإن الأنظمة البصرية الوراثية تسمح بقياس الحالات البيولوجية إلكترونياً وتنظيمها من خلال التغذية الراجعة1. وقد مكنت هذه الواجهة البصرية ثنائية الاتجاه من التحكم السيبراني الجيني في العمليات الخلوية، بما في ذلك التعبير الجيني، والنمو الخلوي، وتركيب الجماعات الخلوية2,3,4. ومع ذلك، فإن العديد من أنظمة البصريات الوراثية ذات الحلقة المغلقة الناجحة تتطلب أجهزة كيموستات (chemostats) متخصصة5، أو أجهزة مائعية دقيقة (microfluidic devices)4,6,7، أو أخذ عينات آلي2,3,8، وهو ما قد يحد من إمكانية الوصول ويعيق دورات التصميم والبناء والاختبار والتعلم الروتينية.

تعد قارئات الأطباق الدقيقة من بين أكثر الأجهزة استخداماً لقياس نمو الميكروبات وديناميكيات التعبير الجيني. فهي توفر قياسات موثوقة للكثافة الضوئية والفلورية عبر العديد من العينات، وتدعم التحكم البيئي، كما أنها مدمجة بالفعل في سير عمل البيولوجيا التركيبية القياسية9. ومع ذلك، فإن مسارات الإضاءة في قارئات الأطباق التجارية القياسية مصممة للقياس الضوئي، وليس للتفعيل البصري الوراثي المبرمج والمحدد لكل بئر أثناء نمو المزرعة. ونتيجة لذلك، غالباً ما تتطلب التجارب البصرية الوراثية أجهزة إضاءة منفصلة10,11,12,13,14، أو نقلاً روبوتياً بين منصات التحفيز والقياس8,15، أو أجهزة قراءة مخصصة5,16,17. وتؤدي هذه الخطوات الإضافية إلى تقليل الدقة الزمنية، وإدخال تباين في المناولة، وتعقيد التحكم في الحلقة المغلقة.

تم تطوير الصفيحة الدقيقة المدمجة بمصابيح LED للدراسات الوراثية الضوئية، أو LEMOS، سابقاً لمعالجة هذه الفجوة18. إن LEMOS عبارة عن جهاز متوافق مع قارئ الصفائح الدقيقة، يحتوي على مصابيح LED يمكن التحكم في كل منها على حدة وموزعة حول آبار الزرع الدقيقة. يظل الجهاز داخل قارئ صفائح دقيقة تجاري طوال التجربة، مما يسمح بإجراء التحفيز الضوئي وقياس الفلورة أو الكثافة الضوئية عند 600 nm (OD600) على المنصة نفسها. في التطبيق الأصلي، دعم جهاز LEMOS 16 بئراً دقيقة للزرع، واستُخدم لاستعراض التحفيز الوراثي الضوئي بنظام الحلقة المفتوحة والتحكم بالتغذية الراجعة ذات الحلقة المغلقة للتعبير الجيني في المزارع الدفعية18. وقد تم مزامنة الجهاز مع كمبيوتر خارجي بحيث يمكن إطفاء إضاءة الـ LED أثناء نوافذ القياس، مما يقلل من التداخل المباشر مع قراءات الفلورة والكثافة الضوئية.

يصف هذا البروتوكول نسخة محدثة من الجهاز، LEMOS 2.0، واستخدامه في تجارب علم البصريات الوراثي (optogenetic) في المزارع الميكروبية. وقد أُعيد تصميم LEMOS 2.0 لزيادة عدد الآبار الدقيقة للمزارع التي يمكن توجيهها بشكل مستقل من 16 إلى 32 بئراً، مما أدى إلى تحسين الإنتاجية التجريبية والسماح باختبار المزيد من الظروف، أو المكررات، أو تصميمات وحدات التحكم في دورة تشغيل واحدة. كما عُدِّل تصميم الجهاز لتقليل تسرب الضوء بين الآبار الدقيقة المضاءة والآبار الدقيقة المظلمة المجاورة لها، مما عزز من موثوقية ضوابط الظلام وتجارب التحفيز ذات الأنماط المكانية. تجعل هذه التعديلات المنصة أكثر ملاءمة للتوصيف المقارن في علم البصريات الوراثي، واختبار وحدات التحكم متعددة الظروف، واعتماد البروتوكول الروتيني من قبل المختبرات التي تستخدم بالفعل أجهزة قراءة الأطباق الدقيقة (microplate readers).

صُمم نظام LEMOS 2.0 لتجارب المزارع الميكروبية بنظام الدفعة التي تتطلب قياسات متكررة للكثافة الضوئية OD600 والفلورة مع إضاءة قابلة للبرمجة بالألوان الأحمر، أو الأخضر، أو الأزرق، أو الحالة المظلمة. يجب أن يدعم قارئ الأطباق قياسات OD600 والفلورة الحركية، والتحكم في درجة الحرارة، والرج، وتعريف مخطط تخطيط مخصص للطبق يتناسب مع الآبار الدقيقة الـ 32 لنظام LEMOS، والتصدير التلقائي لملفات القياس إلى مجلد يراقبه برنامج التحكم المكتوب بلغة Python. تم التحقق من صحة التنفيذ الحالي باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة BioTek Synergy H1 مع برنامج BioTek Gen5 v3.14؛ ويتطلب التنفيذ باستخدام برامج قراءة أطباق أخرى إجراء تعديلات مناسبة على صيغة التصدير، ومحلل الملفات، وخطوات أتمتة الشاشة. وبما أن الجهاز يستخدم صمامات ثنائية باعثة للضوء (LEDs) ذات ذروات انبعاث عند 620–630 nm و 515–525 nm و 465–475 nm، يجب على المستخدمين اختيار المشغلات البصرية والمراسلين الفلوريين التي تتوافق أطياف تفعيلهم وقراءتهم مع هذه القنوات19,20. ومن المرجح أن تتطلب السلالات المضيفة الجديدة، أو المراسلين، أو الأنظمة البصرية، أو الأوساط الغذائية، أو درجات حرارة النمو، أو فترات أخذ العينات، أو تصميمات وحدات التحكم، إعادة معايرة لشدة الـ LED، ونطاق دورة التشغيل، وتصحيح العينة الفارغة، ومعايرة الفلورة، ومعاملات وحدة التحكم.

يغطي البروتوكول سير عمل LEMOS 2.0 الكامل: تصنيع الجهاز، وتجميع الدارة، وبرمجة Arduino، وصب الآبار الدقيقة من البوليديميثيل سيلوكسان (PDMS)، وإعداد قارئ الأطباق، وتحضير السلالات والمزارع، والتنفيذ الآلي للتجربة، وتنظيف الجهاز، وتحليل بيانات الفلورة/OD600. وبالرغم من أن سير العمل النموذجي يركز على التحكم في التعبير الجيني البكتيري باستخدام علم البصريات الوراثي، إلا أنه يمكن تكييف هذا الإطار نفسه مع سلالات ميكروبية أخرى، ومراسلين فلوريين، وأنظمة مشغلات بصرية وراثية، وخوارزميات تحكم مختلفة. ومن خلال الجمع بين الإضاءة القابلة للبرمجة وقياسات قارئ الأطباق القياسية، توفر منصة LEMOS 2.0 المحدثة مساراً ميسراً لتجارب الاضطراب البصري الوراثي والتحكم بالتغذية الراجعة عالية الإنتاجية في المزارع الدفعية.

البروتوكول

جميع الإجراءات التجريبية التي تتضمن Escherichia coli السلالة MG1655  أُجريت في مختبرات مخصصة من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية (BSL-2) في Texas A&جامعة M. أجريت المزارع البكتيرية والمعالجات في كبائن سلامة بيولوجية معتمدة من الفئة الثانية وفقاً لإرشادات الاحتواء القياسية. نُفذت الإجراءات تحت ظروف احتواء محددة تمت مراجعتها والموافقة عليها من قبل جامعة تكساس A&تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة السلامة الحيوية المؤسسية (IBC) بموجب تصريح رقم IBC2023-044.

1. تصنيع إطار LEMOS 2.0 ومصفوفة LED

ملاحظة: ابدأ في تصنيع LEMOS 2.0 عن طريق طباعة هيكل LEMOS 2.0 ثلاثية الأبعاد ووضع شرائط LED داخل جسم الجهاز. الهدف هو إنشاء هيكل مستقر ميكانيكيًا بحيث يتم وضع كل LED بجوار البئر المجهري المقابل. يعد وضع LED الصحيح في هذه المرحلة أمرًا مهمًا لأن عدم المحاذاة يمكن أن يقلل من انتظام التحفيز ويزيد من التداخل الضوئي بين الآبار المجهرية.

  1. قم بطباعة الإطار الداخلي لجهاز LEMOS 2.0 وقالب الصب لآبار PDMS الدقيقة باستخدام تقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد (3D-print) وبالاعتماد على ملفات STL المتوفرة في مستودع GitHub ‏(github.com/synbiosystems/LEMOS-2.0). قم بإزالة جميع مواد الدعم بعد الانتهاء من الطباعة.
    ملاحظة: يُوصى باستخدام خيوط حمض البولي لاكتيك (PLA) وطابعة بنظام نمذجة الترسيب المنصهر (FDM) مع معايير الطباعة التالية: ارتفاع طبقة 0.2 mm، ونسبة ملء 20% لإطار LEMOS 2.0، ونسبة ملء 40% لقالب الصب.
  2. اقطع شرائط LED من منتصف منصات اللحام إلى مجموعتين، تحتوي كل مجموعة على 16 LED. تأكد من وجود ثلاث منصات لحام متاحة عند طرف كل شريط للقيام بعملية اللحام، كما سيتم توضيحه بالتفصيل في القسم 2.
  3. اطوِ كل شريط LED من المنتصف، بحيث تكون مصابيح LED موجهة للخارج (Supplementary Figure 1A, Supplementary Video 1).
  4. قم بتشكيل شريط LED يدويًا ليتناسب مع هندسة الجهاز وأدخله بين الآبار الدقيقة، مع توجيه منصات لحام +5 V إلى الأسفل، مع مراعاة السهم الموجود على شريط LED (Supplementary Figure 1A, Supplementary Video 1). اضبط موضع الشريط بشكل تكراري حتى يستقر كل LED بشكل صحيح في فتحته الخاصة قبل المتابعة.

2. تجميع الدائرة الكهربائية والتحقق من صحتها

ملاحظة: قم بتجميع توصيلات الطاقة والشحن والمتحكم الدقيق والمفتاح وLED اللازمة لتشغيل الجهاز اللاسلكي. بعد التجميع، يجب أن يعمل جهاز LEMOS 2.0 بواسطة البطارية المدمجة، ويُعاد شحنه من خلال وحدة الشحن، ويتلقى أوامر LED من لوحة Arduino الطرفية. تحقق من كل توصيلة طاقة قبل توصيل شرائط LED، حيث أن توجيه الجهد الكهربائي بشكل خاطئ قد يؤدي إلى تلف المتحكم الدقيق أو مصابيح LED.

تنبيه: يتطلب هذا البروتوكول كفاءة مسبقة في عمليات اللحام، بما في ذلك ممارسات السلامة المناسبة (مثل استخدام ممتص الدخان، ونظارات واقية، وطرق الوقاية من الحروق)، وصيانة كاوية اللحام، وتقنيات اللحام الأساسية للأسلاك والثقوب النافذة. يجب على المستخدمين الذين يفتقرون إلى هذه الخبرة الحصول على تدريب قبل محاولة تنفيذ الخطوات الواردة في هذا القسم.

  1. جمع كافة المكونات الإلكترونية المدرجة في جدول المواد وفحصها للتأكد من عدم وجود تلف مادي ظاهر. مراجعة مخطط التوصيلات (الملف التكميلي 1).
  2. ضبط محول جهد الرفع (step-up voltage converter) لإخراج 5 V، بدلاً من القيمة الافتراضية 12 V. وفقاً لمفتاح التكوين الموجود في خلفية اللوحة، يتم فصل الوسادتين (pads) A وB عن طريق تسليط حرارة من مكواة اللحام لإزالة التوصيل.
  3. لحام دبوس VIN في Arduino Nano BLE Rev2 (المشار إليه فيما يلي باسم BLE Nano) بدبوس OUT+ في محول جهد الرفع، ولحام دبوس GND في BLE Nano بدبوس OUT- في محول جهد الرفع (الشكل التكميلي 1B).
  4. لحام دبوس IN– في محول جهد الرفع بالدبوس السالب (-) لوحدة شحن البطارية.
  5. فصل السلكين في "JST PH 2-Pin Cable – Female Connector, 100 mm" عن طريق سحب نهايات توصيل البطارية من المبيت الأبيض. قص كل سلك ليصل طوله إلى ~70 mm ليتناسب بشكل أفضل مع الجهاز، وذلك بالقص من النهايات غير المتصلة بالبطارية (الشكل التكميلي 1C).
  6. تعديل المفتاح. أولاً، إزالة دبابيس التثبيت في كل زاوية. ثانياً، قص جميع الدبابيس إلى 30% من طولها. ثم إزالة الدبابيس T1 وT3 وB3 تماماً (ملاحظة: T = أعلى، B = أسفل، مرقمة من اليسار إلى اليمين من 1 إلى 4 عند النظر مباشرة إلى الدبابيس والمفتاح في الأعلى) (الشكل التكميلي 1D).
  7. لحام كابل JST الأحمر بالدبوس B2، مع ترك نهاية توصيل البطارية مكشوفة لتوصيلها لاحقاً بالموصّل الذكري للبطارية (الشكل التكميلي 1D).
  8. لحام سلك توصيل بين الدبوسين B1 وB4.
  9. لحام دبوس B+ في وحدة شحن البطارية بالدبوس B1، مع الحرص على إبقاء سلك التوصيل من الخطوة السابقة ملحوماً أيضاً في B1 (الشكل التكميلي 1E).
  10. لحام دبوس IN+ في محول جهد الرفع بالدبوس T4.
  11. لحام الدبوس الموجب (+) لوحدة شحن البطارية بالدبوس T2.
  12. لحام كابل JST الأسود بدبوس B– في وحدة شحن البطارية. ترك نهاية توصيل البطارية حرة للتوصيل لاحقاً بالموصّل الذكري للبطارية.
  13. التحقق من التوصيلات في وضع التشغيل العادي للجهاز. توصيل بطارية Li-ion بالدائرة عبر أسلاك توصيل البطارية التي تُرِكت حرة في خطوات اللحام، مع وضع المفتاح في الوضع الأوسط/الإيقاف (off) (الشكل التكميلي 1E).
  14. تحريك المفتاح إلى وضع اليسار/التشغيل (on) (الجانب الذي يحتوي على دبوسين مشغولين فقط).
  15. التحقق من وصول الطاقة إلى BLE Nano عبر مؤشر LED الخاص بالطاقة الموجود على اللوحة (المسمى ‘ON’، بجانب منفذ USB)، والذي يجب أن يضيء باللون الأخضر (الشكل التكميلي 1E، الفيديو التكميلي 1).
  16. التحقق من وصول الطاقة إلى محول جهد الرفع عبر مؤشر LED الموجود على اللوحة، والذي يجب أن يضيء باللون الأزرق.
    ملاحظة: إذا لم تضئ مؤشرات LED، يجب التحقق من جميع التوصيلات باستخدام جهاز الملتيميتر قبل المتابعة.
  17. إزالة شريط LED الأول (الذي تم إدخاله في الخطوة 1.4) ولحام أسلاك بكل من مجموعات وسادات VIN وDIN وGND. إعادة إدخال شريط LED، وتمرير الأسلاك عبر المنفذ الموجود على جانب الإطار (الشكل التكميلي 1F، الفيديو التكميلي 1).
  18. تكرار العملية مع شريط LED الثاني، وفقاً لـ الفيديو التكميلي 1.
  19. لحام شريط LED الأول بدبوس GND في BLE Nano، ودبوس D13 في BLE Nano، ودبوس VIN في BLE Nano.
    ملاحظة: يتطلب اللحام في دبوس VIN لحام سلكين في نفس دبوس Arduino. يتم لحام سلك واحد داخل ثقب الدبوس، والآخر خارج ثقب الدبوس، عند التجاويف في لوحة Nano.
  20. لحام شريطي LED معاً.
  21. التحقق من التوصيلات باستخدام الملتيميتر في وضع قياس الاستمرارية (continuity mode) عن طريق لمس دبوس VIN في BLE Nano ووسادة +5 V في آخر وسادة LED غير ملحومة. تكرار العملية بالنسبة لـ GND.
  22. تثبيت شرائط LED في مكانها باستخدام مسدس صمغ ساخن (الشكل التكميلي 1F، الفيديو التكميلي 1). التحرك ببطء، ولصق زوج واحد أو زوجين من LED في كل مرة، مع السماح للصمغ بأن يبرد بين عمليات اللصق. استخدام الملاقط حسب الحاجة لتثبيت مصابيح LED في مكانها.

3. برمجة لوحات Arduino المركزية والطرفية

ملاحظة: قم ببرمجة لوحتي Arduino المستخدمتين في الاتصال اللاسلكي والتحكم في LED. يتم توصيل لوحة Arduino المركزية (Arduino Nano IOT 33) بجهاز الكمبيوتر أثناء التجربة، وتقوم بنقل الأوامر من نص Python البرمجي. أما لوحة Arduino الطرفية (Arduino Nano 33 BLE Rev 2) فتوضع داخل جهاز LEMOS 2.0 وتتحكم في مصفوفة LED. يجب تحميل المخططات (sketches) المناسبة على كلتا اللوحتين قبل بدء التجربة. تتوفر مؤشرات مرئية لنجاح الاتصال بالجهاز الآخر عن طريق إلغاء التعليق عن الأسطر المذكورة في نصوص Arduino البرمجية: اللوحة المركزية – الأسطر 34-37، حيث يومض LED الأصفر؛ اللوحة الطرفية – الأسطر 99-106، حيث يومض LED الأخضر. أعد تفعيل التعليق على هذه الأسطر بعد التأكد من نجاح الاتصالات بين الأجهزة؛ وإلا فقد تومض مصابيح LED أثناء وجود الجهاز داخل قارئ الأطباق، مما قد يؤثر سلباً على القياسات.

  1. قم بتنزيل ملفات Arduino من مستودع GitHub: LEMOS_Central.ino وLEMOS_Peripheral.ino. قم بتنزيل وتثبيت أحدث إصدار من بيئة التطوير المتكاملة (IDE) لـ Arduino من http://www.arduino.cc/en/software.
  2. قم بتثبيت أحدث إصدار من حزمة اللوحة من مدير اللوحات (Tools > Board > Boards Manager) (Supplementary Figure 2A).
    الجهاز المركزي (Central): Arduino SAMD Boards
    الجهاز الطرفي (Peripheral): Arduino Mbed OS Nano Boards
  3. قم بتثبيت مكتبات Arduino التالية في مدير المكتبات (Tools > Manage Libraries) (Supplementary Figure 2B): مكتبة 'ArduinoBLE’ لاتصالات Bluetooth Low Energy بين الجهازين الطرفي والمركزي، ومكتبة ‘Adafruit_NeoPixel’ لبرمجة LED.
  4. افتح ملف Arduino المسمى LEMOS_Central.ino في بيئة Arduino IDE.
  5. قم بتوصيل الجهاز المقابل بالكمبيوتر عبر كابل بيانات الناقل التسلسلي العام (USB).
  6. اختر منفذ COM الصحيح للجهاز المتصل (Tools > Port). إذا لم يكن منفذ COM واضحاً، راقب المنفذ الذي يظهر ويختفي عند توصيل الجهاز وفصله.
  7. اختر لوحة Arduino Nano 33 IoT من قائمة اللوحات (Tools > Board).
  8. قم برفع السكريبت إلى الجهاز.
  9. كرر الخطوات السابقة لملف LEMOS_Peripheral.ino والجهاز الطرفي (Arduino Nano 33 BLE Rev 2).

4. صب الآبار الدقيقة من الـ PDMS عن طريق القولبة المكررة

ملاحظة: قم بصب الآبار الدقيقة من مادة PDMS الشفافة بصرياً مباشرة داخل إطار LEMOS 2.0 باستخدام القولبة المقلدة21. تعمل الآبار الدقيقة من مادة PDMS على احتجاز المزارع البكتيرية أثناء تجارب قارئ الصفائح، ويجب أن تكون قواعدها شفافة وخالية من الفقاعات لضمان الحصول على قياسات موثوقة لـ OD600 والفلورة. يمكن أن يؤدي الغبار أو الفقاعات أو المعالجة غير الكاملة إلى حدوث تباين بين الآبار، لذا يجب تجنب ذلك أثناء عملية الصب. تأكد من نظافة سطح خزانة استخلاص الأدخنة قبل الصب، حيث إن أي غبار أو شوائب في مادة PDMS ستؤثر سلباً على شفافيتها البصرية وتؤدي إلى قراءات OD600 غير متسقة عبر الآبار الدقيقة.

تنبيه: يجب العمل داخل خزانة استخلاص الأدخنة عند التعامل مع مادة PDMS غير المعالجة. تجنب ملامسة عامل المعالجة للجلد.

  1. قم بتطهير الجزء الداخلي من إطار LEMOS 2.0 حيث يتم صب الآبار الدقيقة عن طريق رش ethanol بتركيز 70%، مع تجنب الملامسة المباشرة لأي مكونات كهربائية باستثناء مصابيح LED. اترك إطار LEMOS 2.0 ليجف تماماً قبل صب الآبار الدقيقة من PDMS.
    ملاحظة: تعريض مصابيح LED لـ ethanol آمن، ولكن ذلك سيؤدي إلى تلف جميع المكونات الكهربائية الأخرى.
  2. رش قالب الصب الخاص بالآبار الدقيقة من PDMS بعامل تحرير، وانتظر لمدة 10 min حتى يستقر الرش على السطح البلاستيكي. يمكن أن يؤدي تطبيق ثانٍ بعد 10 min إضافية إلى تحسين تحرير القالب، ولكنه أمر اختياري.
    ملاحظة: يجعل عامل التحرير (مثل Ease Release 200) قالب الصب كارهاً للماء، مما يسمح بإزالة قالب الصب بسهولة من الآبار الدقيقة من PDMS بعد تصلبها.
  3. قم بوزن وخلط عامل التصلب والقاعدة من 184 silicone elastomer بنسبة كتلة 10:1 (قاعدة إلى عامل تصلب) في كوب بلاستيكي مخصص للاستخدام مرة واحدة.
    ملاحظة: يوصى باستخدام 2.5 g من عامل التصلب + 25 g من القاعدة لإجمالي 27.5 g من الخليط لجهاز LEMOS 2.0 واحد؛ قم بزيادة الكمية بشكل تناسبي في حال صب عدة أجهزة في وقت واحد.
  4. اخلط الخليط بقوة لمدة 5 min على الأقل باستخدام ملعقة بلاستيكية مخصصة للاستخدام مرة واحدة أو عود خشبي، مع كشط جوانب وقاع الكوب لضمان الخلط الكامل.
    ملاحظة: الخلط الشامل أمر بالغ الأهمية؛ حيث إن PDMS غير المخلوط جيداً لن يتصلب بشكل متجانس وسيؤدي إلى قراءات OD600 قاعدية غير متسقة عبر الآبار الدقيقة.
  5. ضع الكوب الذي يحتوي على خليط PDMS في مجفف بالتفريغ الهوائي. قم بتطبيق التفريغ (على الأقل 65 cmHg /25 inHg) لمدة 45–60 min، حتى يتم إزالة جميع فقاعات الهواء المرئية من الخليط. سيتمدد PDMS مع صعود فقاعات الهواء إلى السطح وقد يفيض من الكوب. استخدم حاوية تعادل سعتها على الأقل 3× حجم الخليط.
    ملاحظة: فقاعات الهواء المتبقية في PDMS المتصلب ستغير النفاذية الضوئية لقيعان الآبار الدقيقة، مما يؤدي إلى قياسات OD600 قاعدية غير متسقة.
  6. ثبت إطار LEMOS 2.0 في الهيكل الخارجي باستخدام مشابك تثبيت بأحجام مناسبة على الجوانب الأربعة.
    ملاحظة: تقلل مشابك التثبيت من كمية PDMS التي تتسرب إلى الفجوة بين الهيكل الخارجي وإطار LEMOS 2.0. يمكن أن تؤدي زيادة PDMS في هذه الفجوة إلى زيادة الارتفاع الإجمالي للجهاز ومنع إطار LEMOS 2.0 من الاستقرار بشكل مستوٍ داخل الهيكل الخارجي. كما يمكن وضع شريط Kapton على طول المحيط السفلي لإطار LEMOS 2.0، بجوار الآبار الدقيقة، لتقليل التسرب بشكل أكبر.
  7. صب PDMS منزوع الغاز بعناية في إطار LEMOS 2.0. استخدم حقنة لإضافة PDMS في كل بئر دقيق في الإطار لضمان ملئها بأقل قدر من الفقاعات.
    ملاحظة: تكوين فقاعات صغيرة أمر لا مفر منه؛ ستصعد هذه الفقاعات في النهاية إلى السطح وتختفي. صب PDMS منزوع الغاز فوراً بعد عملية نزع الغاز لتقليل إعادة إدخال الفقاعات أثناء التعامل معه.
  8. أدخل قالب الصب المطبوع ثلاثياً في الإطار المملوء بـ PDMS. اضغط القالب بلطف وبشكل متساوٍ، مع التأكد من استقرار النتوءات الدائرية في قالب الصب داخل ثقوب إطار LEMOS 2.0. يحدد القالب الآبار الدقيقة المربعة المصطفة بجانب مصابيح LED. امسح PDMS الزائد الذي يفيض من الحواف باستخدام منديل نظيف وخالٍ من الوبر.
  9. اترك PDMS يتصلب في درجة حرارة الغرفة (25 °C) على سطح مستوٍ لمدة لا تقل عن 30 h. إذا لزم الأمر، يمكن تسريع التصلب بوضع الجهاز عند 37 °C لمدة 4 h، ولكن فقط بعد إزالة جميع فقاعات الهواء المرئية من PDMS.
    تحذير: لا تعرض جهاز LEMOS لدرجات حرارة أعلى من 37 °C، لأن ذلك قد يؤدي إلى ارتفاع درجة حرارة بطارية Li-ion المدمجة وانفجارها.
  10. قم بإزالة قالب الصب بعد تصلب الآبار الدقيقة من PDMS عن طريق الإمساك به من الحواف وسحبه للأعلى بقوة ثابتة. تأكد من بقاء الآبار الدقيقة من PDMS في الإطار.
  11. افحص كل بئر دقيق للتأكد من أن الجدران شفافة ضوئياً والقاع خالٍ من الفقاعات. أصبح جهاز LEMOS 2.0 المزود بآبار PDMS الدقيقة الجديدة جاهزاً الآن للاستخدام.

5. تهيئة قارئ الأطباق الدقيقة وسير عمل تصدير البيانات

ملاحظة: قم بتكوين قارئ الأطباق الدقيقة للحصول على قياسات حركية متوافقة مع LEMOS 2.0 وأتمتة تصدير البيانات. يجب أن يتعرف القارئ على المخطط المخصص لآبار LEMOS 2.0 الدقيقة، ويقوم بقياس OD600 والفلورية في فترات زمنية محددة، وتصدير ملفات البيانات إلى المجلد الذي يراقبه نص التحكم البرمجي بلغة Python. قم بإجراء قياس خط الأساس باستخدام وسط معقم قبل التجارب البيولوجية للتأكد من أن آبار PDMS الدقيقة وإعدادات قارئ الأطباق تعطي قراءات متسقة. يستخدم هذا البروتوكول قارئ الأطباق الدقيقة BioTek Synergy H1 الذي يتم تشغيله عبر برنامج BioTek Gen5 الإصدار v3.14.

  1. قم بتشغيل برنامج Gen5.
  2. انتقل إلى Plate Types (أنواع الأطباق) وقم باستيراد ملف LEMOS 2.0.xml من GitHub، أو بدلاً من ذلك، قم بإعداد تخطيط الطبق المخصص لـ LEMOS 2.0 في برنامج Gen5 بالرجوع إلى Supplementary File 2 (القسم 1)  و Supplementary File 3.
  3. قم بإجراء قياس خط الأساس باستخدام جهاز LEMOS 2.0 (آبار دقيقة مملوءة بـ 200 µL من وسط M9CA المعقم، ومغطاة بغشاء ختم طبي [على سبيل المثال، غشاء Breathe-Easy]). سجل قيم خط الأساس لـ OD600 والفلورة لجميع الآبار الدقيقة الـ 32، وقارن هذه القيم بتلك التي تم الحصول عليها من طبق ميكروي قياسي مكون من 96 بئراً. إذا لوحظ تفاوت كبير، أعد صب الآبار الدقيقة المصنوعة من PDMS، حيث أن الفقاعات أو الشوائب في PDMS المتصلد هي السبب الأكثر احتمالاً.
    ملاحظة: غشاء Breathe-Easy نفاذ للغازات، مما يحافظ على الظروف الهوائية لنمو الخلايا، مع بقائه شفافاً بصرياً لتجنب التداخل مع قياسات الفلورة و OD600.
  4. افتح بروتوكول التجربة closed_loop_protocol.prt من مستودع GitHub في برنامج Gen5.
    ملاحظة: يتوفر نموذج ملف تجربة مُعد مسبقاً template.xpt في مستودع GitHub للتسهيل. ومع ذلك، فإن الإعدادات موصوفة بالتفصيل في Supplementary File 2 (القسم 2) و Supplementary File 3 لتوفير مرجع لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها للمستخدمين الذين لديهم إصدارات مختلفة من Gen5.

6. تحضير المزارع البكتيرية لتجارب LEMOS 2.0

ملاحظة: يتم تحضير المزارع البكتيرية لتجربة LEMOS 2.0 الزمنية المعتمدة على علم البصريات الوراثي. من المهم اتباع نهج حذر في تحضير المزارع لأن الكثافة الابتدائية والتعرض للضوء قبل التجربة يمكن أن يؤثرا على ديناميكيات التعبير الجيني المقاسة. السلالة المستخدمة في العرض التوضيحي هي Escherichia coli (E. coli) MG1655 التي تحمل pSR58.6 وpNO286-322. يحتوي pSR58.6 على بروتين الفلورسنت الأخضر الفائق الطي (sfgfp) تحت تحكم PcpcG2 وCcaR التأسيسي، ومقاومة الكلورامفينيكول، وأصل تضاعف pColE1. بينما يحتوي pNO286-3 على CcaS التأسيسي، ومقاومة السبيكتينوميسين، وأصل تضاعف p15A. وبالتكامل، تعيد هذه البلازميدات تكوين نظام تعبير جيني محفز بالضوء الأخضر ومثبط بالضوء الأحمر. تم تحويل pSR58.6 وpNO286-3 إلى بكتيريا E. coli MG1655 ذات كفاءة كيميائية باستخدام طريقة التحول بالصدمة الحرارية القياسية23. حُفظت الأطباق في صندوق لحماية الخلايا من الضوء المحيط لتجنب التنشيط المبكر للدائرة البصرية الوراثية.

  1. لقّح مستعمرة واحدة من سلالة CcaSR البصرية الوراثية وسلالة ضابطة سالبة الفلورة في أنبوبي زراعة منفصلين بقاع مستدير سعة 14 mL، يحتوي كل منهما على 2 mL من مرق M9CA المدعم بـ 50 µg/mL من السبيكتينوميسين و 25 µg/mL من الكلورامفينيكول. استخدم تركيبة الوسط هذه في جميع خطوات الزراعة اللاحقة طوال التجربة.
  2. غطِّ كل أنبوب بورق الألمنيوم واحضنه طوال الليل (14-16 ساعة) عند 37 °C مع الرج بسرعة 220 rpm.
    ملاحظة: يحافظ التغليف بورق الألمنيوم على الظروف المظلمة ويمنع التنشيط غير المقصود لنظام CcaSR. بدلاً من ذلك، يمكن حضن المزارع تحت ضوء أحمر مستمر عن طريق وضع الأنابيب في غلاف LED موصل بنفس الإعداد الكهربائي الموصوف في القسم 2، وهو ما يحاكي حالة الكبح للنظام قبل التجربة بشكل أدق.
  3. انقل 100 µL من كل مزرعة ليلية إلى 2 mL من وسط غذائي جديد في أنبوب زراعة جديد مغلف بورق الألمنيوم. احضن المزارع لمدة 4 ساعات عند 37 °C مع الرج بسرعة 220 rpm.
  4. قس الكثافة الضوئية OD600 لكل مزرعة فرعية بعد 4 ساعات باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة.
    ملاحظة: يجب أن تكون المزارع قد وصلت إلى OD600 تتراوح بين 0.4-0.6.
  5. خفف كل مزرعة لتصل إلى OD600 = 0.1 في وسط غذائي جديد، وانقل 200 µL بواسطة الماصة إلى كل بئر دقيق في جهاز LEMOS 2.0، مع توخي الحذر أثناء عملية النقل لتجنب تكون فقاعات هوائية، ثم أحكم إغلاق الجهاز باستخدام فيلم ختم طبي.

7. بدء تجربة السلسلة الزمنية للبصريات الوراثية باستخدام نظام LEMOS 2.0

ملاحظة: ابدأ تجربة LEMOS 2.0 المؤتمتة من خلال التنسيق بين قارئ الأطباق الدقيقة، وجهاز Arduino المركزي، وبرمجية التحكم المكتوبة بلغة Python. أثناء التشغيل، يقوم الكمبيوتر بتنسيق قياسات قارئ الأطباق، وتصدير البيانات، والاتصال عبر Bluetooth، وتشغيل مصابيح LED. ومن الضروري أن تظل نافذة Gen5 مرئية، لأن برمجية Python تستخدم الأتمتة القائمة على الشاشة للتفاعل مع برنامج قارئ الأطباق. ويُستدل على نجاح البدء من خلال ظهور ملفات البيانات المصدرة في المجلد المتوقع، وتأكيد مخرجات الطرفية (terminal) للاتصال عبر Bluetooth، وتحديث أوامر LED عند كل فاصل زمني للتحكم.

  1. قم بتحريك المفتاح إلى اليسار لتشغيل جهاز LEMOS 2.0. سيضيء أول مؤشر LED في شريط الـ LED في جهاز LEMOS 2.0 باللون الأخضر.
  2. قم بتوصيل لوحة Arduino المركزية بالكمبيوتر عبر منفذ USB واختيارها في بيئة Arduino IDE من القائمة المنسدلة (الأدوات > اللوحة).
  3. افتح مراقب التسلسل (Serial Monitor) وقم بتوصيل لوحة Arduino الطرفية الموجودة في LEMOS 2.0 بلوحة Arduino المركزية.
  4. أطفئ مؤشر LED الموجود في شريط الـ LED عن طريق إدخال الحرف 'o' في مراقب التسلسل.
  5. افتح ملف التجربة LEMOS-start-data.xpt في برنامج Gen5 وخذ قراءة أساسية للمزارع الموجودة في الجهاز، مع التأكد من أن قيم OD600 والفلورة تتوافق مع التوقعات. ثم أغلق ملف التجربة.
  6. افتح ملف البروتوكول المحفوظ في الخطوة 5.4 في برنامج Gen5 واحفظه كتجربة بالرجوع إلى الملف التكميلي 2 (القسم 3) والملف التكميلي 3.
  7. تأكد من تثبيت Python 3.10 أو إصدار أحدث على النظام، وقم بتثبيت الحزم المطلوبة باستخدام ملف requirements.txt المرفق.
  8. افتح ملف control_duty_cyle.py (لتجارب دورة التشغيل) أو control_pid.py (لتجارب PID) في أي بيئة تطوير متكاملة (IDE) مناسبة، مثل Visual Studio Code أو Spyder.
    ملاحظة: تأكد من ضبط دليل العمل على المجلد الذي يحتوي على جميع سكربتات Python حتى يمكن استيرادها أثناء تنفيذ السكربت. اختيار بيئة التطوير ليس أمراً حاسماً.
  9. في قسم Main من سكربت Python، قم بتعديل متغير file ليتطابق مع اسم الملف المختار لملف تجربة Gen5 في الخطوة 7.6.
  10. قم بإعداد ملف التجربة وسكربت Python جنباً إلى جنب (الشكل 1).
  11. انقر فوق تشغيل (Run) في تجربة Gen5، ثم قم بإلغائها بمجرد بدء الخطوة الحركية (kinetic step).
    ملاحظة: يبحث سكربت Python عن زر متابعة (Continue) بعد النقر فوق تشغيل. ومع ذلك، في ملف تجربة جديد، لا يظهر هذا الزر حتى يتم أخذ القراءة الثانية أو إلغاء التشغيل الحركي.
  12. قم بتشغيل سكربت Python. لا تقم بتصغير أو تغطية نافذة Gen5 أثناء التشغيل.
    ملاحظة: يستخدم سكربت Python أتمتة قائمة على الشاشة ويجب أن يكون قادراً على تحديد موقع نافذة Gen5 كل 20 min تقريباً لمعالجة تصدير البيانات بعد كل دورة حركية. قد يؤدي حجب النافذة أو تصغيرها خلال هذا الوقت إلى تعطيل التجربة.

8. تنظيف الجهاز، وإزالة الـ PDMS، وإعادة شحن البطارية

ملاحظة: قم بتنظيف وإعادة ضبط جهاز LEMOS 2.0 بعد التجربة. تخلص من المزارع البكتيرية وآبار PDMS الدقيقة المستخدمة، وقم بتعقيم الإطار والغلاف القابلين لإعادة الاستخدام، وأعد شحن البطارية للدورة التالية. تجنب تعريض المكونات الإلكترونية غير المضيئة (غير الـ LED) للإيثانول أو القوة الميكانيكية المفرطة أثناء التنظيف.

  1. قم بتقشير فيلم الختم الطبي برفق من أعلى جهاز LEMOS 2.0 ثم تخلص منه.
  2. قم بسحب والتخلص من جميع سوائل تعليق الخلايا من كل بئر مجهري باستخدام ماصة، وفقاً لإجراءات التخلص من النفايات البيولوجية.
  3. افصل الغطاء الخارجي عن إطار LEMOS 2.0 عن طريق تطبيق قوة ثابتة ومنتظمة. تجنب الثني أو اللي المفرط لإطار PLA، لأن ذلك قد يؤدي إلى التصدع أو التشوه الدائم.
  4. قم بإزالة طبقة PDMS الضخمة من الخارج الإطار واستخدم الملاقط لإزالة الآبار المجهرية المصنوعة من PDMS بعناية من إطار LEMOS 2.0.
  5. قم بتعقيم إطار LEMOS 2.0 والغطاء الخارجي باستخدام ethanol بتركيز 70%، مع تجنب الملامسة المباشرة لأي مكونات كهربائية بخلاف مصابيح LEDs، كما هو موضح في الخطوة 4.1.
  6. أعد شحن بطارية Li-ion من أجل التجربة التالية:
    1. حرك المفتاح إلى اليمين/وضع الشحن.
    2. قم بتوصيل USB بوحدة الشحن.
    3. تأكد من عملية الشحن عبر مصباح LED المدمج، والذي سيومض أثناء الشحن (Supplementary Figure 1E).

9. تحليل الفلورة وديناميكيات النمو

ملاحظة: قم بمعالجة بيانات الفلورة والـ OD600 الناتجة خلال تجربة LEMOS 2.0. يقوم دفتر تحليل البيانات باستيراد بيانات قارئ الأطباق المصدرة، وتطبيق تصحيحات العينة الفارغة (blank) والضوابط السلبية، وحساب الفلورة المعيرة، وإنشاء مخططات المسار الزمني. قبل تشغيل الدفتر، تأكد من أن تعيينات الآبار الدقيقة وتسميات الظروف تتطابق مع المخطط التجريبي.

  1. افتح إما ملف FL_OD_Data_Analysis_Duty_Cycle.ipynb أو ملف FL_OD_Data_Analysis_PID.ipynb.
    ملاحظة: يستخدم هذا التحليل بيانات الفلورة (FL) والكثافة الضوئية (OD) والمخزنة في هذه الملفات التي تم إنشاؤها أثناء التشغيل: Datafile/fl.csv و Datafile/od.csv. كما تستخدم ورقة تحليل PID أخطاء التعبير عن نقطة الضبط المخزنة في Datafile/errors.csv.
  2. قم بتعيين متغير الظروف (conditions) بأسماء الظروف والآبار.
  3. قم بتعيين neg_wells لتكون قائمة بين قوسين تحتوي على أسماء آبار التحكم السلبي.
  4. قم بتعيين od_blank و fl_blank لتمثل متوسطات آبار الفراغ (blank wells)، أو قيم معروفة في حال عدم تشغيل عينة فراغ.
  5. قم بتعيين colors_4_figures للألوان المطلوبة (تتوفر القائمة الكاملة للألوان المسماة على https://matplotlib.org/stable/gallery/color/named_colors.html).
  6. قم بتعيين figsize لتحديد العرض والارتفاع المطلوبين للأشكال الناتجة بالبوصة (inches).
  7. تحقق من أسماء الملفات المدرجة تحت قسم Constants.
  8. قم بتشغيل دفتر الملاحظات (notebook)، وسيتم إنشاء الأشكال كملفات بصيغة .png.

10. استكشاف الأخطاء وإصلاحها

  1. أثناء توصيل أسلاك LED، إذا انكسرت منصات لحام LED، ضع في اعتبارك ما يلي:
    1. قم بثني زاوية شريط LED لتسهيل تمرير الأسلاك عبر منفذ التوصيل.
    2. إذا تم استخدام سلك أكثر صلابة (سلك مفرد)، فاستبدله بسلك أكثر مرونة (سلك مجدول).
  2. إذا تم تشغيل المفتاح ولم يضيء مؤشر الطاقة (LED) الخاص بـ BLE Nano، ضع في اعتبارك ما يلي:
    1. أولاً، تحقق مما إذا كانت البطارية مشحونة. اضبط المفتاح على وضع الشحن وقم بتوصيل وحدة الشحن بمصدر الطاقة. إذا كانت مشحونة، يجب أن يتوقف مؤشر LED عن الوميض ويتحول إلى اللون الأخضر الثابت بعد بضع دقائق. أما إذا كانت البطارية مستنزفة، فاتركها تشحن بالكامل قبل المحاولة مرة أخرى.
    2. إذا كانت البطارية مشحونة ولا يزال مؤشر LED لا يضيء، استخدم جهاز ملتيميتر لقياس الجهد عبر دبابيس VIN و GND في BLE Nano.
      1. 0 V: يوجد قطع في توصيل الأسلاك. افحص كل وصلة لحام على طول مسار البطارية > المفتاح > محول الرفع (step-up converter) > Nano، وأعد صهر أي وصلة تبدو باردة أو غير مكتملة.
      2. 5 V: الطاقة تصل إلى Nano بشكل صحيح، لذا قد تكون اللوحة نفسها تالفة. حاول تشغيل Nano عبر الكابل للتأكد من ذلك. إذا ظل مؤشر الطاقة غير مضاء، قم بلحام Nano جديد لاستبدال الـ Nano التالف.
      3. أكبر من 5 V: لم يتم تكوين محول الرفع لإخراج 5 V. تأكد من فصل المنصات A و B في محول الرفع، كما هو موضح في قسم تجميع الجهاز.
  3. إذا فشل تشغيل سكربت Python، ضع في اعتبارك ما يلي:
    1. تحقق مما إذا كان سكربت Python قد تم فتحه من داخل مجلد المشروع الكامل وليس كملف مستقل؛ حيث يعتمد كل من control_duty_cycle.py و control_pid.py على وحدات محلية أخرى وسيفشلان إذا تم فتحهما بشكل مستقل.
    2. تأكد من إغلاق Arduino IDE، حيث لا يمكن لـ Arduino أن يكون لديه سوى اتصال واحد نشط في المرة الواحدة؛ إذ يمنح نظام التشغيل حق الوصول للبرنامج الذي يفتح المنفذ أولاً.
    3. تأكد من إعداد بروتوكول Gen5 بشكل صحيح، خاصة عند استخدام برامج مختلفة. راجع الملف التكميلي 2 (القسم 2).
    4. تأكد من تثبيت الحزم المطلوبة. أنشئ بيئة افتراضية وثبت الحزم كما هي مدرجة في ملف requirements.txt.
  4. إذا توقفت التجربة بشكل غير متوقع، ضع في اعتبارك ما يلي:
    1. التوقف بعد الدورة الأولى: من المرجح أن مسار تصدير بيانات Gen5 غير مهيأ بشكل صحيح. تأكد من أن وجهة التصدير تطابق المجلد الذي يتوقع سكربت Python القراءة منه في متغير file .
    2. التوقف بعد عدة دورات: يفشل PyAutoGUI أحياناً في التعرف على العناصر الموجودة على الشاشة، وغالباً ما يحدث ذلك بعد تغيير دقة الشاشة، أو قياس العرض، أو حجم النافذة. قم بالتقاط لقطات شاشة مرجعية جديدة يستخدمها السكربت، وحافظ على نافذة Gen5 نشطة وفي المقدمة طوال فترة التشغيل؛ ويمكن تصغير نافذة Python IDE.
    3. في حال أبلغ Gen5 أن درجة حرارة الغرفة خارج النطاق المستهدف، اترك القارئ ليصل إلى حالة التوازن قبل المتابعة. لا تتجاوز تحذير درجة الحرارة، لأن القيام بذلك قد يؤدي إلى ظهور نافذة تقرير التدقيق التي يجب إغلاقها يدوياً وقد تعيق التشغيل الآلي.
  5. إذا لوحظت قيم أساسية عالية بشكل غير عادي أو غير متسقة لـ OD600/الومضان عبر الآبار الدقيقة، ضع في اعتبارك ما يلي:
    1. افحص الآبار الدقيقة المصنوعة من PDMS بحثاً عن غبار أو شوائب محتبسة، والتي تشتت الضوء وتزيد من القراءات.
    2. تجنب ترك PDMS مكشوفاً للهواء المحيط لفترات طويلة قبل الصب أو الاستخدام.
  6. إذا لم تظهر الخلايا أي استجابة يمكن اكتشافها للضوء على الرغم من إجراء التجربة، ضع في اعتبارك ما يلي:
    1. تأكد من إصدار أوامر "تشغيل" LED من خلال فحص مخرجات طرفية IDE وسجل اتصالات BLE.
    2. إذا كانت الأوامر تُرسل ولكن لا يوجد ضوء مرئي، افحص وصلات لحام LED باستخدام جهاز ملتيميتر.

النتائج

تعد منصة LEMOS 2.0 منصة متوافقة مع قارئ الأطباق الدقيقة وتحتوي على 32 بئراً.24 للتحفيز البصري الوراثي القابل للبرمجة والقياس الكمي للتعبير الجيني (الشكل 2-أ,Bيتم إقران كل بئر مجهري بصمام ثنائي باعث للضوء (LED) من نوع WS2812B يمكن عنونته بشكل فردي، ويتم التحكم فيه بواسطة Arduino Nano 33 BLE Sense Rev2 من خلال مكتبة Adafruit_NeoPixel. يتواصل الجهاز مع جهاز كمبيوتر خارجي عبر البلوتوث، مما يسمح بتحديث أوامر الإضاءة أثناء التجربة. وتُصَبُّ آبار مجهرية جديدة من مادة PDMS في الجهاز قبل الاستخدام عن طريق القولبة بالتكرار (الشكل 2ج,د). *E. coli* المزارع المنماة في وسط LEMOS 2.0 عند 30 °C أظهرت النتائج تحت إضاءة LED مستمرة نمواً قابلاً للتكرار عبر الآبار الدقيقة، مما يشير إلى أن الجهاز يدعم المزارع البكتيرية والقياس بواسطة قارئ الأطباق على مدار الفترة الزمنية للتجربة.18 (الشكل 2Eعلاوة على ذلك، كانت منحنيات النمو متشابهة عبر ظروف الإضاءة المختلفة، مما يشير إلى أن التعرض للصمامات الثنائية الباعثة للضوء (LED) لم يؤثر بشكل ملموس على نمو الخلايا في ظل هذه الإعدادات.

لإثبات التحكم في التعبير الجيني باستخدام علم البصريات الوراثي، تم اعتماد نظام CcaSR v3.022، وهو نظام مكون من جزأين يتم تنشيطه بالضوء الأخضر وتثبيطه بالضوء الأحمر للتحكم في التعبير عن sfGFP (الشكل 3A). في ظل الضوء الأخضر، يقوم CcaS بفسفرة ذاتية ونقل مجموعة الفوسفات إلى منظم الاستجابة CcaR، الذي يتكون من ديمر لتنشيط التعبير عن sfGFP المعتمد على المحفز PcpcG2. أما في ظل الضوء الأحمر، فإن CcaS يفقد مجموعة الفوسفات، مما يؤدي إلى تقليل نشاط PcpcG2 وتثبيط التعبير عن sfGFP. تم تحويل بلازميدات CcaSR إلى بكتيريا E. coli MG1655 واستخدامها في التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول (الشكل 3B). وخلال التجربة، قام قارئ الأطباق الدقيقة بقياس OD600 والفلورة كل 10 min. ولمنع تداخل إضاءة LED مع القياسات البصرية، تمت برمجة مصابيح LED لتنطفئ خلال نوافذ القياس في بداية ونهاية كل فاصل زمني مدته 10 min (الشكل 3C).

تم تقييم التداخل بين الآبار أولاً من خلال وضع آبار دقيقة تحت ظروف مظلمة بشكل عمودي أو أفقي بجوار آبار دقيقة تخضع لإضاءة مستمرة بالضوء الأخضر (الشكل 3D). لم تظهر الآبار الدقيقة المظلمة المجاورة لآبار الضوء الأخضر المستمر أي زيادة ملحوظة في التعبير مقارنة بالآبار الدقيقة المظلمة التي لا تحيط بها آبار مضيئة، مما يشير إلى الحد الأدنى من تسرب الضوء بين الآبار الدقيقة. وبناءً على هذه النتائج، تم استخدام قيمة تعديل عرض النبضة (PWM) تبلغ 1 من 255 في التجارب اللاحقة لتوفير تحفيز بصري كافٍ مع تقليل التداخل بين الآبار إلى أدنى حد.

استُخدم التحفيز ذو الحلقة المفتوحة بعد ذلك لتحديد معامل التنشيط للتحكم البصري الجيني القائم على نظام LEMOS. وكان معامل التنشيط هو دورة تشغيل الضوء الأخضر، والتي عُرِفت بأنها كسر نافذة الإضاءة النشطة المخصصة للضوء الأخضر، بينما خُصص وقت الإضاءة المتبقي للضوء الأحمر. استمر كل فاصل تحكم لمدة 10 min، حيث كانت مصابيح الـ LEDs نشطة لمدة 8 min ومطفأة لمدة الدقيقتين المتبقيتين لتجنب التداخل مع قياسات قارئ الأطباق. أدت دورات تشغيل الضوء الأخضر من 5% إلى 80% إلى تعبير متدرج عن sfGFP، مما يوضح إمكانية استخدام دورة التشغيل كمدخل قابل للضبط للتنظيم البصري الجيني (الشكل 3E). وقد ارتفع معدل التعبير مع زيادة دورة التشغيل من 5% إلى 40%، دون حدوث زيادة إضافية ملحوظة عند دورات تشغيل أعلى (الشكل 3F)، مما يشير إلى أن النظام يقترب من حالة التشبع تحت تأثير تحفيز أطول بالضوء الأخضر.

أخيراً، تم تطبيق نظام تحكم بالتغذية الراجعة ذات الحلقة المغلقة لاختبار ما إذا كان نظام LEMOS 2.0 قادراً على تنظيم التعبير الجيني ديناميكياً نحو نقطة ضبط محددة25 (الشكل 4A). وقد تم تعيين مكونات نظام التحكم على النحو التالي: المشغل — مصابيح LEDs، والمتحكم — جهاز كمبيوتر خارجي يعمل ببرمجية PID، والمخرج المقاس — فلورة sfGFP المقيسة بالنسبة لـ OD600. قام المتحكم بمقارنة قيمة FL/OD600 المقاسة مع نقطة الضبط المحددة، ثم قام بتحديث دورة تشغيل الضوء الأخضر للفترة الزمنية التالية ومدتها 10 دقائق. تم تنفيذ تحكم تناسبي تكاملي تفاضلي (PID)، حيث تم حساب مدة التعرض للضوء الأخضر في كل دورة، tgreen، وفقاً للمعادلة التالية:
figure-results-1

هنا، e(t) هو الخطأ بين إشارة FL/OD600 المقاسة ونقطة الضبط عند الزمن t. و K هو الكسب التناسبي، و τI  هو ثابت الزمن التكاملي، و τD هو ثابت الزمن التفاضلي. تم اختيار معاملات التحكم في الحلقة المغلقة باستخدام نموذج التعبير الجيني عبر مراحل النمو (GEAGS)، والذي تم الإبلاغ عنه سابقاً26. وباستخدام هذه المعاملات، اقتربت الإشارة المقاسة من نقطة ضبط FL/OD600 المستهدفة وتتبعتها (الشكل 4B).

تظهر أوامر دورة التشغيل المقابلة في الشكل 4C. ويمثل ارتفاع العمود كسر الضوء الأخضر المقدم خلال كل نافذة إضاءة مدتها 8 min. وقد تغير أمر دورة التشغيل في خطوات منفصلة لأن وحدة التحكم قامت بتحديث المدخلات مرة واحدة كل 10 min. ومع اقتراب تعبير sfGFP من نقطة الضبط، انخفض التعرض للضوء الأخضر وزاد التعرض للضوء الأحمر. وبعد وصول الإشارة المقاسة إلى نقطة الضبط، لوحظ استمرار وجود مستوى منخفض من مدخلات الضوء الأخضر. ومن المرجح أن تعكس مدخلات التحكم المتبقية هذه حد المشتقة الذي يستجيب للتغير الحاد في معدل التعبير بالقرب من نقطة الضبط. وتظهر هذه النتائج أن نظام LEMOS 2.0 يمكنه تنفيذ تحكم بالتغذية الراجعة من نوع PID موجه بالنموذج للتعبير الجيني البصري الوراثي في المزارع المتقطعة.

figure-results-2
الشكل 1: إعداد برنامج LEMOS 2.0 أثناء التجربة. لقطة شاشة نموذجية تظهر نص التحكم بلغة Python وهو يعمل في بيئة VS Code (يساراً)، مع ظهور أوامر LED في الطرفية (terminal) أثناء إرسالها إلى متحكم Arduino الدقيق. ويظهر في لوحة مستكشف الملفات دليل المشروع الذي يحتوي على النص البرمجي الرئيسي ووحدات الدوال المرتبطة به. وعلى اليمين، يظهر برنامج قارئ الأطباق دورة قياس حركية جارية؛ وفي نهاية كل دورة، يقوم نص Python تلقائياً بتشغيل التشغيل التالي عبر واجهة Gen5 وتحديث أوامر دورة عمل LED وفقاً لذلك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 2: بناء جهاز LEMOS وتوصيف نمو الخلايا. (A) مخطط تفجيري لجهاز LEMOS يوضح الآبار الدقيقة المصنوعة من PDMS، ومصابيح LED للتحفيز، والبطارية، والمفتاح، والمتحكم الدقيق، ووحدة الشحن، وإطار الجهاز، والغلاف الخارجي. (B) الجهاز المجمع مع ملء الآبار الدقيقة من PDMS بالماء منزوع الأيونات. (C) بئر دقيقة من PDMS مصبوبة في جهاز LEMOS. مُعاد إنتاجه من Namboothiri et al. (2026)18، بترخيص CC BY 4.0. (D) قالب مطبوع ثلاثي الأبعاد لصب الآبار الدقيقة (E) منحنيات نمو E. coli في جهاز LEMOS عند 30 °C (N = 3 مكررات تقنية لكل من الآبار المضاءة باستمرار بالضوء الأخضر أو الأحمر، وكذلك تلك التي تم الحفاظ عليها في الظلام). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 3: توصيف النظام البصري الوراثي في LEMOS وديناميكيات التحكم في الحلقة المفتوحة. (A) خريطة البلازميد لنظام CcaSR البصري الوراثي ثنائي المكونات: الضوء الأخضر (522 nm) ينشط CcaS/CcaR لزيادة تعبير sfGFP، والضوء الأحمر (620 nm) يقلل من هذا التعبير. (B) بروتوكول إجراء التجارب البصرية الوراثية باستخدام نظام CcaSR البصري الوراثي. (C) مخطط تشغيلي لـ LEMOS. خلال الفترة الزمنية البالغة 12 h، يظل الجهاز داخل قارئ الأطباق الدقيقة. يقوم القارئ بقياس فلورة sfGFP و OD600، ثم يرسل البيانات إلى جهاز كمبيوتر يتولى تتبع الوقت وتشغيل مخططات Arduino. تقوم مخططات Arduino بتوجيه المتحكم الدقيق المدمج لتعطيل إضاءة LED مؤقتاً أثناء كل قياس. مقتبس من Namboothiri et al. (2026)18، بموجب رخصة CC BY 4.0. (D) تأثير تداخل الضوء الأخضر على الخلايا غير المحفزة في الظروف المظلمة. في مخطط الطبق، تشير المربعات الخضراء إلى الآبار الدقيقة ذات الضوء الأخضر (N = 9)، والمربعات الرمادية إلى الآبار الدقيقة في الظروف المظلمة دون تداخل ضوئي في الآبار المحيطة (N = 6)، والمربعات الأرجوانية إلى الآبار المظلمة (N = 3) المجاورة رأسياً للآبار ذات الضوء الأخضر، والمربعات الصفراء إلى الآبار المظلمة (N = 3) المجاورة أفقياً للآبار ذات الضوء الأخضر، والمربعات الزرقاء إلى الآبار ذات الضوء الأخضر (N = 2) التي تحتوي على سلالة ضابطة لقياس الفلورة الذاتية. (E) استجابات الحلقة المفتوحة في LEMOS لدورات تشغيل متباينة للضوء الأخضر (5–80%، N = 3) كمعلمة تحفيزية. تشير الخطوط المتصلة إلى المتوسطات؛ وتشير النطاقات المظللة إلى الانحرافات المعيارية. (F) متوسط معدل التعبير خلال مرحلة النمو الأسي مع دورات تشغيل متباينة. يشير N إلى عدد المكررات التقنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 4: التحكم بالتغذية الراجعة ذات الحلقة المغلقة في نظام LEMOS 2.0. (A) مخطط للتشغيل ذو الحلقة المغلقة: يعمل قارئ الأطباق الدقيقة كحساس يقيس FL/OD600، ويعمل الكمبيوتر كجهاز تحكم، ويقوم جهاز LEMOS 2.0 بتشغيل مصابيح LED لتنظيم التعبير الجيني. والعملية هنا هي التعبير الجيني في خلايا بكتيرية حية. مقتبس من Namboothiri et al. (2026)18، بموجب رخصة CC BY 4.0. (B) تتبع التحكم بالتناسبي التكاملي التفاضلي (PID) لنقطة ضبط FL/OD600 (SP = 18.5 × 105 a.u.). مراجع الضوء المستمر ممثلة باللونين الأخضر والأحمر (N = 3). عمليات تتبع نقطة الضبط موضحة بخطوط برتقالية (N = 3). تشير الخطوط المتصلة إلى متوسط FL/OD600؛ وتشير النطاقات المظللة إلى الانحرافات المعيارية. ويميز الخط المنقط نقطة الضبط. (C>) أوامر دورة التشغيل (duty-cycle) التمثيلية التي أنتجها متحكم PID أثناء تتبع نقطة الضبط في الحلقة المغلقة. يشير ارتفاع العمود إلى جزء الضوء الأخضر الذي تم تقديمه خلال كل فترة إضاءة. ويرمز N إلى عدد المكررات التقنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

منصةتنسيق الزرعالقراءة الناتجةتوضيح التحكم بالتغذية الراجعةنمط النموالقيد الذي يعالجه نظام LEMOS 2.0
LEMOS 2.032 بئرًا دقيقًا من مادة PDMS في قارئ الأطباققارئ أطباق تجاريتتبع نقطة الضبط في المتحكم التناسبي التكاملي التفاضلي (PID) الموجه بالنموذجمزرعة دفعية مهتزةهذه الدراسةهذه الدراسة
LEMOS 1.0١٦ بئراً مجهرية من مادة PDMS في قارئ الصفائحقارئ أطباق تجاريتتبع نقطة الضبط لـ PI وPID الموجه بالنموذجمزرعة دفعية مهتزةإنتاجية منخفضة؛ توافق محدود مع ظروف الظلام18
جهاز توربيدوستات مؤتمت + أخذ عينات روبوتيتيربيدوستات (Turbidostat)قياس التدفق الخلوي + مستشعر الكثافة الضوئية (OD)تتبع نقطة الضبط باستخدام المتحكمات التناسبية التكاملية (PI)، والتناسبية التكاملية التفاضلية (PID)، والتحكم التنبئي بالنماذج (MPC)المستنبت المستمريتطلب أخذ عينات روبوتية؛ تأخير في القياس والتشغيل2, 3
مجهر الآلة الأمميكروفلويديات الخلية الواحدةالمجهرية للخلايا الحيةالتغذية الراجعة للخلية الواحدة / التحكم التنبؤي بالنموذج (MPC)التروية المستمرةيتطلب تقنيات متخصصة في الموائع الدقيقة والمجهرية4, 6, 7
كيمياء حيويةتيربيدوستات مصغرمستشعرات مدمجة للكثافة الضوئية/الفلورةتتبع نقطة الضبط للمتحكم التناسبي التكاملي (PI)المزرعة المستمرةالنطاق الديناميكي للمستشعر المدمج يحد من أداء التغذية الراجعة الفلورية5
مصفوفة أنابيب الضوءأنابيب الزرعقياس التدفق الخلوي/الكثافة الضوئية الخارجيةحلقة مفتوحة فقطمزرعة الدفعات المرجوجةأخذ العينات يدويًا؛ قراءة محدودة للنمو عبر الإنترنت10
LAVA / LITOS / RainbowCap / Diyaأجهزة إضاءة متعددة الآبارقارئ أطباق تجاريالحلقة المفتوحة فقطالمزرعة الدفعيةفصل التحفيز عن القراءة؛ أتمتة محدودة12, 13, 14, 15
لوستروإضاءة صفيحة ذات 96 بئراًقارئ أطباق تجاريدائرة مفتوحة فقطالمزرعة المتقطعةيتطلب نقلاً روبوتياً بين مرحلتي التحفيز والقراءة8
RT-OGENEمنصة متوافقة مع الأطباق متعددة الآبار والأنظمة الموائعية الدقيقةقياس الكثافة الضوئية/الوميض الفلوري المعتمد على الكاميراتمت محاولة إغلاق الحلقة؛ ولكنها كانت محدودة بعملية القراءةمزرعة الدُفعة الساكنةتحد القراءة المعتمدة على الكاميرا والزراعة الساكنة من أداء التحكم16
قارئ الأطباق البصريقارئ/محفز مخصص ذو 96 بئراًالثنائيات الضوئية المدمجةتتبع نقطة الضبط بنظام التشغيل والإيقاف (Bang-bang)مزرعة دفعية مرججةيحد الاعتماد على المراسل/المرشح وانخفاض حساسية الفلورة من مرونة القراءة11,17

الجدول 1: مقارنة LEMOS 2.0 مع المنصات البصرية الوراثية الحالية2,3,4,5,6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,17,18.

الشكل التكميلي 1: صور التجميع. (أ) شريط LED منحني وشريط مصبوب داخل الجهاز. (ب) لوحة Nano BLE Sense Rev 2 ملحومة بمحول رفع الجهد (step-up converter)، والذي بدوره ملحوم بوحدة شحن البطارية. (ج) النسختان الأصلية والمعدلة من "JST PH 2-Pin Cable – Female Connector 100mm". (د) المفتاح الأصلي، والمفتاح المعدل، وكابل JST PH أحمر ملحوم، وجسر توصيل قصير ملحوم بين دبوسين على كلا جانبي الصف السفلي. (هـ) دمج المفتاح في تجميع الدائرة وتغذية الدائرة بالطاقة. (و) عرض جانبي لمصابيح LED وأشرطة LED المثبتة باستخدام الغراء الساخن. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: لقطات شاشة لإعداد بيئة Arduino IDE. (أ) لقطة شاشة لمدير اللوحات (Boards Manager)، تظهر البحث عن إحدى اللوحات المطلوبة. (ب) لقطة شاشة لمدير المكتبات (Library Manager)، تظهر اثنتين من المكتبات المطلوبة. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 1. المخطط السلكي لـ LEMOS. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: بروتوكول تعيين تخطيط مخصص للوحة LEMOS 2.0 في برنامج Gen5.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: لقطات شاشة لخطوات البرنامج الموصوفة في الملف التكميلي 2. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 1: فيديو التجميع الذي يتضمن الخطوات التالية. تثبيت شريط LED في الإطار، وتثبيت شريط LED باستخدام الغراء الساخن، وترتيب الأسلاك الموصلة إلى أشرطة LED وبينها، والتجميع النهائي مع الدوائر الإلكترونية. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول تصنيع وتشغيل LEMOS 2.0، وهو لوح ميكروي مدمج بمصابيح LED مكون من 32 بئراً مخصصاً لتجارب التحفيز البصري الوراثي والتحكم بالتغذية الراجعة داخل قارئ ألواح ميكروية قياسي. وتُظهر التجارب التمثيلية أن LEMOS 2.0 يدعم النمو الميكروبي (الشكل 2E) دون ملاحظة أي تسمم ضوئي ملحوظ تحت الإضاءة. بالإضافة إلى ذلك، يقلل LEMOS 2.0 من تسرب الضوء إلى الآبار الميكروية المجاورة الموجودة في الظلام (الشكل 3D)، مما يحسن موثوقية ضوابط الظلام وتجارب التحفيز ذات النمط المكاني. علاوة على ذلك، يتيح LEMOS 2.0 التفعيل البصري الوراثي القائم على دورة التشغيل (الشكل 3E) وينفذ تحكماً مغلق الحلقة بنظام PID للتعبير الجيني في المزارع المتقطعة (الشكل 4B).

يُعد التبييض الضوئي (Photobleaching) اعتباراً هاماً في التجارب البصرية الوراثية (optogenetic) نظراً لاستخدام نفس مسار العمل البصري لكل من التفعيل وقراءة الفلورة27. يستخدم نظام LEMOS 2.0 صمامات RGB LEDs تجارية تحتوي على ثلاثة صمامات ثنائية ذات ذروات انبعاث عند 620–630 nm (أحمر)، و515–525 nm (أخضر)، و465–475 nm (أزرق)19. وبناءً على ذلك، يجب اختيار المراسل الفلوري وكثافة تشغيل الـ LED لتقليل التداخل الطيفي بين أطوال موجات التفعيل وطيف الاستثارة للمراسل الفلوري، مع الحفاظ على مدخلات ضوئية كافية للتنظيم البصري الوراثي. في هذا البروتوكول، استُخدم نظام CcaSR، حيث تقع استجابات الضوء الأخضر والأحمر ضمن نطاقات التفعيل وإلغاء التفعيل الواسعة المسجلة لهذا النظام22، وتم قياس فلورة sfGFP باستخدام استثارة عند 485 nm. وبما أن أطوال موجات التفعيل الخضراء والحمراء المستخدمة للتحكم في CcaSR منفصلة عن طول موجة استثارة sfGFP، ولأن خرج الـ LED قد تم تقليله إلى كثافة PWM قدرها 1 من أصل 255 مع الاستمرار في إنتاج تنظيم بصري وراثي قوي، فمن المتوقع أن يكون التبييض الضوئي الناتج عن تفعيل الـ LED محدوداً. قد لا يزال يحدث بعض التبييض الضوئي خلال التجارب ذات السلاسل الزمنية الطويلة؛ ومع ذلك، وفي ظل الظروف المستخدمة هنا، لم يكن التبييض كبيراً بما يكفي لحجب الحث البصري الوراثي المقاس، أو استجابة دورة التشغيل (duty-cycle)، أو ديناميكيات تتبع الحلقة المغلقة20.

تعتبر عدة خطوات حاسمة لضمان الأداء الموثوق. أثناء عملية التصنيع، يجب محاذاة كل LED مع البئر الدقيق المقابل له للحفاظ على اتساق التحفيز وتقليل التداخل الضوئي. وأثناء تجميع الدائرة، يجب ضبط المحول الرافع للجهد (step-up converter) على 5 V قبل توصيل المتحكم الدقيق وشرائط LED. كما يتطلب صب الـ PDMS عناية خاصة، لأن الفقاعات أو الغبار أو الشوائب أو المعالجة غير الكاملة يمكن أن تغير النفاذية الضوئية عبر قيعان الآبار الدقيقة وتؤدي إلى خطوط أساس غير متسقة لـ OD600 أو الفلورة28. لذا، يجب إجراء قياس لخط الأساس باستخدام وسط معقم قبل البدء في التجارب البيولوجية. وفي حال ملاحظة فروق كبيرة في قراءات OD600 بين الآبار مقارنة ببقية اللوحة، يجب فحص الآبار المتأثرة للبحث عن مشكلات التصنيع المذكورة سابقاً. وبناءً على درجة الخطورة، يجب إما استبعاد تلك الآبار الدقيقة من التحليل أو إعادة صب الآبار الدقيقة بالكامل.

يعد تكوين البرمجيات مصدراً شائعاً آخر لفشل التجارب. يعتمد سير العمل الحالي على التشغيل المنسق لطريقة قارئ الأطباق، وتصدير بيانات Gen5، وبرنامج التحكم المكتوب بلغة Python، واتصال Bluetooth بين لوحات Arduino المركزية والطرفية. يجب أن يتطابق مسار التصدير وتنسيق الملف مع البنية التي يتوقعها برنامج Python، كما يجب أن تظل نافذة Gen5 مرئية أثناء التشغيل لأن الأتمتة تعتمد على التفاعلات القائمة على الشاشة. قبل بدء التجربة، يجب توصيل جهاز LEMOS بلوحة Arduino المركزية، وتشغيل روتين اختبار للتحقق من إضاءة جميع مصابيح LED بشكل صحيح؛ ويجب تحديد أي مصابيح LED غير مستجيبة ومعالجتها قبل تحميل المزارع البكتيرية، حيث أن الإخفاقات غير المكتشفة ستؤدي إلى ظروف إضاءة غير منضبطة أثناء التجربة. يجب على المستخدمين الذين يقومون بتكييف سير العمل مع نموذج آخر من قارئ الأطباق أو حزمة برمجيات أخرى الحفاظ على نفس منطق التوقيت والقياس والتصدير والتحليل، مع تعديل طبقة الأتمتة حسب الحاجة.

تغلق LEMOS الحلقة من خلال تمكين التشغيل الآلي المتزامن مع فترات القياس18هنا، تم تحديث جهاز LEMOS الأولي من خلال مضاعفة عدد الآبار لزيادة القدرة الإنتاجية. بالإضافة إلى ذلك، تعمل الهندسة المعدلة للآبار الدقيقة على تقليل تسرب الضوء بين الآبار، مما يتيح اختبار الدوائر البصرية الوراثية في ظروف مظلمة إلى جانب الظروف المضاءة في التجربة نفسها. يدعم LEMOS 2.0 حالياً تجارب المزارع المتقطعة. وبما أن معدل النمو، وتوفر الموارد، وديناميكيات التعبير الجيني تتغير أثناء المزرعة المتقطعة، فقد تحتاج المعلمات مثل شدة الـ LED، ونطاق دورة التشغيل، وفاصل أخذ العينات، ومعلمات وحدة التحكم إلى إعادة معايرة لسلالات أخرى، أو بروتينات تقريرية، أو أنظمة بصرية وراثية، أو ظروف نمو مختلفة.20يتم تقديم مقارنة تفصيلية بين LEMOS 2.0 والمنصات التي تم تطويرها مسبقاً لإجراء الدراسات البصرية الوراثية في الجدول 1يمكن أن تشتمل الإصدارات المستقبلية على قنوات أو خزانات مدمجة في الطبق لتبديل الوسط وتخفيفه بشكل متحكم فيه، مما يسمح بإجراء تجارب أطول مع الحفاظ على ظروف نمو أكثر اتساقًا. كما يمكن للتصاميم الإضافية أن تدعم أطوالاً موجية بديلة لمصابيح LED أو تقلل الاعتماد على الأتمتة البرمجية القائمة على الشاشة.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم المؤلفين ب.ج.، ت.س.ب.، و ه.ر.ن. من قبل جامعة تكساس إيه أند إم&محطة تجربة الهندسة M

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
سلك توصيل مجدول 22 AWG AmazonASIN: B089CQ2N69سلك زهيد الثمن لتوصيل الدائرة الكهربائية. يمكن استخدام سلك صلب أو مجدول.
مفتاح منزلق جانب المقبض 2P3T DP3T بـ 8 دبابيس و3 مواقعAmazonASIN: B007Q9Y8YCيجب أن تكون المفاتيح والدبابيس على جوانب متجاورة، وليس متقابلة كما هو شائع.
Arduino Nano 33 BLE Rev 2ArduinoABX00071وحدة تحكم دقيقة – يتناسب التصميم المسطح وقدرة BLE مع احتياجات الجهاز الطرفي.
Arduino Nano 33 IoTArduinoABX00027وحدة تحكم دقيقة – تُستخدم كجهاز مركزي.
قارئ الأطباق الدقيقة BioTek Synergy H1Agilent (BioTek)—أو قارئ أطباق متوافق يدعم الوضع الحركي (kinetic mode)
فيلم ختم Breathe-EasyUSA Scientific9123-6100فيلم ختم طبي؛ ختم للأطباق الدقيقة نفاذ للغازات
كلورامفينيكول (مخزون 25 mg/mL في الإيثانول)متنوع—تركيز العمل 25 µg/mL
E. coli MG1655
Ease Release 200Mann Release Technologiesعامل تحرير
شريط KaptonAmazonASIN: B07F8TZZ4N
أطباق LB agar ومضادات حيوية مناسبةمخبرياً—يُفترض أنها متوفرة بالفعل.
بطارية Li-ion 3.7 V، سعة 3000 mAh (11.1 Wh)، مقاس 104060UfineUFX0391-03 يجب أن تأتي مع كابل JST PH ذو دبوسين (ذكر). مصنعة من قبل Liter Energy، وتُباع عبر عدة تجار تجزئة.
وحدة شحن وتفريغ بطارية Li-ion بمنفذ Type-C USB (5V 1A)AmazonASIN: B0CTMJMRKZابحث عن "Replaces TP4056" على Amazon. وتجاوز وحدات TP4056 القياسية. اختر أي قائمة تعرض الوحدات السوداء الأصغر التي تحمل عبارة "Replaces TP4056" في العنوان.
كابل Li-ion JST PH ذو دبوسين – موصل أنثى 100 mmمتنوعASIN: B07NWNPB77يجب أن يكون متوافقاً مع موصل JST الخاص بالبطارية’.
وحدة تعزيز صغيرة (Mini Boost) من 3.7 V إلى 5 V/8 V/9 V/12 V لوحة رفع جهد مع مؤشر LEDAmazon (Teyleten Robot)ASIN: B0B4TB9QNY[https://a.co/d/03ASKZPq](https://a.co/d/03ASKZPq)
طبق Nunc OmniTray ذو بئر واحدThermo Scientific242811الغلاف الخارجي
pNO286-3AddgenePlasmid #107746يُشفر التعبير التأسيسي لـ CcaS
pSR58.6AddgenePlasmid #63176يُشفر التعبير التأسيسي لـ CcaR و sfGFP تحت محفز PcpcG2
كاوية لحام وقصديرمتنوع—التوصيات: رأس دقيق، قصدير بنواة من مساعد الصهر (flux) أو الراتنج.
سبيكتينوميسين (مخزون 50 mg/mL)متنوع—تركيز العمل 50 µg/mL
أنابيب زراعة معقمة (14 mL ذات قاع مستدير)متنوع—
إيلاستومر السيليكون SYLGARD 184 (قاعدة + عامل معالجة)SYLGARD 184نسبة المعالجة إلى القاعدة 1:10 بالكتلة
كابل USB-A إلى Micro USBمتنوع—لتوصيل لوحات Arduino بجهاز الكمبيوتر. يجب أن يكون سلك نقل بيانات، وليس مجرد سلك شحن.
كابل شحن USB-A إلى USB-Cمتنوع—يتصل بوحدة شحن البطارية
مجفف فراغي ومضخةمتنوع—لإزالة الغازات من PDMS
شريط LED بكسل RGB من نوع WS2812B IC SPI، 100LED/m، DC5V، IP30، أسودAmazon (BTF-LIGHTING)ASIN: B088B8G8LD ; BTF-LIGHTING Part No.: WS2812B1M100LB30شريط LED يمكن الوصول إلى كل وحدة فيه بشكل مستقل. 100 LED/m. الجهد: 5 V. يشير IP30 إلى مقاومة الماء. يُفضل اللون الأسود على الأبيض لتقليل انعكاس الضوء.

المراجع

  1. Kumar S, Khammash M. Platforms for optogenetic stimulation and feedback control. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:918917.
  2. Milias-Argeitis A, et al. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nat Commun. 2016;7:12546.
  3. Gutierrez Mena J, Kumar S, Khammash M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nat Commun. 2022;13(1):4808.
  4. Lugagne JB, Blassick CM, Dunlop MJ. Deep model predictive control of gene expression in thousands of single cells. Nat Commun. 2024;15(1):2148.
  5. Steel H, Habgood R, Kelly CL, Papachristodoulou A. In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLoS Biol. 2020;18(7):e3000794.
  6. Lugagne JB, et al. Balancing a genetic toggle switch by real-time feedback control and periodic forcing. Nat Commun. 2017;8(1):1671.
  7. Chait R, et al. Shaping bacterial population behavior through computer-interfaced control of individual cells. Nat Commun. 2017;8(1):1535.
  8. Harmer ZP, McClean MN. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit (vol 12, pg 1943, 2023). ACS Synth Biol. 2023;12(11):3505.
  9. Abkar L, et al. Enhanced reproducibility and precision of high-throughput quantification of bacterial growth data using a microplate reader. J Vis Exp. 2022;185:63849.
  10. Olson EJ, et al. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nat Methods. 2014;11(4):449-456.
  11. Bugaj LJ, Lim WA. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nat Protoc. 2019;14(7):2205-2228.
  12. Repina NA, et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Rep. 2020;31(10):107737.
  13. Höhener TC, et al. LITOS: A versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Sci Rep. 2022;12(1):13139.
  14. Vogt A, et al. Simultaneous spectral illumination of microplates for high-throughput optogenetics and photobiology. Biol Chem. 2024;405(11-12):751-763.
  15. Kumar S, et al. Diya: A universal light illumination platform for multiwell plate cultures. iScience. 2023;26(10):107862.
  16. Soffer G, Perry JM, Shih SCC. Real-time optogenetics system for controlling gene expression using a model-based design. Anal Chem. 2021;93(6):3181-3188.
  17. Benman W, et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. Commun Biol. 2023;6(1):1192.
  18. Namboothiri HR, et al. Closed-loop optogenetic control in a microplate reader. ACS Synth Biol. 2026;15(6):2356-2365.
  19. Worldsemi. WS2812B intelligent control LED integrated light source. 2026: https://cdn-shop.adafruit.com/datasheets/WS2812B.pdf
  20. Lambert TJ. FPbase: A community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 2019;16(4):277-278.
  21. Xia YN, et al. Replica molding using polymeric materials: A practical step toward nanomanufacturing. Adv Mater. 1997;9(2):147-149.
  22. Ong NT, Tabor JJ. A miniaturized Escherichia coli green light sensor with high dynamic range. ChemBioChem. 2018;19(12):1255-1258.
  23. Hanahan D, Jessee J, Bloom FR. Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods Enzymol. 1991;204:63-113.
  24. ANSI SLAS 1-2004 (R2012). Footprint dimensions. At https://www.slas.org/SLAS/assets/File/public/standards/ANSI_SLAS_1-2004_FootprintDimensions.pdf.
  25. Åström KJ, Murray RM. Feedback systems: An introduction for scientists and engineers. Princeton University Press; Princeton, NJ; 2008.
  26. Namboothiri HR, Pandey A, Hu CY. Resolving emergent transient oscillations in gene circuits with a growth-coupled model. Sci Adv. 2026;12(6):eadz2310.
  27. Song LL, Hennink EJ, Young IT, Tanke HJ. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophys J. 1995;68(6):2588-2600.
  28. Campbell DJ, et al. Replication and compression of bulk and surface structures with polydimethylsiloxane elastomer. J Chem Educ. 1999;76(4):537-541.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التحكم البصري الوراثيلوحة ميكروية مدمجة بصمامات ثنائية باعثة للضوءالتعبير الجينيالتحفيز الضوئي الديناميكيقارئ اللوحات الميكرويةآبار ميكروية من بولي داي ميثيل سيلوكسانتجميع الدوائربرمجة أردوينوقياس الفلورةمستنبتات بكتيرية

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.