يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

تحديد المؤشرات الحيوية والمركبات العلاجية المرشحة لارتفاع ضغط الدم الرئوي باستخدام المعلوماتية الحيوية والتعلم الآلي

82 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/73519

⸱

أغسطس 25, 2026

 ,  , 
1College of Biological and Food Engineering, Huaihua University

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه المقالة سير عمل معلوماتي حيوي قابل للتكرار يدمج مجموعات بيانات ترانسكريبتومية عامة، والتعلم الآلي، والتحقق الخارجي، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي مع النسخ العكسي، وفحص خريطة الاتصال (Connectivity Map)، والرسو الجزيئي لتحديد المؤشرات الحيوية لارتفاع ضغط الدم الرئوي والمركبات العلاجية المرشحة.

الملخص

هدفت هذه الدراسة إلى تحديد المؤشرات الحيوية الجزيئية المرتبطة بارتفاع ضغط الدم الرئوي (PH) والمركبات الجزيئية الصغيرة المرشحة باستخدام بيانات النسخ العامة وموارد التحقق المستقلة. تم دمج ثلاث مجموعات بيانات من Gene Expression Omnibus وهي (GSE22356 وGSE33463 وGSE48149) بعد إجراء عمليات التسوية، وتوصيف المجسات، وتصحيح تأثير الدفعة باستخدام ComBat. واستُخدم تحليل التعبير التفاضلي، وتحليل شبكة التعبير الجيني المشترك الموزون، وتحليل الإثراء الوظيفي، وتحليل شبكة التفاعل بين البروتينات، وثلاث خوارزميات للتعلم الآلي لتحديد جينات الميزات الأساسية. كما تم تقييم الأداء التشخيصي باستخدام منحنيات خصائص تشغيل المستقبل. وشمل التحقق الخارجي مجموعة مستقلة من أنسجة الرئة (GSE117261)، ومجموعة بيانات تسلسل RNA أحادي الخلية للشريان الرئوي (GSE210248)، والتحقق باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل النسخي العكسي الكمي في عينات مستقلة من أنسجة الرئة. واستُخدمت إعادة تموضع الأدوية القائمة على خريطة الاتصال (Connectivity Map) والالتحام الجزيئي لفحص المركبات المرشحة. تم تحديد ثمانية وسبعين جينًا ذات تعبير تفاضلي، واختيرت الجينات CXCL10 وJUN وIFIH1 وMX1 وTLR7 كجينات ميزات أساسية. وفي مجموعة أنسجة الرئة المستقلة GSE117261، أظهر جين JUN أقوى دعم خارجي، بينما كان تكرار الجينات الأخرى متغيرًا. وأكد تفاعل البوليميراز المتسلسل النسخي العكسي الكمي في 20 عينة بيولوجية مستقلة من ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي و20 عينة ضابطة زيادة تنظيم جميع الجينات الخمسة. وأعطى نموذج qRT-PCR الظاهري المكون من خمسة جينات وتحليلات التحقق المتقاطع الخماسية الطبقية المكررة 100 مرة مساحة تحت المنحنى قدرها 1.000، رغم أن صغر حجم المجموعة يتطلب تفسيرًا حذرًا وتحققًا استباقيًا مستقلًا. ودعم التحليل أحادي الخلية لـ GSE210248 تغير التواصل بين الخلايا المناعية والهيكلية والتحول المظهري لخلايا العضلات الملساء. وقد احتل BRD-K91900765/VX-745 المرتبة الأعلى في فحص خريطة الاتصال. تم إدراج MAPK14/p38α، وهو هدفه الدوائي المعروف، كبروتين التحام مرجعي إيجابي، بينما عومل الالتحام ضد البروتينات الخمسة المرتبطة بالمؤشرات الحيوية كدراسة استكشافية. تدعم هذه النتائج الجينات الخمسة كمؤشرات حيوية مرشحة لارتفاع ضغط الدم الرئوي، وVX-745 كفرضية حاسوبية لإعادة تموضع الدواء تتطلب تحققًا تجريبيًا.

المقدمة

يُعد ارتفاع ضغط الدم الرئوي (PH) متلازمة قلبية رئوية مترقية تتميز بارتفاع مستمر في ضغط الشريان الرئوي، وزيادة في المقاومة الوعائية الرئوية، وفشل في البطين الأيمن في نهاية المطاف. وتحدد المعايير الهيموديناميكية الحالية ارتفاع ضغط الدم الرئوي بأنه متوسط ضغط الشريان الرئوي في حالة الراحة بمقدار >20 mmHg، وفقاً لما يتم قياسه عن طريق قسطرة القلب الأيمن1. ومن بين الأنواع السريرية المختلفة، يُعد ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي (PAH) أحد أخطر الأشكال، ويتميز بإعادة تشكيل وعائية رئوية مترقية. وتشمل سماته المرضية خلل الوظائف البطانية، والتكاثر والهجرة غير الطبيعية لخلايا العضلات الملساء في الشرايين الرئوية، وتنشيط الأرومات الليفية في الغلالة البرانية، وترسب المصفوفة خارج الخلية، وتسلل الخلايا الالتهابية، وتضيق أو انسداد الشرايين الرئوية الطرفية2. وتشير هذه التغيرات إلى أن PH/PAH ليس مجرد اضطراب في تضيق الأوعية، بل هو مرض إعادة تشكيل وعائية معقد تقوده آليات جزيئية وخلوية ومناعية التهابية منسقة.

تستهدف علاجات ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي (PAH) الحالية بشكل أساسي مسارات البروستاسيكلين، والإندوثيلين، وأكسيد النيتريك-سيكلاز الغوانيلات الذائب، والفوسفودايستريز من النوع 53˒4. وعلى الرغم من أن هذه العلاجات تعمل على تحسين الأعراض والقدرة على ممارسة التمارين الرياضية والمعايير الهيموديناميكية، إلا أن تأثيراتها تظل في الغالب موسعة للأوعية الدموية وهيموديناميكية. كما أن قدرتها على عكس إعادة تشكيل الأوعية الدموية الرئوية المستقرة محدودة، ولا يزال العديد من المرضى يعانون من تطور المرض رغم العلاج المركب. وبناءً على ذلك، يمثل تحديد مؤشرات حيوية جزيئية ومرشحات علاجية جديدة تعكس عملية إعادة التشكيل حاجة ملحة لم يتم تلبيتها. وبوجه خاص، ظهر التنشيط المناعي الالتهابي، وإشارات الإنترفيرون، ومسارات مستقبلات Toll-like، والتجنيد المناعي بوساطة الكيموكينات، والتحول المظهري للخلايا العضلية الملساء كعوامل مساهمة محتملة في تطور PH/PAH5˒6.

توفر مجموعات بيانات النسخ عالية الإنتاجية موارد قيمة لتحديد البصمات الجزيئية المرتبطة بالأمراض في حالات ارتفاع ضغط الدم الرئوي (PH) وارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي (PAH). ومع ذلك، غالبًا ما تكون الدراسات القائمة على مجموعة بيانات واحدة محدودة بسبب صغر حجم العينات، وتأثيرات الدفعات، وعدم تجانس المنصات، وعدم كفاية التحقق من الصحة. يمكن لتحليل التعبير التفاضلي تحديد الجينات ذات التعبير المتغير، ولكنه قد لا يستوعب بشكل كامل وحدات التعبير المشترك المرتبطة بالمرض أو التفاعلات على مستوى الشبكة. ويمكن لتحليل شبكة التعبير الجيني المشترك الموزونة (WGCNA) تحديد وحدات جينية مرتبطة بسمات المرض، بينما يمكن لتحليل شبكة التفاعل بين البروتينات (PPI) الكشف عن الجينات عالية الاتصال داخل الشبكات البيولوجية. كما يمكن لأساليب التعلم الآلي تحديد أولويات الجينات ذات القيمة التشخيصية أو التصنيفية. ومع ذلك، فإن الاعتماد على خوارزمية واحدة قد يؤدي إلى تحيز خاص بالنموذج. لذا، فإن دمج تحليل التعبير التفاضلي، وWGCNA، وتحليل شبكة PPI، وخوارزميات التعلم الآلي المتعددة قد يعزز من قوة اكتشاف المؤشرات الحيوية.

يتمثل تحدٍ رئيسي آخر في دراسات المؤشرات الحيوية للترانسكريبتوم في التفسير البيولوجي؛ فقد تعكس إشارات الأنسجة الكلية (Bulk-tissue) تغيرات في التعبير الجيني داخل الخلايا الوعائية المقيمة، أو تسلل الخلايا المناعية، أو تغير نسب المجموعات الخلوية المتعددة. ويوفر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (Single-cell RNA sequencing) فرصة لوضع الجينات المرشحة المستمدة من الأنسجة الكلية ضمن سياق خلوي. ففي حالات ارتفاع ضغط الدم الرئوي (PH) وارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي (PAH)، يتضمن إعادة تشكيل الأوعية الدموية الرئوية الخلايا البطانية، وخلايا العضلات الملساء، والأرومات الليفية، والخلايا الوحيدة/البلعمية، والخلايا اللمفاوية، وخلايا مناعية أو هيكلية أخرى. كما يرتبط تطور المرض بتغير التواصل بين الخلايا والتحول المظهري لخلايا العضلات الملساء. وبناءً على ذلك، فإن الجمع بين الفرز الترانسكريبتومي للأنسجة الكلية والتحقق أحادي الخلية قد يساعد في تحديد ما إذا كانت المؤشرات الحيوية المرشحة مرتبطة بالتنشيط المناعي، أو إعادة التشكيل الهيكلي للأوعية الدموية، أو خلل في التواصل متعدد الخلايا.

بالإضافة إلى اكتشاف المؤشرات الحيوية، يمكن استخدام التواقيع النسخية في إعادة توظيف الأدوية حاسوبيًا. تربط خريطة الاتصال (CMap) ملفات التعبير الجيني المرتبطة بالأمراض بالجزيئات الصغيرة التي قد تعكس تلك التواقيع أو تعدلها7. وعندما تقترن هذه الاستراتيجية بتنظيم المركبات والرسو الجزيئي، يمكنها توليد فرضيات علاجية قابلة للاختبار تجريبيًا. ورغم أن تنبؤات CMap والرسو الجزيئي لا يمكنهما إثبات فعالية الدواء، إلا أنهما يستطيعان تحديد أولويات المركبات المرشحة لاختبارات ربط الأهداف المستقبلية، والتجارب القائمة على الخلايا، والتحقق من صحتها باستخدام النماذج الحيوانية.

تم تطوير سير عمل متكامل وقابل للتكرار لتحديد المؤشرات الحيوية لمرض ارتفاع ضغط الدم الرئوي/ارتفاع ضغط الدم الرئوي الشرياني (PH/PAH) والمركبات العلاجية المرشحة. تم دمج ثلاث مجموعات بيانات ترانسكريبتومية عامة من قاعدة بيانات Gene Expression Omnibus بعد إجراء عمليات التسوية وتصحيح تأثير الدفعة. واستُخدم تحليل التعبير التفاضلي، وتحليل شبكة التعبير الجيني المشترك الموزون (WGCNA)، وتحليل الإثراء الوظيفي، وتحليل شبكة التفاعل البروتيني-البروتيني (PPI)، وثلاث خوارزميات للتعلم الآلي لفحص الجينات المتميزة القوية. كما استُخدم تحليل منحنى خصائص التشغيل للمستقبل (ROC)، ومجموعة تحقق مستقلة من أنسجة الرئة، وأدلة تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-sequencing) للشريان الرئوي، والتحقق الكمي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (qRT-PCR) في عينات مستقلة لمزيد من التقييم للجينات المختارة. وأخيرًا، تم تطبيق إعادة توظيف الأدوية بناءً على خريطة المركبات الصغيرة (CMap) والرسو الجزيئي لتحديد المركبات المرشحة. تكمن جدة هذه الدراسة في إطار التحقق متعدد الطبقات، الذي يربط بين الاكتشاف الترانسكريبتومي الشامل، وتحديد الأولويات باستخدام التعلم الآلي، والتحقق المستقل، والتأكيد التجريبي بواسطة qRT-PCR، والتفسير الميكانيكي أحادي الخلية، والفحص الحاسوبي للمركبات. كانت فرضية الدراسة أن PH/PAH يُحركه برنامج منسق من الالتهاب المناعي وإعادة تشكيل الأوعية الدموية، وأن الجينات القوية ضمن هذا البرنامج قد تعمل كمؤشرات حيوية مرشحة وتوفر فرصًا لإعادة توظيف الأدوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

احتوت مجموعات البيانات العامة من مستودع التعبير الجيني (Gene Expression Omnibus (GEO)) التي تم تحليلها في هذه الدراسة على بيانات ترانسكريبتومية مجهولة الهوية من دراسات نُشرت سابقاً، ولم تتطلب موافقة أخلاقية إضافية. وقد وافقت لجنة الأخلاقيات بجامعة Huaihua على دراسة التحقق المستقلة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي باستخدام النسخ العكسي (qRT-PCR) على أنسجة الرئة البشرية (رقم الموافقة 2024(A05112)). كما تم الحصول على موافقة كتابية مستنيرة من جميع المشاركين أو ممثليهم المفوضين قانوناً قبل جمع العينات. وقد طُبقت إجراءات الموافقة والرضا على جميع عينات أنسجة الرئة البالغ عددها 20 عينة لمرض ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي (PAH) و20 عينة ضابطة شملها التحقق بواسطة qRT-PCR. تدرج أدوات البحث المستخدمة في هذا البروتوكول في الـ جدول المواد.

1. جمع ومعالجة مجموعات البيانات النسخية العامة مسبقاً

تم الحصول على مجموعات بيانات المصفوفات الدقيقة GSE22356 وGSE33463 وGSE48149 المتعلقة بفرط ضغط الدم الرئوي (PH) من قاعدة بيانات GEO. واستُخلصت عينات فرط ضغط الدم الرئوي/فرط ضغط الدم الشرياني الرئوي (PAH) وعينات الضبط وفقاً لتوصيفات النمط الظاهري الأصلية. كما تم تنزيل مصفوفات التعبير وملفات توصيف المنصة باستخدام برمجيات R القابلة للتكرار وحزمة GEOquery.

تم إجراء تعليق المسبارات ومطابقة رموز الجينات بشكل متسق عبر مجموعات البيانات. وعندما تطابقت مسبارات متعددة مع الجين نفسه، تم حساب قيمة التعبير المتوسطة. كما طُبقت عملية تسوية المئينات (Quantile normalization)، وتمت إزالة الجينات ذات التعبير المنخفض أو التباين المنخفض. ثم دُمجت مجموعات البيانات، وصُححت تأثيرات الدفعات (batch effects) باستخدام خوارزمية ComBat في حزمة sva8. وتم تقييم التصحيح باستخدام المخططات الصندوقية وتحليل المكونات الرئيسية.

2. تحديد الجينات ذات التعبير المتباين

استُخدمت حزمة limma لمقارنة مستويات التعبير بين عينات PH والعينات الضابطة في مصفوفة التعبير المصححة من تأثيرات الدفعات.9تم تطبيق نموذج خطي، واستُخدمت إحصائيات بايز التجريبية. وقد حُددت الجينات ذات التعبير المتباين باستخدام قيمة معدلة P قيمة <0.05 وتغير طي لوغاريتمي مطلق (log2 fold change) > 0.585. تم تصور النتائج باستخدام مخططات البركان والخرائط الحرارية.

3. بناء شبكة التعبير الجيني المشترك الموزونة

تم بناء شبكة التعبير الجيني المشترك المرجحة باستخدام حزمة WGCNA10. أُجري تجميع للعينات للكشف عن القيم المتطرفة. تم اختيار قوة العتبة اللينة بناءً على مؤشر ملاءمة الطوبولوجيا الخالية من المقياس. حُددت الوحدات الجينية باستخدام خوارزمية قطع الشجرة الديناميكية. تم ربط الجينات الذاتية للوحدات بالنمط الظاهري لـ PH، واختيرت الوحدة المرتبطة بالمرض والتي أظهرت أقوى ارتباط. ثم تم تقاطع الجينات الموجودة في الوحدة الرئيسية مع الجينات ذات التعبير المتباين للحصول على الجينات المتفق عليها.

4. تحليل الإثراء الوظيفي

تم تحليل فئات العملية البيولوجية والمكون الخلوي والوظيفة الجزيئية في وجود Gene Ontology باستخدام clusterProfiler11. كما أُجري تحليل إثراء المسارات باستخدام Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes لتحديد مسارات الإشارات12. استُخدمت قيمة P < 0.05 وقيمة q < 0.2 كحدود للإثراء، وتم تمثيل المصطلحات المثرية بصرياً باستخدام مخططات الفقاعات11.

5. بناء شبكة تفاعلات البروتين-البروتين وتحديد الجينات المركزية

تم تقديم قائمة الجينات المتفق عليها إلى قاعدة بيانات STRING، مع اختيار Homo sapiens كنوع، وعتبة ثقة للتفاعل > 0.413. تم استيراد ملف التفاعل إلى برنامج Cytoscape، واستُخدمت إضافة CytoHubba لترتيب الجينات حسب درجة العقدة. وقد عُرِفت الجينات عالية الاتصال بأنها جينات مركزية (hub genes).

6. اختيار الجينات ذات السمات التشخيصية باستخدام التعلم الآلي

تم تطبيق ثلاث خوارزميات مستقلة لاختيار الميزات. أولاً، أُجري تحليل الانحدار اللوجستي باستخدام مشغل تقليص واختيار الحد الأدنى (lasso) عبر حزمة glmnet والتحقق المتقاطع بمقدار 10 طيات لتحديد الجينات ذات المعاملات غير الصفرية14. ثانياً، طُبق نظام إزالة الميزات المتكرر باستخدام آلات المتجهات الداعمة لإزالة الميزات الزائدة واختيار مجموعة الميزات الفرعية التي حققت أعلى دقة في التحقق المتقاطع15. ثالثاً، تم بناء نموذج الغابة العشوائية، وصُنفت الميزات وفقاً لمتوسط الانخفاض في شوائب جيني (Gini impurity)16. واستُخدم تقاطع مجموعات الجينات المستمدة من الخوارزميات الثلاث لتحديد المجموعة النهائية من جينات الميزات الأساسية. كما استُخدمت حزمة pROC لإنشاء منحنيات خصائص التشغيل للمستقبل وحساب قيم المساحة تحت المنحنى17.

7. التحقق من صحة الجينات الجوهرية باستخدام مجموعات بيانات مستقلة للكتلة والخلية الواحدة

استُخدمت مجموعة GSE117261 كجموعة تحقق خارجية مستقلة لأنسجة الرئة، وهي تحتوي على 58 عينة من PAH و25 عينة ضابطة من متبرعين فاشلين18. ولم تُستخدم مجموعة البيانات هذه في تحليل التعبير التفاضلي للاكتشاف، أو بناء شبكة التعبير الجيني المرجحة المشتركة، أو اختيار الميزات باستخدام تعلم الآلة. تم تطبيع مصفوفة التعبير وتزويدها بالتعليقات التوضيحية، وحُلل التعبير التفاضلي باستخدام limma v3.68.0. كما طُبق تصحيح معدل الاكتشاف الكاذب بطريقة Benjamini-Hochberg على كامل النسخ الجيني الموضح بالتعليقات التوضيحية. وحُسبت منحنيات خصائص تشغيل المستقبل (ROC) للجينات المفردة باستخدام pROC v1.19.0.1، وفواصل ثقة DeLong بنسبة 95%، ونقاط القطع بناءً على مؤشر Youden. كما تم تطبيق نموذج انحدار لوجستي استكشافي مكون من خمسة جينات ضمن GSE117261، وجرى تقييم أدائه الداخلي إضافياً باستخدام التحقق المتقاطع المتداخل والمتكرر.

استُخدمت مجموعة بيانات GSE210248 (الجدول 1>) كمجموعة بيانات تحقق من الخلايا المفردة في الشريان الرئوي، والتي تحتوي على عينات من ثلاثة مرضى مصابين بـ PAH وثلاثة متبرعين أصحاء19. تمت معالجة البيانات باستخدام Seurat v5.5.1 لغرض مراقبة الجودة، والتطبيع (normalization)، وخفض الأبعاد، والتجميع (clustering)، وتصنيف الخلايا20. تم تحديد المجموعات الخلوية الرئيسية، بما في ذلك الخلايا البطانية، وخلايا العضلات الملساء، والأرومات الليفية، والخلايا الوحيدة/البلعمية، وخلايا T/الخلايا القاتلة الطبيعية. حُلل التواصل بين الخلايا باستخدام CellChat v2.1.2 وقاعدة بيانات الربيطة والمستقبل CellChatDB.human21. أُنشئ كائن CellChat من مصفوفة تعبير Seurat المُنظّمة والبيانات الوصفية لأنواع الخلايا. تم تحديد الجينات المفرطة التعبير وتفاعلات الربيطة والمستقبل؛ وحُسبت احتمالات التواصل؛ وأُزيلت التفاعلات التي تشمل مجموعات خلوية تحتوي على أقل من 10 خلايا؛ ثم استُنتجت شبكات التواصل على مستوى المسار وجُمِعت. استُخدمت مجموعة البيانات هذه فقط للتحقق الميكانيكي الخارجي وليس لتدريب النموذج.

عنصرالوصف
مجموعة البياناتGSE210248
نوع البياناتتسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية القائم على القطيرات من 10x Genomics؛ التنميط النسخي عالي الإنتاجية
عينات بشريةثلاث عينات من الشريان الرئوي لمرضى ارتفاع الضغط الشرياني الرئوي (PAH) وثلاث عينات من الشريان الرئوي لمتبرعين أصحاء
مصدر النسيجأنسجة الشريان الرئوي خارج الجسم، والتي تعكس بشكل أساسي البيئة الخلوية لجدار الأوعية الرئوية وعملية إعادة تشكيل الأوعية الدموية
الغرض التحليلي الرئيسيتحديد التموضع حسب نوع الخلية، والتحول المظهري لخلايا العضلات الملساء، والتواصل بين الخلايا المناعية والخلايا التركيبية، والتحقق من الاتساق الآلي للجينات المرشحة

الجدول 1: معلومات أساسية لمجموعة بيانات التحقق من الخلية الواحدة GSE210248. يلخص الجدول رقم الوصول إلى مجموعة البيانات، ومنصة التسلسل، ومصدر النسيج، وتكوين العينة، والغرض التحليلي لتحليل التحقق من الشريان الرئوي في الخلية الواحدة.

8. التحقق من التعبير الجيني بواسطة qRT-PCR

تضمن التحقق باستخدام qRT-PCR عدد 20 عينة نسيج رئوي مستقلة بيولوجياً مصابة بـ PAH من مرضى يعانون من PH/PAH، و20 عينة نسيج رئوي ضابطة مستقلة بيولوجياً. تم استخلاص RNA الكلي باستخدام Total RNA Extraction Kit. وقُيم تركيز RNA ونقاوته باستخدام مقياس الطيف الضوئي (spectrophotometer)، كما تم تقييم سلامة RNA عن طريق الفصل الكهربائي لهلام الأغاروز. وتم تضمين عينات RNA التي تتراوح قيم A260/280 الخاصة بها بين 1.8 و2.1 والتي لم تظهر بها علامات تحلل مرئية فقط.

تم نسخ كميات متساوية من RNA عكسياً إلى DNA مكمل باستخدام Solarbio Universal RT-PCR Kit (AMV; رقم الكتالوج RP1200). أُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) لكل من CXCL10 وJUN وIFIH1 وMX1 وTLR7 باستخدام SYBR Green PCR Master Mix على نظام Real-Time PCR. تم تحليل كل عينة بيولوجية في ثلاث مكررات تقنية، جنباً إلى جنب مع ضوابط خالية من القالب وضوابط خالية من النسخ العكسي. استُخدم متوسط قيمة Ct للمكررات التقنية الثلاثة في التحليلات اللاحقة؛ ولم تُعامل المكررات التقنية كملاحظات مستقلة. استُخدمت بادئات تغطي الوصلات بين الإكسونات وتنتج قطع تضخيم تتراوح ما بين 80-200 bp (الجدول 2). تم التحقق من نوعية البادئات باستخدام NCBI Primer-BLAST وتحليل منحنى الانصهار22.

استُخدم جين β-actin (ACTB) كجين مرجعي داخلي لمعايرة مستويات تعبير الجينات المستهدفة. وحُسب التعبير النسبي باستخدام طريقة 2-ΔΔCt23. كما استُخدمت اختبارات Mann-Whitney U ثنائية الجانب لإجراء المقارنات بين المجموعات بناءً على توزيع البيانات، وطُبق تصحيح معدل الاكتشاف الخاطئ لـ Benjamini-Hochberg على الجينات الخمسة. وأُنشئت منحنيات ROC للجينات المنفردة مع فواصل ثقة DeLong بنسبة 95%، واختيرت نقاط القطع المثلى باستخدام مؤشر Youden. تم في البداية ضبط نموذج الانحدار اللوجستي المكون من خمسة جينات وتقييمه على نفس العينات البيولوجية البالغ عددها 40 عينة؛ وبناءً عليه، عُرِّف هذا التقدير على أنه الأداء الظاهري داخل العينة. ولتقييم احتمالية وجود فرط توافق، أُجريت 100 تكرار للتحقق المتقاطع خماسي الطيات الطبقي باستخدام نموذج انحدار لوجستي منتظم من نوع L2، ثم حُسب أداء ROC المجمع خارج الطيات.

جينرقم وصول RefSeqالبادئ الأمامي (5'′–3′)بادئ عكسي (5′–3′)حجم الناتج (زوج قاعدي)درجة حرارة الانصهار (Tm)°C)ممتد عبر الإكسونات
CXCL10NM_001565.4GTCAAGCCAT
AATTGTTC		ATAGTGCCAG
GGTAGAGT		14146.1نعم
يونNM_002228.4ACAAGTGGCA
GAGTCCCG		CGCCCAAGTT
CAACAACC		15254.5نعم
IFIH1NM_022168GCACAGAGCG
GTAGACCCT		GCCCTGAAGC
ACGAGATG		18254.7نعم
MX1NM_002462.5TTAGCCGTGG
TGATTTAGC		CAAGGTGGAG
CGATTCTG		15652.3نعم
مستقبل TLR7NM_016562.4ATTGCCCTCGT
TGTTATA		TTCCTGGAGTT
TGTTGAT		17948.1نعم
ACTBNM_001101.3CTCACCATGGAT
GATGATATCGC		AGGAATCCTTCT
GACCCATGC		19456.2نعم

الجدول 2: تسلسلات البادئات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل النسخي العكسي الكمي. يدرج الجدول الجينات المستهدفة، وأرقام تتبع RefSeq، وتسلسلات البادئات الأمامية والعكسية، وأحجام النواتج، ودرجات حرارة الانصهار، وحالة تغطية الإكسونات للبادئات المستخدمة في qRT-PCR.

9. فحص المركبات المرشحة والرسو الجزيئي

تم إرسال تواقيع الجينات الأساسية المرتفعة والمنخفضة التعبير إلى قاعدة بيانات Connectivity Map لتحديد الجزيئات الصغيرة المتوقع أن تعكس ملف التعبير الجيني المرتبط بفرط ضغط الدم الرئوي (PH)7. وقد تم ترتيب المرشحين وفقاً لدرجة Logit واحتمالية التنبؤ.

تم الحصول على البنية ثلاثية الأبعاد لـ BRD-K91900765/VX-745 من PubChem تحت معرف CID 303852524. وقد تم جمع المعلومات الصيدلانية المتعلقة بالمركب من قواعد بيانات الأدوية العامة، وحُسبت الواصفات البنيوية باستخدام DrugBank وSwissADME25,26. كما تم الحصول على بنيات البروتين من RCSB Protein Data Bank باستخدام معرفات PDB التالية: CXCL10، 1LV9؛ وJUN، 1JUN؛ وIFIH1، 3B6E؛ وMX1، 5GTM؛ وTLR7، 7CYN؛ وMAPK14/p38α، 1OUK27. أُجري الكشف عن التجويفات العمياء والرسو الجزيئي باستخدام CB-Dock2 v2.0 مع محرك تسجيل النقاط AutoDock Vina v1.2.028,29. رُفعت ملفات البروتين والرابط إلى CB-Dock2، وكُشفت التجويفات المرشحة تلقائياً، وأُجري الرسو ضمن الصناديق المحددة للتجويفات والتي أنشأها الخادم. وبالنسبة لكل بروتين، تم تسجيل معرف التجويف، ودرجة Vina، وحجم التجويف، ومركز صندوق الرسو، وأبعاد صندوق الرسو، وملف معقد البروتين-الرابط. تم اختيار الوضعية ذات درجة Vina الأكثر سلبية كأفضل تشكيل متوقع. أُدرج MAPK14/p38α كهدف صيدلاني معروف وبروتين رسو مرجعي إيجابي لـ VX-745. أما الرسو ضد CXCL10 وJUN وIFIH1 وMX1 وTLR7 فكان استكشافياً ولم يتم تفسيره كدليل على استهداف صيدلاني مباشر أو ارتباط أو تثبيط أو فعالية.

10. التحليل الإحصائي والتحكم في قابلية التكرار

أُجريت جميع التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج R ما لم يُذكر خلاف ذلك. واعتُبرت قيم P ثنائية الطرف التي كانت < 0.05 دالة إحصائياً. كما طُبق تصحيح الاختبارات المتعددة على تحليلات التعبير التفاضلي، والإثراء، والتحقق الخارجي، وتحليلات qRT-PCR كما هو محدد أعلاه. واستُخدم التحقق المتقاطع لتقييم استقرار نماذج التعلم الآلي ونماذج qRT-PCR المدمجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

المعالجة المسبقة لبيانات الترانسكريبتوم العامة وتحديد الجينات ذات التعبير التفاضلي

أدى دمج وتصحيح ComBat للمجموعات GSE22356 وGSE33463 وGSE48149 إلى تقليل الفروق المنهجية بين مجموعات البيانات. وأظهرت المخططات الصندوقية أن توزيعات التعبير للعينات أصبحت أكثر اتساقاً بعد التصحيح. كما أشار تحليل المكونات الرئيسية إلى أن العينات تجمعت بشكل أساسي وفقاً لمصدر مجموعة البيانات قبل التصحيح، ولكنها أصبحت أكثر تداخلاً بعد التصحيح، مما يشير إلى خفض فعال لتأثير الدفعة (ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم تطوير سير عمل متكامل وقابل للتكرار لتحديد المؤشرات الحيوية الجزيئية المرتبطة بـ PH/PAH والمركبات العلاجية المرشحة، وذلك من خلال الدمج بين بيانات النسخ العامة (transcriptomics)، وتحليل شبكة التعبير الجيني المشترك الموزون، والإثراء الوظيفي، وتحليل شبكة التفاعل بين البروتينات، وثلاث خوارزميات للتعلم الآلي، والتحقق الخارجي، وتفسير النسخ أحادي الخلية، وتأكيد تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي الكمي (qRT-PCR)، وفحص خريطة الاتصال (Connectivity Map)، والرسو الجزيئي. وقد تم تحديد CXCL10 وJUN وIFIH1 وMX1 وTLR7 باستمرار كجينات مي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة من قبل مشروع بناء مقاطعة هونان الابتكارية (رقم 2022JJ30465).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2× SYBR Green PCR MastermixBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.Catalog no. SR1110تضخيم PCR كمي في الوقت الحقيقي قائم على الصبغة والكشف عن الفلورة
AI21.msvmRFE.R و e1071Custom R script with the CRAN e1071 packageAI21.msvmRFE.R; e1071 v1.7-17آلة ناقلات الدعم-حذف الميزات العودي
أجاروزBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.Catalog no. A8201; CAS 9012-36-6تقييم سلامة RNA الكلي بواسطة الفصل الكهربائي لهلام الأجاروز
جهاز الفصل الكهربائي لهلام الأجاروزBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.Model DYCZ-24DNالتقييم الكهربائي لسلامة RNA
محرك تسجيل AutoDock VinaCenter for Computational Structural Biology, Scripps Researchv1.2.0; RRID: SCR_011958تسجيل وضعية البروتين والرابط ضمن سير عمل CB-Dock2
CB-Dock2Cao Laboratory, CB-Dock2 web serverv2.0; accessed July 2026الكشف عن التجويف الأعمى والرسو الجزيئي لـ VX-745 مع هياكل البروتين المختارة
CellChatCellChat R packagev2.1.2استنتاج وتصور التواصل بين الخلايا من مصفوفة التعبير أحادية الخلية
CellChatDB.humanDistributed with the CellChat R packageCellChatDB.human; Secreted Signaling subset; minimum cell threshold = 10قاعدة بيانات تفاعلات الرابط-المستقبل البشرية لـ CellChat
clusterProfilerBioconductor R packagev4.20.0; Bioconductor release 3.23تحليلات إثراء الوجود الجيني (Gene Ontology) وموسوعة كيوتو للجينات والجينومات
خريطة الاتصال (CMap/CLUE)Broad InstituteL1000/CLUE resource; RRID: SCR_016204; accessed July 2026التحليل الحسابي لإعادة توظيف الأدوية
بادئات قليلة النوكليوتيد مخصصةBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.Custom synthesized; primer sequences provided in Table 2تضخيم ACTB و CXCL10 و JUN و IFIH1 و MX1 و TLR7
cytoHubbaCytoscape App Storev0.1تصنيف الجينات المركزية بناءً على الدرجة في شبكة تفاعل البروتين-البروتين
CytoscapeCytoscape Consortiumv3.10.4; RRID: SCR_003032تصور وتحليل شبكة تفاعل البروتين-البروتين
DrugBankDrugBank Knowledgebasev6.0; RRID: SCR_002700تحديد هوية المركب وتنسيق المعلومات الفارماكولوجية
نظام توثيق الهلامBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.Model WO-9413Bتصور وتسجيل نتائج سلامة RNA في هلام الأجاروز
أطلس تعبير الجينات (GEO)National Center for Biotechnology InformationGSE22356, GSE33463, GSE48149, GSE117261, and GSE210248; RRID: SCR_005012استرجاع مجموعات بيانات الترانسكريبتوم الكلية وأحادية الخلية
GEOqueryBioconductor R packagev2.80.0; Bioconductor release 3.23التحميل والاستيراد البرمجي لبيانات التعبير والنمط الظاهري من GEO
glmnetCRAN R packagev5.0الانحدار اللوجستي باستخدام مشغل الاختيار والتقليص المطلق الأدنى والنمذجة اللوجستية المنتظمة
limmaBioconductor R packagev3.68.0; Bioconductor release 3.23; RRID: SCR_010943تحليل التعبير التفاضلي وإحصائيات بايز التجريبية
مقياس الطيف الضوئي NanoDropThermo Fisher ScientificNanoDrop ND-1000; software v3.8قياس تركيز RNA ونسب النقاء A260/280 و A260/230
NCBI Primer-BLASTNational Center for Biotechnology InformationWeb tool; RRID: SCR_003095; accessed July 2026التحقق من خصوصية البادئات
pROCCRAN R packagev1.19.0.1; RRID: SCR_024286تحليل خصائص تشغيل المستقبل، وفترات ثقة DeLong، ونقاط قطع مؤشر Youden
بنك بيانات البروتين (PDB)RCSB Protein Data BankCXCL10: 1LV9; JUN: 1JUN; IFIH1: 3B6E; MX1: 5GTM; TLR7: 7CYN; MAPK14/p38α: 1OUK; RRID: SCR_012820استرجاع هياكل البروتين المحددة تجريبياً للرسو الجزيئي
PubChemNational Center for Biotechnology InformationPubChem CID 3038525; RRID: SCR_004284استرجاع الهيكل ثلاثي الأبعاد والمعرفات الكيميائية لـ BRD-K91900765/VX-745
RR Foundation for Statistical Computingv4.6.1; RRID: SCR_001905الحوسبة الإحصائية، ومعالجة البيانات، والتعلم الآلي، والتصور
randomForestCRAN R packagev4.7-1.2اختيار الميزات باستخدام الغابة العشوائية وتصنيف أهمية المتغيرات
نظام PCR في الوقت الحقيقيStratagene, now Agilent TechnologiesMx3000P Real-Time PCR Systemتضخيم qRT-PCR، والتحصيل الفلوري، وتحليل منحنى الانصهار، وتصدير قيم Ct
SeuratCRAN R package; Satija Laboratoryv5.5.1; RRID: SCR_016341ضبط جودة تسلسل RNA أحادي الخلية، والتطبيع، وتقليل الأبعاد، والتجميع، والتوسيم
STRINGSTRING Consortiumv12.0; RRID: SCR_005223بناء شبكة تفاعل البروتين-البروتين
sva (ComBat)Bioconductor R packagev3.60.0; Bioconductor release 3.23تصحيح تأثيرات الدفعة بين مجموعات البيانات
SwissADMESwiss Institute of BioinformaticsWeb server; accessed July 2026الفحص المسبق لمشابهة الدواء، والخصائص الفيزيائية والكيميائية، و ADME
طقم استخلاص RNA الكليBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.Catalog no. R1200استخلاص وتنقية RNA الكلي من عينات أنسجة الرئة
طقم Universal RT-PCR (AMV)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.Catalog no. RP1200النسخ العكسي لـ RNA الكلي إلى DNA مكمل
WGCNACRAN R packagev1.74بناء شبكة التعبير الجيني المشترك الموزونة وتحليل العلاقة بين الوحدة والسمة

المراجع

  1. Simonneau G, et al. Haemodynamic definitions and updated clinical classification of pulmonary hypertension. Eur Respir J. 2019;53(1):1801913. doi: 10.1183/13993003.01913-2018.
  2. Rabinovitch M, Guignabert C, Humbert M, Nicolls MR. Inflammation and immunity in the pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. Circ Res. 2014;115(1):165–175.
  3. Humbert M, et al. 2022 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension. Eur Heart J. 2022;43(38):3618–3731.
  4. Galiè N, et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension. Eur Respir J. 2015;46(4):903–975.
  5. Soon E, et al. Elevated levels of inflammatory cytokines predict survival in idiopathic and familial pulmonary arterial hypertension. Circulation. 2010;122(9):920–927.
  6. George PM, et al. Evidence for the involvement of type I interferon in pulmonary arterial hypertension. Circ Res. 2014;114(4):677–688.
  7. Subramanian A, et al. A next-generation Connectivity Map: L1000 platform and the first 1,000,000 profiles. Cell. 2017;171(6):1437–1452.e17.
  8. Leek JT, et al. The sva package for removing batch effects and other unwanted variation in high-throughput experiments. Bioinformatics. 2012;28(6):882–883.
  9. Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43(7):e47. doi: 10.1093/nar/gkv007.
  10. Langfelder P, Horvath S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 2008;9:559. doi: 10.1186/1471-2105-9-559.
  11. Yu G, Wang LG, Han Y, He QY. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16(5):284–287.
  12. Kanehisa M, Goto S. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Nucleic Acids Res. 2000;28(1):27–30.
  13. Szklarczyk D, et al. The STRING database in protein–protein association networks and functional enrichment analyses for any sequenced genome of interest. Nucleic Acids Res. 2023;51(D1):D638–D646.
  14. Friedman J, Hastie T, Tibshirani R. Regularization paths for generalized linear models via coordinate descent. J Stat Softw. 2010;33(1):1–22.
  15. Guyon I, Weston J, Barnhill S, Vapnik V. Gene selection for cancer classification using support vector machines. Mach Learn. 2002;46:389–422.
  16. Breiman L. Random forests. Mach Learn. 2001;45(1):5–32.
  17. Robin X, et al. pROC: an open-source package for R and S+ to analyze and compare ROC curves. BMC Bioinformatics. 2011;12:77. doi: 10.1186/s12859-011-0077-8.
  18. Stearman RS, et al. Systems analysis of the human pulmonary arterial hypertension lung transcriptome. Am J Respir Cell Mol Biol. 2019;60(6):637–649.
  19. Crnkovic S, et al. Single-cell transcriptomics reveals skewed cellular communication and phenotypic shift in pulmonary artery remodeling. JCI Insight. 2022;7(20):e153471. doi: 10.1172/jci.insight.153471.
  20. Hao Y, et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 2021;184(13):3573–3587.e29.
  21. Jin S, et al. Inference and analysis of cell–cell communication using CellChat. Nat Commun. 2021;12(1):1088. doi: 10.1038/s41467-021-21246-9.
  22. Bustin SA, et al. MIQE 2.0: revision of the Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments guidelines. Clin Chem. 2025;71(6):634–651.
  23. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCt method. Methods. 2001;25(4):402–408.
  24. Kim S, et al. PubChem 2023 update. Nucleic Acids Res. 2023;51(D1):D1373–D1380.
  25. Knox C, et al. DrugBank 6.0: the DrugBank Knowledgebase for 2024. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D1265–D1275.
  26. Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissADME: a free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness, and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 2017;7:42717. doi: 10.1038/srep42717.
  27. Burley SK, et al. RCSB Protein Data Bank: powerful new tools for exploring 3D structures of biological macromolecules for basic and applied research and education. Nucleic Acids Res. 2021;49(D1):D437–D451. doi: 10.1093/nar/gkaa1038.
  28. Eberhardt J, Santos-Martins D, Tillack AF, Forli S. AutoDock Vina 1.2.0: new docking methods, expanded force field, and Python bindings. J Chem Inf Model. 2021;61(8):3891–3898. doi: 10.1021/acs.jcim.1c00203.
  29. Liu Y, et al. CB-Dock2: improved protein-ligand blind docking by integrating cavity detection, docking, and homologous template fitting. Nucleic Acids Res. 2022;50(W1):W159–W164. doi: 10.1093/nar/gkac394.
  30. Duffy JP, et al. The discovery of VX-745: a novel and selective p38α kinase inhibitor. ACS Med Chem Lett. 2011;2(10):758–763.
  31. Sheng Y, et al. Crocin inhibits neutrophil migration and activation to treat hypoxic pulmonary hypertension through targeting HCK. Phytomedicine. 2025;148:157334. doi: 10.1016/j.phymed.2025.157334.
  32. Cui H, et al. Leonurine ameliorates hypoxic pulmonary hypertension by inhibiting cross-talk between neutrophils and endothelial cells via SERPINB3 targeting. Int Immunopharmacol. 2026;176:116467. doi: 10.1016/j.intimp.2026.116467.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تحديد المؤشرات الحيويةالبيانات الترانسكريبتوميةالتعبير التفاضليالتعبير الجيني المشتركشبكة التفاعل البروتينيتسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخليةإعادة توظيف الأدويةتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.