يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

سير عمل سريع لنمذجة قصور ذاكرة التعرف الناجم عن الحرمان من النوم في الفئران باستخدام التعرف على الأشياء الجديدة والمؤشرات الحيوية للحصين

132 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/73557

⸱

سبتمبر 8, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Nanjing Drum Tower Hospital, Affiliated Hospital of Medical School, Nanjing University, 2Department of Neurology, Hefei Eighth People's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine, Bengbu First People's Hospital, 4Department of Pathogen Biology, School of Basic Medicine, Tongji Medical College and State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Severe Zoonotic Infectious Diseases, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه المقالة سير عمل سريعاً وقابلاً للتكرار لنمذجة قصور ذاكرة التعرف الناجم عن الحرمان من النوم في الفئران، وذلك من خلال الجمع بين الحرمان من النوم عن طريق المناولة اللطيفة، واختبار التعرف على الأشياء الجديدة، وتحليل المؤشرات الحيوية في الحصين لدى نفس الحيوانات عبر مسار زمني يمتد لـ 10 أيام، مع تسجيل منظم للتدخلات ومعايير محددة مسبقاً لضبط الجودة.

الملخص

يساهم النوم غير الكافي في التدهور المعرفي وقد يسرع من العمليات التنكسية العصبية. يقدم هذا المقال سير عمل سريعاً وقابلاً للتكرار لنمذجة قصور ذاكرة التعرف الناجم عن الحرمان من النوم في الفئران، مع ربط النتائج السلوكية بالتغيرات الجزيئية في الحصين. يستخدم البروتوكول نموذج الحرمان من النوم عن طريق المناولة اللطيفة لمدة 5 h، والذي يُطبق مباشرة بعد جلسة تعارف معيارية لمدة 10 min على التعرف على الأشياء الجديدة (NOR). يتم تقييم ذاكرة التعرف باستخدام اختبار NOR لمدة 5 min بعد فترة استبقاء محددة بدقة مدتها 5 h، يلي ذلك جمع فوري لأنسجة الحصين من الحيوانات نفسها لقياس السيتوكينات المحفزة للالتهابات، بما في ذلك interleukin-1 beta (IL-1β)، وinterleukin-6 (IL-6)، وtumor necrosis factor-alpha (TNF-α)، وعلامات الإجهاد التأكسدي، بما في ذلك superoxide dismutase (SOD)، وglutathione peroxidase (GPx)، وmalondialdehyde (MDA). إن التقدم المنهجي الرئيسي لا يكمن في التقنيات السلوكية أو الكيميائية الحيوية الفردية، والتي تعد راسخة بالفعل، بل في توحيدها التشغيلي كـ سير عمل مترابط واحد. يتطلب البروتوكول سجلاً منظماً وقابلاً للقياس لتدخلات المناولة اللطيفة، ويربط التدريب والحرمان بنقطة زمنية محددة في الساعة البيولوجية، ويحافظ على الروابط على مستوى الحيوان بين تسجيلات NOR وعينات الأنسجة، ويحدد مسبقاً معايير مراقبة الجودة والتحليل. تم تصميم هذا الإجراء لتقليل التقييد البدني والتمرين القسري، ويمكن إكماله ضمن نافذة تجريبية قصيرة، ويُقترح كسير عمل مرجعي مرشح يمكن للمختبرات الفردية استخدامه لتقييم تنفيذها الخاص للحرمان من النوم عن طريق المناولة اللطيفة، بانتظار التكرار المستقل.

المقدمة

يُعد النوم عملية فسيولوجية أساسية ضرورية لوظائف الدماغ، والتعلم، وترسيخ الذاكرة1. ويرتبط نقص النوم بالخلل المعرفي، واضطرابات المزاج، وتطور الأمراض التنكسية العصبية2. ويُستخدم الحرمان التجريبي من النوم (SD) في القوارض على نطاق واسع لبحث العواقب النيوروبيولوجية لفقدان النوم الحاد. ويُعد الحصين، وهو منطقة في الدماغ مركزية للذاكرة التقريرية والمكانية، عرضة بشكل خاص للحرمان من النوم3.

تتوفر عدة إجراءات لتحفيز فقدان النوم لدى القوارض. يمكن لطريقة المنصات المتعددة المعدلة أن تقلل بشكل فعال من نوم حركة العين السريعة، ولكنها قد تؤدي إلى إجهاد بدني وإنهاك كبيرين4. وفي المقابل، تحافظ طريقة التعامل اللطيف (GH) على اليقظة من خلال تحفيز حسي خفيف، مثل النقر على القفص، أو تحريك الفرشة، أو تقديم مواد تعشيش جديدة عند ظهور علامات النوم. إن تطبيق فترة وجيزة من التعامل اللطيف (GH) مباشرة بعد التعلم يمكن أن يتداخل مع ترسيخ الذاكرة المعتمد على الحصين، مع تجنب العديد من العوامل المربكة المرتبطة بنماذج الحرمان المطول5. ونظرًا لأن التدخلات في هذا البروتوكول يتم تحفيزها بواسطة وضعية الجسم وإشارات اليقظة السلوكية بدلاً من الكشف عن نوم حركة العين السريعة المؤكد بتخطيط كهربائية الدماغ (EEG)، فإن طريقة التعامل اللطيف (GH) كما هي منفذة هنا تشكل طريقة معتمدة للحرمان الكلي من النوم بدلاً من كونها تقنية خاصة بنوم حركة العين السريعة، وقد استُخدمت بهذا الشكل لعدة عقود6.

يعد اختبار التعرف على الأشياء الجديدة (NOR) مقايسة مستخدمة على نطاق واسع لقياس ذاكرة التعرف. وهو يعتمد على الميل الطبيعي للقوارض لاستكشاف شيء جديد أكثر من استكشاف شيء مألوف، دون الحاجة إلى مكافأة أو عقاب أو تدريب مكثف7,8. وقد ثبت أن الحرمان الحاد من النوم (SD) يؤدي إلى ضعف التمييز بين الأشياء الجديدة، مما يوفر قراءة سلوكية فعالة لتعطل تدعيم الذاكرة9. أما على المستوى الجزيئي، فيمكن أن يؤدي فقدان النوم إلى تحفيز الالتهاب العصبي في الحصين والإجهاد التأكسدي، بما في ذلك زيادة مستويات السيتوكينات المحفزة للالتهابات ونواتج بيروكسيد الدهون، بالتزامن مع انخفاض القدرة المضادة للأكسدة10,11.

لا تكمن التحديات في تطبيق هذا النموذج في مدى توفر عناصره الفردية، بل في غياب الاتساق التشغيلي عبر الدراسات المختلفة. فغالباً ما يتم الإبلاغ عن التعامل اللطيف دون وجود سجل منظم لشدة التدخل؛ وكثيراً ما يتم جمع النهايات السلوكية والجزيئية في مجموعات منفصلة؛ كما أن معايير مراقبة الجودة لسلوك الاستكشاف وتخطيط حجم العينة لا تكون صريحة دائماً. الهدف العام من هذا المقال هو تقديم سير عمل موحد لنمذجة قصور ذاكرة التعرف الناجم عن الحرمان من النوم، مع ربط النتائج السلوكية بالمقاييس الجزيئية للحصين في نفس الحيوانات. وتعالج هذه الطريقة فجوات القابلية للتكرار من خلال الجمع بين نافذة GH لمدة 5 h بعد التدريب، وسجل شدة التدخل، وجمع السلوك والأنسجة من نفس المجموعة، ومعايير تحليلية محددة مسبقاً في مسار عمل واحد يمتد لـ 10 أيام (الشكل 1). وقد تمت الإشارة سابقاً إلى غياب التوحيد في تنفيذ GH في أدبيات منهجية أبحاث النوم6.

figure-introduction-1
الشكل 1. تمثيل تخطيطي لسير العمل التجريبي. يمتد البروتوكول على مدار 10 أيام، تشمل التعامل مع الحيوانات والتأقلم، تليها يوم اختبار حاسم يدمج مرحلة تعود على اختبار التعرف على الأشياء الجديدة (NOR) لمدة 10 min، وحرمان من النوم لمدة 5 h، واختبار NOR لمدة 5 min، وجمع فوري لأنسجة الحصين من نفس الحيوانات لتحليل المؤشرات الحيوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات الحيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية وأخلاقيات حيوانات المختبر في AILIMO (شركة Zhejiang AILIMO Biotechnology Co., Ltd.) بناءً على طلب من مستشفى Nanjing Drum Tower (الباحث الرئيسي: Yuan Liu)، رقم الموافقة AP CODE: ALM202605070، المعتمدة في 7 مايو 2026 (صالحة لمدة 4 سنوات)، وفقاً للوائح المؤسسية والوطنية المعمول بها. استخدم فئران C57BL/6J ذكوراً بالغة (عمر 8-12 أسبوعاً) للبروتوكول الموضح أدناه.

1. التحضير وتعويد الحيوانات

  1. توضع فئران المنازل تحت ظروف مختبرية قياسية عند درجة حرارة 22°C ± 1°C ورطوبة تتراوح بين 50%–60% مع دورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة/12 ساعة (يتم تشغيل الأضواء في الساعة 07:00، والتي تُعرف بـ ZT0). ويتم توفير العلف القياسي للقوارض والماء بشكل حر (ad libitum).
  2. يتم التعامل مع كل فأر لمدة 3–5 دقائق يومياً لمدة 7 أيام متتالية على الأقل قبل الاختبار.
    ملاحظة: يقلل هذا الإجراء من الإجهاد الناجم عن التعامل مع الحيوان، والذي قد يؤثر سلباً على السلوك الاستكشافي.
  3. يتم تحضير حلبة اختبار التعرف على الأشياء الجديدة (NOR) مربعة ومعتمة بقياس 40 cm × 40 cm × 40 cm ذات جدران غير عاكسة. يُستخدم لون للحلبة يتناقض مع لون فراء الحيوانات.
  4. تُختار أشياء NOR تكون ثقيلة بما يكفي لمنع تحركها ومصنوعة من مادة غير مسامية. تُستخدم أشياء متميزة في الشكل والملمس مع بقائها متقاربة في الحجم الإجمالي.
    ملاحظة: يوضح الشكل 2 تكوين التدريب والاختبار.
  5. في اليومين 8 و9، تُنقل الفئران إلى غرفة الاختبار قبل ساعة واحدة من عملية التعود. يُوضع كل فأر في الحلبة الفارغة لمدة 10 دقائق، ثم يُعاد إلى قفصه الأصلي.
  6. يتم مسح الحلبة والأشياء باستخدام ethanol بتركيز 70% بين كل حيوان وآخر. يُترك ethanol ليجف في الهواء لمدة تتراوح بين 3–5 دقائق تقريباً تحت تهوية المختبر العادية قبل إدخال الحيوان التالي.
    تنبيه: ethanol مادة شديدة الاشتعال. تأكد من وجود تهوية كافية وأبعدها عن مصادر الاشتعال.

figure-protocol-1
الشكل 2. مخطط لجهاز التعرف على الأشياء الجديدة والتصميم التجريبي. خلال مرحلة التعود، ضع جسمين متطابقين (A و A′) في زاويتين متقابلتين من الساحة. وخلال مرحلة الاختبار بعد فترة استبقاء مدتها 5 h، استبدل أحد الأجسام المألوفة بجسم جديد (B). يتم موازنة وضع الجسم الجديد بين الجانبين الأيسر والأيمن عبر الحيوانات، بحيث يتلقى نصف الحيوانات تقريباً في كل مجموعة الجسم الجديد في كل موضع، وذلك لتقليل الانحياز المكاني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. التدريب على NOR (التعريف)

  1. في اليوم العاشر، ابدأ تدريب التعرف على الأشياء الجديدة (NOR) عند ZT1 (الساعة 08:00 وفقاً لجدول الإضاءة المذكور). حافظ على وقت البدء هذا عبر جميع المجموعات لتقليل التباين في الساعة البيولوجية.
  2. انقل الفئران إلى غرفة الاختبار قبل ساعة واحدة من بدء جلسة التدريب. ضع جسمين متطابقين (A و A′) في زاويتين متقابلتين من الساحة، على بُعد 10 cm تقريباً من الجدران.
  3. ثبّت الأجسام في الأرضية عند الضرورة.
  4. ضع الفأر في مركز الساحة بحيث يكون وجهه بعيداً عن الأجسام. اسمح للفأر بالاستكشاف بحرية لمدة 10 min.
  5. سجّل السلوك باستخدام نظام تتبع فيديو علوي. عرّف الاستكشاف النشط بأنه توجيه الأنف نحو الجسم على مسافة ≤2 cm، أو شم الجسم، أو لمسه بالأنف.
    ملاحظة: لا تحتسب الجلوس فوق الجسم أو تسلقه دون شم نشط كاستكشاف للجسم.
  6. سجل وقيم سلوك NOR باستخدام برنامج EthoVision XT الإصدار 17.5 مع كاميرا علوية Basler acA1300-60gm. قم بتكوين برنامج التتبع بمنطقة كشف لنقطة الأنف بمسافة ≤2 cm من كل جسم لتقييم الاستكشاف النشط، بما يتوافق مع المعايير المحددة في الخطوة 2.5.
  7. في نهاية جلسة التعارف التي تستغرق 10 min، أخرج الفأر من الساحة فوراً.
  8. نظف الساحة والأجسام جيداً باستخدام ethanol بتركيز 70% قبل إدخال الحيوان التالي.

3. الحرمان من النوم عن طريق المناولة اللطيفة

  1. قبل جلسة التدريب في اليوم 10، يتم تعيين رمز تعريف فريد لكل حيوان. يتم الحفاظ على رمز التعريف هذا طوال فترة تسجيل السلوك وجمع الأنسجة.
  2. يتم توزيع الحيوانات على مجموعتي SD وNSD بنسبة 1:1 باستخدام أرقام عشوائية يتم إنشاؤها بواسطة الكمبيوتر عبر دالة RAND في برنامج Excel.
  3. بعد التدريب على NOR مباشرةً، تُعاد فئران NSD إلى أقفاصها الأصلية وتُترك دون إزعاج لمدة 5 h. يتم الحفاظ على حيوانات SD وNSD تحت ظروف بيئية متطابقة وضمن نفس النافذة الزمنية للدورة اليوماوية.
  4. بعد التدريب على NOR مباشرةً، يتم البدء في عملية الحرمان من النوم بطريقة GH لفئران SD. يتم الحفاظ على حالة اليقظة لمدة 5 ساعات متتالية في القفص الأصلي.
  5. تتم مراقبة الحيوانات باستمرار. يتم التدخل عندما يتخذ الفأر وضعيات مرتبطة بالنوم، بما في ذلك الانطواء، أو إغلاق العينين، أو السكون التام.
  6. يتم تطبيق التحفيز تدريجيًا، بدءًا بالنقر اللطيف على القفص. وإذا لزم الأمر، يتم تحريك الفرشة الخفيفة، أو إدخال جسم جديد نظيف مثل أنبوب ورقي، أو لمس الحيوان برفق باستخدام فرشاة ناعمة.
  7. يجب تجنب التقييد البدني، أو إجبار الحيوان على الحركة، أو استخدام التحفيز المنفر أو المؤلم.
  8. يتم استكمال سجل التدخلات في الجدول 1 لكل قفص طوال فترة GH التي تستغرق 5 h. يتم تسجيل العدد التقريبي للتدخلات في الساعة، ونوع التدخل السائد، وأي انحرافات عن البروتوكول أو مخاوف تتعلق برفاهية الحيوان.
  9. يُستخدم نفس نموذج سجل التدخلات عبر جميع المجموعات.
    تنبيه: لا تستخدم التقييد البدني، أو التمارين القسرية، أو المحفزات المؤلمة؛ لأن هذه الإجراءات يمكن أن تؤثر بشكل مستقل على الذاكرة والإجهاد والنتائج الالتهابية.
معرف القفص/المجموعةعنوان 1H2H3H4H5نوع (أو أنواع) التدخل السائدملاحظة انحراف أو رفاهية
معرف السجلسجّل عدد H1سجل عدد H2سجل عدد H3سجّل عدد H4سجّل تعداد H5نقر / فرش فراش / جسم جديد / فرشاة ناعمةسجل في حال وجوده

الجدول 1: نموذج سجل تدخلات المناولة اللطيفة. سجل معرف القفص أو المجموعة، وعدد تدخلات المناولة اللطيفة خلال كل ساعة من فترة الحرمان من النوم التي تستمر 5 h (H1–H5)، وأنواع التدخلات السائدة، وأي انحرافات عن البروتوكول أو ملاحظات تتعلق بالرفاهية.

4. مرحلة اختبار التعرف على الأشياء الجديدة (NOR)

  1. ابدأ مرحلة اختبار التعرف على الأشياء الجديدة (NOR) بعد 5 h بالضبط من انتهاء التدريب على NOR، وذلك للحفاظ على فاصل زمني ثابت للاحتفاظ بالمعلومات مدته 5 h.
  2. ضع جسماً مألوفاً واحداً (A) وجسماً جديداً واحداً (B) في الساحة.
  3. قم بموازنة وضعية الجسم الجديد عبر الحيوانات عن طريق التناوب في وضعه بين الجهتين اليسرى واليمنى، بحيث يتلقى نصف الحيوانات تقريباً في كل مجموعة الجسم الجديد على اليسار والنصف الآخر على اليمين.
  4. ضع الفأر في مركز الساحة. اترك الفأر يستكشف بحرية لمدة 5 min.
  5. سجل الجلسة باستخدام نظام تتبع الفيديو العلوي نفسه المستخدم في مرحلة التعود. طبق تعريف الاستكشاف المحدد في الخطوة 2.5.
  6. نظف الساحة والأجسام باستخدام 70% ethanol بين كل حيوان والآخر.

5. جمع الأنسجة من نفس المجموعة وتشريح الحصين

  1. حدد الحيوان الذي خضع للاختبار السلوكي لجمع الأنسجة منه مباشرة بعد اختبار NOR.
  2. قم بقتل الحيوان عن طريق قطع الرأس دون تخدير، وفقاً لبروتوكول الحيوانات المعتمد، لتجنب التأثيرات المربكة المحتملة للعوامل المخدرة على المؤشرات الحيوية الالتهابية وتلك المعتمدة على الفسفرة. اجمع أنسجة الدماغ فور القتل الرحيم.
  3. احتفظ بالمعرف الفريد لتسجيل السلوك الخاص بالحيوان على جميع أنابيب العينات والسجلات لضمان بقاء كل عينة جزيئية مرتبطة مباشرة بنتيجة NOR لهذا الحيوان.
  4. استخرج الدماغ بسرعة وضعه على سطح تشريح معقم ومبرد بالثلج.
  5. افصل نصفي الكرة المخية بواسطة قطع في المنتصف السهمي. قم بتشريح الحصين من كل نصف كرة باستخدام ملاعق دقيقة (micro-spatulas) مبردة.
  6. قم بالتجميد السريع للحصينات المشرحة في النيتروجين السائل. خزن العينات في درجة حرارة −80°C حتى وقت التحليل.
    تنبيه: يمكن أن يسبب النيتروجين السائل إصابات برد شديدة. ارتدِ معدات الوقاية الشخصية المناسبة للتعامل مع المواد المبردة.

6. تقدير كمية المؤشرات الحيوية في الحصين

  1. أضف إلى منظم تحليل RIPA المبرد بالثلج خليطاً من مثبطات البروتياز والفوسفاتيز بتركيز عمل 1× (10 µL لكل mL من منظم التحليل من محلول مخزون بتركيز 100×).
  2. قم بتجانس أنسجة الحصين بنسبة أنسجة إلى منظم قدرها 1:10 (وزن/حجم) في منظم تحليل RIPA المبرد بالثلج والمضاف إليه المثبطات (10 µL من منظم التحليل لكل mg من الأنسجة). بالنسبة لكتلة أنسجة الحصين النموذجية التي تبلغ حوالي 25–30 mg لكل نصف كرة، استخدم حوالي 250–300 µL من منظم التحليل لكل نصف كرة، أو حوالي 500–600 µL لما يقرب من 50–60 mg من أنسجة الحصين في كلا الجانبين.
  3. قم بطرد مركزي متجانس RIPA بسرعة 14,000 × g لمدة 15 دقيقة عند 4°C واجمع السائل الطافي. استخدم السائل الطافي لتقدير كمية البروتين الكلي ومقايسات ELISA للسايتوكينات الثلاثة.
    ملاحظة: استخدم منظمات التجانس الخاصة بكل طقم لمقايسات SOD وGPx وMDA وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة للحفاظ على النشاط الإنزيمي.
  4. حضّر متجانساً منفصلاً للحصين بتركيز 10% (وزن/حجم) لقياسات SOD وGPx وMDA بنسبة أنسجة إلى منظم 1:9 باستخدام منظم التجانس الخاص بكل طقم بدلاً من منظم تحليل RIPA.
  5. حدد تركيز البروتين الكلي باستخدام مقايسة بروتين BCA.
  6. قدر كميات IL-1β وIL-6 وTNF-α وSOD وGPx وMDA باستخدام أطقم مقايسة ELISA أو المقايسات البيوكيميائية النوعية المذكورة في جدول المواد. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لكل مقايسة.
  7. حضّر المعايير في منظم المقايسة المقابل. خفف العينات بحيث تقع قيم الكثافة الضوئية ضمن الجزء الخطي من منحنى المعايير.
  8. خفف عينات الحصين الخاصة بمقايسات ELISA للسايتوكينات بنسبة 1:5 تقريباً باستخدام مخفف المقايسة المقابل. اضبط التخفيف ضمن نطاق 1:2–1:10 حسب الحاجة للحصول على قيم كثافة ضوئية ضمن الجزء الخطي من منحنى المعايير.
  9. استخدم السوائل الطافية من متجانسات الحصين بتركيز 10% (وزن/حجم) الموصوفة في الخطوة 6.4 مباشرة لمقايسات SOD وGPx وMDA. لا تطبق نظام تخفيف ELISA للسايتوكينات الموصوف في الخطوة 6.8 على هذه المقايسات الثلاثة.
  10. بالنسبة لمقايسات ELISA لكل من IL-1β وIL-6 وTNF-α، أضف 100 µL من المعيار أو عينة الحصين المخففة بشكل مناسب لكل بئر في مكررات، ثم حضنها عند 37°C لمدة 90 دقيقة. أضف 100 µL من الجسم المضاد للكشف الموغل بالبيوتين وحضنه عند 37°C لمدة 60 دقيقة.
  11. أضف 100 µL من مترافق HRP إلى كل بئر من آبار ELISA للسايتوكينات وحضنها عند 37°C لمدة 30 دقيقة. قم بإظهار اللون باستخدام ركيزة TMB عند 37°C في الظلام لمدة 15 دقيقة تقريباً.
  12. بالنسبة لمقايسة SOD، اخلط 20 µL من السائل الطافي لمتجانس الحصين مع 20 µL من محلول الإنزيم العامل و200 µL من محلول الركيزة. حضن الخليط عند 37°C لمدة 20 دقيقة وقس الامتصاصية عند 450 nm.
  13. بالنسبة لمقايسة GPx، ادمج 200 µL من السائل الطافي لمتجانس الحصين مع خليط التفاعل الذي يحتوي على GSH وحضنه عند 37°C لمدة 5 دقائق. أوقف التفاعل وقم بطرد الخليط مركزياً بسرعة 3500 × g لمدة 10 دقائق عند 4°C. أخضع السائل الطافي لتطوير اللون لمدة 15 دقيقة تقريباً وقس الامتصاصية عند 412 nm باستخدام 200 µL من السائل الطافي للتفاعل.
  14. بالنسبة لمقايسة MDA، اخلط 100 µL من السائل الطافي لمتجانس الحصين مع 1.0 mL من كاشف MDA العامل وحضنه في حمام مائي عند 95°C لمدة 40 دقيقة. برد الخليط ثم قم بطرده مركزياً. انقل حوالي 250 µL من السائل الطافي إلى صفيحة ميكروية وقس الامتصاصية عند 532 nm.
  15. بالنسبة لمقايسات ELISA للسايتوكينات، اقرأ الامتصاصية عند الطول الموجي المحدد في الطقم، وعادة ما يكون 450 nm، مع استخدام تصحيح الطول الموجي المرجعي عند توفره.
  16. أنشئ منحنى معايير باستخدام نموذج مناسب، مثل الانحدار اللوجستي رباعي المعلمات. قم بتنميط قياس كل مؤشر حيوي إلى محتوى البروتين الكلي.
  17. سجل تركيزات السايتوكينات بصيغة pg/mg بروتين، وأنشطة الإنزيمات المضادة للأكسدة بصيغة U/mg بروتين، وMDA بصيغة nmol/mg بروتين، بما يتوافق مع الطقم المختار.

7. تحليل البيانات ومراقبة الجودة

  1. استخرج وقت الاستكشاف الموجه نحو الجسم المألوف (Tfamiliar) والجسم الجديد (Tnovel) خلال مرحلة اختبار التعرف على الأجسام الجديدة (NOR).
  2. احسب مؤشر التمييز (DI) على النحو التالي:
    figure-protocol-2.
    ملاحظة: يشير مؤشر التمييز (DI) الذي يتجاوز 0.5 إلى تفضيل الجسم الجديد.
  3. استبعد الحيوان من تحليل اختبار NOR عندما يكون إجمالي وقت استكشاف الأجسام (Tnovel + Tfamiliar) أقل من 10 s. طبق هذا المعيار قبل التحليل على مستوى المجموعة ووثق جميع حالات الاستبعاد.
  4. قيم التوزيع الطبيعي لكل مجموعة باستخدام اختبار Shapiro–Wilk، وتجانس التباين باستخدام اختبار Levene. لكل مجموعة، قيم مؤشر التمييز (DI) مقابل مستوى الصدفة 0.5 باستخدام اختبار t لعينة واحدة ثنائي الذيل؛ وإذا لم يتحقق افتراض التوزيع الطبيعي، استخدم اختبار Wilcoxon للرتب الموقعة لعينة واحدة مقابل 0.5 بدلاً من ذلك.
  5. حدد قيمة ألفا عند 0.05 لجميع الاختبارات الإحصائية ما لم ينص على خلاف ذلك.
  6. قارن مؤشر التمييز (DI) بين مجموعتي NSD و SD المستقلتين باستخدام اختبار t غير مقترن ثنائي الذيل عند تحقق افتراضات التوزيع الطبيعي وتجانس التباين. واستخدم اختبار Mann–Whitney U في الحالات الأخرى.
  7. حلل وقت استكشاف الأجسام المألوفة مقابل الجديدة باستخدام تحليل التباين للقياسات المتكررة ثنائي الاتجاه (two-way repeated-measures ANOVA)، مع اعتبار المجموعة ونوع الجسم كعوامل. أجرِ مقارنات زوجية لاحقة (post hoc) مصححة بطريقة Sidak، ووثق فترات الثقة 95% بجانب جميع تقديرات مقارنة المجموعات.
  8. قارن كل مؤشر حيوي في الحصين بين مجموعتي NSD و SD المستقلتين باستخدام اختبار t غير مقترن ثنائي الذيل عند تحقق افتراضات التوزيع الطبيعي وتجانس التباين. واستخدم اختبار Mann–Whitney U في الحالات الأخرى.
  9. عند تقييم مؤشرات حيوية متعددة من نفس المجموعة، تحكم في معدل الاكتشافات الكاذبة عبر لوحة المؤشرات الحيوية باستخدام إجراء Benjamini–Hochberg. وثق قيم p الاسمية والمصححة وفقاً لمعدل الاكتشافات الكاذبة (FDR).
  10. أجرِ تحليل القوة المسبق (a priori power analysis) باستخدام برنامج G*Power الإصدار 3.1 لمقارنة عينات مستقلة ثنائية الجانب، مع اعتبار مؤشر تمييز NOR هو النتيجة الأساسية. استند في التأثير المتوقع إلى الدراسات المنشورة سابقاً التي أظهرت ضعفاً قوياً في تفضيل الأجسام الجديدة بعد الحرمان من النوم عقب التعلم.
  11. أجرِ تحليل القوة المسبق باستخدام حجم تأثير معياري لـ Cohen’s d = 1.35، وقيمة ألفا ثنائية الجانب 0.05، وقوة 80%، ونسبة تخصيص 1:1. تعطي هذه المعلمات حجم عينة أدنى محسوباً قدره 10 حيوانات لكل مجموعة.
    ملاحظة: تم تقدير حجم التأثير من بيانات التعرف على الأجسام المنشورة سابقاً9. حيث أفاد Palchykova وآخرون بوجود تأثير مجموعة معنوي على مدة استكشاف الجسم الجديد خلال مرحلة الاختبار (F(1,16) = 8.26, p < 0.007) للفئران التي حُرمت من النوم فوراً بعد التدريب مقارنة بمجموعات ضابطة متطابقة زمنياً (n = 9 لكل مجموعة)، وهو ما يتوافق مع Cohen’s d ≈ 1.36. وبناءً على ذلك، تم اعتماد حجم تأثير معياري d = 1.35 لتحليل القوة المسبق.
  12. زد حجم العينة المخطط له بنسبة 20% ليصل إلى 12 حيواناً لكل مجموعة (24 حيواناً في المجموع) للسماح باستبعادات سلوكية أو تقنية محددة مسبقاً. حدد مسبقاً معايير الاستبعاد لتشمل: إجمالي استكشاف الأجسام <10 s خلال اختبار NOR، والاستبعادات المتعلقة بالرفق بالحيوان، وتسجيلات الفيديو غير القابلة للاستخدام، والفشل التقني في فحوصات الأنسجة/العينات.
  13. لا تستبعد الحيوانات بناءً على اتجاه أو حجم تأثير العلاج الملحوظ.
  14. أجرِ التحليلات الإحصائية باستخدام لغة Python الإصدار 3.12، ومكتبة SciPy الإصدار 1.17 لاختبار الفرضيات وحسابات حجم التأثير، ومكتبة statsmodels الإصدار 0.14 لتصحيح معدل الاكتشافات الكاذبة بطريقة Benjamini–Hochberg.
  15. عند استخدام هذا البروتوكول لإنشاء مجموعة بيانات رسمية، وثق أحجام التأثير (على سبيل المثال، Cohen's d لمقارنات المجموعات) بجانب قيم p لجميع الاختبارات الإحصائية المحددة في الخطوات 7.4–7.9.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يجب أن يؤدي التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول إلى نمط نتائج سلوكي وجزيئي متسق دون الحاجة إلى تفسير أي قراءة منفردة بمعزل عن غيرها. تم توضيح التسلسل التجريبي الكامل في الشكل 1، بينما يظهر جهاز اختبار التعرف على الأشياء الجديدة (NOR) والتصميم التجريبي في الشكل 2. في مجموعة NSD، يجب أن تظهر الفئران تفضيلاً واضحاً للجسم الجديد، وهو ما ينعكس في مؤشر تمييز (DI) أعلى من مستوى الصدفة البالغ 0.5. أما الفئران التي تعرضت لبروتوكول GH لمدة 5 h بعد التدريب، فينبغي أن تظهر تفضيل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر هذا المقال إطار عمل سريعاً وقابلاً للتكرار لدراسة قصور ذاكرة التعرف والتغيرات الجزيئية في الحصين الناتجة عن الحرمان الحاد من النوم. ومن خلال تطبيق 5 h من المناولة اللطيفة مباشرة بعد مرحلة تعلم معيارية مدتها 10 min، تستهدف هذه العملية نافذة دمج محددة بعد التعلم، وهي مصممة لتقليل العبء الجسدي المرتبط بنماذج الحرمان الممتدة أو الإجراءات القائمة على الحركة القسرية4,5. ومع ذلك، لا يتضمن هذا البحث قياسات مباشرة لهرمونات التوتر لتأكيد انخفاض الاستجابة للإجهاد الفسي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عن عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل صندوق تنمية الشباب بمستشفى برج الطبل في نانجينغ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (منحة رقم 82502706)، وبرنامج الأبحاث الأساسية في جيانغسو (منحة رقم BK20250258). تم استخدام أدوات مدعومة بالذكاء الاصطناعي أثناء إعداد ومراجعة المخطوطة، بما في ذلك صياغة النصوص وتحسينها وتوليد الأشكال التخطيطية وتحسينها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
إيثانول بتركيز 70%أي مورديرجى تقديم النص المراد ترجمته.تنظيف ساحة واجسام اختبار التعرف على الأشياء الجديدة (NOR)
فئران ذكر بالغة من سلالة C57BL/6J (8–(١٢ أسبوعاً)شركة Zhejiang AILIMO Biotechnology المحدودةيرجى تقديم النص المصدر المراد ترجمته.الحيوانات التجريبية
طقم مقايسة BCA للبروتينThermo Fisher Scientific (Pierce)23225تقدير البروتين الكلي ومعايرته
برمجيات تحليل السلوكNoldus Information Technology B.V.EthoVision XT الإصدار 17.5تسجيل وتحليل استكشاف التعرف على الأشياء الجديدة (NOR)
جهاز طرد مركزي قادر على الوصول إلى 14,000 دورة في الدقيقة × جـ عند 4 °CEppendorfجهاز طرد مركزي 5424 R؛ رقم الكتالوج 5404000610تصفية متجانسات الحصين
تنظيف أنابيب الورقأي موردلم يتم توفير نص للترجمة. يرجى تقديم النص المصدر باللغة الإنجليزية للبدء في عملية الترجمة العلمية.تدخل المناولة اللطيفة
معدات الوقاية الشخصية المخصصة للتبريد العميقأي موردبما أنه لا يوجد نص مصدر متاح للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته من الإنجليزية إلى العربية وفقاً للمعايير المهنية المحددة.التعامل الآمن مع النيتروجين السائل
طقم مقايسة جلوتاثيون بيروكسيدازAbcamab102530تحديد كمية GPx
جهاز تجانس أنسجة الحصينIKA-Werke GmbH & شركة توصية بسيطةT 10 basic ULTRA-TURRAX؛ رقم الكتالوج 0003737000تجانس أنسجة الحصين في محلول التحلل الماص
النيتروجين السائلأي موردنظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته من الإنجليزية إلى العربية، وسأقوم بمعالجته وفقًا للمعايير المهنية والأكاديمية المحددة لـ JoVE.التجميد السريع للحصينات المستأصلة
طقم تحليل MDASigma-AldrichMAK085تقدير كمية مالون ديالدهيد (MDA)
قارئ الأطباق الدقيقةAgilent Technologies / BioTekمقياس الطيف الضوئي للأطباق الدقيقة BioTek Epoch 2قياس الامتصاصية عند الأطوال الموجية المحددة في طقم الاختبار
ملاعق ميكرويةأي موردغير متوفرتشريح الحصين؛ استُخدم مبرداً
إنترلوكين-1 للفئران (Mouse IL-1)β طقم مقايسة الممتز المقياس المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)R&أنظمة دي (D Systems)MLB00Cإنترلوكين-1 (IL-1)β التقدير الكمي
طقم مقايسة الممتز المجهري المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لإنترلوكين-6 (IL-6) للفئرانR&دي سيستمز (D Systems)M6000Bتقدير كمية IL-6
عامل نخر الورم في الفئران (Mouse TNF-α)α طقم مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)R&أنظمة DMTA00BTNF-αα التقدير الكمي
مجموعات الأجسام A/A′ و Bأي موردنظرًا لعدم وجود نص مصدر، يرجى تزويدي بالمحتوى الذي ترغب في ترجمته من اللغة الإنجليزية إلى اللغة العربية، وسأقوم بترجمته وفقًا للمعايير المهنية والأكاديمية المحددة.مراحل التعرف والاختبار لـ NOR
ساحة التعرف على الأشياء الجديدة (NOR) المعتمة (40 سم × ٤٠ سم × ٤٠ سم)أي موردلا ينطبقالاختبار السلوكي
نظام تسجيل فيديو علويBasler AGacA1300-60gmتسجيل فيديو لجلسات التعرف واختبار التعرف على الأشياء الجديدة (NOR)
مزيج مثبطات البروتياز والفوسفاتازThermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)78440أضيف إلى محلول التحلل عند ١× التركيز التشغيلي (10 µL/mL من أصل 100× محلول مخزون
محلول ريبا المنظم للتحلل (RIPA Lysis Buffer)Thermo Fisher Scientific89900تجنيس أنسجة الحصين
أنابيب عينات مناسبة للتخزين بالتجميد العميقThermo Fisher Scientific (Nunc)أنابيب تجميد Nunc CryoTube، 1.8 مل؛ رقم الكتالوج 375418الحفاظ على معرفات العينات الخاصة بكل حيوان وتخزين أنسجة الحصين المُشرحة
فرشاة ناعمةأي موردلا ينطبقتدخل المناولة اللطيفة
طقم تحليل سوبر أكسيد ديسميوتيز (SOD)Sigma-Aldrich19160تقدير كمية سوبر أكسيد ديسميوتاز (SOD)
برمجيات التحليل الإحصائي وتحليل القوةG*Power؛ مؤسسة برمجيات بايثون (Python Software Foundation)G*Power الإصدار 3.1؛ Python الإصدار 3.12 (SciPy 1.17؛ statsmodels 0.14)تحليل القوة المسبق والتحليلات الإحصائية الموضحة في القسم 7 من البروتوكول
علف القوارض القياسيشركة جيانغسو شيتونغ للهندسة الحيوية الصيدلانية المحدودة (Jiangsu Xietong Pharmaceutical Bio-engineering Co., Ltd.)نظام غذائي للحفاظ على الفئران/الجرذان المشععة؛ XTI01WC-010تغذية الحيوانات مخصصة (بشكل حر)
−80 °C مجمدHaier BiomedicalDW-86L626التخزين طويل الأمد لأنسجة الحصين المجمدة بالتجميد السريع

المراجع

  1. Walker MP, Stickgold R. Sleep, memory, and plasticity. Annual Review of Psychology. 2006;57:139-166.
  2. Musiek ES, Holtzman DM. Mechanisms linking circadian clocks, sleep, and neurodegeneration. Science. 2016;354(6315):1004-1008.
  3. Havekes R, Abel T. The tired hippocampus: the molecular impact of sleep deprivation on learning and memory. Current Opinion in Neurobiology. 2017;44:33-39.
  4. Machado RB, Hipólide DC, Benedito-Silva AA, Tufik S. Sleep deprivation induced by the modified multiple platform technique: quantification of sleep loss and recovery. Brain Research. 2004;1004(1-2):45-51.
  5. Hagewoud R, et al. Sleep deprivation impairs spatial working memory and reduces clearance of hippocampal β-amyloid in rats. Neurobiology of Aging. 2013;34(1):22-30.
  6. Fenzl T, et al. Fully automated sleep deprivation in mice as a tool in sleep research. J Neurosci Methods. 2007;166(2):229-35.
  7. Ennaceur A, Delacour J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behavioural Brain Research. 1988;31(1):47-59.
  8. Leger M, et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 2013;8(12):2531-2537.
  9. Palchykova S, et al. Sleep deprivation impairs object recognition in mice. Neurobiology of Learning and Memory. 2006;85(3):263-271.
  10. Wadhwa M, et al. Sleep deprivation induces spatial memory impairment by altered hippocampus neuroinflammation and microglia activation in rats. Journal of Neuroimmunology. 2011;238(1-2):14-23.
  11. Silva RH, et al. Role of hippocampal oxidative stress in memory deficits induced by sleep deprivation in mice. Neuropharmacology. 2016;104:1-8.
  12. Wang Y, et al. Ellagic acid ameliorates sleep deprivation-induced cognitive impairment and neuroinflammation in mice. Aging. 2020;12(10):10327-10340.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

نموذج فأريالمناولة اللطيفةالسيتوكينات المحفزة للالتهابمؤشرات الإجهاد التأكسديإنترلوكين-1 بيتاعامل نخر الورم
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.