يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بروتوكول مُحسَّن لتوليد العضويات الوعائية من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات

231 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/73561

⸱

سبتمبر 3, 2026

 ,  , 
1Center for Stem Cell and Translational Medicine, School of Life Science and Medical Engineering, Anhui University

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هذا البروتوكول طريقة لإنتاج عضوانيات وعائية باستخدام خلايا جذعية بشرية مستحثة متعددة القدرات.

الملخص

برزت العضوانيات الوعائية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) كنماذج ثلاثية الأبعاد قوية لدراسة التطور الوعائي، وآليات المرض، والاستجابات الدوائية. تتيح البروتوكولات الحالية للعضوانيات الوعائية توليد شبكات من الخلايا البطانية والخلايا الحولية ذاتية التنظيم؛ ومع ذلك، فإن التباين بين الدفعات، وعدم اتساق تكوين العضوانيات، والتغطية غير الكافية للخلايا الحولية يمكن أن يؤثر سلباً على قابلية التكرار وقابلية التوسع. تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً مُحسناً لتوليد عضوانيات وعائية من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) مع تحسين قابلية التكرار والاتساق الهيكلي. تشمل التعديلات الرئيسية تحسين ظروف تكوين الأجسام الجنينية، وتحسين تركيزات عوامل النمو وتوقيتها أثناء تحريض الأديم المتوسط والتخصيص الوعائي، وتحسين ظروف الزراعة ثلاثية الأبعاد التي تعزز تجنيد الخلايا الحولية والتفاعلات بين الخلايا البطانية والحولية. تظهر العضوانيات المُحسنة شبكات بطانية موجبة لـ CD31 عالية التفرع ومغلفة باستمرار بخلايا حولية موجبة لـ PDGFR-β، مع تقليل ملحوظ في التباين بين الدفعات مقارنة بالبروتوكول الأصلي. يتم توفير إجراءات مفصلة خطوة بخطوة لتوليد العضوانيات، وتوصيف الفلورة المناعية للحمل الكامل، وتقييم مراقبة الجودة. تتيح هذه الطريقة المُحسنة إنتاجاً قابلاً للتوسع لعضوانيات وعائية عالية الجودة مناسبة لدراسة التفاعلات بين الخلايا الوعائية، ونمذجة الأمراض، وفحص المركبات، مما يقلل من العوائق التقنية للمختبرات التي تسعى لاعتماد هذا النظام النموذجي.

المقدمة

برزت العضويات ثلاثية الأبعاد (3D organoids) كأدوات قوية لنمذجة تطور الأعضاء البشرية والأمراض in vitro، حيث توفر محاكاة حيوية هيكلية وصلة فيزيولوجية مرضية فائقة مقارنة بنماذج المزارع الخلوية التقليدية ثنائية الأبعاد1,2. وفي السنوات الأخيرة، تم بنجاح إنشاء عضويات مشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) لأنواع متعددة من الأنسجة، بما في ذلك الأمعاء3، والدماغ4,5، والكلى6، والكبد7,8، والشبكية9. ومع ذلك، فإن التحدي الرئيسي في الدراسات القائمة على العضويات هو عدم كفاية التوعية الدموية أثناء الزراعة طويلة الأمد، مما قد يؤدي إلى نقص الأكسجة والنخر، وبالتالي إعاقة توسع العضويات وتمايزها10,11. ولمعالجة هذا القصور، تم تقديم استراتيجيات زراعة مشتركة متنوعة، بما في ذلك دمج الخلايا البطانية أو الخلايا الجذعية الميزنكيمية لتعزيز تكوين الشبكة الوعائية12,13. بيد أن المزارع التقليدية ثنائية الأبعاد والنماذج الحيوانية لا تحاكي بيولوجيا الأوعية الدموية البشرية بشكل كامل، بينما تفرض مناهج الزراعة المشتركة تعقيداً تجريبياً إضافياً14. لذا، فإن العضويات الوعائية القادرة على التوعية الذاتية توفر بديلاً واعداً ذا صلة بالبشر15.

يتضمن تكوين الشبكة الوعائية كلاً من تكوين الأوعية الدموية (vasculogenesis) وتكون الأوعية الدموية (angiogenesis)، واللذين يتم تنسيقهما من خلال التفاعلات بين الخلايا البطانية والخلايا الجدارية، مثل الخلايا الحولية وخلايا العضلات الملساء الوعائية، ويتم تنظيمهما بدقة بواسطة جزيئات إشارات متعددة، بما في ذلك VEGF (عامل نمو البطانة الوعائية)، وTGF-β (عامل النمو التحويلي-β)، وPDGF (عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية)، والأنغيوپويتينات16. في عام 2019، وضع Wimmer وزملاؤه طريقة لإنتاج عضويات أوعية دموية ثلاثية الأبعاد ذاتية التجميع مباشرة من hPSCs17,18. يقوم هذا النظام بتوليد الخلايا البطانية والخلايا الحولية في وقت واحد، مما ينتج عنه شبكات وعائية دقيقة مع تكوين تجويف وتغطية بالغشاء القاعدي. وبناءً على هذه المنصة، استُخدمت العضويات الوعائية لنمذجة اعتلال الأوعية الدموية السكري تحت تحفيز الجلوكوز العالي والسيتوكينات المحرضة للالتهابات (TNF-α وIL-6)؛ حيث تعيد هذه العضويات محاكاة تسمك الغشاء القاعدي، وهو سمة مميزة لاعتلال الأوعية الدموية الدقيقة السكري17. بالإضافة إلى ذلك، استُخدم هذا النموذج لدراسة الأمراض الوعائية الوراثية وكمنصة لفحص السمية الوعائية19. وفي الآونة الأخيرة، سعت العديد من الدراسات الموجهة نحو المنهجية إلى تحسين إنتاج العضويات الوعائية. على سبيل المثال، حددت التطورات في تسلسل RNA أحادي الخلية عوامل تنظيمية رئيسية، مثل MECOM وLEF1، مما وفر إطاراً جزيئياً لتوصيف وتحسين تكوين العضويات الوعائية البشرية. بالإضافة إلى ذلك، قدم Xu وآخرون الآبار الدقيقة (microwells) لتسهيل تكوين الأجسام الجنينية المتجانسة ودمجوا مزيج CEPT لتحسين حيوية الخلايا، مما أدى إلى تقليل التباين بين الدفعات الإنتاجية بشكل فعال20.

لتحسين التجانس وقابلية التكرار وإنتاجية توليد العضوانيات الوعائية، تم تحسين البروتوكول الأصلي الذي وصفه Wimmer et al.17,18 بشكل منهجي لمعالجة العديد من القيود الرئيسية. أولاً، يعتمد البروتوكول الأصلي على التجمع الطبيعي في أطباق منخفضة الالتصاق لتكوين الأجسام المضغية، مما قد يؤدي إلى تباين كبير بين الدفعات في حجم التجمعات، وبالتالي تفاوت في كفاءة التمايز. وفي البروتوكول المُحسَّن، يتم دمج كحول البولي فينيل (PVA) مع الرج المداري أثناء تكوين التجمعات لتعزيز التجمع الخلوي الموحد وتحسين الاتساق في حجم الأجسام المضغية. ثانياً، يستخدم البروتوكول الأصلي استبدالاً كاملاً للوسط خلال مرحلة تكوين الشبكة الوعائية، وهو ما قد يسبب تقلبات كبيرة في تركيزات عوامل النمو ويؤثر سلباً على استمرارية التبرعم الوعائي وتجنيد الخلايا الحولية. وفي المقابل، يحتفظ البروتوكول المُحسَّن بثلث الوسط المُكيَّف خلال كل عملية تغيير للوسط للحفاظ على عوامل تحفيز تكوين الأوعية الدموية الداخلية وتثبيت بيئة الزرع. ثالثاً، يتطلب البروتوكول الأصلي عمليات نقل متعددة للأطباق أثناء عزل العضوانيات وإنضاجها، مما يزيد من متطلبات المناولة ومخاطر فقدان العضوانيات. ويتجاوز البروتوكول المُحسَّن هذه الخطوات عن طريق نقل العضوانيات المعزولة بشكل فردي إلى آبار أطباق 96 بئراً منخفضة الالتصاق، مما يبسط الإجراء ويزيد من الإنتاجية. وبشكل جماعي، يوفر هذا البروتوكول المُحسَّن إجراءات تفصيلية خطوة بخطوة ونقاط تفتيش حاسمة لمراقبة الجودة لتقليل الحاجز التقني لاعتماد نظام النموذج هذا وتسهيل التطبيق الأوسع للعضوانيات الوعائية في دراسات التطور الوعائي، وآليات المرض، وفحص الأدوية عالي الإنتاجية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على استخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (hPSCs) في هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية الحيوية بجامعة آنهوي (BECAHU_2026-010).

1. صيانة الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات

ملاحظة: يتم الحفاظ على الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) في ظروف خالية من الخلايا المغذية. تُجرى جميع الإجراءات داخل كابينة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية (Class II) باستخدام تقنية التعقيم.

  1. تحضير أطباق الزرع المطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي
    1. أخرج قارورة من مصفوفة الغشاء القاعدي من درجة حرارة −20 °C وأذبها عند 4 °C طوال الليل لمدة تتراوح بين 12 و16 ساعة تقريبًا. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة.
    2. امزج مصفوفة الغشاء القاعدي المذابة جيدًا تحت ظروف معقمة وقسمها إلى حصص للاستخدام لمرة واحدة (على سبيل المثال، 1 mL لكل أنبوب). احفظ الحصص عند −20 °C لمدة تصل إلى سنتين.
      ملاحظة: حافظ على برودة مصفوفة الغشاء القاعدي والماصات والرؤوس والأنابيب أثناء التعامل معها لمنع التصلب المبكر. تجنب إدخال فقاعات الهواء.
    3. أذب حصة مصفوفة الغشاء القاعدي المطلوبة على الثلج. خفف مصفوفة الغشاء القاعدي بنسبة 1:200 في وسط DMEM مبرد مسبقًا (5 µL من مصفوفة الغشاء القاعدي لكل 1 mL من وسط DMEM؛ التركيز النهائي تقريبًا 5 µg/mL).
    4. امزج المحلول برفق باستخدام الماصة حتى تختفي جميع الجزيئات المرئية.
    5. أضف 0.5 mL من مصفوفة الغشاء القاعدي المخففة إلى كل بئر من طبق مكون من 12 بئرًا. قم بإمالة وتدوير الطبق برفق لتغطية كامل السطح السفلي.
    6. حضن الطبق المطلي عند 37 °C في حاضنة تحتوي على 5% CO₂ لمدة ساعتين على الأقل أو عند 4 °C طوال الليل.
      ملاحظة: احفظ الأطباق المطلية المغلقة عند 4 °C لمدة تتراوح من أسبوع إلى أسبوعين. قم بموازنة درجة حرارة الطبق مع درجة حرارة الغرفة واشفط محلول الطلاء مباشرة قبل الاستخدام.
  2. إذابة الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (hiPSCs)
    1. أخرج قارورة مجمّدة من hiPSCs من النيتروجين السائل وضعها فورًا في حمام مائي عند 37 °C. رج القارورة برفق وأخرجها في غضون دقيقة واحدة، عندما لا يتبقى سوى بضع بلورات ثلجية صغيرة.
      ملاحظة: تجنب التعرض المطول لـ dimethyl sulfoxide (DMSO) عند 37 °C والإذابة غير الكاملة، حيث يمكن لكليهما أن يقلل من حيوية الخلايا.
    2. عقم الجزء الخارجي من القارورة المجمّدة بإيثانول بتركيز 70% وافتحها داخل كابينة السلامة البيولوجية.
    3. انقل معلق الخلايا ببطء على شكل قطرات إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL يحتوي على 3 mL من وسط صيانة hPSC المحدد كيميائيًا والمدفأ مسبقًا، أو وسط صيانة مكافئ محدد كيميائيًا. امزج برفق أثناء النقل لتخفيف DMSO تدريجيًا وتقليل الإجهاد الاسموزي.
    4. قم بЦентrifuge الخلايا عند 300 × g لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (22–24 °C) باستخدام دوار ذي دلاء متأرجحة.
    5. اشفط السائل الطافي بعناية دون تعكير كتلة الخلايا. أعد تعليق الكتلة برفق في 1 mL من وسط صيانة hPSC المحدد كيميائيًا والمدفأ مسبقًا.
      ملاحظة: استخدم ماصة P1000 وقم بالماصة برفق من 2 إلى 3 مرات لتقليل القص الميكانيكي وتكون الفقاعات.
  3. زراعة واستنبات hiPSCs
    1. أخرج الطبق المكون من 12 بئرًا والمطلي مسبقًا من الحاضنة واشفط محلول الطلاء. لا تغسل الآبار.
    2. ازرع ما يقرب من 1 × 105–2 × 105 خلية حية في كل بئر لاستعادة النشاط الروتينية بعد الإذابة. اضبط الكثافة وفقًا لسلالة hiPSC والمتطلبات التجريبية.
    3. وزع معلق الخلايا ببطء على طول جدار كل بئر دون ملامسة السطح المطلي برأس الماصة.
    4. أضف Y-27632 بتركيز نهائي قدره 5 µM لتعزيز بقاء الخلايا والتصاقها بعد الإذابة.
      ملاحظة: استخدم Y-27632 فقط في وسط الزراعة الأولي. استبدله بوسط صيانة hPSC محدد كيميائيًا وخالٍ من Y-27632 في اليوم التالي.
    5. حضن الخلايا عند 37 °C مع 5% CO₂ ورطوبة مشبعة.
    6. افحص التصاق الخلايا وشكلها بعد حوالي 16–24 ساعة. اشفط الوسط واستبدله بوسط صيانة hPSC محدد كيميائيًا وطازج ومدفأ مسبقًا وخالٍ من Y-27632.
    7. استبدل الوسط يوميًا أو كل يومين حتى تصل الخلايا إلى حوالي 70%–80% من درجة التلاقي (confluency) من أجل تمرير الخلايا أو تمايزها.
      ملاحظة: افحص المزارع يوميًا. استخدم المستعمرات ذات الحدود المدمجة والمحددة جيدًا، والنسبة النووية السيتوبلازمية العالية، والحد الأدنى من التمايز التلقائي.

2. توليد وتمايز تجمعات الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (hiPSC)

ملاحظة: يتم الحفاظ على خلايا hiPSCs في ظروف خالية من الخلايا المغذية في وسط صيانة hPSC محدد كيميائياً على أطباق مغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي. يتم تمرير الخلايا كل 4-5 أيام باستخدام 0.02% EDTA. استخدم مزارع ذات كثافة استزراع وحجم مستعمرات مناسبين مع حد أدنى من التمايز التلقائي لزيادة كفاءة التمايز الوعائي.

  1. تحضير معلق خلوي أحادي
    1. قم بشفط وسط صيانة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) المحددة كيميائياً، واغسل الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) باستخدام 0.5 مل من وسط DMEM لكل بئر في طبق مكون من 6 آبار.
    2. قم بشفط وسط DMEM وأضف 0.5 مل من EDTA بتركيز 0.02% لكل بئر. حضّن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين 2 إلى 4 دقائق، وراقب الخلايا حتى تبدأ في التحول إلى الشكل الدائري.
    3. قم بفصل الخلايا باستخدام ماصة P1000. اسحب السائل وأطلقه برفق من 2 إلى 3 مرات لتفكيك التجمعات إلى معلق من الخلايا المفردة.
    4. أعد تعليق الخلايا في 5 مل من وسط صيانة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) المحدد كيميائياً، وانقل المعلق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    5. امزج 10 µL من المعلق الخلوي بـ 10 µL من محلول صبغة تريبان الزرقاء (Trypan blue) بتركيز 0.1%. قم بتحميل 10 µL من الخليط على غرفة عد الخلايا وتحديد عدد الخلايا الحية.
    6. احسب حجم معلق الخلايا المطلوب للحصول على 5 × 105 عدد الخلايا الحية لكل بئر.
    7. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 300 × جـ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (22–23 °C) اشفط السائل الطافي.
    8. أعد تعليق الخلايا في وسط صيانة جديد ومحدد كيميائياً للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) يحتوي على 50 µM مادة Y-27632 بحجم 3 مل لكل بئر.
  2. تكوّن التجمعات البروتينية
    1. أضف 3 مل من معلق الخلايا إلى كل بئر في طبق 6 آبار منخفض الالتصاق. أضف PVA ليصل إلى تركيز نهائي قدره 0.25%.
    2. ضع الطبق على هزاز مداري بسرعة 50 دورة في الدقيقة، ثم حضنه عند 37 °C لمدة يوم واحد.
    3. تأكد من تكوين تجمعات ذات حدود ملساء وقطر يبلغ حوالي 50-100 µm أو أكثر قبل المتابعة.
    4. ملاحظة: قم بتحسين فترة التجميع لكل خط من خطوط الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية (hiPSC) على حدة. قم بتمديد فترة الحضن إلى 2-3 أيام عند الضرورة للحصول على تجمعات بالحجم المطلوب.
  3. تحفيز الأديم المتوسط
    1. في اليوم 0، انقل التجمعات إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام ماصة معقمة ذات استخدام واحد سعة 10 مل. احتفظ بالطبق الأصلي منخفض الالتصاق لإعادة الزرع.
    2. اترك التجمعات تترسب بفعل الجاذبية لمدة تتراوح بين 15 و20 دقيقة تقريبًا.
    3. ملاحظة: تعامل مع التجمعات برفق واستخدم الترسيب بالجاذبية بدلاً من الطرد المركزي لتقليل الضرر الميكانيكي.
    4. قم بشفط الطافي بعناية بعد ترسب التجمعات.
    5. أعد تعليق التجمعات في 3 مل لكل بئر من وسط N2B27 المضاف إليه 12 µM CHIR99021 و30 نانوغرام/مل من BMP-4.
    6. انقل التجمعات مرة أخرى إلى الطبق منخفض الالتصاق واحضنها عند 37 °C.
    7. قم بسحب التجمعات بلطف بواسطة ماصة P1000 مرة واحدة يومياً لتقليل الاندماج المفرط للتجمعات. استمر في تحفيز طبقة الأديم المتوسط لمدة 3 أيام.
  4. تحفيز السلالة الوعائية
    1. في اليوم الثالث، انقل التجمعات إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل واتركها تترسب بفعل الجاذبية. احتفظ بالطبق الأصلي ذي الـ 6 فتحات.
    2. اسحب السائل الطافي بعناية بعد ترسب التجمعات.
    3. أعد تعليق التجمعات في 3 مل لكل بئر من وسط N2B27 المدعم بـ 100 نانوجرام/مل من VEGF-A و 2 µM فورسكولين.
    4. انقل التجمعات مرة أخرى إلى طبق الـ 6 آبار منخفض الالتصاق، وحضنها لمدة يومين إضافيين.

3. توليد الشبكات الوعائية والعضوانيات

  1. تحضير مصفوفة الكولاجين I والغشاء القاعدي
    1. اجمع التجمعات المتكونة في طبق واحد بـ 6 آبار لغرض تضمينها في طبق واحد بـ 12 بئرًا. استخدم ما يقرب من 40-60 تجمعًا لكل بئر.
    2. حضر كمية كافية من خليط مصفوفة الكولاجين I والغشاء القاعدي لإضافة طبقتين بحجم 0.5 mL لكل بئر في الطبق ذي الـ 12 بئرًا.
    3. حضر 12 mL من المصفوفة للطبق ذي الـ 12 بئرًا الواحد. احتفظ بجميع المكونات على الثلج، وحضر الخليط مباشرة قبل الاستخدام، وتجنب إدخال فقاعات الهواء.
    4. أضف 0.5 mL من المصفوفة إلى كل بئر في الطبق ذي الـ 12 بئرًا. حرك الطبق بلطف لتوزيع المصفوفة بالتساوي.
    5. حضن الطبق عند 37 °C لمدة 2 h للسماح لطبقة المصفوفة الأولى بالتصلب.
  2. تضمين التجمعات
    1. انقل التجمعات إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL باستخدام ماصة بلاستيكية معقمة سعة 10 mL واتركها تترسب بفعل الجاذبية.
    2. اشفط السائل الطافي واغسل التجمعات مرتين باستخدام 1 mL من وسط N2B27. تخلص من أكبر قدر ممكن من الوسط المتبقي بعد الغسلة الأخيرة.
    3. حضر خليطًا جديدًا من مصفوفة الكولاجين I والغشاء القاعدي واحتفظ به على الثلج.
    4. أعد تعليق التجمعات المغسولة بلطف في المصفوفة المحضرة حديثًا.
    5. أخرج الطبق ذي الـ 12 بئرًا الذي يحتوي على الطبقة الأولى المتصلبة من الحاضنة.
    6. أضف 0.5 mL من المصفوفة التي تحتوي على التجمعات إلى كل بئر.
    7. رج الطبق بلطف لمدة لا تزيد عن 1 min لتوزيع التجمعات بالتساوي.
    8. حضن الطبق فورًا عند 37 °C لمدة 2 h للسماح للطبقة الثانية بالتصلب.
  3. تحفيز التبرعم الوعائي
    1. سخن مسبقًا وسط N2B27 المكمل بـ 15% FBS و 100 ng/mL VEGF-A و 100 ng/mL FGF-2 حتى درجة 37 °C.
    2. أضف الوسط المكمل المسخن مسبقًا إلى كل بئر لتحفيز التمايز الوعائي.
    3. راقب المزارع بحثًا عن التبرعم الوعائي خلال الـ 1-3 أيام التالية.
    4. ملاحظة: سخن الوسط مسبقًا إلى 37 °C قبل إضافته إلى المزارع لتقليل زعزعة استقرار مصفوفة الهلام.
  4. تغيير الوسط وصيانة المزارع
    1. قم بإجراء أول تغيير للوسط بعد 3 أيام من التضمين.
    2. استبدل الوسط كل يومين بعد ذلك باستخدام وسط N2B27 جديد يحتوي على 15% FBS و 100 ng/mL VEGF-A و 100 ng/mL FGF-2.
    3. احتفظ بثلث الوسط المكيّف أثناء كل عملية تغيير للوسط، واستبدل الثلثين المتبقيين بوسط مكمل جديد.
  5. باشِر بعملية عزل العضوانيات الوعائية في اليوم العاشر (Day 10).

4. إنشاء العضويات الوعائية والتحضير للتصبيغ

  1. عزل الشبكات الوعائية الفردية
    1. أدخل الطرف المستدير لملعقة مختبرية (spatula) معقمة على طول حافة البئر وفصل مصفوفة الهلام بلطف عن القاع.
    2. استمر في تحريك الملعقة من حافة البئر باتجاه المركز حتى تطفو مصفوفة الهلام بأكملها بحرية.
    3. استخدم إبرتين معقمتين لاستئصال الشبكات الوعائية الفردية من الهلام. أزل أكبر قدر ممكن من المصفوفة الزائدة دون إتلاف الشبكة الوعائية.
  2. زراعة العضوانيات المعزولة
    1. انقل كل عضوانية معزولة مباشرة إلى بئر فردي في طبق 96-well منخفض الالتصاق باستخدام ماصة بلاستيكية معقمة تستخدم لمرة واحدة.
    2. أضف 100 µL من وسط N2B27 المكمل بـ 15% FBS و 100 ng/mL VEGF-A و 100 ng/mL FGF-2 إلى كل بئر.
    3. قم بتحضين العضوانيات لمدة 5 أيام إضافية واستبدل الوسط المكمل يومياً.
    4. تأكد من أن العضوانيات تظهر شكلاً مستديراً ومغلفاً بالكامل بحلول اليوم الخامس من النضج.
  3. تثبيت العضوانيات الوعائية
    1. انقل العضوانيات الناضجة شكلياً إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 mL. لا تعالج أكثر من 60 عضوانية تقريباً في كل أنبوب.
    2. اشفط الوسط بعناية وأضف 4% paraformaldehyde (PFA) في PBS.
    3. ثبت العضوانيات في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 h.
      تنبيه: مادة PFA سامة ويُشتبه في كونها مادة مسرطنة. تعامل مع PFA داخل خزانة استخلاص كيميائية (fume hood) مع ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
    4. اشفط PFA واستبدله بـ PBS.
      نقطة توقف: يمكن تخزين العضوانيات الوعائية المثبتة في PBS عند 4 °C لمدة تصل إلى شهر واحد.

5. صبغ وتصوير العضوانيات الوعائية باستخدام المجهر البؤري

  1. الحجب والنفاذية
    1. أضف 2 mL من محلول الحجب إلى كل أنبوب يحتوي على عضوانيات وعائية مثبتة.
    2. ضع الأنابيب رأسياً على هزاز مداري واحضنها مع الرج في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 h لحجب ونفاذية العضوانيات.
  2. حضن الجسم المضاد الأولي
    1. اشفط محلول الحجب وأضف 50–100 µL من الجسم المضاد الأولي المخفف بنسبة 1:100 في محلول الحجب.
    2. ضع الأنابيب بشكل قائم على هزاز واحضنها مع الرج في درجة حرارة 4 °C طوال الليل.
  3. الغسيل وحضن الجسم المضاد الثانوي
    1. اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة 10–15 min لكل غسلة. رج الأنابيب الموضوعة رأسياً أثناء كل غسلة.
    2. أضف جسماً مضاداً ثانوياً فلورياً مخففاً بنسبة 1:300 في محلول الحجب.
    3. احضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 h.
  4. الصبغ النووي المضاد والغسيل النهائي
    1. اغسل العينات مرتين باستخدام PBST لمدة 10–15 min لكل غسلة.
    2. أضف محلول Hoechst مخففاً بنسبة 1:5,000 في PBS واحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10–15 min.
    3. اغسل العينات باستخدام PBS لمدة 10–15 min.
  5. التصوير البؤري (Confocal imaging)
    1. انقل العضوانيات المصبوغة إلى أطباق التصوير البؤري.
    2. التقط صوراً بؤرية باستخدام معاملات تصوير متسقة عبر المجموعات التجريبية.
  6. التحليل الكمي لصور العضوانيات الوعائية
    ملاحظة: أجرِ التحليل الكمي للصور باستخدام Fiji/ImageJ و AngioTool. حافظ على إعدادات التقاط مجهرية متطابقة عبر جميع المجموعات التجريبية.
    1. قياس قطر التجمعات
      1. التقط صور المجال المضيء لتجمعات hiPSC في اليوم 0 باستخدام مجهر مقلوب بمقياس معاير. قم بتصوير التجمعات المنفصلة جيداً وأضف شريط مقياس.
      2. استورد كل صورة إلى Fiji/ImageJ. ارسم خطاً على طول شريط المقياس باستخدام أداة Straight Line واختر Analyze > Set Scale.
      3. أدخل المسافة والوحدة المعروفتين (مثلاً 100 µm) واختر Global لتطبيق المعايرة على جميع الصور في الجلسة.
      4. ارسم خطاً عبر أوسع قطر لكل تجمع باستخدام أداة Straight Line. اختر Analyze > Measure أو اضغط Ctrl+M وسجل القطر بوحدة µm.
      5. قس ما لا يقل عن 30 تجمعاً لكل دفعة.
      6. بالنسبة للتجمعات غير الكروية، حدد مخطط كل تجمع باستخدام أداة Oval أو Polygon Selection. اختر Analyze > Set Measurements > Feret's diameter وسجل القياس.
      7. صَدّر القياسات من جدول Results وجمع البيانات في جدول بيانات.
      8. احسب المتوسط، والانحراف المعياري (SD)، ومعامل الاختلاف (CV) حيث CV = SD/mean × 100% لكل دفعة.
    2. قياس قطر العضوانيات
      1. التقط صور المجال المضيء للعضوانيات الوعائية الناضجة في اليوم 15 باستخدام مجهر مقلوب بمقياس معاير. أضف شريط مقياس في كل صورة.
      2. استورد كل صورة إلى Fiji/ImageJ وعاير المقياس كما هو موضح في الخطوة
      3. ارسم خطاً عبر أوسع قطر لكل عضوانية باستخدام أداة Straight Line. اختر Analyze > Measure أو اضغط Ctrl+M وسجل القطر بوحدة µm.
      4. قس ما لا يقل عن 30 عضوانية لكل دفعة.
      5. بالنسبة للعضوانيات غير منتظمة الشكل، قس أطول وأقصر قطر واحسب متوسطهما، أو حدد قطر Feret كما هو موضح في الخطوة 5.6.1.6.
      6. صَدّر القياسات واحسب المتوسط و SD و CV لكل دفعة.
    3. تقدير المساحة الوعائية الإيجابية لـ CD31
      1. التقط صور z-stack بؤرية لعضوانيات كاملة في اليوم 15 مصبوغة لـ CD31. استخدم إعدادات متطابقة لقوة الليزر، والربح (gain)، والإزاحة (offset)، والثقب (pinhole) لجميع العينات.
      2. أنشئ إسقاطات ذات كثافة قصوى (MIPs) من صور z-stacks باستخدام برنامج المجهر أو Fiji/ImageJ.
      3. طبق عتبة الكثافة لتجزئة الشبكة الوعائية الإيجابية لـ CD31 مع استبعاد إشارة الخلفية.
      4. اختر Process > Noise > Remove Outliers واستخدم نصف قطر يتراوح بين 2–5 بكسل لإزالة الشوائب الصغيرة. اختر Process > Binary > Fill Holes لملء الفجوات الصغيرة داخل الشبكة الوعائية.
      5. اختر Analyze > Set Measurements وفعّل Area و Area fraction. اختر Analyze > Measure لتحديد المساحة الوعائية.
      6. احسب المساحة الوعائية الإيجابية لـ CD31 كنسبة مئوية من المساحة الكلية للعضوانية.
      7. حلل ما لا يقل عن ثلاث عضوانيات لكل دفعة من ثلاث دفعات مستقلة. صَدّر القياسات للتحليل الإحصائي.
    4. تقدير تغطية الخلايا الحوطية الإيجابية لـ PDGFR-β
      1. التقط صور z-stack بؤرية لعضوانيات كاملة في اليوم 15 مصبوغة لـ CD31 و PDGFR-β. أنشئ MIPs من صور z-stacks.
      2. استورد صور MIPs الخاصة بـ CD31 و PDGFR-β إلى Fiji/ImageJ وتحقق من محاذاة الصور.
      3. طبق عتبة على قناة CD31 لإنشاء قناع ثنائي يحدد الشبكة الوعائية.
      4. طبق عتبة على قناة PDGFR-β باستخدام نفس نهج التجزئة لإنشاء قناع ثنائي لإشارة الخلايا الحوطية.
      5. اختر Process > Image Calculator وطبق عملية AND على أقنعة CD31 و PDGFR-β لتحديد البكسلات المتداخلة.
      6. قس مساحة الإشارة المتداخلة.
      7. احسب تغطية الخلايا الحوطية كـ (المساحة الإيجابية لـ PDGFR-β داخل الأوعية الإيجابية لـ CD31/إجمالي المساحة الوعائية الإيجابية لـ CD31) × 100%.
      8. حلل ما لا يقل عن ثلاث عضوانيات لكل دفعة من ثلاث دفعات مستقلة. صَدّر القياسات للتحليل الإحصائي.
    5. تحليل مؤشر التفرع باستخدام AngioTool
      1. التقط صور z-stack بؤرية لعضوانيات كاملة في اليوم 15 مصبوغة لـ CD31. أنشئ MIPs من صور z-stacks.
      2. شغّل AngioTool وحمل صورة MIP.
      3. حدد قطر الوعاء وفقاً لقطر الوعاء النموذجي الملاحظ في الصور.
      4. اضبط عتبة الكثافة لتجزئة الشبكة الوعائية مع استبعاد إشارة الخلفية. حدد الحد الأدنى لحجم الوعاء لاستبعاد الشوائب الصغيرة.
      5. أجرِ التحليل وسجل مساحة الوعاء، وكثافة الأوعية، والطول الإجمالي للأوعية، وعدد الوصلات، ومؤشر التفرع.
      6. تحقق من الصورة الناتجة من خلال التأكد من تحديد الأوعية باللون الأصفر، وعرض الهيكل الوعائي باللون الأحمر، وتمييز نقاط التفرع بنقاط زرقاء.
      7. صَدّر النتائج الكمية من AngioTool.
      8. حلل ما لا يقل عن ثلاثة حقول رؤية لكل دفعة من ثلاث دفعات مستقلة وجمع البيانات للتحليل الإحصائي.

6. تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي للعضويات الوعائية

ملاحظة: قم بإجراء جميع عمليات عزل الـ RNA والإجراءات اللاحقة في ظروف خالية من الـ RNase.

  1. استخلاص RNA
    1. جمع 5–10 من العضيّات الوعائية الناضجة في اليوم 15 في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL خالٍ من RNase. إزالة الوسط المتبقي تماماً.
      ملاحظة: يتم تجميع عضيّات متعددة عند الضرورة للحصول على كمية كافية من RNA.
    2. إضافة 350 µL من محلول التحلل (lysis buffer) المدعم بـ 1% β-mercaptoethanol.
    3. سحب العينات بالماصة 10–15 مرة حتى تتحلل العضيّات تماماً.
    4. نقل ناتج التحلل إلى عمود دوران للتخلص من DNA الجينومي موضوع في أنبوب تجميع. يتم الطرد المركزي عند 11,000 × g لمدة 30 s في درجة حرارة الغرفة.
    5. التخلص من العمود والاحتفاظ بالسائل النافذ.
    6. إضافة حجم مساوٍ من الإيثانول بتركيز 70%، حوالي 350 µL، إلى السائل النافذ والخلط جيداً بالماصة.
    7. نقل ما يصل إلى 700 µL من الخليط إلى عمود دوران RNA موضوع في أنبوب تجميع. يتم الطرد المركزي عند 11,000 × g لمدة 30 s والتخلص من السائل النافذ.
    8. إضافة 350 µL من محلول الغسيل 1 (wash buffer 1) إلى العمود. يتم الطرد المركزي عند 11,000 × g لمدة 30 s والتخلص من السائل النافذ.
    9. تحضير خليط DNase I عن طريق دمج 10 µL من DNase I مع 70 µL من محلول هضم DNase لكل عينة.
    10. إضافة 80 µL من خليط DNase I مباشرة إلى غشاء العمود والتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 min.
    11. إضافة 350 µL من محلول الغسيل 1 إلى العمود. يتم الطرد المركزي عند 11,000 × g لمدة 30 s والتخلص من السائل النافذ.
    12. إضافة 500 µL من محلول الغسيل 2 (wash buffer 2) إلى العمود. يتم الطرد المركزي عند 11,000 × g لمدة 30 s والتخلص من السائل النافذ.
    13. تكرار عملية الغسيل باستخدام 500 µL من محلول الغسيل 2.
    14. طرد العمود الفارغ مركزياً عند 11,000 × g لمدة 2 min لتجفيف الغشاء.
    15. نقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 mL خالٍ من RNase. إضافة 30–50 µL من الماء الخالي من RNase مباشرة إلى الغشاء والتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 min.
    16. الطرد المركزي عند 11,000 × g لمدة 1 min لاسترداد RNA. يتم تخزين RNA عند −80 °C حتى الاستخدام.
      ملاحظة: يتم تقييم تركيز ونقاء RNA باستخدام القياس الطيفي. يُعتبر نطاق نسبة A260/A280 بين 1.8–2.1 مقبولاً.
  2. تخليق cDNA
    1. تحضير خليط تفاعل النسخ العكسي على الثلج.
    2. دمج 600 ng من RNA الكلي مع 4 µL من المزيج الرئيسي لـ RT الذي يحتوي على إنزيم النسخ العكسي، والمحلول المنظم، وdNTPs، وبادئات عشوائية. إضافة الماء الخالي من RNase حتى يصل الحجم النهائي إلى 20 µL.
    3. تحضين التفاعل عند 37 °C لمدة 15 min، يليه 85 °C لمدة 5 s.
    4. تخزين cDNA الناتج عند −20 °C حتى الاستخدام.
  3. تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR)
    1. تحضير 9 µL من المزيج الرئيسي لـ qPCR لكل تفاعل عن طريق دمج 5 µL من 2× SYBR Green master mix، و3 µL من الماء الخالي من RNase، و1 µL من البادئات الأمامية والعكسية المخلوطة مسبقاً بتركيز 10 µM لكل منها.
    2. توزيع 9 µL من المزيج الرئيسي في كل بئر من ألواح qPCR ذات 96 بئراً.
    3. إضافة 1 µL من cDNA إلى كل بئر للحصول على حجم تفاعل نهائي قدره 10 µL.
    4. ختم اللوح بفيلم لاصق بصري والطرد المركزي عند 1,000 × g لمدة 1 min.
    5. إجراء عملية المسخ الأولي عند 95 °C لمدة 30 s.
    6. إجراء 40 دورة تضخيم عند 95 °C لمدة 5 s تليها 60 °C لمدة 30 s.
    7. إجراء تحليل منحنى الانصهار لتأكيد نوعية القطع المتضخمة.
      ملاحظة: يتم تشغيل كل عينة في مكررين أو ثلاثة مكررات.
    8. حساب التعبير النسبي للجين المستهدف باستخدام طريقة 2−ΔΔCt. يتم معايرة قيم Ct بالنسبة للجين المرجعي (مثل GAPDH) ومعايرة التعبير مقابل عينات hiPSC غير المتمايزة.

7. التحليل الإحصائي

  1. اعرض البيانات الكمية في صورة المتوسط ± الانحراف المعياري (SD) من ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة على الأقل (n ≥ 3) لكل حالة.
  2. تعامل مع كل دفعة مستقلة كمكرر بيولوجي واحد لقياسات التجميع وقطر العضوانيات، واحسب متوسط الـ 30 بنية فردية المقاسة داخل كل دفعة للحصول على متوسط واحد على مستوى الدفعة.
  3. احسب متوسط قياسات المساحة الوعائية، وتغطية الخلايا الحوطية، ومؤشر التفرع من عدة عضوانيات أو حقول داخل كل دفعة للحصول على قيمة واحدة على مستوى الدفعة، واستخدم هذه القيم على مستوى الدفعة للمقارنات الإحصائية.
  4. قارن البروتوكول المُحسَّن ببروتوكول Wimmer الأصلي باستخدام اختبار Student's t-test غير المقترن ثنائي الذيل.
  5. حدد الدلالة الإحصائية عندما تكون p < 0.05. ووضح مستويات الدلالة كـ p < 0.05، وp < 0.01، وp < 0.001، حسبما ينطبق.
  6. أجرِ جميع التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج التحليل الإحصائي الإصدار 10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتيح البروتوكول المُحسَّن الموصوف هنا توليد عضوانيات وعائية ناضجة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية (hiPSCs) في غضون 15 يوماً تقريباً باستخدام استراتيجية تمايز تدريجية (الشكل 1A). وباختصار، تم توليد تجمعات hiPSC في أطباق منخفضة الالتصاق مدعمة بـ 0.25% PVA على هزاز مداري (اليوم -1). تم بدء تحفيز الأديم المتوسط في اليوم 0 باستخدام CHIR99021 (12 µM) وBMP-4 (30 ng/mL) لمدة 3 أيام، يليه تحديد السلالة الوعائية باستخدام VEGF-A (100 ng/mL) وفورسكولين (2 µM) لمدة يومين (الأيام 3-5). ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يقدم البروتوكول المُحسّن الموصوف هنا عدة تحسينات أساسية على نظام تمايز العضوانيات الوعائية الذي أسسه في الأصل Wimmer et al.18، وذلك بهدف تعزيز التجانس وقابلية التكرار والسلامة البنيوية لتوليد العضوانيات الوعائية. وبالمقارنة مع البروتوكول الأصلي، توفر الطريقة المُحسّنة تحسينات ملحوظة في الجوانب التالية. أولاً، يؤدي تحسين ظروف تكوين التجمعات إلى تحسين تجانس الأجسام المضغية بشكل كبير. فقد اعتمد البروتوكول الأصلي على التجميع الطبيعي في أطباق 6 آبار منخفضة الالتصاق لتوليد تجمعات hiPSC، حيث تم استزراع 2...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود أي تضارب في المصالح المالية.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC) من خلال صندوق العلماء الشباب (C) (رقم 32200655) والبرنامج العام (رقم 32270847). كما يشكر المؤلفون منصة الخدمات العامة بجامعة Anhui على دعمها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.22 μm مرشح أعلى الزجاجةNalgeneFPE204030للترشيح العقيم للأوساط والمحاليل المنظمة
أنبوب مخروطي سعة 15 مللترسبارك جاد (SparkJade)GD0001معقم
أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 ملل*Eppendorf22363204معقم
2-مركابتويثانول (1000×)Gibco21985023يُستخدم داخل خزانة استخلاص الغازات
Alexa Fluor 488 AffiniPure F2 جزء من جسم مضاد (IgG) من الحمير مضاد للأرانب (السلسلتان الثقيلة والخفيفة)موسومY1104جسم مضاد ثانوي؛ يخفف بنسبة 1:300
Alexa Fluor 594 AffiniPure F(ab′)2 جزء من الجسم المضاد IgG (H+L) من الحمار المضاد للماعزملصقY1007جسم مضاد ثانوي؛ يخفف بنسبة 1:300
جسم مضاد لـ CD31تأشير الخلايا3528 ثانيةالأجسام المضادة الأولية؛ تُخفف بنسبة 1:100 في محلول الحجب
مضاد مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (Anti PDGFR) β جسم مضادZenbio347269الأجسام المضادة الأولية؛ تُخفف بنسبة 1:100 في محلول الحجب (blocking buffer)
جهاز عد الخلايا الآليLife Technologiesكونتيس™ ٢تتضمن شرائح غرفة العد
مكمل B27 (50×)Gibco17504044بالنسبة لوسط N2B27؛ يتم الإذابة عند درجة حرارة 4ºج، قم بتقسيم العينة إلى حصص متساوية وتخزينها في −20ºج)، تجنب التجميد والإذابة
جهاز طرد مركزي مكتبيزونكياSC-3610باستخدام دوّار ذي دلاء متأرجحة
كابينة السلامة البيولوجية (الفئة الثانية)Thermo Fisherعذرًا، يبدو أنك لم تقم بتوفير نص المصدر المراد ترجمته. يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي الذي تود ترجمته إلى العربية، وسأقوم بترجمته وفقًا للمعايير المهنية والعلمية المحددة.غير متاح
بروتين تشكيل العظام 4 (BMP4)ProteintechHZ-1045أعد التشكيل في ماء مقطر مزدوج (ddH) معقم2من 0 إلى 100 نانوغرام/μL، ثم قسّمه إلى حصص متساوية وخزنه في −20 °C
ألبومين المصل البقري (BSA)بايوشارب (Biosharp)9048-46-8للمحلول المنظم للحجب
CHIR99021الاستخلاص بالسوائل فوق الحرجة (MCE)HY-10182حضّر محلولاً مركزاً بتركيز 10 ملي مولار في DMSO، ويُخزن في −20ºجلفنة لمدة تصل إلى سنة واحدة
أول أكسيد الكربون2 حضّانةFisher ScientificLS-CO15037 ºC، 5% CO2، مرطب
طبق تصوير بؤريBiosharpBS-20-GJMللتصوير بعد الصبغ
المجهر البؤري (Confocal Microscope)LEICAغير متاحمجهز بـ 10×, 20×, 63× العدسات الشيئية وبرمجيات ZEN
وسط مزارع ديلجويس-ماككونيل (DMEM)فيفاسيل (Vivacell)C3113-0500لتخفيف Matrigel ومحلول الكولاجين I (collagen I)
DMEM/F-12، مكمل GlutaMAXGibco10565018لتخفيف الـ Matrigel والوسط الغذائي N2B27
إيديتات (0.5 مولار، pH 8.0)InvitrogenAM9260Gيُخفف باستخدام المحلول الملحي المُنظم بالفوسفات (PBS) ليصل التركيز إلى 0.02% لغرض التمرير.
مصل جنين البقر (FBS)Gibco10270-106من أجل وسط التمايز الكامل N2B27 (بتركيز نهائي 15%)
FGF-2NovoproteinC046قم بتحضير محلول مخزون بتركيز 1 مجم/مل في محلول PBS معقم، ثم قسمه إلى حصص تخزينية واحفظه في درجة حرارة −20ºكربون
فورسكولينر&دي سيستمز (D Systems)1099قم بتحضير محلول مخزون بتركيز 10 ملي مولار في DMSO، ويُحفظ في −20ºج
هيبس (1 مولار)Gibco15630080لمحلول الكولاجين I
هويكست (Hoechst)BeyotimeC1071S-4قم بتحضير محلول مخزون بتركيز 1 ملجم/مل في ماء منزوع الأيونات، ثم قم بتقسيمه إلى حصص صغيرة وتخزينه في −20ºكربون
المجهر المقلوبLEICAصمام ثنائي باعث للضوء بنظام DMILالملاحظة الروتينية للخلايا
ماتريجيل (مخفض عوامل النمو)ستيمـا (STEEMA)BM05يُحفظ في −20ºبعد تقسيم العينات، تجنب التجميد والإذابة المتكرر؛ وتداول العينات على الثلج.
محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية لوسط MEM (NEAA, 100×)Gibco11140035لوسط N2B27 الغذائي
مكمل N2 (100×)Gibco17502048بالنسبة للوسط الغذائي N2B27؛ يُحفظ في −20ºج يحفظ بعيداً عن الضوء
وسط نيوروبيزال (Neurobasal Medium)Gibco21103049لوسط N2B27
ماء خالٍ من النوكلياز (خالٍ من DNase/RNase)تسمية (Lablead)Doo55WJلتحضير الـ RNA/cDNA وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)
رجّاج مداريمختبر جوانلا يوجد نص مترجملخطوات الغسيل
بارافورمالدهيد (محلول بتركيز 4%)ServicebioG1101يُخفف باستخدام المحلول الملحي الملبد بالفوسفات (PBS) ليصل التركيز إلى 4% لغرض التثبيت؛ ويُستخدم داخل خزانة استخلاص الغازات (fume hood).
بنسلين-ستريبتومايسين (100×)Gibco15140122لوسط N2B27
وسط PGM1سيلابي (Cellapy)A1517001وسط تمديد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية (hiPSC)؛ يُحفظ في درجة حرارة 4 مئويةºيُحفظ بعيداً عن الضوء، ومستقر لمدة أسبوعين
ملحق PGM1 (25×)سيلابي (Cellapy)A1517101للاستخدام مع الوسط الأساسي PGM1
كحول متعدد الفاينيل (PVA)Sigma-AldrichP8136تُذاب في PGM1 بتركيز 0.25% (وزن/حجم) لتعزيز التجميع
PureCol (كولاجين بقري من النوع الأول، 3 ملغ/مل)مصفوفة حيوية متطورة5005بالنسبة لمزيج الكولاجين I وMatrigel؛ اختبار الدفعة للتأكد من قدرة البلمرة
جهاز التدوير الحراري للتفاعل التسلسلي للبوليميراز الكمي (qPCR)Thermo FisherStepOnePlus™بخاصية منحنى الانصهار؛ للكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR)
طقم النسخ العكسيبيولوجيا دقيقةAG11706لتخليق الحمض النووي المتمم (cDNA) من الحمض النووي الريبي (RNA) الكلي؛ يحتوي على مزيج رئيسي للنسخ العكسي (RT master mix) يشتمل على إنزيم النسخ العكسي، ومحلول منظم، وديوكسي نيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs)، وبادئات عشوائية.
طقم استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA)Yeasen19221ES50لعزل الحمض النووي الريبي (RNA) الكلي من العضوانيات الوعائية؛ يتضمن أعمدة لإزالة الحمض النووي الجينومي (gDNA) وإنزيم دي إن إيز 1 (DNase I) الخالي من الريبانوكلياز (RNase).
بيكربونات الصوديوم (7.5%)Gibco25080094لمحلول الكولاجين من النوع الأول (collagen I)
ديوكسيكولات الصوديومSigma-AldrichD6750حضّر محلولاً بتركيز 1% (وزن/حجم) في ماء منزوع الأيونات لاستخدامه كمحلول حجب.
هيدروكسيد الصوديوم (1.0 عياري)Sigma-AldrichS2770لضبط الرقم الهيدروجيني (pH) لمحلول الكولاجين من النوع الأول (collagen I)
ماصات معقمة صالحة للاستخدام مرة واحدة (10 مل)مختبر بكمان (Bkmamlab)110205007معقمة، ومغلفة بشكل فردي
رؤوس ماصات ذات مرشح معقمة (1000، 200، 20 μL)بيوزيم (Biozym)VT0270/VT0250/VT0220معقم، مع مرشح
إبرة معقمة (30 G)غير متاحلا يوجد نص للترجمة. يرجى تقديم النص المصدر باللغة الإنجليزية لنقوم بترجمته إلى اللغة العربية وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة.لتشريح الشبكات الوعائية
ملعقة مختبرية معقمة (طرف مستدير)Fisher Scientific21-401-5الفولاذ المقاوم للصدأ
مزيج SYBR Green الرئيسيبيولوجيا دقيقةAG117332× التركيز الخاص بتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)؛ يحتوي على إنزيم DNA polymerase ببدء ساخن، ومحلول منظم، وdNTPs، وصبغة SYBR Green
طبق 12 عينًا مُعالج للزراعة النسيجيةBD Falcon353043للتضمين في الهلام وزراعة الشبكة الوعائية
طبق بـ 6 آبار معالج لزراعة الأنسجةEppendorf30720113المعالجة القياسية بـ TC
Triton X-100Sigma-AldrichT9084لمحلول الحجب (blocking buffer)
صبغة تريبان الزرقاء (0.4%)Thermo Fisher15250061لعد الخلايا
Tween 20Sigma-AldrichP7949لمحلول غسيل PBS-T بتركيز 0.05%
طبق 6 فجوات فائق انخفاض الالتصاقCorning3471لتكوين التجمعات والتمايز
طبق بـ 96 بئراً ذات قاع مستدير وفائق انخفاض الالتصاقBeyotimeFULA962-6 قطعلاستزراع العضيّات الوعائية في وسط معلق
عامل نمو البطانة الوعائية أ (VEGF-A)ProteintechHZ-1038قم بتحضير محلول مخزن بتركيز 1 مجم/مل في محلول PBS معقم، ثم قسمه إلى حصص صغيرة وخزنه في −20ºكربون
حمام مائينمر أزرقHWS-2437ºسي
Y-27632القياس الكهربائي المجهري (MCE)HY-10071قم بتحضير محلول مخزون بتركيز 10 ملي مولار في محلول PBS معقم أو DMSO، ويُحفظ في درجة حرارة −20ºج؛ تركيزات العمل: 5 μM (إذابة التجميد)، 50 μM (تكون التجمعات)

المراجع

  1. Lancaster MA, Knoblich JA. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 2014;345:1247125.
  2. Clevers H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 2016;165:1586-1597.
  3. Spence JR, et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 2011;470:105-109.
  4. Lancaster MA, et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 2013;501:373-379.
  5. Quadrato G, et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 2017;545:48-53.
  6. Takasato M, et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 2015;526:564-568.
  7. Takebe T, et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 2013;499:481-484.
  8. Huch M, et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 2015;160:299-312.
  9. Nakano T, et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 2012;10:771-785.
  10. Mansour AA, et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 2018;36:432-441.
  11. Ham O, et al. Blood vessel formation in cerebral organoids formed from human embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2020;521:84-90.
  12. Sun XY, et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. eLife. 2022;11:e76707.
  13. Grebenyuk S, Ranga A. Engineering organoid vascularization. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:39.
  14. Parikh M, Pierce GN. Considerations for choosing an optimal animal model of cardiovascular disease. Can J Physiol Pharmacol. 2024;102:75-85.
  15. Krug A, et al. Three-dimensional spheroid models for cardiovascular biology and pathology. Mechanobiol Med. 2025;3:100144.
  16. Carmeliet P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 2003;9:653-660.
  17. Wimmer RA, et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 2019;565:505-510.
  18. Wimmer RA, et al. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2019;14:3082-3100.
  19. Naderi-Meshkin H, et al. Vascular organoids: unveiling advantages, applications, challenges, and disease modelling strategies. Stem Cell Res Ther. 2023;14:292.
  20. Xu C, et al. Vascular organoid generation from human-induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 2024;214:e67125.
  21. Frenz-Wiessner S, et al. Generation of complex bone marrow organoids from human induced pluripotent stem cells. Nat Methods. 2024;21:868-881.
  22. Sun D, et al. Matrix viscoelasticity controls differentiation of human blood vessel organoids into arterioles and promotes neovascularization in myocardial infarction. Adv Mater. 2025;37:e2410802.
  23. Hoffmann A, et al. Animal-origin-free method for generating blood vessel organoids. Sci Rep. 2026;16:12096.
  24. Nikolova MT, et al. Fate and state transitions during human blood vessel organoid development. Cell. 2025;188:3329-3348.e31.
  25. Quintard C, et al. A microfluidic platform integrating functional vascularized organoids-on-chip. Nat Commun. 2024;15:1452.
  26. Sun L, Wang P, Lin X, Qiu Y. Microfluidic vascular organoids-on-chips: a promising platform for advancing plastic and reconstructive surgery. Chinese Journal of Plastic and Reconstructive Surgery. 2025.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدراتتوليد العضوانياتتكوين الجسم الجنينيحث الأديم المتوسطالتخصيص الوعائياستقطاب الخلايا الحوليةالشبكات البطانيةالتوصيف بالفلورة المناعية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.