مقالة منهجية

بروتوكول يعتمد على إدراجات المزارع الخلوية لإنشاء نموذج مبسط متعدد الخلايا In Vitro للحاجز الدموي الورمي في حالات النقائل الدماغية لسرطان الثدي

5 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/73693

⸱

أكتوبر 21, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Breast Oncology and Surgery, The Second Hospital of Dalian Medical University, 2State Key Laboratory of Medical Proteomics, Dalian Institute of Chemical Physics, 3Department of Pathology, The Second Hospital of Dalian Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تؤسس هذه الدراسة نموذجاً مبسطاً لحاجز الدم والأورام (BTB) متعدد الخلايا in vitro يجمع بين الزراعة المشتركة بنظام Transwell والكريات الورمية ثلاثية الأبعاد، مما يوفر منصة ذات صلة فسيولوجياً لدراسة النقائل الدماغية لسرطان الثدي وفحص العلاجات الموجهة.

الملخص

لا تزال العلاجات الفعالة لنقائل سرطان الثدي في الدماغ (BCBM) محدودة، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى أن الحاجز الدموي الورمي (BTB) يقيد دخول العديد من العوامل الكيميائية والموجهة إلى الآفات النقيلية داخل الجهاز العصبي المركزي. ولنمذجة سمات مختارة من هذه البيئة المجهرية المعقدة في المختبر، تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً معيارياً لإنشاء نموذج مبسط ثلاثي الأبعاد ومتعدد الخلايا للحاجز الدموي الورمي. تتكون الطريقة من ثلاث خطوات أساسية؛ أولاً، يتم إنشاء حجرة للحاجز الدموي الدماغي (BBB) باستخدام أدراج زراعة الخلايا بقطر مسام 0.4 μm. يتم استزراع خلايا بطانية وعائية مجهرية دماغية بشرية (HBMECs) على الجانب القاعدي للغشاء المسامي، وبعد يوم واحد، يتم استزراع خلايا نجمية بشرية (HA) و خلايا دبقية صغيرة بشرية HMC3 (HMC3) على الجانب القمي. وباستخدام خلايا SK-BR-3 كمثال، تُستزرع خلايا سرطان الثدي بطريقة القطرة المعلقة لتشكيل كرويات ورمية ثلاثية الأبعاد منتظمة وموحدة الشكل بعد 3 أيام من الزراعة. ثم تُنقل الكرويات إلى الجانب القمي لغشاء مسامي مطلى بمصفوفة الغشاء القاعدي، مما يوفر فصلاً فيزيائياً مع السماح بالتواصل الكيميائي بين خلايا الحاجز والكرويات الورمية أثناء الزراعة المشتركة. تتيح هذه المنصة تحكماً دقيقاً في الجدول الزمني التجريبي، وتؤدي إلى تغييرات في شكل ومؤشرات الخلايا النجمية تتفق مع الاستجابة التفاعلية حول الورم، مع السماح بتقييم سلامة الحاجز البطاني والنفاذية بين الخلايا.

المقدمة

تعد النقائل الدماغية مضاعفة شائعة في المراحل المتأخرة من مختلف الأورام الصلبة الخبيثة، بما في ذلك سرطان الثدي وسرطان الرئة1,2. وتكون التوقعات المرضية المرتبطة بها سيئة للغاية، كما أن خيارات العلاج محدودة1,2. وفي الجهاز العصبي المركزي السليم، يمثل الحاجز الدموي الدماغي (BBB) واجهة ديناميكية ومتخصصة للغاية تتكون أساساً من خلايا بطانية وعائية دقيقة في الدماغ مرتبطة ببعضها ارتباطاً وثيقاً، بينما يتم دعم سلامتها ووظيفتها بواسطة الغشاء القاعدي الوعائي والتفاعلات المنسقة مع الخلايا الحولية، والخلايا النجمية، والعصبونات، والخلايا الدبقية الصغيرة، والخلايا من سلالة الخلايا الدبقية قليلة التغصن، ومكونات أخرى من الوحدة الوعائية العصبية3. ومن خلال الموصلات المحكمة بين الخلايا البطانية وبمساعدة الخلايا الدبقية المحيطية، يقيد هذا الحاجز بدقة دخول المواد الخارجية إلى الجهاز العصبي المركزي4. وبمجرد انتشار خلايا سرطان الثدي واستقرارها في الدماغ، تتوسع الآفات النقيلية الدماغية، ويزداد نقص الأكسجة الموضعي، وتشتد الإشارات الالتهابية، وتعاد صياغة الوحدة الوعائية العصبية (NVU)، مما يؤدي تدريجياً إلى إعادة بناء الحاجز الدموي الورمي (BTB)5. وعلى الرغم من أن النفاذية الموضعية للحاجز الدموي الورمي أعلى منها في الحاجز الدموي الدماغي، إلا أن الاختلافات في النفاذية للجزيئات ذات الأحجام المختلفة، مقترنة بتروية دموية غير منتظمة، تؤدي إلى تراكم ضعيف للأدوية في أورام الدماغ6. لذلك، أصبح فهم بيولوجيا الحاجز الدموي الورمي وتطوير استراتيجيات إيصال يمكنها عبور هذا الحاجز من الأولويات الهامة في طب أورام الأعصاب.

حتى الآن، لم يتم وصف خصائص وآليات تحول الحاجز الدموي الدماغي (BTB) إلا جزئيًا، ولا تزال خيارات الأدوية الفعالة لعلاج النقائل الدماغية لسرطان الثدي (BCBM) محدودة في الممارسة السريرية. ويتمثل أحد التحديات في المحدودية في توفر العينات السريرية المشتقة من النقائل الدماغية، إلى جانب التوفر المحدود وعدم اكتمال التوصيف الوظيفي لنماذج BTB الموجودة. ولا تزال النماذج الحيوانية In vivo، وخاصة نماذج الفئران7,8، مستخدمة على نطاق واسع في أبحاث BTB. ومع ذلك، تعاني هذه النماذج من قيود، بما في ذلك الاختلافات بين الأنواع، وانخفاض الإنتاجية، وتحديات في التوحيد القياسي وقابلية التكرار، مما قد يعيق الدراسات الميكانيكية وتطوير الأدوية9,10. بالإضافة إلى ذلك، تستخدم نماذج BTB الحالية in vitro عادةً مزارع مشتركة من الخلايا الورمية والخلايا المرتبطة بالحاجز في أنظمة إدخال المزارع الخلوية أو الرقائق الموائعية الدقيقة.

غالبًا ما تفتقر هذه النماذج الحالية إلى البنية ثلاثية الأبعاد للأورام، وبالتالي تكون محدودة في إعادة إنتاج السمات المكانية ذات الصلة بنقائل الدماغ، بما في ذلك تدرجات كثافة الخلايا، والمناطق ناقصة الأكسجة/النخرية، والانتشار الجزيئي المقيد، والتوزيع الخلوي غير المتجانس11,12. ولإدخال مكون ورمي ثلاثي الأبعاد محدد، استخدمنا نموذج الكريات الورمية الذي يتميز بالبساطة وقابلية التكرار والتوافق مع تطبيقات الفحص. وبناءً على ذلك، طورنا مقصورة بشرية مبسطة متعددة الخلايا لمحاكاة الحاجز الدموي الدماغي in vitro ودمجناها مع الكريات الورمية لإنشاء نموذج مبسط للحاجز الورمي الدماغي (الشكل 1A) يجسد سمات بنيوية وخلوية مختارة للبيئة المجهرية لنقائل الدماغ. ويتميز هذا النموذج بسهولة التشغيل، ويدعم قياسات الحاجز الكمية، ويتيح تصور التغيرات المكانية في مجموعات الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة المرتبطة بالورم.

يفصل هذا البروتوكول الخطوات الحاسمة بدءاً من تحضير الخلايا واستزراعها وصولاً إلى توليد الكريات الورمية، وتغطيتها بمصفوفة الغشاء القاعدي، وتحضير العينة الضابطة المطابقة، ونقل الكريات، مما يوفر سير عمل موحد لبناء هذا النموذج المبسط للحاجز الدموي الدماغي (BTB).

البروتوكول

أُجريت هذه الدراسة وفقاً لمبادئ إعلان هلسنكي، واعتمدتها لجنة الأخلاقيات في المستشفى الثاني بجامعة داليان الطبية (رقم الموافقة JW2026-019-01). وقد تم إخفاء هوية جميع البيانات المتعلقة بالمرضى قبل تحليلها. تظهر أدوات البحث المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد.

1. تحضير نموذج الحاجز الدموي الدماغي (BBB)

  1. المتطلبات العامة
    1. يجب إجراء جميع العمليات داخل كابينة تدفق صفائحي معقمة واتباع التقنية العقمية بصرامة.
    2. استخدم حشوات زراعة الخلايا ذات الـ 12 بئراً والمزودة بأغشية PET بقطر مسام 0.4 µm ومساحة غشاء فعالة تبلغ 1.12 cm2.
  2. الطلاء بالكولاجين من النوع الأول (Collagen type I)
    1. أضف 1–2 mL من محلول الطلاء بالكولاجين من النوع الأول إلى كل قارورة أو طبق زراعة، ووزعه بالتساوي على السطح السفلي.
    2. أضف 200 µL و 800 µL من محلول الطلاء إلى الجانبين القمي والقاعدي لكل حشوة زراعة خلايا، على التوالي. رج الطبق برفق لضمان التلامس الكامل مع الغشاء مع تجنب تكون فقاعات تحت الغشاء.
    3. حضن الأوعية والحشوات المطلية عند 37 °C مع 5% CO₂ لمدة 1 h. قم بإزالة محلول الطلاء واغسلها مرتين باستخدام PBS.
    4. احتفظ بالقوارير والأطباق وحشوات زراعة الخلايا المطلية عند 37 °C مع 5% CO₂ واستخدمها في غضون 3 أيام. اشطفها مرة واحدة باستخدام PBS مباشرة قبل الاستخدام.
    5. قم بطلاء أوعية زراعة خلايا HBMEC و HA بالكولاجين من النوع الأول قبل زراعة الخلايا. ولا تتطلب خلايا HMC3-RFP طلاءً بالكولاجين من النوع الأول.
  3. تحضير محلول الطلاء بالكولاجين من النوع الأول
    1. أذب 60 µL من حمض الخليك الثلجي في 50 mL من الماء فائق النقاء وبرد المحلول عند 4 °C.
      تنبيه: حمض الخليك الثلجي مادة مسببة للتآكل. تعامل معه داخل خزانة استخلاص كيميائية مع ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات ومئزر المختبر وواقي العينين. تخلص من نفايات حمض الخليك وفقاً لإجراءات النفايات الكيميائية المؤسسية.
    2. قم بترشيح المحلول عبر مرشح سرنجة بمسامية 0.22 µm، وأضف 500 µL من الكولاجين من النوع الأول (9.45 mg/mL)، وامزجه جيداً، واحفظه عند 4 °C حتى الاستخدام.
  4. تحضير الخلايا
    1. قم بزراعة خلايا HBMEC و HA و HMC3-RFP حتى تصل إلى درجة تلاقي (confluence) تتراوح بين 80%–90% قبل الاستخدام.
      تنبيه: يجب التعامل مع الخطوط الخلوية المشتقة من البشر والمواد المرتبطة بالأنسجة البشرية على أنها مواد قد تكون ذات خطورة بيولوجية. اتبع إجراءات السلامة البيولوجية المؤسسية وارتدِ معدات الوقاية الشخصية المناسبة. تخلص من مواد الزراعة الملوثة كنفايات ذات خطورة بيولوجية.
  5. استزراع خلايا HBMECs في اليوم 0
    1. افصل خلايا HBMECs باستخدام بروتياز شبيه بالتريبسين مأشوب (1×)، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً، وأعد تعليق الراسب للحصول على معلق من الخلايا المفردة.
    2. حدد كثافة الخلايا واضبط المعلق بحيث يحتوي 120 µL على 1.5 × 105  من خلايا HBMECs لكل حشوة زراعة خلايا.
    3. اقلب الطبق ووزع 120 µL من معلق HBMEC على الجانب القاعدي للغشاء المسامي. تجنب تكون فقاعات هوائية أثناء الاستزراع (الشكل 1B).
    4. غطِّ الآبار، وأبقِ الطبق ذو الـ 12 بئراً مقلوباً، وحضنه لمدة 6 h.
    5. أعد الطبق إلى الوضع القائم، وأضف 200 µL و 800 µL من وسط زراعة ECM الكامل إلى الحجرتين العلوية والسفلية، على التوالي، وواصل التحضين.
  6. استزراع خلايا HA و HMC3-RFP في اليوم 1
    1. افصل خلايا HA باستخدام بروتياز شبيه بالتريبسين مأشوب (1×)، وخلايا HMC3-RFP باستخدام 0.25% trypsin-EDTA. قم بالطرد المركزي وأعد تعليق نوعي الخلايا بشكل منفصل.
    2. حدد كثافة الخلايا واجمع 2.0 × 105  من خلايا HA مع 4.0 × 103  من خلايا HMC3-RFP لكل حشوة زراعة خلايا.
    3. قم بطرد الخلايا المختلطة مركزياً، وتخلص من الراشح، وأعد تعليق الراسب في 200 µL من وسط كامل مختلط (وسط AM كامل : وسط MEM كامل = 5:1). أضف معلق الـ 200 µL بالتساوي إلى الحجرة العلوية مع تجنب الفقاعات الهوائية (الشكل 1B). 
    4. أضف 800 µL من وسط زراعة ECM الكامل إلى الحجرة السفلية، وحافظ على وضع الطبق قائماً في المحضنة، وقم بتغيير الوسط يومياً.

2. تحضير الكريات الورمية ثلاثية الأبعاد

  1. تحضير خلايا SK-BR-3
    1. تُزرع خلايا SK-BR-3 حتى تصل نسبة تلاقيها (confluence) إلى 80%–90% قبل البدء في تكوين الكريات (spheroids).
    2. قم بفصل خلايا SK-BR-3 باستخدام trypsin-EDTA بتركيز 0.25%، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً، وأعد تعليق الراسب للحصول على معلق خلوي أحادي.
    3. حدد كثافة الخلايا واضبط المعلق بحيث يكون كل 30 µL تحتوي القطرة على 2 × 104 خلايا.
  2. تكوين القطرات المعلقة
    1. اقلب طبق زراعة خلايا مقاس 10 سم وقم بالتوزيع 30 µL قطرات من معلق الخلايا على غطاء الطبق. ضع ٢٠ قطرة تقريباً على كل غطاء.
    2. استبدل قاعدة الطبق واقلب الطبق المجمّع بسرعة (الشكل 1Bقم بتحضير القطرات مرة أخرى إذا تقطرت من الغطاء أو فقدت شكلها.
  3. زراعة الكريات الخلوية
    1. أضف 5 مل من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS) إلى الطبق وضعه في الحاضنة. لا تحرك الطبق خلال أول يومين من الاستنبات.
    2. للاستزراع طويل الأمد، أضف 10 µL من وسط زراعة كامل إلى كل قطرة كل يومين.
    3. أضف الوسط من حافة كل قطرة باستخدام طرف الماصة مع تجنب ملامسة الكرويات الورمية.

3. تحضير نموذج الحاجز الدموي الورمي (BTB) المبسط

  1. تحضير المواد
    1. غلف أوعية زراعة الخلايا والinserts الخاصة بزراعة الخلايا المطلوبة (غشاء PET، حجم مسام 0.4 µm) بالكولاجين من النوع I واحفظها في الحاضنة حتى وقت الاستخدام.
    2. اقطع أطراف رؤوس الماصات سعة 200 µL باستخدام مقص وعقم الرؤوس المعدلة بواسطة جهاز التعقيم البخاري (autoclave).
  2. إنشاء النموذج
    1. اليوم 0-1: قم ببناء نموذج الحاجز الدموي الدماغي (BBB) وتحضير الكريات الورمية كما هو موضح أعلاه.
    2. اليوم 2: أذب مصفوفة الغشاء القاعدي على الثلج. قم بإزالة وسط الزراعة من كلتا الحجرتين واغسلهما باستخدام PBS.
    3. أضف 800 µL من وسط ECM الكامل إلى الحجرة السفلية و30 µL من مصفوفة الغشاء القاعدي المذابة إلى الحجرة العلوية. وزع مصفوفة الغشاء القاعدي بالتساوي فوق الغشاء المسامي.
    4. حضن الطبق عند 37 °C لمدة 20 دقيقة، ثم أضف 200 µL من الوسط الكامل المختلط (AM:MEM = 5:1) ببطء على طول الجدار الجانبي للحجرة العلوية. أعد الطبق إلى الحاضنة (الشكل 1B).
    5. احتفظ بمصفوفة الغشاء القاعدي على الثلج واعمل بسرعة. استخدم رأس ماصة مبرد مسبقاً عند سحب مصفوفة الغشاء القاعدي.
  3. التحكم المتطابق الخالي من الكريات/مصفوفة الغشاء القاعدي
    1. قم بتحضير inserts التحكم باستخدام نفس حجم مصفوفة الغشاء القاعدي (30 µL)، وتركيبة الوسط، وخطوات الغسيل، وأوقات التحضين، وجدول تغيير الوسط اليومي كما في حالة BTB، ولكن استثنِ نقل الكريات الورمية في اليوم 3. وبذلك، يختلف التحكم المتطابق عن حالة BTB بوجود أو غياب الكريات الورمية وليس بالتعرض لمصفوفة الغشاء القاعدي أو التعامل معها.
  4. نقل الكريات الورمية في اليوم 3
    1. افحص الكريات الورمية تحت مجهر رأسي وتأكد من أنها منتظمة الشكل وقد شكلت كريات متماسكة.
    2. اسحب الكريات الورمية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL باستخدام رأس ماصة مقطوع الطرف واغسلها مرتين بـ PBS. تعامل مع الكريات برفق لتجنب تفككها.
    3. استبدل الوسط في الحجرة السفلية وأزل وسط الزراعة من الحجرة العلوية.
    4. انقل خمس كريات ورمية إلى كل حجرة علوية باستخدام رأس ماصة مقطوع الطرف.
    5. أضف 200 µL من وسط الزراعة الكامل المختلط (AM:MEM = 5:1) إلى الحجرة العلوية ورج الطبق برفق لمنع الكريات من التلامس أو الاندماج (الشكل 1B).
    6. احتفظ بالطبق في الحاضنة وقم بتغيير الوسط يومياً.
  5. جمع العينات
    1. اجمع العينات في اليوم 7 لإجراء التجارب اللاحقة، أو عدل وقت الجمع وفقاً لمتطلبات التجربة.

4. قياس المقاومة الكهربائية عبر الخلايا البطانية (TEER)

  1. تحضير الأقطاب الكهربائية
    1. اشحن مقياس TEER شحناً كاملاً واغمر الأقطاب الكهربائية (chopstick electrodes) في إيثانول بتركيز 75% لمدة 15 min.
      تنبيه: الإيثانول مادة قابلة للاشتعال. احفظ الإيثانول بتركيز 75% بعيداً عن اللهب المكشوف، والشرارات، ومصادر الاشتعال الأخرى، وتعامل معه وفقاً لإجراءات السلامة الكيميائية المؤسسية.
    2. عرّض كبينة السلامة البيولوجية للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 min للتعقيم. لا تعرّض الأقطاب الكهربائية مباشرة للإشعاع فوق البنفسجي.
    3. أخرج الأقطاب الكهربائية من الإيثانول، ووازنها في PBS لمدة 15 min، ثم جففها تحت ظروف معقمة.
  2. موازنة أدخالات المزرعة الخلوية
    1. أخرج الطبق ذو الـ 12 بئراً الذي يحتوي على أدخالات المزرعة الخلوية من الحاضنة واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 min قبل القياس.
  3. قياس المقاومة
    1. حضّر إدخال مزرعة خلوية فارغاً (blank) خالياً من الخلايا بوضع 200 µL و 800 µL من نفس وسط المزرعة الكامل في الحجرتين العلوية والسفلية على التوالي.
    2. أدخل الأقطاب الكهربائية برفق على طول حافة إدخال المزرعة الخلوية دون لمس الغشاء المسامي أو قاع البئر.
    3. اشطف الأقطاب الكهربائية بـ PBS وجففها. قِس كل إدخال يحتوي على خلايا باستخدام نفس الإجراء وسجل المقاومة كـ R₍measured₎.
  4. حساب TEER
    1. احسب قيمة المقاومة الكهربائية عبر البطانة الغشائية (TEER) باستخدام الصيغة التالية13:
      TEER (Ω·cm²) = (R(measured) − R(blank) × S    (1.1)
    2. R(measured)  هي المقاومة عبر الغشاء المسامي الذي يحتوي على الطبقة الخلوية (Ω)؛ و R(blank)  هي المقاومة عبر غشاء مسامي خالٍ من الخلايا (Ω)؛ و S هي مساحة الغشاء الفعالة (cm2). مساحة الغشاء الفعالة المستخدمة في هذه الدراسة هي 1.12 cm2.

5. مقايسة نفاذية FITC-dextran عبر الخلايا (من الاتجاه القمي إلى القاعدي)

  1. تحضير FITC-dextran
    1. قم بتحضير محلول عمل من FITC-dextran (4 kDa) بتركيز 2 mg/mL قبل بدء التجربة واحمه من الضوء.
  2. تفسير اتجاه المقايسة
    1. تُفسر هذه المقايسة على أنها قراءة لسلامة الحاجز بين الخلايا من الجانب القمي إلى الجانب القاعدي، وذلك لأن خلايا HBMECs تلتصق بالوجه القاعدي للغشاء، بينما تشغل الخلايا النجمية، والخلايا الدبقية الصغيرة، والكريات الورمية الحجرة القمية.
      ملاحظة: بالنسبة للدراسات التي تهدف إلى محاكاة التعرض الجهازى، يتم إدخال FITC-dextran أو المركب المختبر في الحجرة السفلية/القاعدية المواجهة للخلايا البطانية، وتُجمع العينات من الحجرة العلوية/القمية باستخدام مخطط أخذ عينات وحساب Papp تم التحقق من صحتهما بشكل منفصل.
  3. الغسل والموازنة
    1. قم بإزالة جميع أوساط الزرع من كلتا الحجرتين. أضف 400 µL و1 mL من وسط DMEM القاعدي الخالي من الجلوكوز والمسخن مسبقاً إلى الحجرتين العلوية والسفلية على التوالي، واغسل برفق لمرة واحدة، ثم تخلص من الوسط.
    2. أضف 400 µL و1 mL من وسط DMEM القاعدي الخالي من الجلوكوز الطازج والمسخن مسبقاً إلى الحجرتين العلوية والسفلية على التوالي. اتركها للموازنة عند 37 °C مع 5% CO₂ لمدة 15 min ثم اشفط جميع السوائل.
  4. قياس النفاذية
    1. أضف 200 µL من محلول عمل FITC-dextran بتركيز 2 mg/mL إلى الجانب القمي و800 µL من وسط DMEM القاعدي الخالي من الجلوكوز إلى الحجرة السفلية. قم بالتحضين عند 37 °C مع 5% CO₂ لمدة 30 min في الظلام.
    2. اجمع 100 µL من الوسط من الحجرة السفلية لكل قطعة إدخال تجريبية بعد 30 min. انقل ثلاث عينات من كل قطعة إدخال إلى طبق أسود ذي 96 بئراً واحمهما من الضوء.
  5. تحضير المنحنى القياسي لـ FITC-dextran
    1. قم بتحضير معايير FITC-dextran بتركيزات 0 و0.5 و1.0 و1.5 mg/mL. أضف 100 µL من كل معيار إلى طبق أسود ذي 96 بئراً في ثلاث مكررات واحْمِ الطبق من الضوء.
  6. قياس الفلورة وحساب Papp
    1. قس شدة الفلورة باستخدام قارئ أطباق دقيق متعدد الوظائف عند طول موجي للإثارة يبلغ 492 nm وطول موجي للانبعاث يبلغ 520 nm. سجل البيانات واحسب معامل النفاذية الظاهري (Papp) باستخدام المعادلات التالية14.
    2. أولاً، قم بإجراء مطابقة خطية لتركيزات المحاليل القياسية لـ FITC-dextran (C) مقابل شدة الفلورة المقابلة (A) لإنشاء منحنى قياسي:
       A = kC + b    (1.2)
    3. هنا، يمثل k ميل المنحنى القياسي، ويمثل b نقطة التقاطع.
    4. بعد ذلك، قم بتعويض شدة فلورة العينة (At) المقاسة عند الزمن t في معادلة المنحنى القياسي للحصول على تركيز FITC-dextran (Ca) في الجانب القاعدي الجانبي عند الزمن t. ثم عوض Ca في الصيغة التالية لحساب Papp (cm/s):
    5. Papp = (Ca × Va)/(t × S × C0)  (1.3)
    6. هنا، Va هو الحجم الإجمالي للجانب القاعدي الجانبي (mL)؛ و t هو زمن النفاذ (s)؛ و S هي المساحة الفعالة للغشاء المسامي (cm2)؛ و C₀ هو التركيز الأولي في الجانب القمي.

6. صبغ التألق المناعي

  1. التثبيت، والغسل، والنفاذية
    1. أزل جميع أوساط الزرع من إدراجات زراعة الخلايا، واغسلها مرتين باستخدام PBS، ثم اشفط جميع السوائل المتبقية.
    2. أضف 200 µL و 800 µL من البارافورمالديهايد بتركيز 4% إلى الحجرتين العلوية والسفلية على التوالي، وثبّت الخلايا طوال الليل عند 4 °C.
      تحذير: مادة البارافورمالديهايد خطرة ويجب التعامل معها داخل خزانة استخلاص كيميائية معتمدة مع ارتداء القفازات ومعطف المختبر وواقي العينين. اجمع نفايات البارافورمالديهايد بشكل منفصل وتخلص منها وفقاً لإجراءات النفايات الخطرة في المؤسسة.
    3. أزل البارافورمالديهايد وأضف 200 µL و 800 µL من PBS إلى الحجرتين العلوية والسفلية على التوالي. اغسل العينات على جهاز هزاز ثلاث مرات لمدة 5 min في كل مرة.
    4. أضف 200 µL و 800 µL من مادة خافضة للتوتر السطحي غير أيونية بتركيز 0.5% إلى الحجرتين العلوية والسفلية على التوالي، وقم بإحداث النفاذية لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة.
    5. أزل محلول المادة الخافضة للتوتر السطحي غير الأيونية واغسل بـ PBS ثلاث مرات لمدة 5 min في كل مرة.
  2. استئصال الغشاء والحجب
    1. اقلب إدراجات زراعة الخلايا على غطاء طبق زراعة خلايا، واستأصل الأغشية المسامية بعناية على طول الحافة باستخدام مشرط، ثم انقلها إلى لوح يحتوي على 24 بئراً.
    2. أضف 200 µL من BSA بتركيز 3% في PBS لتغطية كل غشاء واجره للحجب لمدة 90 min في درجة حرارة الغرفة. إذا لزم الأمر، قطع الأغشية إلى قطع أصغر للتلوين المنفصل.
  3. حضن الأجسام المضادة الأولية
    1. خفف الأجسام المضادة الأولية باستخدام مخفف أجسام مضادة قياسي وأضف كمية كافية من المحلول لتغطية كل غشاء بالكامل.
    2. أضف ماءً فائق النقاء إلى الآبار الفارغة المحيطة لتقليل التبخر واحضن العينات طوال الليل عند 4 °C. استخدم عينات بدون جسم مضاد أولي محدد كعناصر تحكم سلبية.
    3. أزل محلول الجسم المضاد الأولي في اليوم التالي واغسل الأغشية باستخدام 1 mL من PBS على جهاز هزاز ثلاث مرات لمدة 10 min في كل مرة.
  4. تلوين الأجسام المضادة الثانوية و DAPI
    1. خفف الأجسام المضادة الثانوية باستخدام مخفف أجسام مضادة فلوري في ظروف محمية من الضوء، وغطِّ الأغشية بالكامل، واحضنها لمدة 90 min في درجة حرارة الغرفة. اغسل بـ PBS ثلاث مرات لمدة 10 min في كل مرة مع الحماية من الضوء.
    2. أضف محلول تلوين DAPI الجاهز للاستخدام لتغطية الأغشية واحضنها لمدة 15 min في درجة حرارة الغرفة. اغسل بـ PBS ثلاث مرات لمدة 10 min في كل مرة مع الحماية من الضوء.
  5. الترويق، والتثبيت، والتصوير
    1. أضف حجماً مناسباً من كاشف ترويق زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد لتغطية الأغشية واحضنها لمدة 15 min في درجة حرارة الغرفة تحت ظروف محمية من الضوء.
    2. انقل الأغشية إلى شرائح زجاجية باستخدام ملقط عيني، وأضف وسط تثبيت مانع للتلاشي، وثبّت العينات تحت ظروف محمية من الضوء. افحص العينات وصورها باستخدام مجهر مسح ليزري بؤري.

7. التقارير الإحصائية

  1. بالنسبة للمقارنات الوظيفية، تشير n = 3 إلى ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة لكل حالة، وتم التعامل مع كل مكرر بيولوجي كوحدة تجريبية. نقاط البيانات الفردية لجميع المكررات البيولوجية الثلاثة. تُعرض البيانات كمتوسط ± SD. أجرِ المقارنات باستخدام اختبار t لـ Student غير المقترن ثنائي الذيل، مع قيم t وp الدقيقة.

figure-protocol-1
الشكل 1: رسم تخطيطي ومسار بناء نموذج حاجز الورم الدماغي (BTB). (A) تم استزراع خلايا HBMECs على الجانب القاعدي لغشاء إدخال زراعة الخلايا المسامي، بينما تم توزيع خلايا HA وخلايا HMC3-RFP على الجانب القمي. واستُخدمت طبقة من مصفوفة الغشاء القاعدي لفصل الكرويات الورمية عن حجرة خلايا الحاجز. وبالنسبة للمجموعة الضابطة المطابقة الخالية من الكرويات، استُخدمت نفس طبقة مصفوفة الغشاء القاعدي وطريقة التعامل، ولكن مع حذف الكرويات الورمية. (B) تشير الأرقام المحاطة بدوائر في الأعلى إلى أيام الزراعة المقابلة. وقد تم بناء حاجز الدم الدماغي (BBB) وتحضير الكرويات الورمية في وقت واحد. وبعد إضافة طبقة من مصفوفة الغشاء القاعدي إلى السطح العلوي لإدخال زراعة الخلايا، نُقلت الكرويات الورمية إلى الحجرة العلوية باستخدام رأس ماصة مقطوع. ثم تم الحفاظ على نموذج BTB في المزارع لمدة تصل إلى 1 أسبوع قبل جمع العينات. ويمكن عادةً جمع العينات في اليوم 7 لإجراء التجارب اللاحقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

النتائج

في السيطرة المطابقة لنظام الكرة المجوفة الحرة من الحاجز الدموي الدماغي والمغطاة بنفس كمية مصفوفة الغشاء القاعدي، توزعت إشارات HMC3-RFP بشكل واسع نسبيًا عبر الطبقة الظهارية القمية (الشكل 2). في حالة الحاجز الدموي الدماغي (BTB)، أظهرت صور النهاية إشارات HMC3-RFP بشكل رئيسي في المناطق غير المغطاة بكرات الورم، مع تناقص الإشارة أسفل الكرات وفي المناطق المجاورة مباشرة (الشكل 2). تُظهر هذه البيانات وجود ارتباط مكاني بين وجود كُريات الورم وتوزيع خلايا HMC3-RFP عند النقطة النهائية. وبما أنه لم يتم تقييم التوزيع الأساسي لخلايا HMC3-RFP قبل إدخال الكُريات أو تتبع الخلايا على امتداد الزمن، فإن البيانات الحالية لا تُثبت حدوث هجرة نشطة للدبقية الصغيرة، أو طَرد الخلايا، أو استبعادها المُحفَّز بالورم.

أظهرت الخلايا النجمية أيضًا فروقًا في إشارة العلامات والشكل الخلوي في حالة الحاجز الدموي الدماغي (BTB)الشكل 2). بالمقارنة مع الصورة الممثلة للسيطرة الخالية من الكُتَل والخالية من مصفوفة الغشاء القاعدي المتطابقة، أشارت الصور الممثلة إلى زيادة في شدة إشارة الفلورة لـGFAP في كل من المناطق المحيطة بالكُتَل والمناطق البعيدة. وقد أظهرت الخلايا الدبقية النجمية عند حافة الكُتَل تضخماً في أجسامها الخلوية، وعمليات خلوية أكثر سماكة وامتداداً، واتجاه العمليات نحو حافة الكُتَل (الشكل 2). تتماشى هذه السمات النهائية مع ظهار يشبه الخلايا النجمية التفاعلية، ولكنها من تلقاءها لا تُثبِت برنامجًا محددًا للتنسج النجمي التفاعلي أو الآلية الكامنة وراءه. وتم ملاحظة هياكل نجمية حول الورم متشابهة من حيث الشكل النسيجي في مقاطع أنسجة الانتشار الدماغي لسرطان الثدي البشري، حيث أظهر التلوين بالمناعة الفلورية سمات تتماشى مع التنسج النجمي التفاعلي حول الورم (الشكل 3A). لوصف خصائص الخلايا النجمية المرتبطة بـ AQP4 بشكل أعمق، أُجري تلوين مناعي بالفلورة لـ AQP4 في نموذج الحاجز الدموي الدماغي الخالي من الكُتَل العضوية المطابق، وفي المناطق البعيدة والمجاورة للكُتَل العضوية في نموذج الحاجز الدموي الورميالشكل 3B). تُظهر الصفوف الأول والثاني والثالث على التوالي صورًا تمثيلية لنموذج الحاجز الدموي الدماغي، والمنطقة الطرفية لنموذج الحاجز الدموي الودي، والمنطقة المحيطة بالكُرة المجاورة للكُريات الورمية (الشكل 3B). داخل نموذج الحاجز الدموي الدماغي، أظهرت الخلايا الدبقية المحيطة بالكرات تمايزًا شكليًا مقارنةً بالخلايا الدبقية البعيدة. باستخلاص النتائج، تدعم ملاحظات GFAP/AQP4 والتمايز الشكلي إعادة تشكيل الخلايا الدبقية المرتبطة بالكرات الورمية ضمن هذا النموذج؛ وينبغي تفسير التشابه مع أنسجة المرضى على أنه تشابه ظاهري وليس دليلاً على أن النموذج يُعيد إنتاج الظاهرة الدبقية حول الورم لدى البشر بشكل كامل.

لتقييم التغيرات المرتبطة بالكرات الورمية في تنظيم الوصلات البطانية، أجرينا تلوينًا مناعيًا بالفلورسنت للبروتين الوصلي الضيق ZO-1 في الطبقة القاعدية من الخلايا البطانية الدماغية الدقيقة البشرية (HBMEC) في نماذج الحاجز الدموي الدماغي المبسطة والحاجز الدموي الورمي، باستخدام ظروف متطابقة إما بدون كرات ورمية أو تحتوي على كرات ورمية، مع تغطية كميات متساوية من مصفوفة الغشاء القاعدي. وركّز التصوير بالمجهر المتحد البؤر على المنطقة المقابلة للكرات الورمية (الشكل 4A). في السيطرة المطابقة الخالية من الكُرَى، أظهرت إشارات ZO-1 بين الخلايا البطانية للدماغ البشري نمط توزيع خطي مستمر نسبيًا مع حدود بين خلوية محددة بوضوح. في حالة الحاجز الدموي-الدماغي الورمي (BTB)، بدت إشارة الفلورة لـ ZO-1 في المناطق المقابلة للكُرَى الورمية أخفَّ كثافة، مع حدوث انقطاعات بؤرية وعدم اتصال.الشكل 4A). تتماشى هذه الصور النهائية مع فقدان محلي في تنظيم الوصلات الضيقة. ومع ذلك، فإنه بدون علامات جزيئية محددة للحاجز الدموي-الخصوي أو تجارب عرقلة آلية إضافية، لا يمكن للبيانات الحالية التمييز بين إعادة تشكيل الحاجز الدموي-الخصوي المحددة والإصابة البطانية المرتبطة بالورم غير المحددة أو اختلال الحاجز.

على المستوى الوظيفي، تم إجراء قياس مقاومة الشد الكهربائي الظهاري (TEER) وفحوصات نفاذية الديكستران المرتبط بـ FITC في اليوم 7 بشكل متزامن في كل من ظروف المصفوفة الخالية من الكُتَل والضابطة الخالية من الغشاء القاعدي، وظروف الحاجز الدموي الدماغي (BTB) المحتوية على الكُتَل.الشكل 4B). تُعرض القيم الفردية من جميع التكرارات البيولوجية الثلاثة المستقلة كنقاط تشتت في الشكل 4B، مع عرض البيانات الموجزة كمتوسط ± الانحراف المعياري. قيمة المقاومة الكهربائية عبر البطانة (TEER) لحالة الحاجز الدموي الدماغي (106.0 ± 9.5255 Ω·سم2، ن = 3 تكرارات بيولوجية مستقلة) كان أقل من ذلك في المجموعة الضابطة المقابلة (168.0 ± 5.1325 Ω·سم2، ن = 3 تكرارات بيولوجية مستقلة). وبشكل متسق، كان معامل النفاذية الظاهري (Papp) المقاس في اختبار ديكس تران FITC من القطب القمي إلى القاعدي أعلى في حالة BTB (5.851) ± 1.2080 × 10⁻3 سم/ث، ن = 3 تكرارات بيولوجية مستقلة) مقارنةً بالعنصر الضابط المطابق (2.656 ± 1.0937 × 10⁻3 سم/ث، ن = 3 تكرارات بيولوجية مستقلة). اختبار ستيودنت غير المزدوج ذو الذيلين’أظهرت اختبارات t وجود فروق ذات دلالة إحصائية [TEER: t(4) = 9.920، p = 0.0006؛ ب.ظ.ف: ت(4) = 3.395، p = 0.0274] (الشكل 4B). ضمن هذا التكوين التجريبي، يُظهر الانخفاض المتماثل في المقاومة الكهربائية والزيادة في نفاذية FITC-الديكستران تدهور سلامة الحاجز في وجود كُرات الورم. لا تُثبت هذه القياسات وحدها آلية محددة لإعادة تشكيل الحاجز الدموي الدماغي إلى الحاجز الدموي للورم، ولا ينبغي تفسير اختبار نفاذية FITC-الديكستران من القطب القمي إلى القطب القاعدي باعتباره تجربة فيزيولوجية لنقل الدواء من الدم إلى الورم.

figure-results-1
الشكل 2الصبغ بالمناعة الفلورية في نموذج الحاجز الدموي-الخصوي. صور تمثيلية لنفائس المناعة للصبغ باستخدام بان-سي كيه (Pan-CK) وجي إف إيه بي (GFAP) في الطبقات الخلوية القمية لنموذج الحاجز الدموي الدماغي الخالي من الكُويرات (التحكم المطابق) ونموذج الحاجز الدموي الورمي (BTB)، مع تراكب كميات متساوية من مصفوفة الغشاء القاعدي، مع عرض إشارة HMC3-RFP أيضًا. تعرض العمود الأول رسومًا تخطيطية، ويُشير المربع الأسود إلى منطقة العرض في التصوير بالمجهر البؤري المنظوم. الصف الأول يعرض نموذج التحكم المطابق الخالي من الكُويرات (بدون كُويرات)؛ والصف الثاني يعرض المناطق البعيدة عن الكُويرات الورمية في نموذج الحاجز الدموي الورمي (المنطقة البعيدة)؛ والصف الثالث يعرض المناطق المجاورة للكُويرات الورمية في نموذج الحاجز الدموي الورمي (المنطقة المحيطة بالكُويرات). تُشير الأسهم إلى مناطق تُظهر سمات شكلية للدبقات تتماشى مع النمط الظاهري التفاعلي. صُبغت النوى الخلوية بصبغة DAPI (باللون الأزرق)، ووُسمت الخلايا الورمية باستخدام البان-سايتوكييراتين (Pan-CK؛ باللون الأخضر)، وتظهر الخلايا الدبقية الصغيرة المُعبرة عن RFP باللون الأحمر، ويظهر صبغ GFAP باللون السماوي. مقياس الشريط = 100 µم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 3: يُظهر التلوين بالمناعة الفلورية مظاهر شكلية تتماشى مع تفاعل النجميات الالتهابية المحيطة بالورم في نموذج الحاجز الدموي الدماغي. (أ) تعرضت مقاطع أنسجة الدماغ من مرضى يعانون من نقائل سرطان الثدي إلى الدماغ للفحص باستخدام H&تلوين هيماتوكسيلين وإيوزين. أظهرت هياكل الخلايا النجمية عند واجهة نسيج الورم ونسيج الدماغ أو الأوعية الدموية خصائص شكلية تتماشى مع تَغَلُّظ دبقي تفاعلي حول الورم. تشير الأسهم السوداء إلى مناطق نموذجية. كما أظهر التلوين بالمناعة الفلورية خصائص شكلية للخلايا النجمية تتماشى مع نمط تفاعلي؛ حيث يبرز السهم الأحمر منطقة نموذجية. شرائط المقياس: 50 µم لله&الصور الملونة بالصبغة الكهربائية في الصف الأول، 10 µم لله&الصور الملونة بالصبغة الكهربائية في الصف الثاني، و50 µم للصور المناعية بالفلورسcence في الصف الثالث. (ب) أُجري تلوين مناعي بالفلورسcence لـ AQP4 في نموذج الحاجز الدموي الدماغي الخالي من الكُتَل العنقودية وفي المناطق البعيدة والمجاورة للكُتَل العنقودية في نموذج الحاجز الدموي للدماغ-الورم. تعرض الصف الأول صورًا نموذجية لنموذج الحاجز الدموي الدماغي، ويعرض الصف الثاني صورًا نموذجية للمنطقة البعيدة في نموذج الحاجز الدموي للدماغ-الورم، ويعرض الصف الثالث صورًا نموذجية للمنطقة المجاورة للكُتَل العنقودية القريبة من الكُتَل الورمية. تشير الأسهم إلى التغيرات الشكلية في الخلايا النجمية في المنطقة المجاورة للكُتَل العنقودية. صُبغت النوى باستخدام DAPI وتظهر باللون الأزرق، في حين يظهر AQP4 باللون الأصفر. شريط المقياس = 100 µم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 4: التوصيف الوظيفي لنموذج BTB. (أ) الصبغ بالمناعة الفلورية لبروتين ZO-1 في الطبقة البطانية القاعدية لنماذج الحاجز الدموي الدماغي (BBB) والحاجز الدموي الورمي (BTB) المغطاة بكمية متساوية من مصفوفة الغشاء القاعدي. تُظهر العمود الأول مخططات تخطيطية، حيث تشير المربعات السوداء إلى المناطق المختارة للتصوير بالمجهر البؤري. تُظهر الصف الأول صورًا تمثيلية للطبقة الخلوية القاعدية في نموذج الحاجز الدموي الدماغي دون كُويرات ورمية (بدون كُويرات)، في حين يُظهر الصف الثاني صورًا تمثيلية للطبقة الخلوية القاعدية في نموذج الحاجز الدموي الورمي مع كُويرات ورمية (مع كُويرات). يُبرز السهم الأحمر منطقة ذات إضاءة ضعيفة لـ ZO-1 وانقطاعات بؤرية. صُبغت النوى باستخدام DAPI وتظهر باللون الأزرق، في حين يظهر بروتين ZO-1 باللون الأخضر. شريط المقياس = 50 µم. (ب) قيم مقاومة الكهروكيميائية النهائية (TEER) ومعاملات النفاذية الظاهرية (Papp) لدكستران FITC (4 كيلو دالتون) للتحكم المطابق في الحاجز الدموي الدماغي الخالي من الكُتَل (بدون كُتلة) وحالة الحاجز الدموي للورم (مع كُتلة)، مع طبقة متساوية من مادة المصفوفة الغشائية القاعدية فوق كل منهما. n = 3 تكرارات بيولوجية مستقلة لكل حالة. تُعرض النقاط الفردية لكل التكرارات البيولوجية الثلاثة، ويُقدَّم ملخص البيانات كمتوسط ± تم الحصول على قيم SD. FITC-dextran Papp في الاتجاه القمي إلى القاعدي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

تم استخدام نموذج كروي لإدخال مكون ورمي ثلاثي الأبعاد يوفر تنظيماً مكانياً وقيوداً على الانتشار لا توفرها مزارع الخلايا الورمية التقليدية ثنائية الأبعاد. كما أن بساطته وقابلية تكراره تجعلانه متوافقاً مع سير العمل الموجه نحو الفرز. تم دمج الكريات مع مقصورة حاجز بشري مكونة من ثلاثة أنواع من الخلايا تشمل الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ، والخلايا النجمية، والخلايا الدبقية الصغيرة، لبناء نموذج مبسط متعدد الخلايا للحاجز الدموي الدماغي (BTB) البشري in vitro. يتميز النظام بسهولة التشغيل، والتوافق مع المزارع متعددة الآبار وقياسات الحاجز الكمية (الشكل 1)، ويسمح بتصور مورفولوجيا الخلايا وتوزيعها المكاني عن طريق صبغ المناعة الفلورية. وتدعم التغيرات النجمية المرتبطة بـ GFAP/AQP4 الملاحظة وتشابهها المورفولوجي مع الخلايا النجمية المحيطة بالورم في أنسجة نقائل سرطان الثدي إلى الدماغ مدى ملاءمة هذا النموذج لدراسة تفاعلات محددة بين الورم والخلايا الدبقية والخلايا البطانية5، على الرغم من أن هذه النتائج لا تثبت التكافؤ التام مع الحاجز الدموي الدماغي البشري الكامل.

استُخدمت طريقة القطرة المعلقة لإنتاج كرويات ورمية، والتي تمت زراعتها مشتركة مع خلايا بطانية وعائية دقيقة من الدماغ البشري، وخلايا نجمية بشرية، وخلايا دبقية صغيرة بشرية لإنشاء نموذج بشري مبسط متعدد الخلايا في المختبر منصة BTB. وتحت الظروف التي تم اختبارها، ارتبطت الكريات الورمية بانخفاض في المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER)، وزيادة في نفاذية FITC-dextran من الجهة القمية إلى القاعدية، وتغير في تنظيم بروتين ZO-1، وتغيرات في المورفولوجيا والمؤشرات النجمية. وتعد قياسات TEER والنفاذية من الطرق المعتمدة لتقييم سلامة الحاجز في في المختبر أنظمة الحواجز13,14تُثبت هذه النتائج حدوث خلل في الحاجز المرتبط بالكرويات الورمية وإعادة تشكيل دبقية ضمن هذا النظام المحدد. ومع ذلك، فإن منصة الحاجز الورمي الدماغي (BTB) هذه لا تُحدث تحولاً كاملاً من الحاجز الدموي الدماغي (BBB) إلى الحاجز الورمي الدماغي، ولا تظهر هجرة نشطة للخلايا الدبقية الصغيرة، أو آلية جزيئية محددة لإعادة تشكيل الحاجز الورمي الدماغي. وبناءً على ذلك، يُفضل اعتبار هذه المنصة نموذجاً تجريبياً قابلاً للتطبيق لإنشاء الفرضيات وإجراء دراسات منضبطة للتفاعلات بين الورم والخلايا الدبقية والخلايا البطانية، مع ضرورة إجراء اختبارات نقل ذات اتجاه ملائم عند نمذجة إيصال الدواء الجهازِي.

ينطوي هذا النموذج المبسط على عدة قيود مهمة. أولاً، فهو لا يحتوي على الوحدة الوعائية العصبية الكاملة أو البيئة الدقيقة للورم الدماغي؛ إذ تغيب عنه الخلايا الحوطية، والعصبونات، والغشاء القاعدي/المصفوفة خارج الخلوية المكتملة فسيولوجياً، والخلايا المناعية الجارية. وتعد الخلايا الحوطية منظمات مهمة للوظيفة الوعائية العصبية ووظيفة الحاجز15,16,17، ولكن يظل دمجها في نموذج بشري معياري in vitro أمراً صعباً بسبب محدودية توفر الخلايا الحوطية البشرية الأولية والتباين بين الدفعات الإنتاجية. ولذلك، لا ينبغي وصف هذا النموذج بأنه حاجز دم دماغي ورمي (BTB) بشري كامل، بل منصة تجريبية مبسطة. ثانياً، تستخدم الدراسة الحالية خط خلايا SK-BR-3 كخط وحيد لخلايا سرطان الثدي، وبالتالي لا يمكن تعميم الأنماط الظاهرية الملحوظة على بيولوجيا نقائل سرطان الثدي إلى الدماغ (BCBM) ككل. وسيكون التحقق من صحة النتائج باستخدام أنواع فرعية إضافية من سرطان الثدي، ونماذج ذات ميل للدماغ، أو كرويات أو عضوانيات BCBM مشتقة من المرضى أمراً مهماً لإثبات إمكانية التعميم والأهمية السريرية للمرضى. ثالثاً، تعتبر بيانات HMC3-RFP الحالية ملاحظات نهائية ولا تحدد ما إذا كان النمط المكاني ناتجاً عن الهجرة النشطة، أو البقاء التفاضلي، أو التوزيع الموجود مسبقاً؛ لذا يتطلب الأمر تصويراً طولياً للخلايا الحية للتمييز بين هذه الاحتمالات. رابعاً، تثبت بيانات ZO-1 وTEER وFITC-dextran وجود خلل في الحاجز ولكنها لا تميز بين إعادة التشكيل الخاصة بـ BTB والإصابة البطانية غير النوعية؛ مما يستدعي مزيداً من التوصيف الجزيئي والضوابط الآلية. خامساً، نظراً لأن خلايا HBMECs قد زُرعت على الوجه القاعدي للغشاء في هذا التكوين، فإن مقايسة FITC-dextran من القمة إلى القاعدة المذكورة هي قراءة لسلامة الحاجز وليست مقايسة فسيولوجية للنقل من الدم إلى الورم. ويجب أن تقوم دراسات التوصيل الجهازية بإدخال المقتفي أو الدواء في الحجرة السفلية/القاعدية المواجهة للبطانة والتحقق من النقل نحو حجرة الورم العلوية/القمية. وأخيراً، استندت القياسات الوظيفية الحالية إلى ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة لكل حالة. وعلى الرغم من أن هذا التصميم يفرق بين التكرار البيولوجي والتكرار التقني، فإن زيادة عدد المكررات البيولوجية المستقلة من شأنه أن يعزز تقييم القابلية للتكرار. إن دمج هذه التحسينات، بما في ذلك الخلايا الحوطية والمواد المشتقة من المرضى، قد يؤدي تدريجياً إلى زيادة الأهمية الفسيولوجية والترجمية لهذه المنصة.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل مشروع الإصلاح التعليمي بمقاطعة لياونينغ (JG24DB110)، ومشروع خطة توجيه الحياة والصحة في داليان (2025ZDJH01PT101)، وبرنامج 1+X في المستشفى الثاني بجامعة داليان الطبية (2024LCJSYL07)، والمؤسسة المتحدة لمعهد داليان للفيزياء الكيميائية التابع للأكاديمية الصينية للعلوم وجامعة داليان الطبية (DMU-2&DICP UN202509).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25% Trypsin-EDTA (1×) (لفصل خلايا HMC3-RFP)NCM BiotechC100C1يُستخدم لفصل خلايا HMC3-RFP أثناء تحضير الخلايا.
أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 mLJet BiofilCFT001015تُستخدم لجمع وغسل ومعالجة الكريات الورمية.
طبق زراعة خلايا 12 بئراًJet BiofilTCP011012يُستخدم لحمل أدراج زراعة الخلايا ذات الـ 12 بئراً أثناء بناء نموذج BBB/BTB.
كاشف ترويق لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعادThermo FisherV11326يُستخدم لترويق أغشية زراعة الخلايا المصبوغة قبل التثبيت والتصوير المجهري البؤري.
جسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب مُعلم بـ Alexa Fluor 488ProteintechRGAR002جسم مضاد ثانوي فلوري يُستخدم للكشف عن الأجسام المضادة الأولية للأرانب عن طريق التألق المناعي.
جسم مضاد ثانوي مضاد للفئران مُعلم بـ Alexa Fluor 647ProteintechRGAM005جسم مضاد ثانوي فلوري يُستخدم للكشف عن الأجسام المضادة الأولية للفئران عن طريق التألق المناعي.
مخفف للأجسام المضادةSolarbioA1800يُستخدم لتخفيف الأجسام المضادة الأولية للتصبيغ بالتألق المناعي.
وسط تثبيت مضاد للتلاشيSolarbioS2100يُستخدم لتثبيت الأغشية المصبوغة وتقليل تلاشي الفلورة أثناء التصوير.
مكمل نمو الخلايا النجمية (AGS)ScienCell1852مكمل يُستخدم لزراعة الخلايا النجمية البشرية.
وسط الخلايا النجمية (AM)ScienCell1801وسط زراعة يُستخدم للخلايا النجمية البشرية وكمكون لوسط الغرفة العلوية المختلط.
طبق زراعة خلاياServicebioCCD-100يُستخدم لزراعة الخلايا الروتينية وتحضير الكريات الورمية بطريقة القطرة المعلقة.
كولاجين من النوع ICorning354249يُستخدم لطلاء أوعية الزراعة وأدراج زراعة الخلايا قبل استزراع الخلايا.
أغطية شرائح زجاجيةCitotest10212450Cتُستخدم للتثبيت وتحضير العينات للمجهر.
محلول تصبيغ DAPIServicebioG1012-10MLيُستخدم للتصبيغ النووي المقابل أثناء التصبيغ بالتألق المناعي.
وسط DMEM أساسي (1×)GibcoC11995500BTيُستخدم كوسط أساسي في مقايسة نفاذية FITC-dextran.
مكمل نمو الخلايا البطانية (ECGS)ScienCell1052مكمل يُستخدم لزراعة الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري.
وسط الخلايا البطانية (ECM)ScienCell1001وسط زراعة يُستخدم لخلايا HBMECs وللغرفة السفلية في نموذج BBB/BTB.
مصل جنين العجل (FBS)GibcoA5669701مكمل مصلي يُستخدم في أوساط زراعة الخلايا الكاملة.
ديكستران مُعلم بـ FITC (الوزن الجزيئي 4,000)BeyotimeST2930-50mgمتتبع فلوري يُستخدم لتقييم النفاذية بين الخلايا وحساب Papp.
مخفف أجسام مضادة فلوريةSolarbioA1840يُستخدم لتخفيف الأجسام المضادة الثانوية الفلورية للتصبيغ بالتألق المناعي.
حمض الخليك الثلجيSigma27225يُستخدم لتحضير محلول طلاء الكولاجين من النوع I.
HAHuman astrocyteNAالمكون النجمي لتقييم الاستجابات المورفولوجية والمؤشرية المرتبطة بالورم
HBMECHuman brain microvascular endothelial cellsNAمكون الحاجز البطاني لـ BBB/BTB
HMC3-RFPRFP-labeled human microglial cell line HMC3NAالمكون الدبقي الصغير للتتبع الفلوري
MatrigelCorning354230مصفوفة الغشاء القاعدي تُستخدم كطبقة تغطية لفصل الكريات الورمية عن مقصورة خلايا الحاجز.
وسط MEM كامل (مع NEAA) (10)Procell SystemPM150410Bوسط يُستخدم كمكون من وسط زراعة الغرفة العلوية المختلط.
شرائح مجهريةCitotest188105تُستخدم لتثبيت الأغشية المصبوغة المستأصلة للتصوير المجهري البؤري.
جسم مضاد من الفئران مضاد لـ GFAP البشريEMD MilliporeMAB360-25μLجسم مضاد أولي يُستخدم للكشف عن GFAP في الخلايا النجمية بواسطة التألق المناعي.
بارافورمالدهيدServicebioG1101-500MLيُستخدم لتثبيت الخلايا قبل التصبيغ بالتألق المناعي.
مسحوق PBS محلول ملحي منظم بالفوسفاتServicebioG0002-2Lيُستخدم لخطوات الغسل والموازنة والتحضير طوال البروتوكول.
محلول بنسيلين-ستربتوميسين (P/S)ServicebioG4003-100MLمكمل مضاد حيوي يُستخدم في أوساط زراعة الخلايا الكاملة.
ماصةEppendorf3123000250تُستخدم للتعامل مع السوائل خلال إجراءات زراعة الخلايا والمقايسات.
رؤوس ماصةMWM Bio800201تُستخدم للتعامل الروتيني مع السوائل؛ وتُستخدم الرؤوس ذات النهايات المقطوعة المعدلة لنقل الكريات الورمية.
جسم مضاد متعدد النسائل من الأرانب مضاد لـ PAN-CK البشريMedChemExpressHY-P81164جسم مضاد أولي يُستخدم لتحديد الخلايا الورمية بواسطة التألق المناعي.
جسم مضاد من الأرانب مضاد لـ ZO-1 البشريProteintech21773-1-APجسم مضاد أولي يُستخدم لتقييم تنظيم الوصلات المحكمة البطانية بواسطة التألق المناعي.
SK-BR-3Human breast cancer cell lineNAمكون الكريات الورمية لبناء BTB
درج طبق زراعة الأنسجة (0.4 μm، غشاء PET)، أطباق 12 بئراًJet BiofilTCS016012درج زراعة خلايا مسامي يُستخدم لبناء نموذج الزراعة المشتركة BBB/BTB.
جهاز قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (TEER)MillicellERS-2يُستخدم لقياس المقاومة الكهربائية عبر درج زراعة الخلايا كقراءة لسلامة الحاجز.
TrypLE Express (1×) (لفصل خلايا HBMECs و HA)Gibco12605-010يُستخدم لفصل خلايا HBMECs وخلايا HA أثناء تحضير الخلايا.

المراجع

  1. Park M, et al. Breast cancer metastasis: mechanisms and therapeutic implications. Int J Mol Sci. 2022;23(12):6806. doi:10.3390/ijms23126806.
  2. Wang R, et al. The clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 2019;19(1):1091. doi:10.1186/s12885-019-6311-z.
  3. McConnell HL, Mishra A. Cells of the blood-brain barrier: an overview of the neurovascular unit in health and disease. Methods Mol Biol. 2022;2492:3–24.
  4. Dong X. Current strategies for brain drug delivery. Theranostics. 2018;8(6):1481–1493.
  5. Gril B, et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nat Commun. 2018;9(1):2705. doi:10.1038/s41467-018-05030-w.
  6. Pitz MW, Desai A, Grossman SA, Blakeley JO. Tissue concentration of systemically administered antineoplastic agents in human brain tumors. J Neurooncol. 2011;104(3):629–638.
  7. Adkins CE, et al. Characterization of passive permeability at the blood-tumor barrier in five preclinical models of brain metastases of breast cancer. Clin Exp Metastasis. 2016;33(4):373–383.
  8. Lockman PR, et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clin Cancer Res. 2010;16(23):5664–5678.
  9. Song H-T, et al. Rat model of metastatic breast cancer monitored by MRI at 3 tesla and bioluminescence imaging with histological correlation. J Transl Med. 2009;7:88. doi:10.1186/1479-5876-7-88.
  10. Miarka L, Valiente M. Animal models of brain metastasis. Neurooncol Adv. 2021;3(Suppl 5):v144–v156.
  11. Kim J-H, et al. Inflammatory mammary carcinoma with metastasis to the brain and distant organs in a spayed Shih Tzu dog. J Vet Diagn Invest. 2011;23(5):1079–1082.
  12. Wiese DA, Thaiwong T, Yuzbasiyan-Gurkan V, Kiupel M. Feline mammary basal-like adenocarcinomas: a potential model for human triple-negative breast cancer (TNBC) with basal-like subtype. BMC Cancer. 2013;13:403. doi:10.1186/1471-2407-13-403.
  13. Srinivasan B, et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 2015;20(2):107–126.
  14. Harding IC, et al. Developing a transwell millifluidic device for studying blood-brain barrier endothelium. Lab Chip. 2022;22(23):4603–4620.
  15. Liu X, et al. The role of neurovascular unit damage in the occurrence and development of Alzheimer’s disease. Rev Neurosci. 2019;30(5):477–484.
  16. Nikolakopoulou AM, et al. Pericyte loss leads to circulatory failure and pleiotrophin depletion causing neuron loss. Nat Neurosci. 2019;22(7):1089–1098.
  17. Bell RD, et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 2010;68(3):409–427.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

نقائل سرطان الثدينموذج في المختبرالخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغالمزرعة المشتركة للخلايا النجميةالخلايا الدبقية الصغيرةالكريات الورميةطريقة القطرة المعلقةالنفاذية عبر الخلوية

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.