مقالة منهجية

بروتوكول لتشريح وصبغ مناعي وتثبيت الجهاز البصري لذبابة Drosophila

8 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/73786

⸱

أكتوبر 30, 2026

 ,  ,  , 
1Centre for Genomics and Systems Biology (CGSB), New York University Abu Dhabi, 2Department of Biology, New York University

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكولاً مفصلاً وقابلاً للتكرار لتشريح وتلوين مناعي وتثبيت الجهاز البصري في ذبابة Drosophila في مرحلتي التطور والبلوغ من أجل التصوير عالي الدقة. وتتيح هذه الطرق تصور نمط الخلايا العصبية الوليدة، وتحديد التخصصات العصبية، واستهداف محاور المستقبلات الضوئية، وتنظيم الشبكة العصبية في البالغين، مما يوفر إطاراً متعدد الاستخدامات لدراسة تطور الجهاز البصري.

الملخص

يُعد النظام البصري في ذبابة Drosophila نموذجاً قوياً لاستكشاف كيفية توليد التنوع العصبي ودمجه في دوائر عصبية وظيفية، وهو سؤال محوري في العلوم العصبية التطورية. يتكون هذا النظام من الشبكية وأربعة تجمعات عصبية (neuropils) متميزة هي: الصفيحة (lamina)، والنخاع (medulla)، والفصيصة (lobula)، وصفيحة الفصيصة (lobula plate)، والتي تشكل معاً بنية عالية التنظيم تعالج المدخلات البصرية من الشبكية وتنقلها إلى المراكز العليا في الدماغ. يمر النظام البصري بعمليات إعادة تشكيل كبيرة أثناء التطور؛ فخلال التطور اليرقي، تتولد الأرومات العصبية (neuroblasts) تدريجياً من الظهارة العصبية وتنقسم بشكل غير متماثل لإنتاج أنماط فرعية متنوعة من الخلايا العصبية من خلال دمج برامج التنميط المكاني والزماني. بعد ذلك، تتمايز هذه الخلايا العصبية وتكون وصلات مشبكية دقيقة تبني الدوائر الوظيفية للنظام البصري في الحشرة البالغة. يمكن دراسة هذه العمليات الديناميكية بشكل موثوق باستخدام الصبغ المناعي عبر المراحل اليرقية، والعذراوية، ومرحلة البلوغ. نقدم هنا بروتوكولاً مفصلاً وقابلاً للتكرار لتشريح وصبغ النظام البصري في Drosophila أثناء مراحل تطوره وفي مرحلة البلوغ. نركز بشكل أساسي على التصوير التمثيلي للأرومات العصبية اليرقية لتسليط الضوء على التنميط الزماني والمكاني وتحديد التخصصات العصبية، ولتصور مورفولوجيا التجمعات العصبية في الحشرة البالغة. يوفر هذا إطاراً قوياً لتصور النظام البصري النامي في Drosophila.

المقدمة

يعتبر الجهاز البصري لذبابة Drosophila melanogaster نموذجاً نمائياً هاماً لاستكشاف الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء تطور الجهاز العصبي. وقد ساهمت هياكله النمطية للغاية، ومجموعة أدواته الجينية الواسعة، وعملياته النمائية المحفوظة في تعزيز فهمنا لتطور الخلايا الجذعية العصبية، والتخصيص العصبي، وتجميع الدوائر، وتنظيم الدماغ. يتكون الجهاز البصري للذبابة من شبكية العين المركبة وأربعة من العقد البصرية (optic neuropils) - وهي الصفيحة (lamina)، والنخاع (medulla)، والفصيص (lobula)، وصفيحة الفصيص (lobula plate) - مرتبة في دائرة هرمية معقدة1. تقوم الخلايا المستقبلة للضوء الحسية في الشبكية برصد الضوء وتحويله إلى إشارات عصبية2,3,4. وتمر هذه الإشارات عبر عصبونات بينية محلية وعصبونات إسقاطية تربط بين العقد البصرية الأربعة، حيث تستخلص مراحل المعالجة المتتالية السمات البصرية مثل التباين والحركة واللون4,5. ثم يتم نقل المعلومات البصرية المعالجة إلى مراكز الدماغ العليا عبر عصبونات الإسقاط البصري لمزيد من التكامل4,5,6. ​

يخضع الفص البصري النامي لسلسلة من الأحداث التنموية الموقوتة بدقة والتي تحول الظهارة العصبية (NE) التكاثرية إلى شبكة دوائر عصبية معقدة7,8. تنشأ الظهارة العصبية (NE) من الصفيحة البصرية أثناء التخلق الجنيني7,8. خلال المراحل اليرقية، تتكاثر خلايا الظهارة العصبية في البداية من خلال انقسامات متماثلة لتوسيع تجمع الخلايا السلفية. بعد ذلك، تنتقل تدريجياً لتصبح أرومات عصبية، والتي تنقسم بشكل غير متماثل لتوليد العصبونات والخلايا الدبقية للنظام البصري في الطور البالغ9,10,11,12,13. وتعمل آليات التنميط المكاني الزماني على تنويع الهويات العصبونية، حيث تشكل العصبونات المتولدة حديثاً طبقات متمركزة داخل النخاع النامي، ثم تتمايز لاحقاً إلى دوائر وظيفية أثناء نمو طور العذراء14,15,16,17,18,19. يؤدي تكامل الإشارات المكانية الزمانية إلى تنشيط عوامل نسخ عصبونية محددة لكل نوع من الخلايا، والتي يحدد تعبيرها المستمر أنواع الخلايا العصبونية14,15,20,21,22. وتوجد آليات مماثلة في الصفيحة والفصيصة لتحديد الهويات العصبونية14,23,24,25,26.

أصبح التصوير بالفلورة المناعية للجهاز البصري النامي الطريقة المفضلة لتصوير الأحداث الخلوية والجزيئية التي تكمن وراء تطوره. ولا يعتمد نجاح التصوير على تحضير عينات أنسجة عالية الجودة وكواشف صبغ مناعي موثوقة فحسب، بل يعتمد أيضاً على التشريح الدقيق والتوجيه الصحيح للعينة أثناء التثبيت27,28. تتطلب البنى النمائية والعمليات الخلوية المختلفة توجيه العينات بطرق محددة للكشف عن السمات التشريحية للدماغ. وقد وصفت عدة مقالات وبروتوكولات بالتفصيل عملية تشريح والصبغ المناعي لدماغ Drosophila 28,29,30,31,32. ومع ذلك، فإن عدداً قليلاً منها فقط قد تناول ذلك في سياق عملية نمائية مدروسة على نطاق واسع في الجهاز البصري27.

نقدم هنا بروتوكولاً شاملاً لعمليات التشريح، والصبغ المناعي، وتثبيت الأنظمة البصرية في اليرقات والبالغين. تعتمد طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة لتشريح دماغ اليرقات على استخدام إبر محاقن متوفرة على نطاق واسع، مما يجعل هذا الإجراء متاحاً بسهولة للمختبرات والمؤسسات التعليمية التي تفتقر إلى أدوات التشريح المتخصصة. ونستعرض هذا البروتوكول من خلال أمثلة ممثلة، تشمل تصوير عملية الانتقال من الظهارة العصبية إلى الخلايا العصبية الجذعية (NE to NB) في اليرقات، والتنظيم العصبي المركزي داخل النخاع النامي، والعصبونات في الفص البصري للبالغين. كما نقدم أمثلة توضح تحليلات الأنماط المكانية والزمانية واستهداف المستقبلات الضوئية في النظام البصري النامي والبالغ. وتوفر هذه الإجراءات مع اتجاهات التثبيت المحددة معاً إطاراً عملياً للحصول على صور عالية الجودة وقابلة للتكرار للنظام البصري لـ Drosophila في مرحلتي النمو والنضج، وذلك لأغراض دراسات التطور العصبي.

البروتوكول

1. تحضير الكواشف والمعدات

يتطلب التشريح الناجح والصبغ المناعي للجهاز البصري في ذبابة Drosophila تحضير جميع الكواشف والمعدات قبل بدء التجربة. إن تحضير جميع المحاليل مسبقاً يقلل من وقت التعامل مع الأنسجة ويساعد في الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة طوال الإجراء. يجب تحضير الكواشف التالية وإبقاؤها في المتناول:

  1. محلول ملحي منظم بالفوسفات (1x PBS): قم بتحضير 1x PBS من محلول مخزون بتركيز 10x لاستخدامه في تشريح الأنسجة، والغسل، وتحضير الكواشف. يوفر PBS بيئة متساوية التوتر تحافظ على سلامة الأنسجة أثناء التعامل معها. يُحفظ 1x PBS عند 4 °C.  
  2. وسط التشريح: للتشريح، استخدم وسط شنايدر (Schneider's insect medium) المبرد بالثلج. تم تركيب وسط شنايدر لدعم أنسجة Drosophila من خلال محاكاة التركيب الأيوني لليمف الدموي للحشرة بدقة، ويُنصح به لعمليات التشريح المطولة.
  3. محلول التثبيت (4% فورمالدهيد في 1x محلول ملحي منظم بالفوسفات مع Triton X-100 (PBST)): قم بتحضير محلول فورمالدهيد طازج بتركيز 4% من محلول مخزون فورمالدهيد بتركيز 16% في 1x PBST لضمان التثبيت الأمثل وحفظ الأنسجة. 
    تنبيه: الفورمالدهيد مادة عالية التفاعل وسامة في حال استنشاقها أو بلعها أو امتصاصها عبر الجلد. يجب التعامل معه داخل خزانة استخلاص كيميائية (fume hood) باستخدام معدات الوقاية الشخصية (PPE) المناسبة، والتخلص منه في حاوية النفايات الخطرة المخصصة للفورمالدهيد.
  4. محلول الغسل المنظم (1x PBST): قم بتحضير PBST (عبارة عن 1x PBS يحتوي على 0.3% Triton X-100) لاستخدامه في عمليات الغسل والنفاذية. 
  5. محلول الحجب (Blocking Solution): استخدم إما 5% ألبومين مصل بقري (يُحضر من 30% BSA في 1x PBST) أو 5% مصل ماعز طبيعي (5% NGS في 1x PBST) كمحلول حجب. يساعد ذلك في تقليل الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة. يُحفظ عند 4 °C للاستخدام طويل الأمد.  
  6. تحضير أطباق مطلية بـ Sylgard: توفر أطباق التشريح المطلية بـ Sylgard سطحاً ناعماً يعمل على تثبيت الأنسجة ويحمي رؤوس الملاقط الدقيقة. اخلط قاعدة Sylgard 184 وعامل المعالجة بنسبة 10:1 حتى يمتزجا تماماً. صب الخليط في أطباق بتري للحصول على طبقة متساوية، ثم اتركه ليتصلب عند 37 °C لمدة 2-4 أيام حتى يجف. تبلغ فترة صلاحية خليط Sylgard 184 المحفز في درجة حرارة الغرفة (22-25 °C) حوالي 2 h، لذا يجب استخدام الخليط خلال هذا الوقت.
  7. قم بتبريد جميع أوساط التشريح والمحاليل المنظمة مسبقاً، وحافظ عليها فوق الثلج أثناء تحضير العينات والتشريح والصبغ المناعي للحفاظ على شكل الأنسجة وتقليل التحلل. قبل البدء في البروتوكول، تأكد من تحضير جميع أدوات التشريح، وشرائح المجهر، وأغطية الشرائح، ووسط التثبيت، والملاقط أو إبر التشريح بحيث تكون متاحة بسهولة. اجمع الذباب أو اليرقات في المرحلة التنموية المناسبة وجهزها للتشريح.
    لم يتطلب العمل على Drosophila melanogaster أي موافقة أو إرشادات أخلاقية.

2. تشريح الدماغ اليرقي، والصبغ المناعي، والتثبيت

  1. تشريح:
    1. اجمع من 8 إلى 10 من يرقات الطور الثالث المتجولة ذبابة الفاكهة (*Drosophila*) إخراج اليرقات من داخل القارورة باستخدام فرشاة رسم مبللة، وغسلها في لوح تنقيط زجاجي باستخدام محلول PBS بتركيز 1X مبرد بالثلج لإزالة بقايا الطعام العالقة.
    2. باستخدام ملقط أو فرشاة صغيرة، انقل يرقة واحدة من لوح التنقيط الزجاجي إلى قطرة من محلول PBS بتركيز 1X أو وسط شنايدر (Schneider's medium) المبرد بالثلج الموجودة في مركز طبق بتري بقطر 150 مم (بدون سيلجارد Sylgard). 
    3. أمسك اليرقة من منطقة منتصف الجسم باستخدام إبرة محقنة سعة 1 مل باليد غير المهيمنة. وباستخدام اليد المهيمنة، قم بإجراء قطع مستعرض بإبرة المحقنة في الموضع نفسه، بحيث تُقطع اليرقة إلى نصفين (الشكل 1أ–B).
      ​تنبيه: إبر المحاقن حادة وقد تسبب الإصابة. تخلص من الأدوات الحادة المستخدمة في حاوية مخصصة للأدوات الحادة.
    4. أمسك النصف الأمامي من اليرقة (والذي يمكن تمييزه من خلال خطاطيف الفم السوداء) عند حافة القطع باليد غير المهيمنة. وباستخدام إبرة المحقنة في اليد المهيمنة، ادفع خطاطيف الفم بلطف إلى الداخل عبر تجويف الجسم، كما لو كنت تقلب جورباً من الداخل إلى الخارج. يؤدي هذا الإجراء إلى قلب بشرة اليرقة، مما ينتج عنه تحضير مقلوب (inside-out). وتعد طريقة التشريح المقلوبة أسرع وتساعد في حماية الدماغ وأقراص العين من التلف (الشكل 1ج-D). 
    5. بمجرد قلب القشيرة، يمكن رؤية الدماغ متصلاً بالأقراص التخيلية وكلاليب الفم. وباستخدام إبرة حقنة، يتم إزالة الأنسجة غير المرغوب فيها، بما في ذلك المعي، والغدد اللعابية، والجسم الدهني (الشكل 1هـ). 
    6. انقل الدماغ الذي تم تشريحه إلى لوحة البقع الزجاجية التي تحتوي على 300 µL من محلول PBS بتركيز 1X المبرد بالثلج، والذي يُحفظ على الثلج (الشكل 1F). 
    7. كرر الخطوات 2.1.2–2.1.6 حتى يتم تشريح عدد كافٍ من الأدمغة، أو حتى مرور 20 دقيقة. 
      ​ملاحظة: يجب ألا يتجاوز وقت التشريح 20 دقيقة للحفاظ على الجودة العالية للأنسجة.
    8. استخدم أـ 200 μL استخدام الماصّة لسحب معظم المحلول المنظم من الأدمغة، مع ترك كمية كافية فقط لإبقائها مغمورة.  
    9. التثبيت: أضف 200 μL من محلول التثبيت البارد (4% فورمالدهيد) فوق الأدمغة في طبق التشريح وتغطيتها بشريحة زجاجية مجهرية، ثم وضع الطبق على الهزاز المكتبي بسرعة هز 28 مع 8° الرجّ بزاوية لمدة 20 دقيقة. 
      ​ملاحظة: تجنب سرعات الهز العالية لمنع تفكك الأنسجة. 
      ​تنبيه: مادة الفورمالديهايد خطرة. يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات، ومعطف المختبر، وقناع الوجه، وواقي العينين، عند التعامل مع المحاليل التي تحتوي على الفورمالديهايد.
    10. اشفط محلول التثبيت، ثم أضف 200 μL محلول غسيل (PBS بتركيز 1X مع 0.3% من Triton X-100). قم بإجراء شطفتين سريعتين باستخدام PBST، يليهما غسلان لمدة 20 دقيقة لكل منهما. 
      ​ملاحظة: يُعد Triton X-100 منظفاً أساسياً لنفاذية عينات الأنسجة وتسهيل تغلغل الأجسام المضادة.
    11. الحجب: يتم شفط محلول PBST وإضافة محلول الحجب (5% مصل ماعز طبيعي أو 5% BSA في 1x PBST) إلى الأدمغة. تُحضن لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: تعمل عملية الحضن في محلول الحجب على إشباع مواقع الارتباط غير النوعية في النسيج، مما يؤدي إلى تقليل التلوين الخلفي وزيادة نوعية الأجسام المضادة. يوصى بهذه الخطوة، رغم أنه يمكن تخطيها إذا كان تلوين الأجسام المضادة نوعياً ويظهر حداً أدنى من التلوين الخلفي. 
  2. التلوين المناعي 
    1. قم بتحضير مزيج الأجسام المضادة الأولية بالتخفيف الموصى به في حوالي 50 μL اغسل باستخدام PBST. 
      ​ملاحظة: تُحفظ حصص الأجسام المضادة على الثلج أثناء التحضير للحفاظ على استقرارها ونشاطها.
    2. انقل الأدمغة من الفجوة الزجاجية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل. تخلص من محلول الحجب الزائد من الأدمغة، مع ترك كمية كافية لإبقائها مغمورة.
    3. قم بتحضير محلول مزيج الأجسام المضادة وأضفه إلى الأنبوب الذي يحتوي على الأدمغة. امزج المكونات برفق عن طريق السحب والضخ باستخدام 20 µL رأس ماصة لضمان توزيع متساوٍ للأجسام المضادة.
      ​ملاحظة: تحضين الأدمغة في 50 µL يقلل محلول الجسم المضاد الأولي من استهلاك الأجسام المضادة دون المساس بجودة التلوين. 
    4. تُحضن الأنابيب التي تحتوي على الأدمغة على حامل عند 4 °C لمدة 16 ساعة.
      ​ملاحظة: يمكن إجراء تحضين الجسم المضاد الأولي لمدة تتراوح بين 48 و72 ساعة في درجة حرارة 4 °C لتعزيز الصبغ في بعض الحالات. ويمكن إعادة استخدام الأجسام المضادة الأولية ثلاث مرات على الأقل دون خفض جودة الصبغ.
    5. أضف 200 μL من محلول PBST. قم بإجراء غسلتين سريعتين، تليهما غسلتان طويلتان لمدة 20 دقيقة لكل منهما. 
    6. قم بتحضير مزيج الأجسام المضادة الثانوية بالتخفيفات الموصى بها في حوالي 250 μL من محلول الغسيل PBST. 
      ​ملاحظة: تُجرى جميع عمليات التحضين بعد إضافة الأجسام المضادة الثانوية في الظلام لتجنب التعرض للضوء، والذي قد يؤدي إلى حدوث التبييض الضوئي. 
    7. أزل فائض محلول PBST، ثم أضف مزيج الأجسام المضادة الثانوية إلى الأدمغة. واتركها لتحضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (22–25 °C) أو لمدة 16 ساعة في 4°C على هزاز، مغطى بصندوق من الورق المقوى للحفاظ عليه في الظلام. 
    8. كرر خطوات الغسل السابقة (شطفتان سريعتان، يليهما غسلتان طويلتان لمدة 20 دقيقة لكل منهما) باستخدام PBST. 
      ​نقطة توقف: يمكن تخزين الأدمغة في محلول PBST عند 4 °C لمدة تصل إلى أسبوع واحد. ومع ذلك، يُوصى بتصوير العينات في أقرب وقت ممكن بعد التثبيت لتقليل فقدان الإشارة الناتج عن تحلل الأنسجة أو اضمحلال الفلوروفور.
  3. تثبيت الفصوص البصرية لليرقات
    1. قم بتجهيز شريحة مجهرية عن طريق تنظيفها باستخدام إيثانول بتركيز 70%، واتركها لتجف لمدة 5 دقائق (الشكل 2E). 
    2. ضع شريطين متوازيين من الشريط اللاصق مزدوج الوجه في مركز شريحة المجهر، مع ترك فجوة تتراوح بين 5 و10 مم بين الشريطين. 
    3. باستخدام 200 µL باستخدام ماصة ذات طرف مقطوع، انقل الأدمغة إلى شريحة مجهرية نظيفة أخرى، وأزل الأنسجة غير المرغوب فيها، مثل الأقراص التخيلية للأرجل، التي قد تعيق رؤية المنطقة المستهدفة أثناء التصوير. 
      ​ملاحظة: يمكن ترك الأنسجة الصغيرة التي لا تعيق منطقة الاهتمام أثناء التصوير كما هي أثناء عملية التثبيت.  
    4. انقل الأدمغة إلى الشريحة المجهرية التي تحتوي على الشريط اللاصق مزدوج الوجه. 
      ​ملاحظة: تأكد من عدم جفاف الأدمغة وبقائها مغمورة دائماً في محلول PBST المنظم بتركيز 1x. 
    5. حدد الاتجاه الأمامي-الخلفي لكل دماغ يرقي تحت المجهر المجسم (stereomicroscope)، وذلك باستخدام المورفولوجيا المنتفخة المميزة للدماغ وموضع الحبل العصبي البطني (VNC) كمعالم تشريحية (الشكل 2أ–D).
    6. التثبيت الأمامي: ضع الدماغ بحيث يكون الجانب المنتفخ متجهًا للأعلى، بعيدًا عن الشريحة، ويكون الحبل العصبي البطني (VNC) متجهًا نحو الشريحة (الشكل 2أ, الشكل 3أ).
    7. التثبيت الخلفي: ضع الدماغ بحيث يكون الجانب المنتفخ مواجهًا للشريحة والحبل العصبي البطني (VNC) مواجهًا بعيدًا عن الشريحة (الشكل 2ب, الشكل 3F).
    8. التثبيت الجانبي: يتم تقسيم الدماغ المثبت أمامياً والسلسلة العصبية البطنية (VNC) طولياً على طول الخط المتوسط باستخدام إبرة حقنة سعة 1 مل أو إبرة تنغستن دقيقة لإنتاج نصفي دماغ مقسومين (الشكل 2ج). قم بتدوير كل نصف كرة بمقدار 90° وضعه بحيث يكون الجانب الجانبي، أي جانب سدادة الفصيص (lobula-plug)، مواجهًا للشريحة الغطائية، بينما يكون سطح القطع الإنسي مواجهًا لاتجاه بعيد عن مستوى التصوير (الشكل 2-د, الشكل 3K).
      ​ملحوظة: قم بتعديل وضعية الدماغ تحت المجهر المجسم حسب الحاجة للحصول على التوجيه المطلوب. حافظ على غمر الدماغ أثناء تحديد الوضعية.
    9. اشفط معظم المحلول المنظم، مع ترك كمية كافية لإبقاء الأدمغة مغمورة. 
    10. أضف ٢٠-40 μL من وسط التثبيت (SlowFade Gold Antifade) على المنطقة التي تحتوي على الأدمغة وتوزيعه بالتساوي باستخدام 20 μL ماصة. 
    11. ضع غطاء الشريحة بعناية بحيث يستند إلى شريطي اللاصق، ثم أحكم سد الحواف باستخدام طلاء الأظافر.
      ملحوظة: في حال تكون فقاعات كبيرة بعد وضع شريحة التغطية، أضف المزيد من وسط التثبيت في الفجوة الموجودة بين شريحة التغطية والشريحة الزجاجية حتى تختفي الفقاعات. 

3. تشريح ودباغة مناعية وتثبيت دماغ البالغين

  1. التشريح: يُعد تشريح دماغ البالغين أكثر تطلباً من الناحية التقنية ويتطلب تعاملاً دقيقاً. ويُوصى بشدة باستخدام ملقط حاد من الفولاذ المقاوم للصدأ عند تشريح دماغ البالغين. 
    1. قم بتخدير عدد كافٍ من الذباب البالغ في العمر المطلوب باستخدام منصة تخدير بثاني أكسيد الكربون (CO2 fly pad)، ثم انقلهم إلى منديل ورقي مبلل موضوع على دلو من الثلج للحفاظ على التخدير أثناء عملية التشريح.
      ​ملاحظة: بعد التخدير، يمكن الحفاظ على رطوبة الذباب باستخدام منديل ورقي على الثلج أثناء عملية التشريح، مما يلغي الحاجة إلى الحفاظ على ثاني أكسيد الكربون (CO2)2 وضع الوسادة وتسهيل عملية المناولة.
    2. باستخدام ملقط دقيق، امسك الذبابة البالغة برفق من أرجلها وضعها في طبق بتري مطلي بمادة Sylgard. 
    3. ثبّت الذبابة على الصفيحة المطلية بـ Sylgard عن طريق إدخال دبوس من الأعلى عبر منتصف الصدر، بعيداً عن منطقة الدماغ. اغمر الذبابة في قطرة من محلول PBS المنظم بتركيز 1X أو وسط Schneider المبرد بالثلج، ثم حدد وضعية رأس الذبابة لإجراء التشريح عن طريق تدوير الذبابة باتجاهك أو تحريك الصفيحة. 
      ​تنبيه: دبابيس التشريح حادة وقد تسبب إصابة. تخلص منها في حاوية مخصصة للأدوات الحادة.
    4. باستخدام ملقط في اليد المهيمنة، قم بإزالة الخرطوم والكيوتيكل الجبهي بين العينين بعناية للكشف جزئياً عن الدماغ. يؤدي ذلك إلى إيجاد فتحة أسفل كيوتيكل الشبكية تتيح للملقط تسهيل عملية تشريح الدماغ لاحقاً. 
    5. باستخدام ملقط دقيق، أمسك الشبكية برفق عند حوافها الخارجية واسحبها من كلا الجانبين. توخَّ الحذر لعدم وخز الفصوص البصرية أثناء تقشير الشبكية. 
    6. نظف بعناية الأنسجة المتبقية الملتصقة بالدماغ، مثل الرغامى أو المعي الأمامي. 
    7. انقل الدماغ النظيف إلى لوحة تنقيط زجاجية تحتوي على 200 µL من محلول PBS بتركيز 1X، وتُحفظ على الثلج. 
    8. كرر خطوات التشريح من 3.1.2 إلى 3.1.7 حتى يتم جمع عدد كافٍ من الأدمغة أو مرور 30 دقيقة. 
    9. استخدم أ 200 µL استخدم الماصة لسحب محلول PBS من الأدمغة، مع ترك كمية كافية فقط لإبقائها مغمورة. 
    10. التثبيت: أضف 200 μL من محلول التثبيت البارد (فورمالدهيد 4% في محلول PBS بتركيز 1X) على صفيحة البقع الزجاجية التي تحتوي على أدمغة بالغة مستأصلة، ثم توضع الصفيحة، مغطاة بشريحة زجاجية مجهرية، على هزاز المختبر بسرعة 28 لمدة 30 دقيقة. 
      ​تنبيه: الفورمالديهايد مادة خطرة. يجب ارتداء القفازات المناسبة، ومعطف المختبر، ووسائل حماية العين عند التعامل مع المحاليل التي تحتوي على الفورمالديهايد.
    11. قم بشفط محلول التثبيت، مع ترك كمية كافية لغمر الأدمغة، ثم أضف 200 µL محلول PBST. تُكرر عملية الغسل 3 مرات سريعة ومرتين طويلتين، لمدة 20 دقيقة لكل منها.
    12. الحجب: أزل محلول PBST واحضن الأدمغة في محلول حجب (5% NGS أو 5% BSA) لمدة 45 دقيقة. 
    13. انقل الأدمغة إلى أنبوب سعة 1.5 مل، وأزل معظم محلول الحجب، مع ترك كمية كافية فقط لإبقاء الأدمغة مغمورة.
  2. التلوين المناعي
    1. قم بتحضير مزيج الأجسام المضادة الأولية بالتخفيف المناسب في 50 µL من محلول PBST.  
    2. أضف خليط الأجسام المضادة الأولية إلى الأنبوب الذي يحتوي على الأدمغة، واتركه في الحضانة لمدة تتراوح بين 12 و16 ساعة عند درجة حرارة 4 °C. 
    3. اشفط محلول الأجسام المضادة، ثم أضف محلول PBST لإجراء شطفين سريعين وعمليتي غسل طويلتين لمدة 20 دقيقة لكل منهما.  
    4. قم بتحضير خليط الأجسام المضادة الثانوية بالتخفيفات الموصى بها في 250 µL من محلول PBST. 
    5. أزل محلول PBST ثم أضف مزيج الأجسام المضادة الثانوية. قم بالتحضين على هزاز مختبري (benchtop rocker) في درجة حرارة الغرفة (22-25 °C) لمدة ساعتين أو تُترك لمدة 12-16 ساعة في درجة حرارة 4 °C في الظلام. 
    6. كرر عمليات الغسل (3 مرات سريعة ومرتين طويلتين، لمدة 20 دقيقة لكل منها).
      ​نقطة توقف: توقف عند هذه الخطوة واحتفظ بالأدمغة في محلول PBST عند 4 °C لمدة أسبوع. 
  3.   تثبيت الفصوص البصرية للبالغين
    1. قم بتجهيز شريحة مجهرية عن طريق تنظيفها باستخدام الإيثانول بتركيز 70%. 
    2. قم بتجهيز جسر من شرائح التغطية عن طريق وضع شريحتين من شرائح التغطية مقاس 18 × 18 مم على قطرة صغيرة من غراء لاصق متعدد الأغراض، وذلك لإنشاء مسافة (أقل من 1 مم) بينهما لوضع الأدمغة (الشكل 2F).
    3. باستخدام 200 µL اقطع طرف الماصة، وانقل الأدمغة المنظفة إلى شريحة زجاجية، وأزل الأنسجة التي قد تعيق الرؤية أثناء التصوير، مثل القصبة الهوائية أو كيوتيكل الرأس.
    4. انقل الأدمغة التي تم تنظيفها إلى جانب التثبيت الذي تم تحضيره في الخطوة 3.3.2. 
      ​ملاحظة: حافظ على غمر الأدمغة في محلول PBST بتركيز 1x طوال إجراء عملية التثبيت، ولا تسمح بجفافها.
    5. باستخدام المجهر المجسم، حدد الاتجاه الأمامي-الخلفي لكل دماغ بالغ بناءً على شكله العام؛ حيث يتوافق السطح المحدب مع الجانب الأمامي، بينما يتوافق السطح المقعر مع الجانب الخلفي.
    6. التثبيت الأمامي: ضع الدماغ بحيث يكون السطح الأمامي والفصوص الهوائية مواجهة لغطاء الشريحة (الشكل 4A).
    7. التثبيت الخلفي: ضع الدماغ بحيث يكون السطح الخلفي مواجهًا لشريحة التغطية والفصوص الهوائية مواجهة للجهة البعيدة عن شريحة التغطية (الشكل 4-د).
    8. التثبيت الجانبي: ضع الدماغ بحيث تكون العصبونات البصرية (visual neuropils) موجهة بشكل موازٍ لمستوى التصوير. ضع الدماغ في الموضع الأمامي، ثم قم بتدويره 90°، وثبّتها مقابل حافة غطاء الشريحة الفاصل (الشكل 4G).
    9. اشفط معظم محلول PBST المنظم بتركيز 1x، مع ترك كمية كافية لإبقاء الأدمغة مغمورة. 
    10. أضف 40 μL من وسط التثبيت (ويُفضل استخدام VECTASHIELD Antifade Mounting Media) فوق المنطقة التي تحتوي على الأدمغة، ثم توزيعه بالتساوي باستخدام 20 μL ماصة. أضف المزيد من وسط التثبيت إذا لزم الأمر.  
      ​ملاحظة: يعمل وسط التثبيت المانع للتلاشي VECTASHIELD بشكل جيد مع شريحة الجسر ذات الغطاء الزجاجي لأن لزوجتها العالية تساعدها على البقاء في المساحة الموجودة بين الأغطية الزجاجية.
    11. ضع شريحة غطاء بمقاس 22 × 22 مم بعناية بحيث تستند على شريحتي غطاء. تخلص من أي فقاعات عن طريق إضافة المزيد من وسط التثبيت من الفجوة. 
    12. أحكم إغلاق الحواف باستخدام طلاء الأظافر (الشكل 2F).

4. الحصول على الصور ومعالجتها

  1. التقط الصور باستخدام مجهر Leica STELLARIS 8 confocal مع عدسات شيئية بقوة تكبير 40x (NA = 1.3) و63x مغمورة بالزيت (NA = 1.4)، وبدقة تبلغ 1024 × 1024 بكسل. 
  2. جمع مجموعات الصور المتراكمة (Z-stacks) بخطوة Z قدرها 1 µm وبسرعة مسح تبلغ 200 Hz. 
  3. التصوير باستخدام المسح ثنائي الاتجاه مع نطاق تكبير يتراوح بين 0.75–1.0x، وذلك حسب العينة. 
  4. إجراء الكشف عند ضبط مستوى الكسب (gain) على 100 باستخدام الكاشف المناسب لكل فلوروفور. 
    ملحوظة: استخدم أطوال موجات إثارة تبلغ 405، 488، 555، و647 nm، مع ضبط قوة الليزر وفقًا للجسم المضاد والفلوروفور الذي يتم تصويره. 
  5. التقط الصور باستخدام برنامج Leica الخاص بالالتقاط، وقم بمعالجتها باستخدام برنامج Fiji/ImageJ2 الإصدار 2.16.0/1.54p.

النتائج

تعد عمليات التشريح الناجحة، والصبغ المناعي، وتوجهات التثبيت الصحيحة أمراً ضرورياً للحفاظ على البنية العامة للفص البصري النامي والالتقاط الدقيق لسماته التشريحية، وانتقالاته النمائية، وأنواع خلاياه. وتوفر توجهات التثبيت المختلفة مناظير تكميلية للأجهزة البصرية في يرقات وبالغـات Drosophila، مما يسمح بتصور مناطق تشريحية وسمات عصبية مختلفة.

توجيهات تثبيت اليرقات:

يوضح هذا القسم اتجاهات التثبيت التمثيلية التي تسهل تصوير الفص البصري اليرقي النامي (الشكل 3). يسلط المخطط الخاص بدماغ اليرقة الضوء على الهياكل الرئيسية للفص البصري، بما في ذلك مركز التكاثر الخارجي OPC، والنخاع medulla، والصفيحة lamina (الشكل 3A). ويظهر التثبيت الأمامي OPC، والانتقال من الظهارة العصبية إلى الخلايا العصبية الجنينية (NE-to-NB)، وحزمة الخلايا العصبية الجنينية في النخاع، والصفيحة النامية. ويبرز الدماغ المثبت أمامياً والمصبوغ بـ Deadpan (Dpn) وE-Cadherin (ECad) وDachshund (Dac) هذه الهياكل (الشكل 3B). كما يوضح هذا الاتجاه تسلسل عوامل النسخ الزمني في الخلايا العصبية الجنينية للنخاع، كما يظهر من التعبير المتسلسل لـ Hth وOpa وErm وEy (الشكل 3C). ويمكن أيضاً رؤية محاور المستقبلات الضوئية، المحددة بأجسام مضادة لـ anti-Chp، والمتداخلة مع عصبونات الصفيحة، في الاتجاه الأمامي (الشكل 3D، E). يكشف التثبيت الخلفي عن مركز التكاثر الداخلي (IPC) وأطراف OPC، مما يوفر مناظر تكميلية للفص البصري النامي (الشكل 3F، G-H). كما يمكن رؤية محاور المستقبلات الضوئية (الموجبة لـ Chp) المتداخلة مع عصبونات الصفيحة في الاتجاه الخلفي (الشكل 3I، J). ويوفر هذا الاتجاه، جنباً إلى جنب مع التثبيت الأمامي، وصولاً تكميلياً إلى مناطق مختلفة من النظام البصري اليرقي النامي. ويكشف التثبيت الجانبي عن النمط المكاني لـ OPC إلى جانب التنظيم متحد المركز للعصبونات (الشكل 3K). كما يوفر التثبيت الجانبي في الوقت ذاته رؤية للتنظيم متحد المركز لعصبونات النخاع (الشكل 3L). وتشمل المجموعات العصبونية التمثيلية عصبونات النخاع الداخلية الموجبة لـ Bsh (Mi1) غير المرتبطة بنطاق مكاني، والعصبونات العابرة للنخاع الموجبة لـ TfAP-2 (Tm1 وTm2 وTm4 وTm6)، بالإضافة إلى الأنواع الفرعية العصبونية المحددة للمنطقة مثل Dm8 وDRA-Dm8 وDm11 (الشكل 3L). ويتواجد Vsx وOptix (Optix-GAL4>GFP) في الظهارة العصبية (NE) ولكن ليس في الخلايا العصبية الجنينية (NB)، بينما يوجد Rx في كل من NE وNBs19. بالإضافة إلى ذلك، يتم التعبير عن Vsx وRx في عصبونات محددة بعد الانقسام تتوافق مع نطاقاتها المكانية19 (الشكل 3M). ويمكن رؤية محاور المستقبلات الضوئية التي تستهدف الصفيحة والنخاع في الاتجاه الجانبي (الشكل 3N، O). تتيح اتجاهات التثبيت هذه تحليل كيفية توليد النمط المكاني والزمني للخلايا العصبية الجنينية في النخاع لهويات عصبونية متميزة14،22.

وضعيات تثبيت الحشرات البالغة: يعرض هذا القسم مخططاً ومثالاً تمثيلياً لوضعيات التثبيت المستخدمة لتصوير الفص البصري في ذبابة Drosophila البالغة. يوفر التثبيت الأمامي عرضاً وجهياً للفص البصري، مما يكشف عن الصفيحة (lamina)، والنخاع (medulla)، والجوانب الأمامية من اللوبولا (lobula) وصفيحة اللوبولا (lobula plate) (الشكل 4A). يقوم Anti-Bruchpilot (Brp) بتمييز العصبونات البصرية، بينما يحدد Bsh عصبونات Mi1 في قشرة النخاع (الشكل 4B). وفي نفس الوضعية، يقوم anti-Chaoptin (Chp) بتمييز محاوير المستقبلات الضوئية التي تمتد إلى الصفيحة والنخاع (الشكل 4C). أما وضعية التثبيت الخلفية فتكشف عن المناطق الأكثر عمقاً في الفص البصري، مما يسمح بتصور النخاع العصبي بعمق (الشكل 4D، E). وفي هذه الوضعية، يوضح صبغ Chp نهايات المستقبلات الضوئية داخل النخاع (الشكل 4F). ويوفر التثبيت الجانبي عرضاً جانبياً للفص البصري، مما يتيح التصوير المتزامن للصفيحة، والنخاع، واللوبولا، وصفيحة اللوبولا (الشكل 4G، H). يحدد Bsh عصبونات الصفيحة (L4 و L5) جنباً إلى جنب مع العصبونات الذاتية للنخاع (Mi1)، بينما يحدد Brp حدود النسيج العصبي. وتستهدف إسقاطات المستقبلات الضوئية مناطق داخل الصفيحة والنخاع (الشكل 4I)، مما يوفر نظرة عامة على تنظيم الجهاز البصري لدى الحشرة البالغة.

توفر اتجاهات التثبيت الأمامية والخلفية والجانبية معاً مناظر تكميلية للأنظمة البصرية النامية والناضجة، مما يمكن الباحثين من فحص المناطق التشريحية المختلفة، والسمات التطورية، والمجموعات العصبونية بناءً على أهدافهم التجريبية.

figure-results-1
الشكل 1: تشريح دماغ يرقة Drosophila باستخدام طريقة إبرة المحقنة. (A) مخطط ليرقة في المرحلة الثالثة المتأخرة يوضح موقع الدماغ والهياكل التشريحية المرتبطة به. (B) يوضح اليرقة وهي موضوعة بين إبرتي محقنة، حيث يشير الخط المنقط إلى الموقع التقريبي للفصل المستعرض. (C) النصف الأمامي لليرقة بعد إزالة الأنسجة المحيطة. (D) خطوات متسلسلة توضح قلب القشيرة اليرقية باستخدام إبر المحقنة. (E) التحضير المقلوب الذي يظهر الدماغ، والأقراص التخيلية، وكلابات الفم. (F) دماغ اليرقة المعزول في طبق بقع زجاجي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: خطوات تثبيت الفصوص البصرية ليرقات وبالغات ذبابة Drosophila. (A) اتجاه التثبيت الأمامي لدماغ اليرقة. (B) اتجاه التثبيت الخلفي لدماغ اليرقة. (C) تنصيف ثنائي للدماغ المثبت أمامياً باستخدام إبرة حقنة. (D) اتجاه التثبيت الجانبي لنصف الدماغ المقطوع. (E) خطوات نموذجية لتثبيت دماغ اليرقة. (F) خطوات نموذجية لتثبيت دماغ البالغ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: اتجاهات التثبيت لتصوير الجهاز البصري ليرقة Drosophila. (A) مخطط يوضح اتجاه التثبيت الأمامي لدماغ اليرقة في الطور الثالث، حيث يواجه السطح الأمامي غطاء الشريحة. (B) صورة مجهرية بؤرية ممثلة لدماغ يرقة مثبت أماميًا تظهر مركز التكاثر الخارجي (OPC) المصبوغ بـ anti-DE-Cadherin (DE-CAD، رمادي)، والنيوروبلاست في النخاع المصبوغة بـ anti-Deadpan (Dpn، أصفر)، والصفيحة النامية المصبوغة بـ anti-Dachshund (Dac، أرجواني). (C) صورة لنيوروبلاست النخاع التي تعبر بالتتابع عن عوامل النسخ الزمنية Homothorax (Hth) و Odd-paired (Opa) و Earmuff (Erm) و Eyeless (Ey) أثناء تطور النيوروبلاست. (D-E) صورة ممثلة لمحاور المستقبلات الضوئية التي تمتد من قرص تخيل العين إلى الصفيحة والنخاع الناميين. (F) مخطط يوضح اتجاه التثبيت الخلفي لدماغ اليرقة، حيث يواجه السطح الخلفي غطاء الشريحة. (G) صورة مجهرية بؤرية للسطح الخلفي السطحي للفص البصري تظهر مركز التكاثر الداخلي (IPC) ونيوروبلاست النخاع المتمركزة عند أطراف OPC (tOPC). (H) مقطع بصري تم الحصول عليه من عمق الفص البصري الخلفي، يبرز IPC واللوبولا النامية. (I-J) منظر خلفي لمحاور المستقبلات الضوئية التي تمتد إلى الفص البصري النامي. (K) مخطط يوضح اتجاه التثبيت الجانبي لدماغ يرقة مقسوم نصفين، حيث يواجه السطح الإنسي المقطوع غطاء الشريحة لتصور التنظيم المركزي للنخاع النامي جنباً إلى جنب مع الصفيحة وسدادة اللوبولا. (L) صورة مجهرية بؤرية ممثلة تظهر الترتيب المركزي للمجموعات العصبونية في النخاع، بما في ذلك عصبونات Mi1 المصبوغة بـ Brain-specific homeobox (Bsh)، وعصبونات Tm1 و Tm2 و Tm4 و Tm6 المصبوغة بـ TfAP-2، وعصبونات Dm8 الموجبة لـ Dachshund (Dac) في النخاع البطني، وعصبونات DRA-Dm8 و Dm11 في منطقة الحافة الظهرية، مما يوضح التنظيم المكاني للأنواع الفرعية لعصبونات النخاع. (M) مسقط الكثافة القصوى لمركز التكاثر الخارجي يظهر نطاقات النمط المكاني المحددة بواسطة عوامل النسخ Vsx و Optix (Optix-GAL4>GFP) و Rx في الفص البصري النامي. (N-O) صورة ممثلة لمحاور المستقبلات الضوئية في اتجاه التثبيت الجانبي، تظهر امتداداتها واستهدافها داخل الصفيحة والنخاع الناميين. شريط المقياس = 50 µm. الاختصارات: La = الصفيحة (Lamina). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: اتجاهات التثبيت لتصوير النظام البصري لذبابة Drosophila البالغة.(A) مخطط يوضح اتجاه التثبيت الأمامي لدماغ الذبابة البالغة، حيث يكون السطح الأمامي مواجهاً لغطاء الشريحة. (B) صورة بؤرية ممثلة لدماغ بالغ مثبت أمامياً تظهر عصبونات Mi1 الإيجابية لبروتين Brain-specific homeobox (Bsh) (باللون الأرجواني) داخل قشرة النخاع والنيوروبيلات الملونة بـ anti-Bruchpilot (Brp، باللون الأزرق). يوفر هذا الاتجاه عرضاً أمامياً للصفيحة الطرفية، والنخاع، واللوبيولا، وصفيحة اللوبيولا. (C) صورة ممثلة لمحاور المستقبلات الضوئية الملونة بـ anti-Chaoptin (Chp، باللون الأصفر) والتي تمتد إلى نيوروبيلات الصفيحة والنخاع. (D) مخطط يوضح اتجاه التثبيت الخلفي لدماغ الذبابة البالغة، حيث يكون السطح الخلفي مواجهاً لغطاء الشريحة. (E) صورة بؤرية ممثلة للنظام البصري لذبابة بالغة مثبتة خلفياً، تبرز الطبقات العميقة من نيوروبيل النخاع الملونة بـ anti-Brp. (F) عرض خلفي لمحاور المستقبلات الضوئية الملونة بـ anti-Chaoptin (Chp، باللون الأصفر) يظهر استهدافها داخل نيوروبيل النخاع. (G) مخطط يوضح اتجاه التثبيت الجانبي لدماغ الذبابة البالغة، حيث يتم وضع أحد الفصص البصرية موازياً لغطاء الشريحة لتصور التنظيم العام للنظام البصري. (H) عرض جانبي ممثل للفص البصري للذبابة البالغة يظهر عصبونات الصفيحة الإيجابية لـ Bsh (L4 وL5) وعصبونات Mi1 في النخاع (باللون الأرجواني)، جنباً إلى جنب مع النيوروبيلات الملونة بـ anti-Brp (باللون الأزرق)، مما يكشف عن التنظيم المكاني للصفيحة، والنخاع، واللوبيولا، وصفيحة اللوبيولا. (I) صورة ممثلة لمحاور المستقبلات الضوئية الملونة بـ anti-Chaoptin (Chp، باللون الأصفر) والتي تمتد إلى نيوروبيلات الصفيحة والنخاع الملونة بـ anti-Brp (باللون الأزرق). شريط المقياس = 50 µm. الاختصارات: Me = النخاع (Medulla)؛ La = الصفيحة (Lamina)؛ Lo = اللوبيولا (Lobula)؛ Lop = صفيحة اللوبيولا (Lobula plate). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لتشريح وتلوين المناعي وتثبيت الأنظمة البصرية في يرقات وبالغة Drosophila من أجل التصوير البؤري عالي الدقة. يحافظ الإجراء على السلامة الهيكلية ومورفولوجيا الفصوص البصرية النامية والناضجة، مع توفير اتجاهات تثبيت تتيح التصور الأمثل للعمليات التطورية الرئيسية والمجموعات العصبية وبنى النيوروبيل. تشمل الأمثلة التمثيلية الموصوفة الانتقال من الظهارة العصبية إلى الخلايا العصبية الأولية (NE-to-NB)، والنمط الزماني والمكاني داخل النخاع، واستهداف محور المستقبلات الضوئية في الفص البصري، وتنظيم نيوروبيلات النظام البصري في البالغين9,10,13,14,23. وبناءً على ذلك، يقدم هذا البروتوكول إطاراً مرناً يمكن تكييفه بسهولة لتصور عمليات أخرى أو أنواع خلوية في أي مرحلة تطورية.

مقارنة بالطرق المنشورة سابقاً، يجمع هذا البروتوكول بين إجراءات محسّنة لكل من الأنظمة البصرية ليرقات وبالغات Drosophila، ويوفر عدة اتجاهات للتثبيت مصممة لتناسب الأسئلة التجريبية المختلفة. وعلى الرغم من أن العديد من البروتوكولات المنشورة تصف تشريح دماغ Drosophila والصبغ المناعي28,29,30,31,32، إلا أن عدداً قليلاً نسبياً يركز تحديداً على النظام البصري في سياق العمليات النمائية27. ويصف البروتوكول طريقة بديلة لتشريح اليرقات تستخدم محاقن سعة 1 mL متوفرة بسهولة بدلاً من الملاقط الدقيقة المتخصصة. ورغم أن هذا النهج يتطلب منحنى تعلم أكثر حدة، إلا أنه يوفر بديلاً نظيفاً وغير مكلف وسريعاً قد يكون ذا قيمة خاصة للمختبرات التعليمية والمجموعات البحثية ذات الوصول المحدود إلى معدات التشريح المتخصصة. وبحسب فهمنا، فإن طريقة التشريح هذه أقل إجهاداً للدماغ من طريقة الملاقط، التي تؤدي إلى سحب الدماغ أثناء التشريح وغالباً ما تتسبب في إصابته. علاوة على ذلك، يستخدم بروتوكول الصبغ المناعي الخاص بنا كوكتيلات من الأجسام المضادة بأحجام مخفضة وبشكل مدروس دون المساس بجودة الصبغ، مما يحافظ على الأجسام المضادة التجارية التي غالباً ما تكون باهظة الثمن. وتوفر هذه الميزات مجتمعة مزايا عملية من حيث سهولة الوصول والتشريح والتثبيت، بينما تسمح بتكييف البروتوكول بسهولة مع المتطلبات التجريبية المختلفة.

يعتمد التنفيذ الناجح للبروتوكول على الاهتمام الدقيق بعدة خطوات رئيسية. وبشكل عام، يمكن معالجة التحديات الشائعة من خلال ضبط إجراءات التشريح أو التثبيت أو التلوين أو التثبيت على الشريحة. قد يؤدي الإجهاد الميكانيكي المفرط أثناء التشريح أو الرج أو السحب بالماصة إلى تلف الأنسجة أو تفتتها؛ لذا، يجب إجراء عمليات التشريح بسرعة في محلول PBS بارد جداً (في الثلج)، مع استخدام حركات لطيفة عند إزالة الأنسجة المحيطة وأثناء عمليات الرج والسحب بالماصة اللاحقة. أما التثبيت الضعيف، والذي يُستدل عليه بتشوه الأنسجة أو فقدان المورفولوجيا أو عدم اتساق التلوين، فقد ينتج عن عدم كفاية وقت التثبيت أو عدم ملاءمة محلول التثبيت. ويساعد استخدام محلول فورمالديهايد مُحضّر حديثاً وغمر النسيج بالكامل أثناء التثبيت في الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة واتساق التلوين. وقد ينتج التلوين الضعيف أو غير المتساوي عن عدم كفاية النفاذية، أو عدم تغلغل الأجسام المضادة بشكل كافٍ، أو عدم مثالية فترة تحضين الأجسام المضادة. ويمكن أن يؤدي زيادة النفاذية أو زيادة وقت تحضين الأجسام المضادة، وتمديد تحضين الجسم المضاد الأولي عند 4 °C حيثما كان ذلك مناسباً، إلى تحسين تغلغل الأجسام المضادة وعملية التلوين. كما قد ينتج التلوين الخلفي العالي عن عدم كفاية الحجب أو الغسيل، أو عن التركيز المفرط للأجسام المضادة. ويمكن أن يساعد الحجب والغسيل الكافيان، جنباً إلى جنب مع الضبط المناسب لتركيز الأجسام المضادة، في تقليل التلوين غير النوعي. ومن ناحية أخرى، قد يؤدي التوجيه الخاطئ عند التثبيت على الشريحة إلى حجب المنطقة المراد دراستها أو وضعها بعيداً جداً عن غطاء الشريحة. لذا فإن إعادة توجيه الدماغ وفقاً للمعالم التشريحية الموضحة في البروتوكول ووضع المنطقة المراد دراستها بالقرب من غطاء الشريحة يمكن أن يسهل تصوير السمة التشريحية الصحيحة.

على الرغم من تعدد استخداماته، قد يتطلب البروتوكول تعديلاً ليتناسب مع أنسجة معينة، أو مراحل نمائية محددة، أو أنواع مختلفة من الأجسام المضادة، ومتطلبات التصوير. فعلى سبيل المثال، قد تستفيد بعض الأنسجة من تقصير مدة التثبيت على الجليد، بينما قد تتطلب بعض الأجسام المضادة فترة تحضين ممتدة عند 4 °C تصل إلى أسبوع واحد، أو على العكس من ذلك، فترة تحضين أقصر عند 22–25 °C. يمكن تقييم جودة التثبيت من خلال الحفاظ على المورفولوجيا العامة للدماغ والفص البصري، ووضوح حدود الأنسجة، وأدنى حد من التشوه أو التفتت أو الانفصال. وبالمثل، يمكن تقييم كفاية النفاذية من خلال صبغ الأجسام المضادة بشكل منتظم نسبياً في جميع أنحاء النسيج، مما يشير إلى تغلغل كافٍ للأجسام المضادة. تسمح هذه الاعتبارات بمرونة في ضبط ظروف التثبيت، والنفاذية، والصبغ، والتركيب لتناسب التطبيق التجريبي المحدد مع الحفاظ على الجهاز البصري لـ Drosophila.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح. وقد راجع المؤلفون جميع التعديلات النهائية ووافقوا عليها.

تم استخدام أداة تحرير اللغة (Grammarly) لتصحيح الأخطاء الإملائية وإعادة صياغة الجمل.

شكر وتقدير

تم الحصول على الأجسام المضادة أحادية النسيلة Brp وDac وDE-Cad وChp من بنك الهجين للدراسات النمائية (Developmental Studies Hybridoma Bank)، الذي أنشأه المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) وتديره جامعة أيوا، قسم الأحياء، مدينة أيوا، IA 52242. حصل A.B. وA.R. وC.S. على دعم من تمكين من خلال جائزة معهد أبحاث جامعة نيويورك أبوظبي الممنوحة لمركز جامعة نيويورك أبوظبي لعلم الجينوم وبيولوجيا الأنظمة (ADHPG-CGSB)، ومن خلال منحة NIH RO1 EY017916 الممنوحة لـ C.D.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
دبابيس تثبيت الحشرات من Austerlitz، 0.15 ممFine Science Tools26002-15
جسم مضاد: Mouse anti-Brp بنك الهجين للدراسات التنمويةnc82تخفيف بنسبة 1:50
جسم مضاد: مضاد Chp من الفأربنك الهجين للدراسات التنموية24B10تخفيف بنسبة 1:50
الأجسام المضادة: أجسام مضادة من جرذ ضد DE-CADبنك الهجين للدراسات التنمويةDCAD2تخفيف بنسبة 1:20
الجسم المضاد: مضاد Dac من الفأربنك الهجين للدراسات التطوريةmAbdac1-1تخفيف بنسبة 1:100
الأجسام المضادة: مضاد GFP من الغنمBioRad4745-1051 تخفيف بنسبة 1:200
جسم مضاد: أرنب مضاد لـ Bsh مختبر ديسبلان-تخفيف بنسبة 1:1000
جسم مضاد: مضاد Hth من خنزير غينيامختبر ديسبلان-تخفيف بنسبة 1:100
جسم مضاد: مضاد TfAP-2 من خنزير غينيا مختبر ديسبلان-تخفيف بنسبة 1:500
جسم مضاد: أرنب مضاد لـ Ey مختبر ديسبلان-تخفيف بنسبة 1:200
جسم مضاد: مضاد Erm من الجرذ مختبر ديسبلان (Desplan lab)-تخفيف بنسبة 1:100
الجسم المضاد: مضاد Rx من خنزير غينيامختبر ديسبلان-تخفيف بنسبة 1:300
جسم مضاد: أرنب مضاد لـ Vsxمختبر ديسبلان-تخفيف بنسبة 1:100
جسم مضاد: IgG مضاد للفأر من الحمار مقترن بـ Alexa Fluor 405Abcamab175658تخفيف بنسبة 1:250
جسم مضاد: جسم مضاد من الحمير ضد IgG الفأري مقترن بـ Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch 715-547-003تخفيف بنسبة 1:400
الجسم المضاد: جسم مضاد من الحمير مضاد لـ IgG الفأري مقترن بـ Alexa Fluor 555ThermoFisher Scientific A31570 تخفيف بنسبة 1:500
جسم مضاد: IgG مضاد للفأر من الحمار مقترن بـ Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch 715-605-151 تخفيف بنسبة 1:250
جسم مضاد: جسم مضاد لـ IgG الخاص بخنزير غينيا من مصدر حمار، مقترن بـ Alexa Fluor 405Jackson ImmunoResearch 706-475-148تخفيف بنسبة 1:250
الأجسام المضادة: جسم مضاد من الحمار ضد IgG لخنزير غينيا مقترن بـ Alexa Fluor 555Sigma-Aldrich SAB4600297-5OUL تخفيف بنسبة 1:500
الجسم المضاد: جسم مضاد من الحمير ضد IgG الخاص بخنزير غينيا مقترن بـ Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch 706-605-148 تخفيف بنسبة 1:250
الجسم المضاد: جسم مضاد من الحمار ضد IgG الأرنب مقترن بـ Alexa Fluor 405Abcamab175651تخفيف بنسبة 1:250
جسم مضاد: IgG مضاد للأرنب من الحمار مقترن بـ Alexa Fluor 555InvitrogenA31572تخفيف بنسبة 1:500
جسم مضاد: جسم مضاد لـ IgG الفأر من مصدر حماري مقترن بـ Alexa Fluor 555AbcamAb150154 تخفيف بنسبة 1:500
الأجسام المضادة: جسم مضاد من الحمير ضد IgG الأغنام مقترن بـ Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch 713-545-147 تخفيف 1:400
حقنة BD سعة 1 مل كاملة مع إبرة مقاس 25g × 16 مم عدد 120بي دي (BD)303175
بقري  ألبومين المصل البقري (BSA)، 30% Sigma-AldrichA7284-50ML
غطاء شريحة زجاجي 18 × 18 ممVWR631-0120
غطاء شرائح زجاجي 24 × 24 ممVWR631-0126
شريط لاصق مزدوج الوجه 19 مم × 33 مسكوتشAMS12354
الذبابة: Canton Sمقياس السعرات الحرارية التفاضلي الماسح (BDSC)64349
ذابة: Optix-GAL4كيوتو104266
الذبابة: nls-GFP/CyO-YFP مختبر BDSC/ Desplan4775
Flystuff Drosophila Ultimate Flypadsشركة جينيسي ساينتيفيك (Genesee Scientific Corporation)59-172B
وعاء ثلج بغطاء، مستدير، 4 لتر، أزرقCorning 432123
الصورة (FIJI)(المعاهد الوطنية للصحة، بيثيسدا، ميريلاند، الولايات المتحدة الأمريكية)Fiji/ImageJ2 الإصدار 2.16.0/1.54p 
مناديل كيمتيك ساينس (Kimtech Science) عالية الدقةKimberly-Clark Professional 05511
فيلم الختم المختبريبارافيلم M (Parafilm M)PM-996
شرائح المجهرVWR8037/1
جهاز طرد مركزي صغيرVWR521-2848
طلاء الأظافرموموسو2023/11/05
مصل ماعز طبيعيSigma-AldrichG9023
فرشاة طلاء كاملينS-66
بارافورمالدهيد (PFA)سيجماP6148
أطباق بتري 100 ملم × 15 ملمفالكون (Falcon)351029
محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)سيجماP5493
PYREX® ٩ ألواح اختبار ذات تجاويف غائرةCorning7220-85
هزاز مختبري (سطحي)Fisherbrand8861025
أنابيب Safelock سعة 1.5 ملEppendorfO219706H
وسط شنايدر لتربية الحشرات سيجماS0146
مادة Slowfade gold المانعة للتلاشيInvitrogenS36936
إلاستومر السيليكون Sylgard 184داو4019862
TritonX-100سيجما93426
إبر تنجستن 0.25 ممفاين ساينس تولز (Fine Science Tools)10130-10
إبر تنجستن 0.5 ملمFine Science Tools10130-20
لاصق UHU متعدد الاستخداماتUHU40815
ملاقط فائقة الدقة بروتينات مصل اللبن المعزولة500235
وسط تثبيت Vectashield المانع للبهتانناقلH-1000
جهاز خلط دواميVWRVM-3000

المراجع

  1. Nériec N, Desplan C. From the Eye to the Brain: Development of the Drosophila Visual System. Curr Top Dev Biol. 2016;116:247–71.
  2. Montell C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 2012;35(6):356–63.
  3. Currier TA, Pang MM, Clandinin TR. Visual processing in the fly, from photoreceptors to behavior. Genetics. 2023;224(2),1–28.
  4. Fischbach KF, Dittrich APM. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell Tissue Res. 1989;258(3):441–75.
  5. Dorkenwald S, et al. Neuronal wiring diagram of an adult brain. Nature. 2024;634(8032):124–38.
  6. Matsliah A, et al. Neuronal “parts list” and wiring diagram for a visual system. bioRxiv: The Preprint Server for Biology. Preprint posted online April 2024.
  7. Younossi-Hartenstein A, Nassif C, Green P, Hartenstein V. Early neurogenesis of the Drosophila brain. J Comp Neurol. 1996;370(3):313–29.
  8. Zhang Y, Li X. Development of the Drosophila Optic Lobe. Cold Spring Harb Protoc. 2024;2024(3):108156.
  9. Apitz H, Salecker I. A Challenge of Numbers and Diversity: Neurogenesis in the Drosophila Optic Lobe. J Neurogenet. 2014;28(3-4):233–49.
  10. Egger B, Gold KS, Brand AH. Notch regulates the switch from symmetric to asymmetric neural stem cell division in the Drosophila optic lobe. Development. 2010;137(18):2981–7.
  11. Sato M, Yasugi T, Minami Y, Miura T, Nagayama M. Notch-mediated lateral inhibition regulates proneural wave propagation when combined with EGF-mediated reaction diffusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(35):E5153–62.
  12. Wang W, et al. Notch signaling regulates neuroepithelial stem cell maintenance and neuroblast formation in Drosophila optic lobe development. Dev Biol. 2011;350(2):414–28.
  13. Yasugi T, Sugie A, Umetsu D, Tabata T. Coordinated sequential action of EGFR and Notch signaling pathways regulates proneural wave progression in the Drosophila optic lobe. Development. 2010;137(19):3193–203.
  14. Bakshi A, Ben El Kadhi K, Desplan C. Decoding neuronal diversity: Mechanisms governing neural cell fate in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 2025;93.
  15. Holguera I, Desplan C. Neuronal specification in space and time. Science (1979). 2018;362(6411):176–80.
  16. Konstantinides N, et al. A complete temporal transcription factor series in the fly visual system. Nature. 2022;604(7905):316–22.
  17. Li X, et al. Temporal patterning of Drosophila medulla neuroblasts controls neural fates. Nature. 2013;498(7455):456–62.
  18. Suzuki T, Kaido M, Takayama R, Sato M. A temporal mechanism that produces neuronal diversity in the Drosophila visual center. Dev Biol. 2013;380(1):12–24.
  19. Chen YC, et al. Single-locus chromatin memory enables flexible spatial fate specification in the Drosophila visual system. bioRxiv. Published online August 21, 2026:2026.08.09.743789.
  20. Erclik T, et al. Integration of temporal and spatial patterning generates neural diversity. Nature. 2017;541(7637):365–70.
  21. Simon F, et al. Spatial, temporal and Notch determination of terminal selector expression controls neuronal cell fate in the Drosophila optic lobe. Nat Neurosci. 2026;29(5):1068–78.
  22. Bhattacharya A, Rao H, Sen SQ. Chromatin priming and Hunchback recruitment integrate spatial and temporal cues in Drosophila neuroblasts. eLife15:RP110150.
  23. Bostock MP, Prasad AR, Donoghue A, Fernandes VM. Photoreceptors generate neuronal diversity in their target field through a Hedgehog morphogen gradient in Drosophila. Elife. 2022;11:e78093.
  24. El-Danaf RN, et al. Morphological and functional convergence of visual projection neurons from diverse neurogenic origins in Drosophila. Nat Commun. 2025;16(1):1–15.
  25. Pinto-Teixeira F, et al. Development of Concurrent Retinotopic Maps in the Fly Motion Detection Circuit. Cell. 2018;173(2):485–98.
  26. Xu C, Ramos TB, Rogers EM, Reiser MB, Doe CQ. Homeodomain proteins hierarchically specify neuronal diversity and synaptic connectivity. Elife. 2023;12:RP90133.
  27. Arain U, Valentino P, Islam IM, Erclik T. Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization. J Vis Exp. 2021;(170):e61273.
  28. Zhang Y, Li X. Immunostaining of Drosophila Brains to Study Optic Lobe Development. Cold Spring Harb Protoc. 2024;2024(3):108157.
  29. Daul AL, Komori H, Lee CY. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harb Protoc. 2010;2010(7):pdb.prot5460.
  30. Sweeney ST, Hidalgo A, de Belle JS, Keshishian H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011;2011(12):1472–4.
  31. Tito AJ, Cheema S, Jiang M, Zhang S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J Vis Exp. 2016;(118):55128.
  32. Wu JS, Luo L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 2006;1(4):2110–5.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

بروتوكول التلوين المناعيتطور الدوائر العصبيةالخلايا العصبية الأولية اليرقيةمورفولوجيا النيوروبيلالتخصيص العصبيتشريح الجهاز البصريالتنميط الزمكانيالروابط المشبكيةالتنوع العصبي

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.