يدمج سير العمل هذا بين ترانسكريبتوميكس الخلايا المفردة والترانسكريبتوميكس الشامل مع فحوصات أولية لأنسجة المرضى لتحديد أولوية MMP1 في قرحة القدم السكري. أظهر MMP1 نمط تعبير متمحور حول الخلايا الليفية ووفرة أعلى في الأنسجة، مما يدعم وجود ارتباط بإعادة تشكيل المصفوفة، بينما تظل السببية والجدوى السريرية غير محسمة.
مقالة بحثية
تحديد أولويات MMP1 في قرحة القدم السكرية من خلال تحليل النسخ المتكامل للكتلة والخلايا الفردية مع التحقق من الأنسجة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لا تزال المصادر الخلوية للتغيرات النسخية القابلة للتكرار في قرحة القدم السكرية (DFU) غير محددة بشكل كامل. دمجت هذه الدراسة بين تحليل التعبير التفاضلي، وتحليل شبكة التعبير الجيني المشترك المرجح (WGCNA)، وفحص جينات الاعتلال العصبي السكري الطرفي (DPN)، واختيار الميزات الاستكشافي باستخدام التعلم الآلي، ومجموعتين خارجيتين من بيانات النسخ الكلي (bulk-transcriptomic)، والتحليل أحادي الخلية، وتحليل شبكات الطب الصيني التقليدي (TCM)، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) ولطخة ويسترن على أنسجة المرضى. وفي مجموعة GSE199939 (10 عينات من DFU و 11 عينة ضابطة)، تم تحديد 3,691 جيناً معرضاً للتعبير التفاضلي، وكان النموذج الأزرق في WGCNA مرتبطاً بقوة بـ DFU (r = 0.97, p = 5 × 10-13). وأدى تقاطع الجينات ذات التعبير التفاضلي، والجينات المركزية للنموذج الأزرق، و 1,062 جيناً مرتبطاً بـ DPN إلى استخلاص 77 مرشحاً. وقد دُعمت الجينات CCL7 و CHEK1 و MKI67 و MMP1 و MMP13 و TRPV2 بطريقتين على الأقل من طرق اختيار الميزات؛ وأثار الفصل التام في عملية إزالة الميزات التكرارية لآلة ناقلات الدعم مخاوف بشأن فرط التخصيص في مجموعة الاكتشاف. وأظهر MMP1 أكبر تغيير في التعبير في مجموعة الاكتشاف (log2 fold change = 9.854; adjusted p = 1.24 × 10-29). وفي المصفوفة المدمجة GSE68183/GSE80178، سجل MMP1 قيمة p معدلة بلغت 0.0159 ومساحة تحت منحنى خصائص التشغيل للمستقبل (AUC) بلغت 0.981. وفي GSE134431، كان تعبير MMP1 أعلى اسمياً في DFU مقارنة بجلد القدم السكري غير المتقرح (p = 0.0225; adjusted p = 0.135; AUC = 0.808). وأظهر تحليل 69,944 خلية من 24 عينة أعلى متوسط تعبير لـ MMP1 في الخلايا الليفية، مع تعبير أعلى على مستوى العينة في الخلايا الليفية، والخلايا القرنية، والخلايا البطانية في DFU. وأظهرت فحوصات أنسجة المرضى وفرة أعلى في mRNA لـ MMP1 في أربعة أزواج متطابقة (اختبار مزدوج على ΔCq, p = 3.04 × 10−5) ووفرة بروتينية أعلى في ثلاثة أزواج متطابقة (paired p = 0.0107). وكان التكرار الإحصائي غير مكتمل. تشير النتائج إلى وجود ارتباط بإعادة تشكيل المصفوفة يتمحور حول الخلايا الليفية، وهو أمر يخضع لقيود ناتجة عن مدخلات عدد النسخ لكل مليون (TPM) في تحليل الاكتشاف القائم على العد، وسجلات المعالجة المسبقة غير المكتملة للتحليل أحادي الخلية، ومجموعات فحوصات الأنسجة الصغيرة. ولا تزال السببية والفائدة السريرية غير مثبتة.
المقدمة
تُعد قرحة القدم السكرية من المضاعفات الشديدة والمتكررة لمرض السكري، والتي تنجم عن تضافر الاعتلال العصبي، والتحميل الميكانيكي المتكرر، ومرض الشرايين المحيطية، والقابلية للإصابة بالعدوى، وضعف ترميم الأنسجة. وتشير التقديرات المعاصرة إلى أن ملايين الأشخاص يتأثرون بها عالمياً كل عام، وغالباً ما تطول فترة الالتئام، مع وجود مخاطر كبيرة لحدوث الانتكاسات، ودخول المستشفى، وبتر الأطراف السفلية، والوفاة1. لذا، لا تعتمد الوقاية والإدارة على رعاية الجروح الموضعية فحسب، بل تعتمد أيضاً على تحديد فقدان الإحساس الواقي، وتقليل الضغط الأخمصي، وعلاج العدوى ونقص التروية، ومعالجة عوامل الخطر الجهازية1,2. ويكتسب الاعتلال العصبي المحيطي السكري أهمية خاصة لأن الخلل الوظيفي الحسي التدريجي يمكن أن يقلل من الوعي بالضغط والصدمات وتلف الأنسجة، بينما قد تؤدي التشوهات الحركية واللاإرادية إلى تغيير الميكانيكا الحيوية للقدم وسلامة الجلد2,3. وعلى مستوى الأنسجة، قد يتزامن الإصابة العصبية مع الالتهاب العصبي، والخلل الوظيفي للأوعية الدقيقة، والإجهاد الأيضي، والترميم المعيب، مما يخلق بيئة جرح تستمر فيها الإصابة رغم الرعاية القياسية1,3.
يتطلب الالتئام الجلدي الناجح تنسيقاً بين الالتهاب، وإعادة التظهير، وتكوين الأوعية الدموية، وتنشيط الخلايا الليفية، وترسيب المصفوفة خارج الخلية (ECM)، وما يلي ذلك من إعادة تشكيل للمصفوفة. وفي حالة مرض السكري، قد تصبح هذه العمليات غير منظمة زمنياً؛ حيث يمكن أن تظل الإشارات الالتهابية نشطة، وقد يضعف هجرة الخلايا الكيراتينية، وقد تكون الاستجابات البطانية غير كافية، وقد تنتج الخلايا الليفية مصفوفة غير طبيعية أو تنظمها بشكل خاطئ. وتعد الخلايا الليفية محوراً أساسياً في المرحلة السدوية للإصلاح لأنها تقوم بتخليق بروتينات المصفوفة، وتنظيم بنية الكولاجين، والتواصل مع الخلايا المناعية والظهارية، والمساهمة في انكماش الجرح. وقد أظهرت الدراسات التي استخدمت خلايا ليفية مشتقة من مرضى يعانون من تقرحات القدم السكرية (DFU) وجود اختلالات مستمرة في النسخ المتعلق بالمصفوفة خارج الخلية (ECM) وتجميع المصفوفة، مما يدعم الرؤية القائلة بأن حالة الخلايا الليفية تمثل مكوناً هاماً في بيولوجيا الجروح المزمنة4. وتشارك بروتينات ميتالوبروتينيز المصفوفة (MMPs) في هذه العملية من خلال شطر ركائز المصفوفة خارج الخلية (ECM)، مما يسمح بهجرة الخلايا، وتجدد الأنسجة، وإعادة تشكيلها؛ ومع ذلك، تعتمد آثارها على الموقع، والتوقيت، وتوافر الركيزة، والتنظيم بواسطة مثبطات ميتالوبروتينيز الأنسجية (TIMPs)5. وبناءً على ذلك، فإن عدم التوازن بين التحلل البروتيني واستبدال المصفوفة قد يتوافق مع ضعف الإصلاح، ولكن زيادة تعبير بروتين MMP واحد لا تحدد بحد ذاتها دوراً ضاراً أو مفيداً. وقد تم الإبلاغ عن تغير في مستويات ميتالوبروتينيز المصفوفة 1 (MMP1)، وهو كولاجيناز خلالي قادر على المشاركة في تجدد الكولاجين الليفي، في أنسجة تقرحات القدم السكرية (DFU)، كما ربطت دراسات سريرية سابقة بين أنماط MMP/TIMP وحالة الجرح أو مسارات الالتئام6,7. وتدعم هذه الملاحظات إجراء المزيد من الاستقصاء حول MMP1 في حالات تقرحات القدم السكرية (DFU).
يوفر التنميط النسخي نهجاً منهجياً لتحديد البرامج الجزيئية المرتبطة بقرحة القدم السكرية (DFU)، إلا أن العديد من القيود المنهجية تعقد عملية التفسير. فمجموعات بيانات الأنسجة الكلية تقوم بحساب متوسط الإشارات عبر الخلايا الكيراتينية، والأرومات الليفية، والخلايا البطانية، والخلايا المناعية، ومكونات أخرى، مما يجعل من الصعب تحديد ما إذا كان المرشح يعكس تعبيراً متغيراً داخل نوع خلوي معين، أو تحولات في التكوين الخلوي، أو كليهما. كما يمكن أن تقل إمكانية المقارنة بين مجموعات البيانات بسبب الاختلافات في المنصات، واستراتيجيات التسوية، ومواقع أخذ عينات الأنسجة، وشدة القرحة، وحالة العدوى، ومرحلة المرض، والأنسجة المرجعية. ومن المهم الإشارة إلى أن جلد القدم السكرية غير المتقرح يمثل مقارناً نسيجياً سكرياً ذا صلة سريرية، ولكنه ليس قابلاً للاستبدال بالجلد السليم. يمكن لتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) أحادي الخلية أن يعالج جزئياً مشكلة المصدر الخلوي من خلال تحليل المجموعات الخلوية غير المتجانسة وحالاتها النسخية. وقد حددت دراسة سابقة للتنسخ أحادي الخلية والمكاني لقرحة القدم السكرية مجموعات متميزة من الأرومات الليفية، وأثبتت أن برامج الأرومات الليفية تختلف وفقاً لسياق الجرح وحالة الالتئام8. وتدعم هذه النتائج استخدام التحليل بدقة خلوية لاستكمال بيانات التنسخ الكلية.
قد تساعد طرق اختيار الميزات في ترتيب أولويات المرشحين من بيانات التعبير عالية الأبعاد، ومع ذلك، فإن الدراسات الطبية الحيوية ذات العينات الصغيرة تكون عرضة بشكل خاص للتقديرات المتفائلة واختيار الجينات غير المستقر. عندما يتجاوز عدد المتغيرات المقاسة عدد العينات البيولوجية بشكل كبير، يمكن أن يحدث فصل تام ظاهري حتى عندما تكون المعلومات التنبؤية القابلة للتعميم محدودة. كما أن إعادة استخدام الملاحظات نفسها لاختيار الميزات، والضبط، وتقييم الأداء تؤدي إلى تضخيم قيمة AUC بشكل أكبر، مما يجعل التحقق المتقاطع المتداخل، والنماذج المقفلة، ومجموعات الاختبار المستقلة حقاً أموراً أساسية لتقييم الأداء التنبؤي9,10. وتعتبر هذه المخاوف ذات صلة بدراسات DFU لأن المجموعات المتاحة علناً غالباً ما تكون صغيرة وغير متجانسة. بالإضافة إلى ذلك، استُخدمت قواعد بيانات مكونات وأهداف وأعشاب الطب الصيني التقليدي فقط لتوليد الفرضيات.
دمجت هذه الدراسة بين تحليل النسخ الشامل (bulk transcriptomics)، وتحليل شبكة共expression الجينية المرجحة (WGCNA)، وفحص الجينات المرتبطة باعتلال الأعصاب السكري (DPN)، واختيار الميزات باستخدام تعلم الآلة، وتقييم مجموعات بيانات خارجية، وتحليل الخلية الواحدة، وتحليل شبكة الطب الصيني التقليدي (TCM)، والتحقق من أنسجة المرضى. تم تقييم الجينات المرشحة التي تم تحديدها في مجموعة الاكتشاف عبر مجموعات بيانات نسخية إضافية، وتم تحديد موقع المرشح الرائد في أنواع خلايا محددة باستخدام بيانات الخلية الواحدة. بعد ذلك، تم فحص MMP1 على مستويي mRNA والبروتين في أنسجة المرضى بواسطة qPCR واللطخة الغربية (western blotting). صُمم هذا الإطار لتحديد مرشح مرتبط بقرح القدم السكري (DFU) قابل للتكرار وتوصيف سياقه الخلوي والبيولوجي.
البروتوكول
تصميم الدراسة ومصادر البيانات
تمت مراجعة الدراسة، بما في ذلك جمع واستخدام عينات أنسجة المرضى لعمليات التحقق بواسطة qPCR وwestern blot، والموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى ووهان الرابع (رقم الموافقة KY2024-161-01). وقد أُجريت جميع الإجراءات التي تضمنت أنسجة بشرية وفقاً للبروتوكول المعتمد والمبادئ الأخلاقية المعمول بها. واستخدم المكون الترانسكريبتومي للدراسة مجموعات بيانات مجهولة الهوية ومتاحة للعموم. كما تم الحصول على موافقة كتابية مستنيرة من جميع المشاركين الذين استُخدمت عينات أنسجتهم في التحقق التجريبي. وحُللت مجموعات البيانات الترانسكريبتومية المتاحة للعموم في شكل مجهول الهوية، وتولت المؤسسات المعنية إجراءات الموافقة للدراسات الأصلية التي أنتجت البيانات.
دمجت هذه الدراسة بين ترانسكريبتوميات الكتلة (bulk transcriptomics)، وتحليل الشبكات، واختيار الميزات، والتحليل أحادي الخلية، والتنبؤ بشبكة الطب الصيني التقليدي (TCM)، والتحقق من أنسجة المرضى. كانت مجموعة الاكتشاف هي مجموعة بيانات Gene Expression Omnibus (GEO) رقم GSE199939 (10 عينات DFU و11 عينة ضابطة). وشمل التقييم الخارجي لترانسكريبتوميات الكتلة مصفوفة مدمجة من GSE68183/GSE80178 (9 عينات DFU و6 عينات ضابطة) وGSE134431 (13 عينة DFU و8 عينات من جلد القدم السكري غير المتقرح [DFS]). واستخدم التحليل أحادي الخلية كائن Seurat معالج مسبقاً ومصنف بواسطة SingleR مشتق من GSE165816، ويضم 69,944 خلية من 24 عينة (14 DFU و10 ضوابط). وشمل تقييم الأنسجة أربعة أزواج متطابقة من المرضى (DFU والمناطق المحيطة بالجرح) لإجراء qPCR وثلاثة أزواج متطابقة لطريقة western blotting، بناءً على سجلات المقايسة المستردة والاقتران الذي أكده المؤلف. جميع المواد والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.
بناء مجموعة الجينات المرتبطة بـ DPN
تم استرجاع الجينات المرتبطة بـ DPN من قاعدة بيانات الجينات التابعة للمركز الوطني لمعلومات التقانة الحيوية (NCBI) باستخدام rentrez. شملت مصطلحات البحث "diabetic peripheral neuropathy" و"diabetic neuropathy" و"diabetic polyneuropathy" و"painful diabetic neuropathy" و"diabetic sensorimotor polyneuropathy"، مع قصر البحث على Homo sapiens. تم تعيين المعرفات المسترجعة إلى رموز الجينات الرسمية، وتحويلها إلى أحرف كبيرة، وتنظيفها، وإزالة المكرر منها. دُمجت الجينات المستمدة من قاعدة البيانات مع قائمة جينات DPN منسقة من الأدبيات العلمية مع إزالة التكرار، مما نتج عنه 1,062 جيناً مرتبطاً بـ DPN. تتوفر سلاسل البحث الكاملة وكود تنظيف المعرفات في النصوص البرمجية المرفقة؛ وهي تشمل أيضاً اعتلالات الأعصاب السكري، ومرض السكري المقترن باعتلال الأعصاب المتعدد المتناظر/المتماثل القاصي أو اعتلال الأعصاب الطرفية، ومصطلح MeSH الخاص باعتلالات الأعصاب السكري. ولا يزال المكون المستمد من الأدبيات العلمية يتطلب توثيقاً للمصادر على مستوى الاستشهادات.
المعالجة المسبقة لمجموعة الاكتشاف وتحليل التعبير التفاضلي
تمت محاذاة مصفوفة تعبير GSE199939 مع جدول النمط الظاهري وفقاً لمعرف العينة. وجُعلت معرفات الجينات المكررة فريدة. وقامت تحليلات الاستكشاف المؤرشفة بتقريب قيم التعبير وتطبيق نموذج توزيع ثنائي الحدين السالب باستخدام برنامج DESeq2 (الإصدار 1.48.2)، مع اعتبار المجموعة عاملاً للتصميم، والمقارنة بين DFU والمجموعة الضابطة. أما الجينات التي كانت تعاني من قيم معدلة مفقودة... p استُبعدت القيم. وتم التحكم في الاختبارات المتعددة باستخدام إجراء بنجاميني-هوخبيرج (BH). واستخدمت قائمة الجينات ذات التعبير التفاضلي (DEG) المؤرشفة قيمة لوغاريتمية مطلقة2 تغير طي أكبر من 1 ومعدل وفقاً لتصحيح BH p < 0.05. أكدت المقارنة مع مصدر GEO العام أن المدخلات كانت بتنسيق TPM، وليست تعدادات القراءات الخام. ولا يفي تقريب قيم TPM بمتطلب تعدادات القراءات الخام الخاص ببرنامج DESeq2. تم الاحتفاظ بالتقديرات الأصلية، ولكن تظل صحة إحصائيات الاكتشاف ونتائج WGCNA واختيار الميزات المعتمدة عليها غير محسمومة في انتظار إعادة التحليل المناسبة. وقد تم توثيق مقارنة المصدر في الأرشيف التكميلي.
لأغراض التصوير البياني، تم تطبيق تحويل تثبيت التباين (VST) الخاص بـ DESeq2 مع ضبط blind = FALSE. وأُجري تحليل المكونات الرئيسية (PCA) على مصفوفة التعبير الخاصة بـ VST. واستخدمت الخريطة الحرارية درجات z المحسوبة لكل صف لأكثر 50 جينًا ذات أقل قيم p معدلة. وقامت آلية تنفيذ PCA بتوسيط وقياس القيم المحولة لكل جين باستخدام prcomp مع ضبط scale. = TRUE.
تحليل شبكة التعبير الجيني المشترك المرجح
بالنسبة إلى تحليل WGCNA، تم الاحتفاظ بالجينات التي تتجاوز عدد قراءاتها 5 في ثلاث عينات على الأقل من GSE199939. تم تقدير عوامل الحجم باستخدام DESeq2، وطُبق تحويل VST مع ضبط blind = TRUE، واختيرت الجينات الـ 5,000 الأكثر تباينًا عبر العينات. تم تقييم جودة العينات والجينات باستخدام goodSamplesGenes، واستُخدم التجميع الهرمي بمتوسط الروابط (average-linkage hierarchical clustering) لتقييم الجودة على مستوى العينات.
تم بناء شبكة موقعة باستخدام WGCNA (الإصدار 1.74). تم تقييم قوى مرشحة تتراوح من 1–10 و 12–30 بزيادات قدرها 2 باستخدام pickSoftThreshold؛ وتم استخدام هدف ملاءمة الطوبولوجيا الخالية من المقياس بقيمة 0.85، وكانت قوة العتبة الناعمة المختارة 18. تم تحديد الوحدات (Modules) باستخدام blockwiseModules من خلال مصفوفة تجاور موقعة ومصفوفة تداخل طوبولوجي موقعة، ومعامل ارتباط بيرسون، والحد الأدنى لحجم الوحدة 30، وارتفاع قطع الدمج 0.25، وعتبة إعادة التعيين 1 × 10-6، و pamRespectsDendro = FALSE، والحد الأقصى لحجم الكتلة 10,000.
تَمَّ حساب الارتباط بين الجينات الذاتية للوحدات (Module eigengenes) وسمة تقرح القدم السكري (DFU) الثنائية. واعتُبرت الوحدات غير الرمادية التي حققت |r| > 0.5 و p < 0.05 مرتبطة بـ DFU. وبالنسبة لكل وحدة مرتبطة، عُرِّفت أهمية الجين (GS) بأنها ارتباط بيرسون بين التعبير الجيني وحالة DFU، وعُرِّفت عضوية الوحدة (MM) بأنها ارتباط بيرسون بين التعبير الجيني والجين الذاتي للوحدة المقابلة. كما عُرِّفت الجينات المركزية (Hub genes) بـ |MM| > 0.8 و |GS| > 0.5. واختيرت الوحدة الزرقاء للمتابعة كونها أظهرت أقوى ارتباط إيجابي مع DFU، ثم أُجري تقاطع لجيناتها المركزية مع الجينات المعبّر عنها تفاضلياً (DEGs) ومجموعة الجينات المرتبطة باعتلال الأعصاب الطرفية السكري (DPN). وبناءً على ذلك، يستخدم حد الجينات المركزية المُبلغ عنه القيم المطلقة لكل من MM و GS، بغض النظر عن إشارة الارتباط.
تحديد أولويات الميزات القائم على التعلم الآلي
تم تقييم الـ 77 جينًا المشتركة بين مجموعات جينات DEG، والجينات المركزية للوحدة الزرقاء (blue-module hub-gene)، والجينات المرتبطة بـ DPN في مجموعة البيانات GSE199939. وتم دمج رموز الجينات المكررة بناءً على متوسط تعبيرها. خضعت مصفوفة الجينات المرشحة لتحويل لوغاريتمي log2 عندما تجاوزت القيمة القصوى 50، كما تمت إزالة الميزات ذات التباين الصفري وتوحيد الميزات المتبقية. استُخدمت بذرة عشوائية (random seed) بقيمة 123. وتضمن التسلسل المطبق ما يلي: فحص المرشحين على نطاق المجموعة بأكملها، ودمج الرموز المكررة، والتحويل اللوغاريتمي المشروط، وتصفية التباين الصفري، وعمليتي التمركز والقياس (centering and scaling) للمجموعة الكاملة، واختيار الميزات الخاص بالخوارزمية. وقد استخدم فحص DEG وWGCNA مجموعة الاكتشاف الكاملة قبل مرحلة التحقق المتبادل على مستوى الخوارزمية. وبناءً على ذلك، فإن سير العمل المذكور لا يؤسس لعملية تحقق متداخلة خالية من التسريب (leakage-free nested validation)، ولا يمكن استخدام قيم AUC الداخلية كتقديرات غير متحيزة للأداء التنبؤي.
تم تطبيق ثلاثة إجراءات لاختيار الميزات. أولاً، تم تركيب انحدار لوجستي باستخدام عامل تقليص واختيار الحد الأدنى المطلق (LASSO) بواسطة glmnet (الإصدار 5.0)، مع استخدام العائلة الثنائية (binomial family)، وقيمة alpha = 1، وخطأ التصنيف كمقياس للتحقق المتقاطع، وبدون تقييس إضافي، مع إجراء تحقق متقاطع خماسي الطيات مقيد بحجم الفئة الأصغر. تم اختيار الميزات عند lambda.1se؛ بينما استُخدمت lambda.min فقط في حال لم يحدد lambda.1se أي جين. ثانياً، تم تركيب غابة عشوائية مكونة من 1,000 شجرة باستخدام randomForest (الإصدار 4.7-1.2)؛ وتم الإبقاء على الجينات التي كان متوسط انخفاض معامل جيني (Gini) فيها مساوياً على الأقل لمتوسط الأهمية عبر الجينات المرشحة. ثالثاً، تم تنفيذ عملية حذف الميزات التكراري باستخدام آلة ناقلات الدعم الخطية (SVM-RFE) بواسطة e1071 (الإصدار 1.7-17)، حيث تم ترتيب الميزات حسب مربع الوزن الخطي على المجموعة الكاملة قبل تقييم مجموعات فرعية من الميزات أصغر تدريجياً عن طريق المساحة تحت المنحنى (AUC) للتحقق المتقاطع باستبعاد عينة واحدة (LOOCV). لم يتم إعادة حساب الترتيب داخل كل طية تدريب. استخدم تركيب SVM الخطي الإعدادات scale = FALSE و probability = TRUE دون شبكة ضبط تكلفة صريحة. استخدم اختيار عقوبة LASSO التحقق المتقاطع الداخلي الخاص به دون حلقة تقييم خارجية منفصلة، وحُسبت أهمية الغابة العشوائية من المجموعة الكاملة.
لم يتم اختيار أي جين بواسطة الطرق الثلاث جميعاً؛ وبناءً على ذلك، تم الاحتفاظ بالجينات التي دعمها طريقتان على الأقل. أنتجت طريقة SVM-RFE قيمة AUC بلغت 1.00 عبر جميع أحجام المجموعات الفرعية التي تم تقييمها، وتم اختيار أصغر مجموعة فرعية متساوية. ونظراً لأن هذا الفصل التام أثار مخاوف بشأن الإفراط في التخصيص (overfitting) والتقييم المتفائل في مجموعة الاكتشاف الصغيرة، لم يتم تفسير قيمة AUC الخاصة بـ SVM-RFE كتقدير للأداء السريري. لم يتم اختبار أي نموذج جيني متعدد مغلق في مجموعة خارجية؛ وقد قامت تحليلات خصائص تشغيل المستقبل (ROC) الخارجية بتقييم تعبير الجينات المرشحة الفردية. وأكد فحص نص التحليل (analysis script) أن المعالجة المسبقة وتصنيف سمات SVM لم يقتصرَا على طيات التدريب. وقد استُخدمت نتائج LOOCV نفسها لاختيار حجم المجموعة الفرعية، دون حلقة تقييم خارجية. وبالتالي، فإن سير العمل هذا يحتوي على تسريب للمعلومات (information leakage) ويدعم فقط تحديد أولويات السمات الاستكشافية.
تحليل الإثراء الوظيفي
تم إجراء تحليلات التمثيل الزائد لـ Gene Ontology (GO) و Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) على مجموعة الجينات الستة. تم ربط رموز الجينات بمعرفات Entrez باستخدام org.Hs.eg.db (الإصدار 3.21.0). أُجري تحليل GO باستخدام clusterProfiler (الإصدار 4.16.0) عبر الأنطولوجيات الخاصة بالعملية البيولوجية، والمكون الخلوي، والوظيفة الجزيئية. استخدم إثراء KEGG رمز الكائن البشري (hsa). عُرّفت المصطلحات ذات الدلالة الإحصائية بأنها ذات قيمة p اسمية < 0.05 وقيمة p معدلة وفق طريقة BH بمقدار < 0.05. ونظرًا لتضمين ستة جينات فقط، استخدم تحليل الإثراء بشكل أساسي للتوصيف الوظيفي. استخدم نص KEGG البرمجي توصيفات KEGG.db المحلية مع enrichKEGG(use_internal_data = TRUE)؛ ويجب توثيق إصدار التوصيف. لم توفر نصوص GO و KEGG البرمجية "كونًا" (universe) مخصصًا، لذا حددت قواعد بيانات التوصيف الخلفيات الافتراضية.
التقييم الخارجي للنسخ الشامل (bulk-transcriptomic)
بالنسبة لمصفوفة GSE68183/GSE80178 المدمجة، تمت توحيد رموز الجينات ودمج الرموز المكررة عن طريق حساب متوسط التعبير عبر الصفوف المتطابقة. وقد تمت مواءمة الجينات المرشحة الستة مع ملف النمط الظاهري. ونظرًا لأن الملفات المتاحة لم توثق بشكل كامل إجراءات الدمج وتصحيح الدفعات (batch-correction) المسبقة، فقد تم تحليل هذه المجموعة من البيانات كما وردت وتفسيرها بحذر. وبناءً على ذلك، لا يمكن إثبات إزالة تأثيرات الدفعات أو استقلالية إشارة المجموعة عن تأثيرات الدراسة من سجل المعالجة المقدم. وتوفر هذه المصفوفة دعمًا استكشافيًا عبر مجموعات البيانات بدلاً من أن تكون تكرارًا حاسمًا للنتائج.
بالنسبة لـ GSE134431، تم استخراج الجينات الستة المرشحة من مصفوفة عدد القراءات لكل كيلوبايت لكل مليون قراءة مرسومة (RPKM) وتم تحويلها إلى log2(RPKM + 1). استُخدمت مجموعة DFS كمجموعة مرجعية وDFU كمجموعة مقارنة. تمثل DFS جلد القدم السكري غير التقرحي. رسم الشكل 4C المقدم في الأصل قيم RPKM الخام؛ بينما يستخدم اللوح المنقح مقياس log2(RPKM + 1) المذكور. تم التحقق من اختبارات Wilcoxon ثنائية الجانب مع التقريب الطبيعي وتصحيح الاستمرارية، وتحليلات ROC الموجهة تلقائياً، على كلا المقياسين، وأعطت قيم p ومساحات تحت المنحنى (AUCs) متطابقة لأن التحويل رتيب تماماً.
في كل مجموعة بيانات تحقق شاملة، تم اختبار اختلافات التعبير بين المجموعات باستخدام اختبارات ويلكوكسون لمجموع الرتب ثنائية الجانب، وطُبق تصحيح BH على الجينات الستة. حُسبت منحنيات ROC باستخدام pROC (الإصدار 1.19.0.1)، مع استخدام الاتجاه الذي تم تحديده تلقائيًا بواسطة الحزمة. كما حُسبت قيم AUC وفترات الثقة 95% (CIs) المقابلة لها لمقارنة أنماط التمييز عبر مجموعات البيانات. قد يؤدي اختيار اتجاه ROC تلقائيًا من كل مجموعة بيانات تقييم إلى إعطاء تمييز متفائل؛ لذا فإن قيم AUC للجين الواحد هذه هي قيم وصفية ولا تصدق نموذج تنبؤ سريري محدد مسبقًا.
التوطين على مستوى الخلية الواحدة والتحليل على مستوى العينة
استخدم تحليل الخلية الواحدة كائن Seurat المحفوظ biofsci_SingleR_annotated_MMP1_analyzed.rds من GSE165816، والذي يحتوي على 22,889 جينًا و69,944 خلية في مقايسة RNA. احتفظت مقايسة RNA بطبقة عددات صحيحة غير سالبة وطبقة بيانات تم إنشاؤها بواسطة LogNormalize بمعامل قياس قدره 10,000 متبوعًا بتحويل log1p؛ ولم تكن الأخيرة TPM. تضمن الكائن 2,000 جين متغير تم اختيارها باستخدام طريقة vst (loess.span = 0.3؛ و20 حاوية متساوية العرض)، وتعبيرًا مقيسًا لجميع الجينات المحتفظ بها (تم تفعيل التمركز والقياس؛ scale.max = 10)، و50 مكونًا رئيسيًا تم حسابها من الميزات المتغيرة باستخدام البذرة 42. استخدم سجل الأوامر المحفوظ أبعاد Harmony من 1-20 لبناء الجوار الأقرب والتقريب والإسقاط المتشعب الموحد (UMAP). تضمنت إعدادات الجوار k = 20، وAnnoy مع 50 شجرة ومسافة إقليدسية، وعتبة تقليم للجوار الأقرب المشترك (SNN) قدرها 1/15. استخدم التجميع دقة 0.8، والخوارزمية 1، وn.start = 10، وn.iter = 10، وrandom.seed = 0. استخدم UMAP تنفيذ uwot، و30 جارًا، وبُعدين للمخرجات، ومقياس مسافة جيب التمام، وmin.dist = 0.3، وspread = 1، وlearning.rate = 1، والبذرة 42. احتفظ الكائن باختزال Harmony، ولكن لم يتسنَّ استعادة حدود مراقبة الجودة الأصلية، واستدعاء RunHarmony الكامل بما في ذلك المتغيرات المصاحبة للدفعات، وإعدادات مرجع SingleR والتوسيم لهذا الكائن الذي تم تحليله. تم تخزين تسميات أنواع الخلايا، وتسميات المجموعات، ومعرفات العينات في SingleR_label وGroup وorig.ident على التوالي. تم الاحتفاظ بعشرة أنواع من الخلايا الموصوفة: الخلايا البائية (B cells)، والخلايا التائية CD8+ T cells، والخلايا البطانية، والخلايا الظهارية، والأرومات الليفية، والخلايا الجذعية المكونة للدم، والخلايا الكيراتينية، والبلاعم، والخلايا الوحيدة، والعصبونات.
تم تلخيص تعبير MMP1 حسب نوع الخلية. صُنفت الخلايا التي يتجاوز تعبير MMP1 المعياري الصفر على أنها موجبة لـ MMP1. ولإجراء التحليل على مستوى العينة، حُسب متوسط التعبير المعياري لكل تركيبة من العينة ونوع الخلية. وقورنت عينات DFU والعينات الضابطة ضمن كل نوع من الخلايا باستخدام اختبارات ويلكوكسون لمجموع الرتب ثنائية الجانب (two-sided Wilcoxon rank-sum tests)، متبوعة بتصحيح BH عبر جميع أنواع الخلايا المختبرة. وكان رقم الدخول للعينة في قاعدة بيانات GEO، وليس الخلية الفردية، هو الوحدة المستخدمة في هذه المقارنات المذكورة. ولم تُعامل أرقام الدخول الـ 24 كدليل على وجود 24 متبرعاً مستقلاً. كما أن الكائن المحفوظ لم يتضمن معرفاً مؤكداً للمتبرع، ولم يتم نمذجة أخذ عينات نسيجية متكررة من المتبرعين؛ وبناءً على ذلك، تُفسر الاختبارات على مستوى العينة على أنها استكشافية. تعتمد هذه الملخصات على متوسط التعبير المعياري ضمن العينة ونوع الخلية؛ وهي ليست نماذج تعبير تفاضلي زائفة في الكتلة (pseudobulk differential-expression models) قائمة على مجموع العد.
تم تقييم عشر مجموعات جينية وظيفية باستخدام Seurat AddModuleScore. وحُسبت ارتباطات Spearman بين تعبير MMP1 في كل خلية ودرجات الوحدات (module scores)، مع إجراء تصحيح BH. ولأغراض التحليل الاستكشافي للخلايا ذات التعبير العالي عن MMP1، تم اختيار ثلاثة أنواع من الخلايا التي أظهرت أعلى متوسط تعبير عن MMP1 من بين أنواع الخلايا التي تحتوي على 50 خلية على الأقل. وقد حُدد حد قطع عام (global cutoff) بأنه وسيط التعبير بين الخلايا الموجبة لـ MMP1 عندما يتوفر أكثر من 10 خلايا موجبة؛ وفيما عدا ذلك، استخدم البرنامج المئوية 75 الإجمالية. تم تعيين الخلايا التي تتجاوز هذا الحد إلى مجموعة MMP1-high، والخلايا المتبقية إلى مجموعة MMP1-low. استخدم FindMarkers اختبار Wilcoxon، مع logfc.threshold = 0.25، و min.pct = 0.1. وخضعت الجينات المرتفعة التعبير التي كانت قيمة p المعدلة لها < 0.05 لتحليل إثراء العمليات البيولوجية في GO. ونظرًا لأن المجموعات تم تعريفها بناءً على تعبير MMP1، فقد استُخدم هذا التحليل لوصف المسارات المرتبطة بحالة MMP1-high. وتعتبر الارتباطات لكل خلية، وقيم p المعدلة لها، وإثراء MMP1-high مقابل MMP1-low وصفية لأنه لم يتم نمذجة التبعية داخل العينة. ولم يتم تفسير الخلايا الفردية على أنها مكررات بيولوجية مستقلة.
التنبؤ بالمكونات والأهداف والأعشاب في الطب الصيني التقليدي (TCM)
تمت مطابقة الجينات الستة ذات الأولوية مع العمود 4 من جدول تفاعلات المواد الكيميائية والجينات في قاعدة بيانات السموم الجينية المقارنة (CTD) المحلية. واقتصرت السجلات على Homo sapiens في العمود 7. تم تقليم أسماء المكونات وتوحيدها لتصبح أحرفاً صغيرة من أجل المطابقة، كما تمت إزالة عمليات الربط المكررة بين المكون والهدف وبين العشبة والمكون. ورُبطت المكونات بالأعشاب باستخدام الجدول المرجعي للعشبة والمكون. استخدم إثراء قاعدة البيانات قيمة p الاسمية < 0.05 وقيمة p المعدلة < 0.05. تمت إزالة السجلات المكررة للعشبة والمكون والهدف قبل التلخيص القائم على التغطية. واستخدم إثراء الأعشاب أداة clusterProfiler::enricher مع اعتبار الربط بين العشبة والمكون بمثابة TERM2GENE، وبقيم minGSSize = 1، وmaxGSSize = 500، وpvalueCutoff = 1، وqvalueCutoff = 1 قبل تطبيق عتبات الدلالة الاسمية والمعدلة وفق طريقة BH. قد تصف هذه الروابط في قاعدة البيانات تغيرات في التعبير أو النشاط، ولا تثبت وجود ارتباط مباشر أو اتجاه موحد للتأثير.
تم ترتيب الأعشاب باستخدام درجة التغطية التالية:
S = 3R + 5L +2T + 3C + 2I + N (1)
هنا، يمثل R عدد سجلات MMP1، وL عدد المكونات المرتبطة بـ MMP1، وT عدد الأهداف المشمولة، وC عدد المكونات الأساسية، وI مؤشر محور المصفوفة، وN العدد الإجمالي للمكونات.
تمثلت المكونات الأساسية في كيرسيتين، ولوتيولين، وبيربيرين. تم ضبط مؤشر محور المصفوفة على القيمة 1 عندما تغطي العشبة كل من MMP1 وMMP13، وعلى القيمة 0 في الحالات الأخرى. تطلب تحديد الأعشاب المرشحة وجود سجل واحد على الأقل مرتبط بـ MMP1، وإما مكونين مرتبطين بـ MMP1 على الأقل، أو أربعة أهداف على الأقل بالإضافة إلى مكون أساسي واحد. استُخدمت الدرجة لتلخيص مدى تغطية قاعدة البيانات ولم تُعامل كمقياس للفعالية الدوائية. وتحدد المعاملات قاعدة تغطية استدلالية مخصصة تؤكد على السجلات والمكونات المرتبطة بـ MMP1، والتغطية الأوسع للأهداف، والمكونات الثلاثة المحددة، والتغطية المشتركة لـ MMP1/MMP13. لم يتم ضبط هذه المعاملات وفقاً للنتائج السريرية أو التحقق منها تجريبياً، وقد تؤدي الأوزان البديلة إلى تغيير ترتيب الأعشاب.
جمع أنسجة المرضى والتقييم الأولي بواسطة qPCR واللطخة الغربية
كان المرضى المصابون بقرح القدم السكري المشخصة سريريًا، والذين خضعوا لعملية تنضير أو جراحة مؤشرة سريريًا في مستشفى ووهان الرابع، مؤهلين للمشاركة عند توفر أنسجة القدم والحصول على موافقة كتابية مستنيرة. وتمثلت معايير الاستبعاد في وجود ورم خبيث في موقع أخذ العينات، أو وجود سبب غير سكري للقرحة، أو عدم كفاية كمية أو جودة الأنسجة للفحوصات المخطط لها. تم الحصول على أنسجة DFU وأنسجة غير متقرحة محيطة بالجرح من المريض نفسه وفقًا لبروتوكول الدراسة المعتمد؛ حيث عملت الأخيرة كمقارن متطابق للمنطقة المحيطة بالجرح، ولم تكن جلدًا سليمًا غير مصاب بالسكري. شمل تقييم qPCR أربعة أزواج متطابقة (أربع عينات DFU وأربع عينات مقابلة من المنطقة المحيطة بالجرح)، بينما شمل تحليل western blotting ثلاثة أزواج متطابقة. وقد أكد المؤلفون التطابق لكل فحص؛ ولم يتم استخدام الهوية المشتركة بين الفحوصات في المقارنات الإحصائية. اعتبر كل مريض وحدة بيولوجية، بينما كانت آبار PCR التقنية عبارة عن قياسات مكررة داخل العينة الواحدة. هدفت هذه الفحوصات الأولية إلى تقييم تعبير MMP1 على مستوى الأنسجة، ولم تكن مصممة لتحديد الأداء التشخيصي، أو السببية، أو إمكانية التعميم عبر الأنماط الظاهرية لـ DFU.
للتحقق بواسطة qPCR، تم استخلاص الحمض النووي الريبي الكلي (total RNA) من عينات أنسجة مشتقة من المرضى باستخدام كاشف استخلاص total RNA وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. تم تقييم تركيز ونقاء الـ RNA طيفياً، واستُخدمت العينات التي تراوحت نسبة A260/A280 فيها بين 1.8–2.1 للتحليلات اللاحقة. تم إجراء النسخ العكسي لـ total RNA (بمقدار 1 µg) باستخدام طقم النسخ العكسي لفيروس لوكيميا الفئران مولويني (M-MLV) في حجم تفاعل نهائي قدره 20 µL. يحدد مشروع الجهاز المتاح نظام PCR في الوقت الحقيقي. تم إجراء الـ PCR الكمي باستخدام 2x SYBR Green PCR master mix في تفاعل بحجم 20 µL يحتوي على 10 µL من 2x SYBR Green master mix، و0.4 µL من كل من البادئات الأمامية والعكسية، و2 µL من الحمض النووي المتمم (cDNA)، و7.2 µL من الماء الخالي من النوكلياز. تضمن برنامج التضخيم مسخاً أولياً عند 95 °C لمدة 30 s، تلاه 40 دورة عند 95 °C لمدة 5 s و60 °C لمدة 30 s. وأُجري تحليل منحنى الانصهار للتحقق من خصوصية التضخيم. تم قياس وفرة نسخ MMP1 باستخدام β-actin (ACTB) كجين مرجعي. تسلسلات البادئات مدرجة في الجدول 1. بالنسبة للتحليل المزدوج المنقح، تم حساب متوسط الآبار التقنية الخمسة لكل هدف داخل كل عينة قبل حساب ΔCq، وحُسب التعبير النسبي لـ MMP1 باستخدام طريقة 2-ΔΔCq ، مع استخدام مجموعة أنسجة ما حول الجرح غير التقرحية كمعاير. كانت أزواج العينات المستردة هي NC–DFU وNC1–DFU1 وNC2–DFU2 وNC3–DFU3، والتي أكد المؤلفون أنها أربعة أزواج متطابقة لكل مريض. استخدم مخطط qPCR السابق قيم الآبار التقنية الخمسة من NC وDFU فقط؛ بينما يظهر المخطط المنقح قيمة واحدة على مستوى العينة بعد حساب متوسط الآبار التقنية لكل زوج من الأزواج الأربعة. استخدم الاستدلال المزدوج ΔCq = mean Cq(MMP1) − mean Cq(ACTB)، بدلاً من قيم التغير المضاعف (fold-change) على مستوى البئر. كما يختلف مشروع الجهاز المؤرشف عن حجم التفاعل وبرنامج الدورات المُبلغ عنه، ولا يزال تطابقه مع التجربة الممثلة في المخطط غير محلول.
من أجل التحقق باستخدام لطخة ويسترن (WB)، تم تجنيس عينات الأنسجة في محلول منظم لمقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي المبرد بالثلج والمضاف إليه مثبطات البروتياز. حُضنت المستخلصات على الثلج لمدة 30 min ثم طُردت مركزياً عند 12,000 x g لمدة 15 min عند درجة حرارة 4 °C. جُمعت السوائل الطافية، وحُددت تركيزات البروتين باستخدام مقايسة حمض البيكينشونينيك. فُصلت كميات متساوية من البروتين (20 µg لكل مسار) على هلامات بولي أكريلاميد وبودرة دوديسيل كبريتات الصوديوم ذات تدرج تركيز 4%–20%، ثم نُقلت إلى أغشية بولي فينيليدين ثنائي الفلوريد بمسامية 0.22 µm. حُجبت الأغشية باستخدام 5% من الحليب منزوع الدسم في محلول ملحي منظم بالتريس يحتوي على 0.1% Tween-20 لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة، ثم حُضنت طوال الليل عند 4 °C مع جسم مضاد متعدد النسائل لـ MMP1 (بنسبة 1:1,000) وجسم مضاد متعدد النسائل لـ cofilin (بنسبة 1:6,000). وبعد ثلاث غسلات باستخدام محلول ملحي منظم بالتريس يحتوي على 0.1% Tween-20، حُضنت الأغشية مع جسم مضاد لـ IgG للأرانب من الماعز مقترن ببيروكسيداز الفجل (بنسبة 1:5,000) لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة. تم تصور حزم البروتين باستخدام ركيزة كيميائية مضيئة محسنة، وصُورت بنظام تصوير التألق الكيميائي باستخدام برنامج التشغيل الملحق (الإصدار 1.2.0)، كما هو مسجل في البيانات الوصفية للصورة. كُميت الحزم باستخدام برنامج ImageJ. استُخدم cofilin كضابط تحميل، وتم تطبيع وفرة بروتين MMP1 بالنسبة لـ cofilin لإجراء المقارنة بين المجموعات.
التحليل الإحصائي والبرمجيات
كانت جميع الاختبارات ثنائية الجانب ما لم ينص على خلاف ذلك. واستُخدمت قيمة p المصححة بطريقة BH و < 0.05 كعتبة أساسية للاختبارات المتعددة. تباينت أحجام العينات الدقيقة حسب مجموعة البيانات، وبالنسبة للتحليل على مستوى العينة في الخلايا المفردة، تباينت حسب وجود نوع معين من الخلايا في كل عينة. وتظهر ملخصات التعبير المستمر كملاحظات فردية مع مخططات صندوقية تعرض الوسيط والمدى الربيعي؛ وتمتد الشعيرات إلى 1.5 مرة من المدى الربيعي. وبالنسبة لتقنية اللطخة الغربية (western blotting)، تم تحليل النسب الست المسترجعة لـ MMP1-to-cofilin باستخدام اختبار t مزدوج وثنائي الجانب على ثلاثة أزواج من المرضى أكد المؤلفون هويتهم (df = 2; p = 0.0107). وبالنسبة لتقنية qPCR، تم حساب متوسط خمس قيم Cq لـ ACTB وخمس قيم Cq لـ MMP1 بشكل منفصل داخل كل عينة قبل حساب ΔCq. وقد قارن اختبار t مزدوج وثنائي الجانب بين قيم ΔCq لقرحة القدم السكرية (DFU) والأنسجة المحيطة بالجرح المتطابقة عبر أربعة أزواج من المرضى أكد المؤلفون هويتهم (df = 3; p = 3.04 × 10−5). واستُخدم متوسط ΔCq للأنسجة المحيطة بالجرح كمعاير مشترك لعرض التعبير النسبي. كما تم الحصول على المتوسط الهندسي للتغير في الطي (fold change) داخل المريض وفاصل الثقة 95% CI الخاص به عن طريق التحويل العكسي لمتوسط فرق ΔCq المزدوج وفاصل الثقة المستند إلى اختبار t. وتظهر الملاحظات البيولوجية الفردية بخطوط تربط الأنسجة المتطابقة؛ علماً بأن الآبار التقنية لا تزيد من الحجم البيولوجي للعينة. وتعتبر قيم p الخاصة بفحص الأنسجة اسمية واستكشافية. ومع وجود ثلاثة أو أربعة مرضى، لا يمكن تقييم طبيعية الفروق المزدوجة بشكل موثوق، وتظل الفحوصات أولية. أُجريت التحليلات المعلوماتية الحيوية وإنشاء الأشكال في برنامج R 4.5.2 على نظام التشغيل Windows 11. وشملت إصدارات الحزم الأساسية DESeq2 1.48.2 و WGCNA 1.74 و glmnet 5.0 و randomForest 4.7-1.2 و e1071 1.7-17 و pROC 1.19.0.1 و clusterProfiler 4.16.0 و Seurat 5.5.0 و SingleR 2.10.0 و rentrez 1.2.4 و ggplot2 4.0.3. ويتوفر جرد موحد للبرمجيات وقواعد البيانات والمعلمات في الجدول التكميلي 1.
النتائج
تحدد ترانسكريبتوميات الاكتشاف برنامج تعبير واسع مرتبط بقرحة القدم السكرية (DFU)
استُخدمت مجموعة GSE199939 كعينة استكشافية وشملت 10 عينات من قرح القدم السكري (DFU) و11 عينة ضابطة (الشكل 1A). وأظهر تحليل المكونات الرئيسية للتعبير الجيني المُطبع باستخدام VST فصلاً واضحاً بين المجموعات؛ حيث فسر المكونان الرئيسيان 1 و2 نسبة 34.8% و15.1% من إجمالي التباين، على التوالي (الشكل 1B).
باستخدام |log2 fold change| > 1 وقيمة p المعدلة وفقاً لطريقة BH < 0.05، حدد تحليل التعبير التفاضلي 3,691 من الجينات ذات التعبير التفاضلي (DEGs)، بما في ذلك 1,247 جيناً ارتفع تعبيرها في تقرحات القدم السكري (DFU) و 2,444 جيناً انخفض تعبيرها في تقرحات القدم السكري (الشكل 1C). شكلت أعلى 50 جيناً ذات تعبير تفاضلي نمط تعبير ذا بنية مجموعات قوية (الشكل 1D). ومن بين الجينات الستة التي تم اختيارها لاحقاً، أظهر جين MMP1 أكبر تغير في مجموعة الاكتشاف (log2 fold change = 9.854؛ وقيمة p المعدلة = 1.24 × 10-29).
وحدة تعبير مشترك مرتبطة بـ DFU تتقارب مع DEGs والجينات المرتبطة بـ DPN
تم إجراء تحليل شبكة التعبير الجيني المشترك الموزون (WGCNA) على أكثر 5,000 جين تباينًا بعد تحويلها باستخدام تحويل الحجم الثابت (VST). تم اختيار قوة عتبة ناعمة قدرها 18 للشبكة الموقعة، لتحقيق التوازن بين ملاءمة الطوبولوجيا الخالية من المقياس والاتصال (الشكل 2أ). وحدد التجميع الهرمي والكشف الديناميكي عن الوحدات عدة وحدات تعبير مشترك (الشكل 2ب). وأظهرت الوحدة الزرقاء أقوى ارتباط إيجابي مع تقرح القدم السكري (DFU) (معامل بيرسون r = 0.97, p = 5 × 10-13; الشكل 2ج). وتتوفر ملخصات مراقبة الجودة الخاصة بتجميع العينات وحجم الوحدات المقابلة في الشكل التكميلي 1أ،ب.
ضمن الوحدة الزرقاء، استوفت 689 جينًا معايير المحور |MM| > 0.8 و |GS| > 0.5 (الشكل 2D). وأدى تقاطع 3,691 من الجينات ذات التعبير التفاضلي (DEGs)، و689 جينًا محورياً في الوحدة الزرقاء، و1,062 جينًا مرتبطًا بـ DPN إلى تحديد 77 جينًا مرشحًا مشتركًا (الشكل 2E). ويظهر عرض مبسط لشبكة المحاور في الوحدة الزرقاء وإحصائيات المحاور الأعلى تصنيفًا في الشكل التكميلي 2A,B.
يؤدي اختيار الميزات متعدد الطرق إلى إعطاء الأولوية لستة جينات، ولكنه يظهر فرط ملاءمة في مجموعة الاكتشاف
تَمَّ تحليل الجينات الـ 77 المتقاطعة باستخدام خوارزميات LASSO، والغابة العشوائية (random forest)، وSVM-RFE. وقد أبقت خوارزمية LASSO على سبعة جينات عند جزاء الاختيار المحدد، وهي: MMP1، وMMP13، وTRPV2، وCCL7، وAURKA، وMKI67، وCHEK1 (الشكل 3A). أما تصفية الغابة العشوائية فقد أبقت على 41 جينًا بأهمية تساوى أو تتجاوز المتوسط، بما في ذلك خمسة أعضاء من اللوحة النهائية ضمن الميزات الأكثر تصنيفًا (الشكل 3B). وأنتجت خوارزمية SVM-RFE قيمة AUC قدرها 1.00 لكل مجموعة فرعية متداخلة تم تقييمها؛ وبموجب قاعدة ربط الحد الأدنى للحجم، تَمَّ اختيار CHEK1 كمجموعة فرعية مكونة من جين واحد (الشكل 3C)، مما يثير مخاوف بشأن الإفراط في التجهيز (overfitting) والتقييم المتفائل في مجموعة الاكتشاف. وتظهر عروض التعبير الجيني المقابلة لمجموعة الاكتشاف، والخريطة الحرارية، ومنحنيات ROC في الشكل التكميلي 3A–C.
لم يتم اختيار أي جين بواسطة الطرق الثلاث جميعاً. وقد أدى الاحتفاظ بالجينات التي تدعمها طريقتان على الأقل إلى تحديد CCL7، وCHEK1، وMKI67، وMMP1، وMMP13، وTRPV2 (الشكل 3D). وسلط تعليق GO لهذه الجينات الستة الضوء على تفكيك المصفوفة خارج الخلوية، والعمليات التقويضية والأيضية للكولاجين، والكروموسوم المكثف، والوظائف المرتبطة بإنزيم ميتالوإندو بيبتيداز (جميع قيم p المعدلة وفق طريقة BH < 0.05؛ الشكل 3E). وحدد تحليل KEGG مسارات إشارات إنترلوكين-17 (IL-17) (CCL7/MMP1/MMP13؛ قيمة p المعدلة = 1.81 × 10-4) ومسارات إشارات الريلاكسين (MMP1/MMP13؛ قيمة p المعدلة = 0.0175؛ الشكل 3F). واستُخدمت نتائج الإثراء هذه لتوصيف الوظائف البيولوجية التي تمثلها مجموعة الجينات الستة.
يظهر التقييم عبر مجموعات البيانات دعماً غير متجانس لـ MMP1
في المصفوفة المدمجة GSE68183/GSE80178 (9 حالات DFU و6 ضوابط)، اختلف كل من CCL7 وMMP1 وMMP13 بين المجموعات بعد تصحيح BH عبر الجينات الستة (قيمة p المعدلة = 0.0168 و0.0159 و0.0431 على التوالي؛ الشكل 4A). أما CHEK1 وMKI67 وTRPV2 فلم تصل إلى عتبة الدلالة المعدلة (قيمة p المعدلة = 0.259 و0.680 و0.259). وقد أنتج تحليل ROC للجينات المفردة قيم AUC بلغت 0.944 لـ CCL7 (فاصل ثقة 95%، 0.825–1.000)، و0.704 لـ CHEK1 (0.403–1.000)، و0.574 لـ MKI67 (0.243–0.905)، و0.981 لـ MMP1 (0.930–1.000)، و0.870 لـ MMP13 (0.686–1.000)، و0.722 لـ TRPV2 (0.447–0.997؛ الشكل 4B). واعتُبرت قيم ROC هذه استكشافية لأن إجراءات الدمج وتصحيح الدفعة (batch-correction) السابقة لم تكن موثقة بالكامل.
في مجموعة البيانات GSE134431 (13 عينة DFU و8 عينات DFS غير متقرحة)، كان تعبير MMP1 أعلى في عينات DFU مقارنة بعينات DFS وفقاً لاختبار Wilcoxon عند مستوى الدلالة الاسمي (p = 0.0225)، على الرغم من أن هذا الارتباط لم يظل دالاً إحصائياً بعد تصحيح BH (القيمة الاحتمالية المعدلة p = 0.135؛ الشكل 4C). ولم تظهر الجينات الخمسة الأخرى أي فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعتين. كما أظهر MMP1 أعلى قيمة وصفية للمساحة تحت المنحنى (AUC)، حيث بلغت AUC قيمة 0.808 (فاصل ثقة 95%، 0.589–1.000)، بينما تراوحت قيم AUC للمرشحين الآخرين بين 0.529 و0.635 (الشكل 4D). وبشكل عام، أظهر MMP1 النمط الوصفي الأكثر اتساقاً من بين المرشحين الستة، إلا أن التكرار الإحصائي كان غير مكتمل.
يحدد تحليل الخلية الواحدة موضع MMP1 بشكل أساسي في الخلايا الليفية
احتوت مجموعة بيانات الخلية الواحدة على 69,944 خلية من 24 عينة (14 عينة من تقرحات القدم السكري DFU و10 عينات ضابطة) وتكونت من 10 أنواع خلوية مصنفة (الشكل 5A). وقد حدد التصور الميزاتي باستخدام UMAP تعبير MMP1 في مناطق خلوية محدودة بدلاً من إظهار تعبير منتظم عبر الأطلس الخلوي (الشكل 5B). وبشكل عام، كان لدى 3,799 خلية (5.43%) تعبير MMP1 معياري أكبر من صفر. وأظهرت الخلايا الليفية أعلى متوسط تعبير معياري (0.181) وأكبر نسبة إجمالية للخلايا الموجبة لـ MMP1 (7.88%؛ الشكل 5C).
على مستوى العينة، كان متوسط تعبير MMP1 أعلى في عينات DFU منه في العينات الضابطة في الخلايا الكيراتينية، والأرومات الليفية، والخلايا البطانية. وبعد إجراء تصحيح BH لجميع أنواع الخلايا المختبرة، سجلت كل من هذه المقارنات قيمة p معدلة بلغت 0.0214 (الخلايا الكيراتينية: 9 عينات ضابطة و14 عينة DFU؛ الأرومات الليفية: 10 و14؛ الخلايا البطانية: 10 و14؛ الشكل 5D). وقد ارتفعت نسبة الخلايا الموجبة لـ MMP1 من 5.86% إلى 9.29% في الأرومات الليفية، ومن 0.026% إلى 6.68% في الخلايا الكيراتينية، ومن 0.29% إلى 2.67% في الخلايا البطانية (الشكل 5E).
كانت ارتباطات درجات الوحدات الوظيفية لكل خلية متواضعة. لوحظ أكبر ارتباط إيجابي لدرجة وحدة الشيخوخة/النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة (SASP) (معامل ارتباط سبيرمان rho = 0.274)، تليها إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلوية (rho = 0.240)، والموت الخلوي الحديدي (ferroptosis) (rho = 0.197)، وتنشيط الخلايا الليفية (rho = 0.170؛ الشكل 5F). وأظهرت مقارنة الخلايا الليفية ذات المستويات العالية من MMP1 والمستويات المنخفضة من MMP1 إثراءً لمصطلحات تنظيم المصفوفة خارج الخلوية، وتنظيم البنية خارج الخلوية، وتنظيم لُييفات الكولاجين، ومعالجة البروتينات السكرية، وطي البروتين (الشكل 5G). ربطت هذه النتائج الوصفية حالة الخلايا الليفية ذات المستويات العالية من MMP1 بالعمليات المتعلقة بإعادة تشكيل المصفوفة. تتوفر تحليلات UMAP إضافية على مستوى المجموعة، وملخصات العينات لجميع أنواع الخلايا، وسياق الدرجات الوظيفية في الشكل التكميلي 4A–C. ولم يتم التعامل مع ارتباطات الخلايا الفردية كأدلة مستقلة عن المتبرع.
تُعطي تغطية الشبكة الأولوية للمكونات المرتبطة بـ MMP1 والأعشاب المرشحة
احتوى جدول علاقة (العشبة-المكون-الهدف) المصفى على 561 سجلاً فريداً تربط بين 99 عشبة، و14 مكوناً، وخمسة من الأهداف المرشحة الستة. كان MMP1 هو الهدف الأكثر تكراراً بـ 156 سجلاً، يليه CHEK1 (120)، ثم MMP13 (102)، ثم MKI67 (100)، وأخيراً TRPV2 (83؛ الشكل 6A). ومن بين المكونات، كان لكل من الكيرسيتين واللوتولين أوسع تغطية عشبية، حيث ارتبطا بـ 83 و 62 عشبة على التوالي. أما البربرين فقد ارتبط بـ 10 أعشاب؛ وقد استُخدمت هذه المكونات الثلاثة كمكونات أساسية في قاعدة تحديد الأولويات (الشكل 6B).
صنف مؤشر التغطية كلاً من Guanhuangbo وMahuang وNiuxi في المرتبة الأعلى معاً (الدرجة = 38 لكل منها؛ الشكل 6C). وقد غطى كل منها جميع الأهداف الخمسة المتاحة واحتوى على مكونين مرتبطين بـ MMP1. وأظهرت مصفوفة المكونات والأهداف أن الكيرسيتين (quercetin) وفر أوسع تغطية عبر مجموعة الأهداف، بينما وفر اللوتولين (luteolin) والبربرين (berberine) اتصالاً إضافياً متمحوراً حول MMP1 (الشكل 6D). وربطت شبكة مركزة بين الأعشاب الرائدة والمكونات التمثيلية والأهداف الخمسة المتاحة (الشكل 6E). وقد حددت هذه النتائج مجموعات من (العشبة-المكون-الهدف) ذات تغطية عالية في قاعدة البيانات لإجراء مزيد من التقييم. وتظهر مصفوفات تغطية (العشبة-الهدف) والمكونات الأساسية الداعمة في الشكل التكميلي 5A,B.
تظهر المقايسات الأولية للأنسجة المزدوجة وفرة أعلى في mRNA وبروتين MMP1
أظهر تقييم لطخة ويسترن (Western blot) وفرة أعلى لبروتين MMP1 في عينات DFU مقارنة بعينات منطقة ما حول القرحة غير المتقرحة المقابلة لها (الشكل 7A،B). وكان متوسط الفرق بين DFU ومنطقة ما حول القرحة في نسبة MMP1/cofilin للأزواج الثلاثة المقابلة هو 0.3553 (فاصل ثقة 95%، 0.1959–0.5147؛ اختبار t المقترن ثنائي الطرف، t(2) = 9.592، p = 0.0107). وتظهر القياسات المقترنة لكل مريض في الشكل 7B. وبعد حساب متوسط خمس آبار تقنية لكل جين في كل عينة، أظهر qPCR وفرة أعلى من mRNA الخاص بـ MMP1 المعياري في كل عينة من عينات DFU الأربع مقارنة بعينة منطقة ما حول القرحة المقابلة لها (الشكل 7C). وكان متوسط فرق ΔCq بين DFU ومنطقة ما حول القرحة داخل المريض الواحد هو −2.6035 (فاصل ثقة 95%، −2.8024 إلى −2.4046؛ اختبار t المقترن ثنائي الطرف، t(3) = −41.663، p = 3.04 × 10−5)، وهو ما يقابل زيادة في المتوسط الهندسي بمقدار 6.08 أضعاف (فاصل ثقة 95%، 5.30–6.98). وتعتبر هذه الملاحظات المستمدة من عينة صغيرة أولية ولا تثبت وجود تأثير وظيفي.
عبر مجموعات بيانات الاكتشاف ومجموعات البيانات الخارجية الضخمة، أظهر MMP1 النمط الوصفي الأكثر اتساقاً من بين الجينات الستة ذات الأولوية، على الرغم من أن التكرار الإحصائي كان غير مكتمل. وأظهرت ملخصات الخلايا المفردة أعلى متوسط تعبير في الخلايا الليفية، كما أظهرت قياسات WB المزدوجة من ثلاثة مرضى وقياسات qPCR المزدوجة من أربعة مرضى وفرة أعلى من MMP1. وتدعم هذه الملاحظات اعتبار MMP1 مرشحاً مرتبطاً بـ DFU لمزيد من الاستقصاء. وقد تم تلخيص سير عمل التقييم العام من الحوسبة إلى الأنسجة في الشكل التكميلي 6.
توافر البيانات:
تتوفر مجموعات البيانات الترانسكريبتومية العامة من قاعدة بيانات NCBI Gene Expression Omnibus تحت أرقام الوصول GSE199939 وGSE68183 وGSE80178 وGSE134431 وGSE165816. وتتضمن Supplementary File 1 برمجيات التحليل وإنشاء الأشكال المتاحة، وجداول التعبير والنتائج المعالجة، وجداول مصادر الأشكال الكمية، وجداول المخرجات الإحصائية، ودفتر عمل qPCR الأصلي ومشروع الجهاز، وصور western blot غير المقصوصة المرفقة. كما يحتوي الأرشيف على البيانات الوصفية المستخرجة للخلايا وسجل الأوامر من كائن الخلية المفردة المستعاد، وتقارير التحقق من نوع المصفوفة، وبيان بمحتويات الملفات. تحتفظ Supplementary File 1 بملفات المصدر التاريخية وتتضمن مجلد R2_Updates الذي يحتوي على جداول مصدر المقايسات المزدوجة المنقحة، والمخرجات الإحصائية، وكود إنشاء الأشكال، وقائمة المعلمات المصححة. تم تحديد ملف Seurat RDS الذي تم تحليله بالكامل في وثائق الأرشيف ولكن لم يتم إدراجه في ملف ZIP التكميلي هذا. كما أن سجل دمج البيانات الضخمة الكامل، وإعدادات ترشيح وتوسيم الخلايا المفردة الأصلية، وتفاصيل طرح الخلفية من اللطخة الأصلية وتفاصيل تحويل المسارات إلى كميات غير متاحة بالكامل؛ وهذه القيود موصوفة في البروتوكول والمناقشة. لم يتم إيداع ملف RDS المستعاد محلياً في مستودع عام.
الشكل 1: يحدد تحليل الترانسكريبتوم الاستكشافي برنامج تعبير مرتبط بقرحة القدم السكرية (DFU). (أ) نظرة عامة على سير العمل الحسابي، والذي يتكون من بناء مجموعة جينات DPN والتحليل الاستكشافي لـ GSE199939، وتكامل الشبكة والتعلم الآلي، وتقييم الكتلة والخلية الواحدة، والتنبؤ بالمكونات والأهداف والأعشاب في الطب الصيني التقليدي (TCM). (ب) تحليل المكونات الرئيسية لملفات تعبير GSE199939 المستقرة من حيث التباين من 10 عينات DFU و11 عينة ضابطة. تشير القطع الناقصة إلى مناطق المجموعات بنسبة 90%؛ وتدل النسب المئوية على التباين الذي يفسره كل مكون. (ج) مخطط بركاني لنتائج التعبير التفاضلي باستخدام DESeq2 لمقارنة DFU مقابل المجموعة الضابطة. تشير النقاط الحمراء والتركوازية إلى الجينات التي زاد تعبيرها في DFU والمجموعة الضابطة، على التوالي، باستخدام |log2 fold change| > 1 وقيمة p المعدلة وفقاً لـ BH < 0.05؛ أما النقاط الرمادية فلم تستوفِ كلا العتبتين. (د) خريطة حرارية لـ z-score لكل صف لأكثر 50 جيناً ذات أقل قيم p معدلة. تمثل الأعمدة العينات البيولوجية ويشير شريط التعليق التوضيحي إلى المجموعة. DEGs: الجينات ذات التعبير التفاضلي؛ DFU: قرحة القدم السكرية؛ DPN: الاعتلال العصبي السكري المحيطي؛ VST: تحويل استقرار التباين. تم وصف التقييم التجريبي النهائي في البروتوكول والشكل 7. qPCR: تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي؛ TCM: الطب الصيني التقليدي؛ RF: الغابة العشوائية؛ LASSO: عامل تشغيل الاختيار والتقلص المطلق الأدنى؛ SVM-RFE: إزالة الميزات العودية لآلة ناقلات الدعم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تقارب تحليل WGCNA والمعرفة السابقة بـ DPN لتحديد 77 جيناً مرشحاً. (أ) تقييم العتبة الناعمة للشبكة الموقعة لأكثر 5,000 جين تباينًا بعد تحويل VST. القوة المختارة كانت beta = 18؛ ويمثل الخط المتقطع هدف ملاءمة الطوبولوجيا الخالية من المقياس عند 0.85. (ب) مخطط شجري للجينات بطريقة الربط المتوسط مع تعيينات ألوان الوحدات الديناميكية. (ج) ارتباطات بيرسون بين الجينات الذاتية للوحدة وسمة DFU الثنائية. تعرض كل خلية معامل الارتباط وقيمة p المقابلة ثنائية الجانب؛ ويشير اللون إلى الاتجاه والقيمة. (د) أهمية الجين لـ DFU مقابل عضوية الوحدة في الوحدة الزرقاء. النقاط الزرقاء تستوفي |عضوية الوحدة| > 0.8 و|أهمية الجين| > 0.5؛ العدد n = 689 جيناً محورياً. (هـ) تقاطع ثلاثي المجموعات لـ 3,691 من DEGs، و689 جيناً محورياً في الوحدة الزرقاء، و1,062 جيناً مرتبطاً بـ DPN، مما أسفر عن 77 مرشحاً مشتركاً. DFU: قرحة القدم السكرية؛ DPN: الاعتلال العصبي السكري الطرفي؛ GS: أهمية الجين؛ MM: عضوية الوحدة؛ WGCNA: تحليل شبكة التعبير الجيني المشترك الموزون. احتوت مجموعة الاكتشاف على 21 عينة (10 حالات DFU و11 مجموعة ضابطة). يستخدم التعليق التوضيحي في الشكل 2D القيمة |MM| > 0.8 و|GS| > 0.5، وهو ما يطابق معيار القيمة المطلقة الذي تم التحقق منه في كود الاختيار الأصلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3يؤدي تحديد أولويات الميزات باستخدام طريقة متعددة إلى الحصول على لوحة مكونة من ستة جينات. (Aمنحنى التحقق المتبادل خماسي الطيات لانحدار LASSO الثنائي. تشير الخطوط المتقطعة الرأسية إلى lambda.min وlambda.1se؛ وقد تم اختيار الميزات غير الصفرية عند lambda.1se ما لم تكن تلك الجزاء لم تسفر عن أي ميزة.Bمتوسط انخفاض معامل جيني لنموذج الغابات العشوائية لأعلى 20 جيناً تصنيفاً من نموذج مكون من 1,000 شجرة. تحدد الأعمدة الحمراء أعضاء لوحة الجينات الستة النهائية؛ ويمثل الخط المتقطع متوسط الأهمية المستخدم كحد أدنى للاستبقاء عبر المجموعة الكاملة من المرشحين.سي) منحنى AUC الخاص بـ LOOCV لـ Linear SVM-RFE عبر مجموعات فرعية متداخلة من الميزات. أنتجت جميع أحجام المجموعات الفرعية AUC = 1.00؛ CHEK1 تم اختياره بناءً على قاعدة الربط للأصغر حجماً، مما يشير إلى وجود فرط في التخصيص في مجموعة الاكتشاف. (دمصفوفة دعم الطريقة لـ CCL7, CHEK1, MKI67, MMP1, MMP13، و TRPV2تشير النقاط إلى الاختيار بواسطة LASSO، أو الغابة العشوائية (random forest)، أو SVM-RFE؛ ويعطي العمود الأخير عدد الطرق الداعمة.هـ) مصطلحات وجودية جينية (Gene Ontology) مختارة مُثرية بين الجينات الستة. يشير موضع النقطة إلى نسبة الجينات، وتوضح تسميات النقاط عدد الجينات المرسمة، بينما يشير اللون إلى قيمة -log10 المعدلة وفق طريقة بنجاميني-هوخبرج (BH-adjusted) p، ويشير الشريط الجانبي إلى الأنطولوجيا. (فمسارات KEGG المُثرىة بين الجينات المحددة. يوضح موضع النقطة مقدار الإثراء، وتوضح تسميات حجم النقطة عدد الجينات المحددة، ويميز اللون بين المسارات. تطلب الإثراء قيمة اسمية. p < 0.05 والمعدلة وفق طريقة BH p < 0.05. AUC، المساحة تحت منحنى خصائص التشغيل للمستقبل؛ BH، بنجاميني-هوخبيرغ؛ BP، العملية البيولوجية؛ CC، المكون الخلوي؛ KEGG، موسوعة كيوتو للجينات والجينومات؛ LOOCV، التحقق المتقاطع باستبعاد عينة واحدة؛ MF، الوظيفة الجزيئية؛ SVM-RFE، حذف الميزات المتكرر باستخدام آلة ناقلات الدعم. LASSO، عامل اختيار وتقليص المطلق الأدنى. تستخدم اللوحات A-D عينات الاكتشاف الـ 21 (10 حالات تقرح قدم سكري و11 حالة ضابطة). في اللوحة A، تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ المعياري لخطأ التحقق المتقاطع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تقييم النسخ المتعددة (bulk-transcriptomic) عبر مجموعات بيانات مختلفة للوحة المكونة من ستة جينات. (A) تعبير الجينات الستة في المصفوفة المدمجة GSE68183/GSE80178 (6 عينات ضابطة و 9 عينات DFU). (B) منحنيات ROC المقابلة لكل جين مفرد مع قيم AUC؛ تتوفر فترات الثقة 95% في جدول البيانات المصدرية. نظراً لأن عمليات الدمج وتصحيح الدفعات (batch correction) السابقة لم يتم توثيقها بالكامل، فقد تم تفسير هذه النتائج على أنها استكشافية. (C) التعبير بصيغة log2(RPKM + 1) في GSE134431 (8 عينات DFS غير متقرحة و 13 عينة DFU). (D) منحنيات ROC وقيم AUC المقابلة لكل جين مفرد. في (A) و (C)، توضح الصناديق الوسيط والنطاق الربيعي، وتمتد الشعيرات إلى 1.5 مرة من النطاق الربيعي، وتمثل النقاط العينات البيولوجية. تشير النجمات إلى الدلالة الاسمية من اختبارات ويلكوكسون لمجموع الرتب ثنائية الجانب (*p < 0.05, **p < 0.01)؛ وتم ذكر قيم p المعدلة بطريقة BH عبر الجينات الستة في النص وجدول البيانات المصدرية. تم اختيار اتجاه ROC تلقائياً بواسطة pROC. AUC، المساحة تحت منحنى خصائص تشغيل المستقبل؛ DFS، جلد القدم السكري غير المتقرح؛ DFU، قرحة القدم السكرية؛ RPKM، عدد القراءات لكل كيلوباز لكل مليون قراءة مرسومة؛ ROC، خصائص تشغيل المستقبل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: التوطين على مستوى الخلية الواحدة يربط MMP1 بإشارات الخلايا الليفية وإعادة تشكيل المادة الخلالية. (A) مخطط UMAP لـ 69,944 خلية من 24 عينة (10 عينات ضابطة و14 عينة DFU)، ملونة وفقاً لتصنيفات أنواع الخلايا العشرة المستمدة من SingleR. (B) مخططات سمات UMAP توضح التعبير المعياري لـ MMP1 في الخلايا الضابطة وخلايا DFU. (C) ملخص لأنواع الخلايا يوضح متوسط التعبير المعياري لـ MMP1؛ يشير حجم النقاط والتسميات إلى الكسر الإجمالي للخلايا الموجبة لـ MMP1، والمعرف بأنه التعبير المعياري > 0. (D) متوسط تعبير MMP1 على مستوى العينة في الخلايا البطانية، والخلايا الليفية، والخلايا الكيراتينية. توضح الصناديق الوسيط والمدى الربيعي؛ والنقاط تمثل العينات البيولوجية. أُجريت اختبارات Wilcoxon rank-sum ثنائية الجانب متبوعة بتصحيح BH عبر جميع أنواع الخلايا المختبرة. كانت أعداد العينات المتاحة 10 ضابطة و14 DFU للخلايا البطانية والليفية، و9 ضابطة و14 DFU للخلايا الكيراتينية. (E) كسور الخلايا الموجبة لـ MMP1 حسب المجموعة ونوع الخلية. (F) ارتباطات Spearman لكل خلية بين تعبير MMP1 ودرجات الوحدات الوظيفية. (G) إثراء العمليات البيولوجية حسب GO بين الجينات التي ارتفع تعبيرها في الخلايا الليفية ذات التعبير العالي لـ MMP1 مقابل الخلايا الليفية ذات التعبير المنخفض لـ MMP1. BH، Benjamini-Hochberg؛ DFU، قرحة القدم السكرية؛ ECM، المادة الخلالية خارج الخلية؛ GO، الوجود الجيني؛ HSC، الخلايا الجذعية المكونة للدم؛ UMAP، التقريب والإسقاط المتشعب الموحد. تعتبر ارتباطات كل خلية والإثراء المشروط بالتعبير في اللوحتين F و G أوصافاً استكشافية، دون استدلال تأكيدي يراعي المتبرعين. يتطلب الاستقلال على مستوى العينة التحقق من معرفات المتبرعين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: التنبؤ بمكونات وأهداف وأعشاب الطب الصيني التقليدي (TCM) القائم على التغطية والمرتكز على MMP1. (أ) عدد سجلات الأعشاب والمكونات والأهداف المصفاة من قاعدة البيانات لكل هدف مرشح متاح. (ب) عدد الأعشاب المرتبطة بالمكونات الأكثر تكراراً؛ يشير اللون الفيروزي إلى المكونات المرتبطة بـ MMP1. (ج) الأعشاب الرائدة مصنفة حسب درجة التغطية؛ تمثل الأعمدة الذهبية أعلى ثلاث درجات مشتركة. (د) مصفوفة المكونات والأهداف للمكونات التمثيلية ذات التغطية العالية. تظهر قيم الخلايا عدد الأعشاب المرتبطة؛ وتشير الخلايا الفارغة إلى عدم وجود سجل في جدول العلاقات المصفى. (هـ) شبكة مركزة تربط الأعشاب والمكونات والأهداف المرشحة ذات التصنيف العالي والتمثيلية. يشير لون العقدة إلى نوع الكيان؛ ترمز الحواف الرمادية بين العشبة والمكون إلى الاحتواء، وترمز الحواف الفيروزية بين المكون والهدف إلى روابط قاعدة البيانات. احتوى جدول العلاقات المصفى على 561 سجلاً فريداً، و99 عشبة، و14 مكوناً، وخمسة أهداف ذات روابط مؤهلة؛ ويظهر CCL7 كعقدة سادسة مرشحة ومعزولة. TCM، الطب الصيني التقليدي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7التقييم الأولي للتعبير عن MMP1 في قرح القدم السكري (DFU) في أنسجة المرضى باستخدام تقنية qPCR واللطخة الغربية. (A(لطخة ويسترن تمثيلية قُدمت سابقاً توضح وفرة بروتين MMP1 في الأنسجة المحيطة بالقرحة غير المتقرحة وأنسجة قرحة القدم السكري (DFU)، مع استخدام الكوفيلين كضابط تحميل).Bنسب MMP1 إلى الكوفيلين المستمدة من مشروع التخطيط الأصلي. توضح الرموز القياسات البيولوجية الفردية لثلاثة أزواج من المرضى؛ وتربط الخطوط بين عينات المنطقة المحيطة بالجرح وقرح القدم السكرية (DFU) المتطابقة. الاختبار المزدوج ثنائي الجانب يرجى تزويدي بالنص المراد ترجمته.أعطى الاختبار تـ(2) = 9.592 و p = 0.0107. (كربون) نسبي MMP1 وفرة الـ mRNA في أربعة أزواج متطابقة من المرضى أكدها المؤلفون: NC–DFU، وNC1–DFU1، وNC2–DFU2، وNC3–DFU3. خمس مكررات تقنية ACTB آبار وخمس مكررات تقنية MMP1 تم حساب متوسط قيم الآبار بشكل منفصل لكل عينة قبل Δحساب قيمة Cq. تم حساب التعبير النسبي باستخدام طريقة 2^-ΔΔCq−ΔΔدورة العتبة طريقة استخدام متوسط المنطقة المحيطة بالجرح Δتُستخدم قيمة Cq كمعاير شائع. يمثل كل رمز عينة بيولوجية واحدة؛ وتربط الخطوط بين الأنسجة المتطابقة. والزوجي ثنائي الجانب ت-الاختبار المستخدم على مستوى العينة Δقيم Cq (تُعد عملية التحول من الحالة السائلة إلى الحالة الصلبة (التصلب) خطوة أساسية في العديد من التطبيقات العلمية والصناعية. يصف هذا البروتوكول الإجراءات اللازمة لمراقبة وتوصيف هذه العملية لضمان الحصول على خصائص مادية محددة.(3) = −41.663; p = 3.04 × 10−5)، وليست تغييرات طيات في الآبار التقنية. لم تُستخدم نجوم الدلالة الإحصائية. الآبار التقنية ليست مكررات بيولوجية. تشير "الضابطة" إلى أنسجة غير متقرحة محيطة بالجرح. Cq، دورة التكميم. مقايسة الأنسجة. p القيم اسمية واستكشافية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| جين | رقم تسجيل RefSeq | بادئ أمامي من الطرف 5' إلى 3' | البادئ العكسي من الطرف 5 إلى الطرف 3 |
| MMP1 | NM_002421 | ATGAAGCAGCCCAGATGTGGAG | TGGTCCACATCTGCTCTTGGCA |
| ACTB | NM_001101.5 | CACCATTGGCAATGAGCGGTTC | AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT |
الجدول 1: تسلسلات البادئات للتحقق من التعبير الكمي لـ MMP1 بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR). تسلسلات الأوليغونوكليوتيد الأمامية والعكسية (5′–3′) وأرقام الوصول لسجلات النسخ المرجعية في NCBI موضحة لـ MMP1 البشري (NM_002421) و ACTB (NM_001101.5). تم استخدام ACTB (β-actin) كجين مرجعي للتعبير النسبي لـ MMP1.
الشكل التكميلي 1: ملخصات مراقبة جودة WGCNA. (A) تجميع هرمي بمتوسط الروابط لعينات GSE199939 استناداً إلى أكثر 5,000 جين تباينًا واستقرارًا. تم تلوين تسميات العينات حسب المجموعة؛ والخط الأفقي المتقطع هو دليل ارتفاع المخطط الشجري عند المئين 95 المستخدم للتقييم البصري للقيم المتطرفة. (B) عدد الجينات المخصصة لكل وحدة WGCNA. تشير الأشرطة ذات اللون الأزرق المخضر إلى الوحدات الثماني غير الرمادية التي استوفت معيار الارتباط بـ DFU؛ بينما تشير الأشرطة الرمادية إلى الوحدات الأخرى. DFU، قرحة القدم السكري؛ VST، تحويل استقرار التباين؛ WGCNA، تحليل شبكة التعبير الجيني المشترك الموزون. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2دعم التعبير المشترك للوحدة الزرقاء. (A) شبكة تعبير مشترك مبسطة لأعلى 25 جيناً محورياً في الوحدة الزرقاء وفقاً للتصنيف. ومن بين الارتباطات الزوجية التي تبلغ قيمتها المطلقة |ر| > 0.70، تحتوي الشبكة المعروضة على اتحاد أقوى رابطين لكل جين. يشير حجم العقدة إلى الدرجة ضمن هذه الشبكة المعروضة والمبسطة، بينما يشير تعبئة العقدة إلى أهمية الجين فيما يتعلق بقرحة القدم السكرية (DFU).B) أهمية الجينات وعضوية الوحدة الزرقاء لأعلى 15 مركزاً تصنيفاً. تم اختيار المجموعة الفرعية من الحواف لسهولة القراءة ولا تمثل جميع الارتباطات المؤهلة. DFU: قرحة القدم السكري؛ GS: أهمية الجينات؛ MM: عضوية الوحدة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3: عروض تعلم الآلة لمجموعة الاكتشاف الداخلية. (أ) التعبير المقيس لكل من CCL7، وCHEK1، وMKI67، وMMP1، وMMP13، وTRPV2 في مجموعة الاكتشاف GSE199939. توضح الصناديق الوسيط والمدى الربيعي، وتمثل النقاط العينات البيولوجية. (ب) خريطة حرارية لدرجة z للصف على مستوى العينة للجينات الستة نفسها. يتم ربط تسميات العينات القصيرة بمعرفات GEO في مفتاح البيانات المصدرية. (ج) منحنى ROC لنموذج مجموعة الاكتشاف متعدد الجينات المجهز. تم الحصول على قيمة AUC مقدارها 1.00 من خلال تجهيز النموذج وتقييمه على العينات الـ 21 نفسها، مما يشير إلى حدوث فرط ملاءمة (overfitting) في مجموعة الاكتشاف. AUC، المساحة تحت منحنى خصائص تشغيل المستقبل؛ ROC، خصائص تشغيل المستقبل. تضمنت مجموعة الاكتشاف 21 عينة (10 DFU و 11 عينة ضابطة). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 4: سياق التعبير على مستوى الخلية المفردة. (A) مخطط UMAP لـ 69,944 خلية ملونة حسب مجموعة الضبط ومجموعة DFU. (B) متوسط تعبير MMP1 على مستوى العينة البيولوجية عبر جميع تصنيفات أنواع الخلايا العشرة؛ تمثل النقاط العينات، ويستخدم المحور السيني تحويلاً للجذر التربيعي للعرض. (C) خريطة حرارية لدرجات الوحدات الوظيفية الملخصة عبر الخلايا ضمن كل نوع خلية مصنف ومعيرة داخل كل وحدة. DFU، قرحة القدم السكرية؛ UMAP، التقريب والاسقاط المتشعب الموحد. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلي 5: مصفوفات تغطية TCM الداعمة. (أ) أعداد سجلات الأعشاب والمستهدفات في قاعدة البيانات لـ 18 عشبة من الأعلى تصنيفاً من حيث التغطية المرتبطة بـ MMP1، والمستهدفات المرشحة الخمسة الممثلة في جدول العلاقات المصفى. (ب) أعداد سجلات قاعدة البيانات التي تربط نفس الأعشاب بالمكونات الأساسية quercetin وluteolin وberberine. تشير قيم الخلايا إلى سجلات قاعدة البيانات الفريدة بعد إزالة التكرارات. TCM، الطب الصيني التقليدي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 6: سير عمل التقييم الحسابي والنسيجي. يلخص المخطط مدخلات الاكتشاف، وتقاطع DEG/WGCNA، واختيار الميزات الاستكشافي، والتقييم الكتلي الخارجي، وسياق الخلية الواحدة، وتوسعة TCM، وتقييم التعبير النسيجي المتطابق. استخدم qPCR أربعة أزواج متطابقة من المرضى واستخدم western blotting ثلاثة أزواج متطابقة من المرضى. تم الاحتفاظ بأعداد المرشحين والنتائج الحسابية المبلغ عنها من التحليل الأصلي. تظل مدخلات TPM في سير عمل الاكتشاف القائم على العد، وسجلات المعالجة المسبقة الأصلية غير المكتملة للخلية الواحدة، ومجموعات مقاييس الأنسجة الصغيرة بمثابة قيود. لا يشير المخطط إلى أن تحليلات الاكتشاف قد تمت إعادة التحقق من صحتها. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 1: قائمة ببرمجيات التحليل، وقواعد البيانات، والمعلمات، والقيود. يوثق كتاب العمل هذا 26 خطوة تحليلية، تشمل خطوة التحليل، والأداة أو قاعدة البيانات المستخدمة، والإصدار المسجل، والمدخلات، والمعلمات الرئيسية، والمخرجات، والمعلومات المفقودة أو القيود. ويغطي هذا الملف تحليل النسخ الاستكشافي (discovery transcriptomics)، وتحليل شبكة التعبير الجيني المشترك المرجح (WGCNA)، وفحص الجينات واختيار الميزات، والتحليل الإثرائي، وتحليلات الكتلة والخلايا الفردية الخارجية، وتحليل شبكة الطب الصيني التقليدي (TCM)، وتقارير فحوصات الأنسجة. ويسجل الجدول المعلومات المنهجية المتاحة، ولا يهدف في حد ذاته إلى إثبات قابلية التكرار المستقلة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 1أرشيف البيانات، ورمز التحليل، ومصدر الأشكال، ومصدر المقايسات. يحتوي هذا الأرشيف على البرامج النصية المتاحة للتحليل وتوليد الأشكال، وجداول التعبير والنتائج المُعالجة، والأشكال الكمية وبيانات المصدر الإحصائية، ودفتر عمل qPCR الأصلي ومشروع الجهاز، وصور لطخة وسترن (western blot) غير المقصوصة والمُقدمة، والبيانات الوصفية المستخرجة للخلية الواحدة وسجل الأوامر، وتقارير التحقق من نوع المصفوفة، وبيان بالملفات. تم الاحتفاظ بالملفات التاريخية؛ ويوفر المجلد R2_Updates تحليل الاختبار المزدوج المصحح، ومصادر الأشكال المحدثة، وقائمة المعلمات المراجعة. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.
المناقشة
أعطى سير العمل التكاملي هذا الأولوية لجين MMP1 بناءً على نتائج النسخ الشامل (bulk transcriptomics)، وتحليل شبكة المجموعات المترابطة الموزونة (WGCNA)، وفحص الجينات المرتبطة بـ DPN، والاختيار الاستكشافي للميزات، ثم فحص سياقه الخلوي وتعبيره النسيجي. وقد تم دعم ستة جينات بواسطة طريقتين من طرق الاختيار على الأقل، وأظهر MMP1 أكبر تغيير في التعبير ضمن مجموعة الاكتشاف. كانت الأدلة الخارجية متباينة؛ حيث ظل MMP1 ذا دلالة إحصائية في المصفوفة المدمجة GSE68183/GSE80178، في حين كانت ارتباطاته في GSE134431 اسمية (p = 0.0225) ولم تصمد أمام تصحيح BH (القيمة المعدلة p = 0.135). وتعتبر قيمة AUC البالغة 0.808 في GSE134431 وصفية، خاصة وأن اتجاه منحنى ROC قد تم تحديده ضمن مجموعة التقييم. وبناءً على ذلك، فإن وصف "الأكثر اتساقاً" يصف النمط الملحوظ بين المرشحين الستة ولا يعني تكراراً إحصائياً كاملاً أو مؤشراً حيوياً تشخيصياً تم التحقق من صحته.
تم ربط مجموعة الجينات المرشحة بدورة تجدد الكولاجين، وتفكيك المصفوفة خارج الخلوية (ECM)، ونشاط الميتالوإندوبيبتيداز، وإشارات IL-17 والريلاكسين. وتتوافق هذه التصنيفات مع بيولوجيا الجروح المزمنة ولكنها تشمل عدداً قليلاً من الجينات. وقد أفادت دراسات بشرية سابقة بوجود تغير في أنماط MMP والمثبطات في الجروح السكرية6، بينما ربطت دراسة مستقبلية حول تقرحات القدم السكرية (DFU) بين ارتفاع نسبة MMP1 إلى مثبط البروتينات المعدنية النسيجي 1 (TIMP1) وبين عملية الالتئام7. وبالتالي، فإن زيادة تعبير MMP1 لا تشير بالضرورة إلى تأثير ضار بشكل مطلق؛ فقد يعتمد ذلك على مرحلة الإصلاح، وتوفر الركيزة، وتوازن المثبطات. وتوفر الملاحظات التجريبية المتعلقة بـ MMP13 و CCL7 و IL-17 سياقاً إضافياً11,12,13,14، ولكن لا يمكن افتراض أن وظائفها متكافئة في حالات تقرحات القدم السكرية البشرية.
حددت ملخصات الخلية الواحدة أعلى متوسط تعبير لجين MMP1 في الخلايا الليفية، مع تعبير أعلى على مستوى العينة في الخلايا الليفية، والخلايا الكيراتينية، والخلايا البطانية في قرح القدم السكري (DFU). ويتفق هذا النمط مع التقارير التي تشير إلى تغير تنظيم المصفوفة خارج الخلوية (ECM) في الخلايا الليفية المشتقة من قرح القدم السكري4، وحالات الخلايا الليفية غير المتجانسة في دراسات الخلية الواحدة والدراسات المكانية8، وبرامج الخلايا الليفية المساعدة في الشفاء المرتبطة بالبلاعم15. ومع ذلك، تتطلب معرفات العينات التحقق على مستوى المتبرع، وتظل ارتباطات درجات الوحدات على مستوى الخلية والإثراء المشروط بالتعبير وصفية لأن التبعية داخل المتبرع الواحد لم يتم نمذجتها. كما أن المساهمات من المجموعات الظهارية والبطانية تعارض وجود آلية مستقلة تماماً للخلايا الليفية. ومن شأن النسخ المكاني (Spatial transcriptomics)، أو التهجين الموضعي للـ RNA (in situ)، أو الصبغ المناعي أن يوفر تحديداً مكانياً تكميلياً16.
تكمن القيمة المنهجية في الجمع بين التعبير التفاضلي، والتعبير المشترك، والمعرفة المسبقة بالجينات، والملخصات المحلولة على مستوى الخلية، وأنماط المقاييس المستقلة لتحديد أولويات المرشحين. ولا تكمن هذه القيمة في الدقة التنبؤية لمجموعة الاكتشاف. لقد سبق الفحص الشامل للمجموعة عملية التحقق المتبادل على مستوى الخوارزمية، كما أن قيمة AUC الموحدة لـ SVM-RFE والتي بلغت 1.00 تثير مخاوف بشأن التسريب، والفرط في التخصيص، والتقييم المتفائل. وبناءً على ذلك، يجب أن تظل هذه اللوحة نتيجة لتحديد أولويات الميزات. وسيكون من الضروري إجراء عمليات معالجة مسبقة واختيار وضبط متداخلة بالكامل، يتبعها اختبار مستقل ومغلق، لإجراء تقييم تنبؤي9,10. وقد تم التحقق من مدخلات الاكتشاف على أنها TPM رغم استخدامها في نموذج قائم على العد؛ وبالتالي تظل إحصائيات الاكتشاف الناتجة والاختيار اللاحق غير مؤكدة بانتظار إعادة التحليل المناسبة. وتفتقر مصفوفة الكتلة المدمجة إلى سجل المعالجة المسبقة الكامل الخاص بها. بينما يوفر كائن Seurat المسترد إعدادات التطبيع، واختيار الميزات المتغيرة، وPCA، والجيران، والتجميع، وUMAP، على الرغم من أن التصفية الأصلية، واستدعاء Harmony الكامل، ومرجع التعليقات التوضيحية لا تزال موثقة بشكل غير كامل. وتعد إعادة المعالجة المنسقة من البيانات المصدرية، وتقييم تأثير الدفعة الموثق، أو تحليلات pseudobulk المدركة للمتبرع أو تحليلات النماذج المختلطة، طرقاً بديلة لمزيد من التقييم.
توفر مقايسات أنسجة المرضى أدلة متعامدة أولية على وفرة أعلى من MMP1. كانت المقارنة مع أنسجة غير متقرحة محيطة بالجرح من نفس المرضى، لذا فإن التباين يعكس الاختلافات المحلية المرتبطة بالقرحة داخل الأنسجة السكرية بدلاً من المقارنة مع الجلد السليم. تم تحليل قياسات WB المستردة من ثلاثة أزواج متطابقة من المرضى وقياسات qPCR من أربعة أزواج متطابقة أكدها المؤلفون باستخدام اختبارات متزاوجة، مع عرض الملاحظات البيولوجية الفردية. بالنسبة لـ qPCR، تم حساب متوسط الآبار التقنية داخل كل عينة واستُخدم ΔCq للاستدلال؛ ولم تؤدِ الآبار التقنية إلى زيادة حجم العينة البيولوجية. يدعم الاتجاه المتسق للملاحظات المتزاوجة مقارنة أولية للتعبير، ولكن المجموعات الصغيرة لا يمكنها إثبات القابلية للتعميم أو تقييم افتراضات التوزيع بشكل موثوق. إن وفرة البروتين في الأنسجة الكلية لا تحدد التموضع الخلوي للبروتين، أو النشاط الإنزيمي، أو التأثير السببي على الالتئام. هناك حاجة إلى مجموعات أكبر محددة سريرياً. وتشمل القيود الأخرى عدم اكتمال المتغيرات السريرية المصاحبة، وأنسجة مقارنة متميزة، ومجموعة جينات DPN مشتقة من الأدبيات غير موثقة بالكامل، وسجلات غير كاملة لطرح الخلفية من البقع الأصلية. لا ينبغي التعامل مع الأنسجة السليمة، وأنسجة التحكم المحددة في الدراسة، وجلد القدم السكري غير المتقرح على أنها قابلة للتبادل.
تُعد شبكة الطب الصيني التقليدي (TCM) امتداداً لتوليد الفرضيات. وتلخص أوزانها المخصصة مدى تغطية قاعدة البيانات بدلاً من ارتباط الهدف أو الفعالية، وقد تتغير التصنيفات بناءً على محتوى قاعدة البيانات وخيارات تحديد الأوزان. كما يتميز الكيرسيتين والبربرين بتعرض جهازي متغير أو محدود17,18. وبناءً على ذلك، تتطلب المكونات والأعشاب المرشحة اختبارات مباشرة للهدف، والاستجابة للجرعة، والحركية الدوائية، والسمية، والاختبارات الوظيفية. وينبغي أن تجمع الأعمال المستقبلية بين مجموعات مستقلة موثقة جيداً مع التوطين المكاني واضطراب MMP1 في الخلايا الليفية الأولية أو نماذج الجروح متعددة الخلايا. وتدعم النتائج الحالية MMP1 كمرشح مرتبط بقرحة القدم السكري (DFU) في سياق إعادة تشكيل المصفوفة المرتكز على الخلايا الليفية، دون إثبات السببية أو الفائدة السريرية.
الإفصاحات
يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا البحث من قبل مشروع ووهان البلدي للبحوث العلمية الطبية (مشروع توجيهي، منحة رقم WX23Z77)، وبإدارة لجنة الصحة البلدية في ووهان.
يتوجه المؤلفون بالشكر للمشاركين الذين قدموا عينات الأنسجة لهذه الدراسة، وللباحثين الذين قاموا بإنشاء وإيداع مجموعات البيانات المتاحة علنًا في NCBI Gene Expression Omnibus.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| شرائط أنابيب PCR شفافة ذات جدار رقيق سعة 0.2-mL (8 أنابيب) | Axygen / Corning | PCR-0208-C | URL: https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/TW/en/Genomics-%26-Molecular-Biology/PCR-Consumables/PCR-Tubes-and-Strip-Tubes/Axygen%C2%AE-PCR-Strip-Tubes/p/PCR-0208-C |
| رؤوس ماصات مرشحة ومعقمة سعة 1,000-μL | Axygen / Corning | TF-1000-R-S | URL: https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/SEA/en/Liquid-Handling/Pipette-Tips-and-Accessories/Pipette-Tips/Axygen%C2%AE-Universal-Fit-Filter-Pipette-Tips/p/TF-1000-R-S |
| أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة سعة 1.5-mL، خالية من DNase/RNase | Solarbio Life Sciences | YA0430 | URL: https://www.solarbio.com/goodsInfo?id=305429 |
| رؤوس ماصات مرشحة ومعقمة سعة 10-μL | Axygen / Corning | TF-300-L-R-S | URL: https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/CALAOther/en/Liquid-Handling/Pipette-Tips-and-Accessories/Pipette-Tips/Axygen%C2%AE-Aerosol-Barrier-Tips/p/TF-300-L-R-S |
| مزيج SYBR Green PCR Mastermix بتركيز 2× | Solarbio Life Sciences | SR1110 | URL: https://www.solarbio.com/goodsInfo?id=994 |
| محلول ملحي منظم بـ Tris بتركيز 20× | Solarbio Life Sciences | T1080 | URL: https://www.solarbio.com/goodsInfo?id=1309 |
| رؤوس ماصات مرشحة ومعقمة سعة 200-μL | Axygen / Corning | TF-200-R-S | URL: https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/CALAOther/en/Liquid-Handling/Pipette-Tips-and-Accessories/Pipette-Tips/Axygen%C2%AE-Universal-Fit-Filter-Pipette-Tips/p/TF-200-R-S |
| زوج بادئات qPCR لجين ACTB | Solarbio Life Sciences (تخليق قليلو نيوكليوتيد مخصص) | Custom | RefSeq NM_001101.5; F: CACCATTGGCAATGAGCGGTTC; R: AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT; URL: https://www.solarbio.com/ |
| جهاز Amersham Imager 600 | GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden | Amersham Imager 600 | الطراز مسجل في جميع ملفات TIFF الـ 22 المرفقة؛ إصدار برنامج التشغيل 1.2.0؛ URL: https://cdn.cytivalifesciences.com/api/public/content/digi-17089-original |
| طقم قياس البروتين باستخدام حمض البيكينشونينيك (BCA) | Solarbio Life Sciences | PC0020 | URL: https://www.solarbio.com/goodsInfo?id=64504 |
| clusterProfiler | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/ | الإصدار 4.16.0 |
| جسم مضاد متعدد النسائل لـ Cofilin (أرنب مضاد لـ Cofilin) | Proteintech Group (Wuhan Sanying Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, China) | 10960-1-AP | تخفيف WB المستخدم في هذه الدراسة: 1:6,000؛ URL: https://www.ptgcn.com/; RRID:AB_2291830 |
| قاعدة بيانات السموم الجينية المقارنة | CTD | https://ctdbase.org/ | مورد المكونات-الأهداف |
| DESeq2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/DESeq2/ | الإصدار 1.48.2 |
| ماء خالٍ من DNase/RNase | Solarbio Life Sciences | R1600 | URL: https://www.solarbio.com/goods.php?id=1085 |
| e1071 | CRAN / e1071 authors | https://cran.r-project.org/package=e1071 | الإصدار 1.7-17 |
| ركيزة ECL Plus ذات التألق الكيميائي | Solarbio Life Sciences | PE0010 | URL: https://www.solarbio.com/pdf/2-DBYMY/1-ZW/PE0010.pdf |
| مستودع تعبير الجينات (GEO): GSE134431 | National Center for Biotechnology Information | GSE134431 | URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE134431 |
| مستودع تعبير الجينات (GEO): GSE165816 | National Center for Biotechnology Information | GSE165816 | URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE165816 |
| مستودع تعبير الجينات (GEO): GSE199939 | National Center for Biotechnology Information | GSE199939 | URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE199939 |
| مستودع تعبير الجينات (GEO): GSE68183 | National Center for Biotechnology Information | GSE68183 | URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE68183 |
| مستودع تعبير الجينات (GEO): GSE80178 | National Center for Biotechnology Information | GSE80178 | URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE80178 |
| الأنطولوجيا الجينية | Gene Ontology Consortium | https://geneontology.org/ | GO |
| ggplot2 | ggplot2 developers | https://ggplot2.tidyverse.org/ | الإصدار 4.0.3 |
| glmnet | CRAN / glmnet authors | https://cran.r-project.org/package=glmnet | الإصدار 5.0 |
| جدول مرجعي للمكونات العشبية | المصدر غير مذكور في المخطوطة | غير مذكور | غير موثق: اسم قاعدة البيانات/الملف الدقيق، الإصدار/التاريخ، ورابط الوصول العام |
| جسم مضاد IgG من الماعز مضاد للأرنب (H+L) مقترن بـ HRP | Proteintech Group (Wuhan Sanying Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, China) | SA00001-2 | تخفيف WB المستخدم في هذه الدراسة: 1:5,000؛ URL: https://www.ptgcn.com/products/HRP-conjugated-Goat-Anti-Rabbit-IgG-H-L-SA00001-2.htm; RRID:AB_2722564 |
| عينات أنسجة من قرحة القدم السكرية البشرية | Wuhan Fourth Hospital, Wuhan, China | N/A | عينات DFU متطابقة مع المرضى؛ qPCR عدد = 4 عينات؛ WB عدد = 3 عينات؛ البروتوكول المعتمد KY2024-161-01 |
| عينات أنسجة بشرية غير متقرحة من محيط الجرح | Wuhan Fourth Hospital, Wuhan, China | N/A | مقارنة من محيط الجرح متطابقة مع المرضى؛ qPCR عدد = 4 عينات؛ WB عدد = 3 عينات؛ البروتوكول المعتمد KY2024-161-01 |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.net/ij/ | الإصدار غير موثق |
| موسوعة كيوتو للجينات والجينومات | KEGG | https://www.genome.jp/kegg/ | كود الكائن البشري hsa |
| قائمة جينات DPN منسقة من الأدبيات | مكون مشتق من الأدبيات؛ جدول المصدر على مستوى الجينات غير موثق بالكامل | غير مذكور | المنشأ على مستوى الجينات غير موثق بالكامل |
| مقياس طيف ضوئي للأشعة فوق البنفسجية والمرئية للأحجام الدقيقة | الشركة المصنعة/الطراز غير مذكور في المخطوطة | غير مذكور | غير موثق: الشركة المصنعة، الطراز، ورابط المنتج الدقيق؛ الاستخدام المذكور: تقييم تركيز RNA ونسبة A260/A280 |
| جسم مضاد متعدد النسائل لـ MMP1 (أرنب مضاد لـ MMP1) | Proteintech Group (Wuhan Sanying Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, China) | 10371-2-AP | تخفيف WB المستخدم في هذه الدراسة: 1:1,000؛ URL: https://www.ptgcn.com/Products/MMP1-Antibody-10371-2-AP.htm; RRID:AB_2297741 |
| زوج بادئات qPCR لجين MMP1 | Solarbio Life Sciences (تخليق قليلو نيوكليوتيد مخصص) | Custom | RefSeq NM_002421; F: ATGAAGCAGCCCAGATGTGGAG; R: TGGTCCACATCTGCTCTTGGCA; URL: https://www.solarbio.com/ |
| NCBI Gene | National Center for Biotechnology Information | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ | قاعدة بيانات الجينات البشرية |
| حليب مجفف خالي الدسم، كاشف حجب | Solarbio Life Sciences | D8340 | URL: https://www.solarbio.com/goodsInfo?id=1488 |
| org.Hs.eg.db | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/ | الإصدار 3.21.0 |
| هلام SDS-PAGE مسبق الصب، تدرج 4%–20% | Solarbio Life Sciences | PG42010-S | URL: https://www.solarbio.com/goodsInfo?id=12646 |
| pROC | CRAN / pROC authors | https://cran.r-project.org/package=pROC | الإصدار 1.19.0.1 |
| مزيج مثبطات البروتياز، بتركيز 100× | Solarbio Life Sciences | P6730 | URL: https://www.solarbio.com/goodsInfo?id=25748 |
| نظام نقل البروتين | الشركة المصنعة/الطراز غير مذكور في المخطوطة | غير مذكور | غير موثق: الشركة المصنعة، الطراز، ورابط المنتج الدقيق؛ الاستخدام المذكور: النقل إلى غشاء PVDF بمسامية 0.22-μm |
| غشاء PVDF، بمسامية 0.22 μm | Solarbio Life Sciences | YA1690 | URL: https://www.solarbio.com/goodsInfo?id=228106 |
| R | R Foundation for Statistical Computing | https://www.r-project.org/ | الإصدار 4.5.2 |
| randomForest | CRAN / randomForest authors | https://cran.r-project.org/package=randomForest | الإصدار 4.7-1.2 |
| جهاز PCR في الوقت الحقيقي | Roche Diagnostics | LightCycler 96 | إصدار البرنامج غير مؤكد. يختلف حجم المشروع/الدورات عن البروتوكول المذكور؛ لا يزال الربط الدقيق بالتجربة قيد التحقق. |
| جهاز طرد مركزي دقيق مبرد | الشركة المصنعة/الطراز غير مذكور في المخطوطة | غير مذكور | غير موثق: الشركة المصنعة، الطراز، ورابط المنتج الدقيق؛ الاستخدام المذكور: 12,000 × g لمدة 15 دقيقة عند 4 °C |
| rentrez | CRAN / rentrez authors | https://cran.r-project.org/package=rentrez | الإصدار 1.2.4 |
| منظم تحلل RIPA، قوة عالية | Solarbio Life Sciences | R0010 | URL: https://www.solarbio.com/goodsInfo?id=1163 |
| نظام الفصل الكهربائي SDS-PAGE | الشركة المصنعة/الطراز غير مذكور في المخطوطة | غير مذكور | غير موثق: الشركة المصنعة، الطراز، ورابط المنتج الدقيق؛ الاستخدام المذكور: فصل البروتينات على هلام بتدرج 4%–20% |
| Seurat | Satija Lab / Seurat developers | https://satijalab.org/seurat/ | الإصدار 5.5.0 |
| SingleR | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/SingleR/ | الإصدار 2.10.0 |
| مجانس أنسجة | الشركة المصنعة/الطراز غير مذكور في المخطوطة | غير مذكور | غير موثق: الشركة المصنعة، الطراز، ورابط المنتج الدقيق؛ الاستخدام المذكور: تجنيس الأنسجة في منظم تحلل مبرد بالثلج |
| كاشف TriQuick لاستخلاص RNA الكلي | Solarbio Life Sciences | R1100 | URL: https://www.solarbio.com/goodsInfo?id=1083 |
| Tween-20 | Solarbio Life Sciences | T8220 | URL: https://www.solarbio.com/goodsInfo?id=102 |
| أغطية مسطحة فائقة الوضوح لشرائط أنابيب PCR سعة 0.2-mL | Axygen / Corning | PCR-2CP-RT-C | URL: https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/TW/en/Genomics-%26-Molecular-Biology/PCR-Consumables/PCR-Tubes-and-Strip-Tubes/Axygen%C2%AE-PCR-Strip-Caps/p/PCR-2CP-RT-C |
| طقم RT-PCR عالمي (M-MLV) | Solarbio Life Sciences | RP1100 | URL: https://www.solarbio.com/goodsInfo?id=992 |
| WGCNA | CRAN / WGCNA authors | https://cran.r-project.org/package=WGCNA | الإصدار 1.74 |
| Windows | Microsoft | https://www.microsoft.com/windows/windows-11 | Windows 11 |
المراجع
- Armstrong DG, Tan TW, Boulton AJM, Bus SA. Diabetic foot ulcers: a review. JAMA. 2023;330(1):62–75.
- Bus SA et al. Guidelines on the prevention of foot ulcers in persons with diabetes (IWGDF 2023 update). Diabetes Metab Res Rev. 2024;40(3):e3651.
- Sloan G, Selvarajah D, Tesfaye S. Pathogenesis, diagnosis and clinical management of diabetic sensorimotor peripheral neuropathy. Nat Rev Endocrinol. 2021;17(7):400–20.
- Maione AG et al. Altered ECM deposition by diabetic foot ulcer-derived fibroblasts implicates fibronectin in chronic wound repair. Wound Repair Regen. 2016;24(4):630–43.
- Caley MP, Martins VLC, O'Toole EA. Metalloproteinases and wound healing. Adv Wound Care (New Rochelle). 2015;4(4):225–34.
- Lobmann R et al. Expression of matrix-metalloproteinases and their inhibitors in the wounds of diabetic and non-diabetic patients. Diabetologia. 2002;45(7):1011–6.
- Muller M et al. Matrix metalloproteinases and diabetic foot ulcers: the ratio of MMP-1 to TIMP-1 is a predictor of wound healing. Diabet Med. 2008;25(4):419–26.
- Theocharidis G et al. Single cell transcriptomic landscape of diabetic foot ulcers. Nat Commun. 2022;13(1):181.
- Vabalas A, Gowen E, Poliakoff E, Casson AJ. Machine learning algorithm validation with a limited sample size. PLoS One. 2019;14(11):e0224365.
- Lewis MJ et al. nestedcv: an R package for fast implementation of nested cross-validation with embedded feature selection designed for transcriptomics and high-dimensional data. Bioinform Adv. 2023;3(1):vbad048.
- Hattori N et al. MMP-13 plays a role in keratinocyte migration, angiogenesis, and contraction in mouse skin wound healing. Am J Pathol. 2009;175(2):533–46.
- Pang J, Maienschein-Cline M, Koh TJ. Monocyte/macrophage heterogeneity during skin wound healing in mice. J Immunol. 2022;209(10):1999–2011.
- Finley PJ et al. Diabetic wounds exhibit decreased Ym1 and arginase expression with increased expression of IL-17 and IL-20. Adv Wound Care (New Rochelle). 2016;5(11):486–94.
- Moon JY et al. IL-17A is increased in diabetic wounds and impairs keratinocyte function via histone demethylase JMJD3. Nat Commun. 2026;17(1):780.
- Xiao Y et al. Macrophages regulate healing-associated fibroblasts in diabetic wound. Mol Biol Rep. 2024;51(1):203.
- Theocharidis G et al. Integrated skin transcriptomics and serum multiplex assays reveal novel mechanisms of wound healing in diabetic foot ulcers. Diabetes. 2020;69(10):2157–69.
- Almeida AF et al. Bioavailability of quercetin in humans with a focus on interindividual variation. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2018;17(3):714–31.
- Khoshandam A, Imenshahidi M, Hosseinzadeh H. Pharmacokinetic of berberine, the main constituent of Berberis vulgaris L.: a comprehensive review. Phytother Res. 2022;36(11):4063–79.