ويهدف هذا كمقدمة لتصحيح تسجيل المشبك من البويضات القيطم المورق. وهو يغطي إزالة الغشاء المحي ، وتشكيل ختم gigaohm (gigaseal) ، وتحويل اختياري من التصحيح إلى طوبولوجيا خارج التدريجي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
منذ تطويره من قبل Sakmann وNeher 1 ، 2 ، أصبح المشبك التصحيح على النحو المنصوص عليه تقنية مفيدة للغاية لقياس كهربية من القنوات الأيونية واحدة أو متعددة في الخلايا. ويمكن تطبيق هذه التقنية على القنوات الأيونية في بيئتها الأصلية على حد سواء ، وأعرب عن غيري في الخلايا ، مثل البويضات التي تحصد من الضفادع الأفريقية المخالب ، القيطم المورق. هنا ، نحن تصف تقنية راسخة من تسجيل المشبك التصحيح من البويضات القيطم. وتستخدم هذه التقنية لقياس خصائص القنوات الأيونية إما يتم التعبير عنها في السكان (macropatch) أو بشكل فردي (على قناة واحدة تسجيل). علينا أن نركز على تقنيات لتعظيم نوعية البويضة وإعداد جيل الختم. مع كل العوامل الأمثل ، وهذا الأسلوب يعطي احتمال توليد ختم ناجحة أكثر من 90 في المئة. قد يكون الأمثل في عملية مختلفة من قبل كل باحث على أساس عوامل يرى انه أو انها الأكثر أهمية ، ونحن نقدم النهج الذي قد يؤدي الى نجاح أكبر في أيدينا.
البروتوكول
الجزء 1 : إزالة الغشاء المحي
- إعداد مجموعتين من الملقط. نحن نفضل رقم 5 الملقط ، حيث تم ضبط واحد شحذ قليلا مع ملف. أيضا بإعداد ماصة نقل وقص الزجاج والنار تلميع - 7 "باستور ماصة.
- وأوصت : لمنع الانزلاق من البويضات ، وقطع دائرة الشبكة (المربعات 1 ملم) والغراء في قاع طبق بيتري 60mm. ويمكن إعادة استخدام هذا الطبق إلى أجل غير مسمى إذا ما واصلت النظيفة بين الاستخدامات.
- ملء طبق بيتري في منتصف الطريق مع حل مفرط التناضح (انظر الوصفة) ووضع تحت ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هناك العديد من المعلمات تسجيل الكهربية لم تناقش هنا. تلاعب في الإعداد ، ونظام إدارة الضوضاء ، والتعبير القناة ، والبروتوكولات تسجيل كلها أمور حاسمة أيضا إلى نتائج تجريبية جيدة.
في تجربتنا ، هذه هي أهم معالم لتشكيل الأختام يعتمد عليها : البويضات ذات جودة عالية ، وإزالة الغشاء المحي بسرعة (ويعرف أيضا باسم "تقشير") ، استخدام ماصات سحبت حديثا حمايتها من الغبار ، وماصات سلس ، تطبيق الضغط الايجابي عند دخول الحمام الحل ، وأوقات وجيزة في الحمام قبل الخ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
تقلص وصفة الحل هو من مختبر الدريتش RW. نشكر وكالات التمويل والمؤسسات التالية للحصول على الدعم : المعاهد القومية للصحة ، المؤسسة الوطنية للعلوم ، الجمعية الأمريكية للقلب ، الضمور العضلي جمعية ، ودونالد وباء ديليا E. مؤسسة باكستر ، وصندوق الوقف وKlingenstein ماكنايت علم الأعصاب.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| مضخم تثبيت الرقعة &البرمجيات | الجهاز | HEKA Instruments | EPC-10 | أو أي جهاز مماثل آخر (على سبيل المثال HEKA EPC-9 أو Axopatch 200B) |
| ملقط رقم 5 (زوجان) | أداة | Fine Science Tools | ||
| محلول تقليص البويضات | كاشف | المكون الكمية N-methyl-D-glucamine 220 HEPES 10 MgCl2 1 EGTA 10 Aspartic Acid 220 KCl 2 ضبط الرقم الهيدروجيني pH إلى 7.4 باستخدام N-methyl-D-glucamine | ||
| شبكة منسوجة | ٨٠٠ ميكرومتر | Spectrum Labs | 146481 |
المراجع
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
