التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

ملخص

ويهدف هذا كمقدمة لتصحيح تسجيل المشبك من البويضات القيطم المورق. وهو يغطي إزالة الغشاء المحي ، وتشكيل ختم gigaohm (gigaseal) ، وتحويل اختياري من التصحيح إلى طوبولوجيا خارج التدريجي.

الملخص

منذ تطويره من قبل Sakmann وNeher ^{1 ، 2} ، أصبح المشبك التصحيح على النحو المنصوص عليه تقنية مفيدة للغاية لقياس كهربية من القنوات الأيونية واحدة أو متعددة في الخلايا. ويمكن تطبيق هذه التقنية على القنوات الأيونية في بيئتها الأصلية على حد سواء ، وأعرب عن غيري في الخلايا ، مثل البويضات التي تحصد من الضفادع الأفريقية المخالب ، القيطم المورق. هنا ، نحن تصف تقنية راسخة من تسجيل المشبك التصحيح من البويضات القيطم. وتستخدم هذه التقنية لقياس خصائص القنوات الأيونية إما يتم التعبير عنها في السكان (macropatch) أو بشكل فردي (على قناة واحدة تسجيل). علينا أن نركز على تقنيات لتعظيم نوعية البويضة وإعداد جيل الختم. مع كل العوامل الأمثل ، وهذا الأسلوب يعطي احتمال توليد ختم ناجحة أكثر من 90 في المئة. قد يكون الأمثل في عملية مختلفة من قبل كل باحث على أساس عوامل يرى انه أو انها الأكثر أهمية ، ونحن نقدم النهج الذي قد يؤدي الى نجاح أكبر في أيدينا.

البروتوكول

الجزء 1 : إزالة الغشاء المحي

1. إعداد مجموعتين من الملقط. نحن نفضل رقم 5 الملقط ، حيث تم ضبط واحد شحذ قليلا مع ملف. أيضا بإعداد ماصة نقل وقص الزجاج والنار تلميع - 7 "باستور ماصة.
2. وأوصت : لمنع الانزلاق من البويضات ، وقطع دائرة الشبكة (المربعات 1 ملم) والغراء في قاع طبق بيتري 60mm. ويمكن إعادة استخدام هذا الطبق إلى أجل غير مسمى إذا ما واصلت النظيفة بين الاستخدامات.
3. ملء طبق بيتري في منتصف الطريق مع حل مفرط التناضح (انظر الوصفة) ووضع تحت المجهر تشريح.
4. 1-3 إزالة البويضات القيطم من حل الحضانة مع ماصة باستير مصقول ومكان في الطبق.
5. انتظر 15S -- 2 دقيقة للخلايا أن يبدأ في الانكماش. أوقات أطول جعل خلايا قشر أسهل ؛ أقصر المهل الزمنية لصحة الخلايا من أجل التصحيح.
6. كما تقلص الخلايا ، والغشاء المحي تبدأ لتصبح بالكاد مرئية باعتبارها طبقة شفافة فوق الخلية. حدد خلية سليمة (بدون جدلات أو عيوب) لتقشير.
7. مع زوج واحد من الملقط ، فهم بلطف الغشاء المحي دون الإضرار غشاء البلازما. مع الآخر ، فهم بالقرب من نفس المكان وبلطف المسيل للدموع واضحة بصرف النظر الغشاء وخالية من الخلية.
8. مع ماصة باستور ، نقل بعناية الخلية إلى غرفة تسجيل. لاحظ أن الخلية سيكون هشا بعد إزالة المحي.

الجزء 2 : الجيل Gigaseal

1. ملء ماصة تسجيل مع المالحة. استخدام الحد الأدنى من حجم الحل الذي يجعل الاتصال الكهربائية جيدة مع السلك الكهربائي من أجل تقليل السعة ماصة.
2. نفض الغبار مرات عدة ماصة للسماح بتعويم فقاعات والانزلاق على السلك الكهربائي.
   الضغط على ماصة شغلها. ويمكن القيام بذلك عن طريق الفم أو مع مضخة ماء من متجر للحيوانات الاليفة. هذا الضغط ضروري للحفاظ على ماصة لأنه ينظف الصلبان واجهة السائل وينتقل إلى الخلية.
3. العثور على البويضة في الغرفة ، والتركيز بشدة على حافة الخلية.
4. مع ماصة للخروج من الحمام ، ومركز الطرف (من التركيز) أعلاه الخلية. يقلل هذا الوقت الذي يقضيه في الحمام قبل جيل الختم.
5. إسقاط ماصة أسفل إلى التركيز الشديد المقبل إلى الخلية. جعله مقربة (~ 50 ميكرون). سترى التشويه صغير من الحل للخروج من دفع ماصة من الضغط الخلفي.
6. باستخدام برنامج التصحيح المشبك ، والتحقق من مقاومة ماصة (هدفنا هو حوالي 3-4 MΩ) وصفر الحالي باستخدام الجهد الإزاحة.
7. مع الضغط الايجابي على ماصة ، نقل معلومات سرية ببطء نحو الخلية في حين رصد المقاومة بصريا أو باستخدام جهاز عرض الصوت الذي يولد لهجة الذي يتناسب مع وتيرة المقاومة. كما غيض يبدأ لمسة الخلية ، فإن المقاومة الزيادة.
8. ولكن فجأة التبديل بلطف من الموجب إلى الضغط السلبي من قيمة مطلقة تقريبا نفس. وينبغي زيادة المقاومة لتشكيل الختم.
9. معظم الوقت ، وتشكيل ختم يحدث في غضون عدة ثوان ؛ مطلوبة أحيانا 30-60 ثانية.
10. بمجرد أن المقاومة في 1GΩ ، يمكن الضغط من أجل الإفراج محايدة. لديك الآن إلى التصحيح على الخلية. للحصول على التصحيح من الداخل إلى الخارج ، وسحب بعيدا عن الخلية بسرعة. للخارج التدريجي ، انظر أدناه.

الجزء 5 : خارج التدريجي طوبولوجيا (اختياري)

1. مباشرة بعد تحقيق gigaseal ، وتمزق الغشاء. ويمكن القيام بذلك مع شفط حادة ، لكننا نفضل الخامس (أ) 1 1 مللي ثانية للنبض. وينبغي أن المقاومة تنخفض إلى أكثر قليلا من المقاومة ماصة الأولي.
2. نقل ماصة بعيدا عن الخلية ببطء وسلاسة. يجب أن تشاهد سحب قسم من الخلية مع ماصة. فجأة ، وخلال بضع ثوان ، وسوف الخلية المفاجئة الظهر والمقاومة يجب على الفور وبشكل متزامن عودة إلى GΩs.
3. لديك الآن تصحيحا في تكوين خارج التدريجي. ما يتعرض له من أي ectodomains القنوات الأيونية وشملت إلى الحمام.

الجزء 6 : النتائج المتوقعة

عموما ، والأختام أعلى المقاومة هي الأفضل ، وعاش فترة أطول. 10 GΩ هو المبدأ جيدة لنوعية عالية الأختام. في تجربتنا ، فإن فرص الحصول على أختام هذه النوعية تختلف مع العديد من العوامل ، لا سيما الخلايا الماصة والجودة. يمكن أن يكون التصحيح على أسعار اقتناء أكثر من 95 ٪ مع الخلايا السليمة ، الماصات نظيفة ، وباحث من ذوي الخبرة. قد تكون هذه البقع تستمر لعدة دقائق ومناسبة لأية دراسة الكهربية من القنوات الأيونية التي أعرب عنها في البويضات القيطم ، بما في ذلك تسجيلات قناة واحدة.

المناقشة

هناك العديد من المعلمات تسجيل الكهربية لم تناقش هنا. تلاعب في الإعداد ، ونظام إدارة الضوضاء ، والتعبير القناة ، والبروتوكولات تسجيل كلها أمور حاسمة أيضا إلى نتائج تجريبية جيدة.

في تجربتنا ، هذه هي أهم معالم لتشكيل الأختام يعتمد عليها : البويضات ذات جودة عالية ، وإزالة الغشاء المحي بسرعة (ويعرف أيضا باسم "تقشير") ، استخدام ماصات سحبت حديثا حمايتها من الغبار ، وماصات سلس ، تطبيق الضغط الايجابي عند دخول الحمام الحل ، وأوقات وجيزة في الحمام قبل الخ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مضخم تثبيت الرقعة &البرمجيات	الجهاز	HEKA Instruments	EPC-10	أو أي جهاز مماثل آخر (على سبيل المثال HEKA EPC-9 أو Axopatch 200B)
ملقط رقم 5 (زوجان)	أداة	Fine Science Tools
محلول تقليص البويضات	كاشف			المكون الكمية N-methyl-D-glucamine 220 HEPES 10 MgCl2 1 EGTA 10 Aspartic Acid 220 KCl 2 ضبط الرقم الهيدروجيني pH إلى 7.4 باستخدام N-methyl-D-glucamine
شبكة منسوجة	٨٠٠ ميكرومتر	Spectrum Labs	146481