مقالة منهجية

جعل التصحيح ، وماصات أقطاب شارب مع بولير برمجة

DOI:

10.3791/939

⸱

أكتوبر 8, 2008

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University , 2Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا الفيديو يوضح كيفية استخدام مجتذب برمجة لجعل ماصات التصحيح والأقطاب الكهربية حادة ل. ويمكن استخدام نفس الإجراء لتقديم مجموعة متنوعة من الأدوات الزجاجية ، بما في ذلك إبر الحقن.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد microelectrodes الزجاج (وتسمى أيضا الماصات) في العمود الفقري لالكهربية على مدى عقود. اليوم ، يتم إجراء من هذا القبيل من الشعيرات الدموية الماصات الزجاج باستخدام مجتذب برمجة. هذه الصكوك الحرارة الشعرية إما باستخدام خيوط معدنية أو الليزر واستخلاص الزجاج باستخدام الجاذبية ، والسيارات أو كليهما. يتم تشكيل لماصات التصحيح ، المشبك تسجيل استخدام الحرارة فقط ، والجاذبية ، بينما الأقطاب حادة لتسجيل الخلايا استخدام مزيج من الحرارة والجاذبية ، والحركية ملف. الإجراء التي استخدمت لصنع الخلايا الماصة تسجيل مماثلة لتلك التي استخدمت لصنع إبر الحقن لمجموعة متنوعة من التطبيقات ، بما فيها الحقن في كرنا القيطم البويضات. في الزجاج ، ويستخدم عامة الشعرية <1.2 مم في القطر لجعل ماصات لتسجيل المشبك التصحيح ، بينما يستخدم لتسجيل أضيق الزجاج داخل الخلايا (القطر الخارجي = 1.0 ملم). لكل أداة ، هو برمجة مجتذب مختلف قليلا. هذا الفيديو يبين كيفية جعل كلا النوعين من ماصات تسجيل مجتذب باستخدام برامج محددة مسبقا.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سحب ماصات

باستخدام microelectrode مجتذب مثل سوتر P - 97 يلهب / براون ، سحب مجموعة من حوالي 10-20 الماصات.

  1. حدد الزجاج الخاص الشعرية. نستخدم البورسليكات الشعيرات الدموية (سوتر BF150 - 110 - 10 ، القطر الخارجي 1.5mm ، 1.1mm قطرها الداخلي ، 10cm طويلة). مخزن الزجاج بعناية بحيث يبقى نظيفا والغبار الحرة.
  2. تصميم برنامج الانسحاب. نستخدم برنامج الخطوة 5 ، مع الحرارة وسرعة التنازلي في كل خطوة ، وسحب صغيرة على الخطوة النهائية. سوتر في ماصة كتاب طبخ مرجعا ممتازا لتطوير برامج مناسبة.
  3. دراسة نصائح ماصة تحت المجهر لتحديد قطرها الافتتاح وسلاسة. تجاهل الخام ، نصائح متفاوتا ، أو غير منتظمة. وينبغي أن يكون بروتوكول جيدة ضمان سحب هذه نادرة. لتسجيل التصحيح ، المشبك القياسية ، يجب أن تكون فتحات غيض 1-3 ميكرون في القطر. وتفتق الحاد (كليلة غيض) يؤدي إلى انخفاض المقاومة لفتح القطر نفسه. يمكن تعديل شكل وحجم الضغوط التي التلميع.

ماصات النار تلميع

  1. اقامة منصة تلميع (microforge) مع خيوط البلاتين التدفئة التي يسيطر عليها دواسة القدم. وهناك عدة مفيدة يتوفر من العلم ALA (CPM - 2) يمكن تجميعها أو جهاز مماثل مجزأة.
  2. اختياري : معطف ماصة مع عازل لتخفيض السعة وتحسين خصائص الضوضاء. نحن نستخدم الشمع الأسنان. Sylgard 184 ™ (بولي ميثيل siloxane الاستومر المعروف أيضا باسم PDMS) هو أيضا خيار.
  3. إذا باستخدام الشمع ، والحفاظ على كميات صغيرة المنصهر في مكان قريب. مع الضغط الجوي على الجزء الخلفي من ماصة للحفاظ على الشمع من دخول ماصة ، وتراجع لفترة وجيزة تلميح إلى الشمع السائل وإزالته. مع Sylgard وتخزين الاستومر أعد في aliquots المجمدة والطلاء غيض ماصة تحت المجهر. الحرارة لعلاج الاستومر.
  4. ضع ماصة (مغلفة أو لا) في جهاز تلميع وتقديم نصيحة ~ 50 ميكرون من خيوط. نضع في اعتبارنا أن خيوط سوف توسع عند تسخينها.
  5. وأوصت : اتبع بروتوكول منفصل عن "تلميع الضغط" لتغيير شكل ماصة للمقاومة الأمثل وقطر الحافة.
  6. نبضة قصيرة الحرارة (1-2 ثوان) كافية لإزالة الشمع من غيض من ماصة وناعمة الزجاج.
  7. ضع ماصة الانتهاء في صندوق مغلق للحماية من الغبار ، وكرر لمدة 10 ماصات ناجحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويوضح البروتوكول هو هنا في الاستخدام اليومي في المختبرات الكهربية وتستخدم أيضا لصنع إبر الحقن للخلايا والحيوانات. مع مجتذب برمجة ، فمن السهل أن تجعل ماصات لمجموعة متنوعة من الاستخدامات. مع الاهتمام والرعاية ، فإن خيوط مجتذب الخاص على الماضي لمدة سنة واحدة أو أكثر. حظا سعيدا مع التجارب الخاصة بك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر وكالات التمويل والمؤسسات التالية للحصول على الدعم : المعاهد القومية للصحة ، المؤسسة الوطنية للعلوم ، الجمعية الأمريكية للقلب ، الضمور العضلي جمعية ، ودونالد وباء ديليا E. مؤسسة باكستر ، وصندوق الوقف وKlingenstein ماكنايت علم الأعصاب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
جهاز سحب الماصات الدقيقةأداةSutter Instrument Co.P-97أو أداة مماثلة (مثل Sutter P-87 أو P-2000)
أنابيب شعرية زجاجيةكاشفSutter Instrument Co.BF150-86-10أو زجاج شعري مماثل. ولتسهيل عملية ملء الماصة، استخدم أنبوباً شعرياً يحتوي على فتيلة زجاجية.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Sutter P97 Microforge

مقالات ذات صلة