تقنية التعقيم في العلوم البيئية

تقنية التعقيم هي مهارة أساسية في علم الأحياء الدقيقة ، ولها تطبيقات حاسمة في البحوث البيئية.

إذا كانت الثقافات الميكروبيولوجية ملوثة ، فإن الوقت والعمالة والتكاليف المالية التي قد تكون مطلوبة من المختبر "لتنظيف" أو استبدال المزارع ، وخاصة العزلات النادرة من البيئات الفريدة ، يمكن أن تكون عالية جدا وباهظة الثمن ، وقد تكون بعض العينات لا يمكن الاستغناء عنها.

يقلل الاستخدام السليم للتقنيات المعقمة من احتمالية التلوث البكتيري والفطري للكواشف ووسائط الاستزراع والعينات البيئية ، كما يتجنب التلوث المتبادل بين العينات. إنه أيضا إجراء أمان يقلل من الانتقال المحتمل للميكروبات إلى المجرب ، وهو أمر مهم بشكل خاص عند العمل مع مسببات الأمراض.

سيقدم هذا الفيديو مبادئ التعقيم. العديد من التقنيات الهامة للحفاظ على الكواشف والثقافات المعقمة ؛ وأخيرا ، بعض استخداماتها في العلوم البيئية.

الهدف من استخدام التقنيات المعقمة هو إنشاء بيئة عمل معقمة ومعدات وكواشف والحفاظ عليها ، وذلك لتقليل تلوث العينات البيولوجية. تشمل المصادر الشائعة للتلوث الكائنات الحية الدقيقة المحمولة جوا ، والميكروبات الموجودة على مقعد المختبر أو المعدات ، وتلك الموجودة في شعر الباحث وجسمه وملابسه.

هناك نوعان من العوامل أساسية لإزالة أو منع التلوث في المختبر: المواد الكيميائية المطهرة والحرارة. غالبا ما تستخدم محاليل مثل 70٪ من الإيثانول والمبيض المخفف لتطهير المعدات وأسطح العمل وقفازات المجربين قبل الانخراط في أعمال معقمة.

في الوقت نفسه ، يمكن قتل الميكروبات الموجودة على الأدوات والأواني الزجاجية والوسائط السائلة أو داخلها بالحرارة في الأوتوكلاف ، وهي غرفة تعقم المحتويات عن طريق التعرض للبخار المضغوط بدرجة حرارة عالية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعقيم أدوات مثل قضبان الزجاج المستخدمة في الطلاء المنتشر وحلقات التلقيح المعدنية بالحرارة باستخدام مصدر لهب ، مثل موقد بنسن.

يعد استخدام مصدر اللهب أيضا أحد أكثر الطرق شيوعا لإنشاء بيئة عمل معقمة. تتسبب الحرارة المنبعثة من اللهب في حدوث الحمل الحراري للهواء ، مما يؤدي إلى زيادة التيار الهوائي الذي يرفع أي ملوثات محمولة جوا بعيدا عن محيط الموقد ، ويخلق "مجالا معقما" لإجراء أعمال تجريبية معقمة.

الآن بعد أن فهمت المبادئ الكامنة وراء التقنيات المعقمة وسبب أهميتها ، دعنا ننتقل إلى بروتوكول لإنشاء بيئة عمل معقمة ، وتكوين وسط نمو معقم ، ونقل البكتيريا معقمة بين ظروف الاستزراع المختلفة.

قبل البدء في العمل المعقم ، من المهم أن يرتدي المجرب معدات الحماية الشخصية المناسبة ، أو معدات الوقاية الشخصية. الغرض من ذلك هو منع المجرب من تلويث العينات والثقافات المعملية ، وكذلك لمنع نقل الميكروبات المسببة للأمراض إلى الباحث. تشمل عناصر معدات الوقاية الشخصية معطف المختبر والقفازات ونظارات السلامة.

الخطوة التالية هي تعقيم وتخزين وسائط النمو بشكل صحيح لاستخدامها في زراعة العينات الميكروبية. أولا ، قم بوزن الكمية المناسبة من المكونات الصلبة المتوسطة ، وأضفها إلى الحجم المناسب للمذيب السائل المحدد من قبل الشركة المصنعة ، مثل الماء منزوع الأيونات ، في حاوية قابلة للتعقيم أضف قضيب تحريك مغناطيسي ، ضع الحاوية على محرك لوح ساخن ، وقم بإذابة المكونات الوسيطة الصلبة بحرارة منخفضة وتقليب.

أغلق الحاويات المتوسطة. إذا كنت تستخدم وعاءا زجاجيا بغطاء لولبي ، فتأكد من عدم إحكام ربط الغطاء تماما ، حيث سيتمدد الهواء داخل الأوعية بسبب التسخين أثناء التعقيم ويحتاج إلى الهروب. بدون هروب ، يمكن أن يتسبب الغاز في تمزق السفينة. ضع قطعة من شريط الأوتوكلاف على الأوعية ، وقم بتعقيم الوسائط وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، مثل 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية. بعد التعقيم ، تحقق من أن الخطوط الموجودة على أشرطة الأوتوكلاف تحولت إلى اللون الأسود ، مما يشير إلى الوصول إلى درجة الحرارة المناسبة.

بالنسبة لوسائط نمو السائل ، اتركها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة ، وقم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة أو مع التبريد حسب الاقتضاء. بالنسبة لوسائط النمو الصلبة القائمة على أجار ، اتركها تبرد إلى حوالي 50؟ ج ، ثم تصب في أطباق بتري المعقمة. اترك الأجار يبرد ويتصلب قبل تخزينه في درجة الحرارة المناسبة.

بالنسبة للوسائط التي لا يمكن تعقيمها بسبب وجود مكونات حساسة للحرارة ، قم بتعقيم المرشح باستخدام مرشح 0.22 درجة مئوية.

تتمثل التقنية الأساسية في العمل الميكروبيولوجي في نقل الثقافات البكتيرية بشكل معقم بين وسائط النمو المختلفة ، الصلبة والسائلة. قبل البدء ، نظف سطح مقعد المختبر بمطهر. هذا يقلل من خطر تلويث الثقافات أو الوسائط المعقمة.

عادة ما يستخدم نقل الثقافات البكتيرية أداة تسمى حلقة التلقيح ، والتي تحتاج إلى التعقيم قبل استخدامها عن طريق التسخين في اللهب.

قم بتشغيل مصدر اللهب. مرر حلقة التلقيح ببطء عبر طرف اللهب. سوف تتحول الحلقة إلى اللون الأحمر الساخن. لنقل مستعمرة بكتيرية من صفيحة أجار صلبة ، افتح لوحة بتري قليلا ، واضغط برفق على حلقة التلقيح الساخنة على جزء فارغ من سطح الأجار لتجنب قتل البكتيريا بالحرارة. اكشط مستعمرة واحدة بحلقة التلقيح ، وأغلق اللوحة.

لنقل البكتيريا من وسط نمو سائل ، قم بإزالة الغطاء من حاوية الزراعة. للمساعدة في منع التلوث ، تجنب وضع الغطاء على المقعد. مرر فم الحاوية 2-3 مرات عبر الجزء الأكثر سخونة من اللهب. بعد ذلك ، المس بعناية حلقة التلقيح الساخنة والمعقمة داخل الحاوية واتركها تبرد قبل إدخالها في مزرعة المرق. قم بإزالة حلقة واحدة من الثقافة ، وأغلق الغطاء على الفور.

لنقل البكتيريا التي تم الحصول عليها إلى وسط نمو معقم ، قم بإزالة الغطاء من وعاء به مرق معقم وقم بتمرير فتحة الحاوية عبر اللهب 2-3 مرات. بعد ذلك ، قم بخفض حلقة التلقيح بعناية في الوسط ، وحركها برفق لتحرير البكتيريا. أغلق الغطاء على الفور. تعقيم حلقة التلقيح بعد الاستخدام.

في حالة نقل البكتيريا إلى صفيحة أجار معقمة ، افتح غطاء صفيحة بتري جديدة بأجار غير ملقح. قم بربط حلقة التلقيح بالثقافة البكتيرية ذهابا وإيابا عبر قطاع واحد من الأجار. قم بتعقيم الحلقة وتبريدها عن طريق لمس جزء فارغ من الأجار ، ثم قم بعمل خط آخر على الأجار بزاوية منفرجة للخط الأول ، مع التأكد من عبور الخط الأول في أول 1-2 ضربات ولكن تجنب لمس الخط الأول في السكتات الدماغية اللاحقة. كرر التعقيم والخطوط 2 مرات أخرى. أغلق لوحة بتري وقم بتعقيم حلقة التلقيح.

بمجرد التلقيح ، يجب بعد ذلك تحضين المرق أو صفيحة الأجار في درجة حرارة النمو المثالية للكائن الحي الدقيق المحدد للحصول على ثقافة قابلة للحياة. على الوسط الصلب ، يمكن رؤية العشب أو الخيط المستمر من البكتيريا على أجار مغطى بأول خطين ، ولكن يجب الحصول على مستعمرات فردية على الخط الأخير. قد تؤدي التقنيات المعقمة السيئة إلى نمو العفن والملوثات الأخرى على اللوحة.

تعتبر التقنيات المعقمة مهمة في العديد من التجارب التي تنطوي على عينات ميكروبية من البيئة. في هذه الدراسة ، عزل الباحثون العاثيات ، وهي فيروسات مصابة بالبكتيريا ، من بكتيريا التربة الشائعة Arthrobacter. نمت ثقافات المفاصل لأول مرة في ظل ظروف معقمة. ثم تم غسل عينات التربة وترشيحها في عازلة العاثيات ، وتم خلط محلول العاثيات مع الثقافة البكتيرية وطلاءه على ألواح أجار. سيتشكل العشب البكتيري على اللوحة ، ولكن ستكون هناك عمليات إزالة ، أو "لويحات" ، في الأماكن التي أصاب فيها الفيروس البكتيريا وقتلها. يمكن بعد ذلك تنقية العاثيات من هذه اللويحات لمزيد من الدراسة.

بخلاف استخدام شعلات بنسن ، يمكن أيضا الحفاظ على بيئات العمل المعقمة في محطات العمل المتخصصة المعروفة باسم شفاطات التدفق الصفحي ، والتي تستخدم تدفق الهواء الموجه والمرشحات للحفاظ على العقم. هنا ، عمل العلماء في غطاء التدفق لعزل البكتيريا والفيروسات المسببة للأمراض المحتملة من عينات المياه. ثم تم استزراع هذه العزلات مع الأميبا. نظرا لأن الأميبات تأكل عادة البكتيريا أو "البلعمة" ، فإن أي بكتيريا كانت قادرة على مقاومة هضم الأميبين والبقاء في هذه الكائنات الحية يمكن أن تظل قابلة للحياة في الخلايا البشرية وتسبب الأمراض.

أخيرا ، تسمح الظروف المعقمة بدراسة مفصلة للآليات البيئية مثل تكوين عقيدات الجذر في نباتات البقوليات - الأعضاء المليئة بالبكتيريا التي "تصلح" النيتروجين الجوي في الأمونيا ، والتي يستخدمها النبات للنمو. أنشأ الباحثون هنا "عوالم مصغرة" لدراسة عملية العقيدات باستخدام ألواح بتري مسننة مع وسط نمو النبات ، ووضعوا الشتلات فيها وتلقيح الشتلات بالبكتيريا الجذرية المكونة للعقيدات. تمنع البيئة المعقمة لغطاء التدفق تلوث الثقافات بالبكتيريا أو الفطريات الأخرى.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول التقنيات المعقمة في العلوم البيئية. يجب أن تفهم الآن سبب أهمية ظروف العمل المعقمة ؛ كيفية إجراء التجارب الميكروبيولوجية بشكل معقم ؛ وبعض تطبيقات التقنيات المعقمة للبحوث البيئية. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!