استخراج المؤشرات الحيوية من الرواسب - استخراج المذيبات المتسارع
المصدر: مختبر جيف سالاكوب - جامعة ماساتشوستس أمهيرست
تم العثور على توزيع مجموعة من المؤشرات الحيوية العضوية تسمى الجلسرين ثنائي الألكيل رباعي الإيثرات…
1. جمع المواد اللازمة
- استخراج العينات. يتم تجميد العينات (في هذه الحالة ، الرواسب) وتجفيفها بالتجميد وسحقها وتجانسها قبل الاستخراج ، واستخراجها في مجموعات لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة.
- اعتمادا على حجم العينة ، استخدم قوارير التجميع بأحجام 40 أو 60 مل. في هذه التجربة ، يتم استخدام قوارير زجاجية من البورسليكات (40 مل) وأغطية آمنة للمذيبات. قم باحتراق القوارير والماصات الزجاجية البورسليكات وعلب الوزن عند 550 درجة مئوية لمدة 6 ساعات قبل ضمان إزالة الملوثات العضوية المحتملة.
- ثنائي كلورو الميثان (DCM) والميثانول شائعان في معظم مختبرات الكيمياء الجيولوجية العضوية. استخدمها بشكل فردي (الميثانول أولا ، متبوعا ب DCM) لشطف أدوات المختبر والأواني الزجاجية قبل الاستخدام. يستخدم خليط من ثنائي كلورو الميثان إلى الميثانول (MeOH ؛ 9: 1) في العديد من المختبرات لاستخراج المؤشرات الحيوية بكفاءة مع مجموعة واسعة من الأقطاب. يجب أن تكون المذيبات خالية من الملوثات العضوية.
- احصل على مستخرج مذيب معجل لاستخدامه في هذه التجربة.
2. تحضير خلايا العينة
- قم بتجميع خلية عينة لكل عينة يتم استخراجها ، بالإضافة إلى خلية واحدة فارغة.
- لكل خلية ، قم بربط غطاء نهاية على أحد طرفي جسم الخلية.
- ضع مرشحا محترقا من الألياف الزجاجية فوق كل خلية باستخدام ملاقط مغسولة بالمذيبات. ثم اضغط برفق وببطء على الفلتر لأسفل في الخلية باستخدام مكبس المرشح.
- قم بتسمية أجسام الخلايا بالرقم ( على سبيل المثال 1 - 22) لكل عينة واكتب "فارغة" على الخلية الفارغة.
- املأ الفراغ بالأرض الدياتومية (أو الرمل) وغطاءه بغطاء نهاية ثان. شد باليد.
3. تحضير العينات
- ضع علبة وزن محترقة على ميزان المختبر ثم فارغها.
- اشطف ملعقة المختبر بالمذيب ، ثم استخدمها لنقل كتلة مناسبة من العينة إلى علبة الوزن ، وتسجيل الكتلة.
- تختلف كتلة العينة حسب محتواها من المواد العضوية. قد تتطلب المواد العضوية الخالية من الدهون نسبيا (الطين البحري) عدة جرامات ، بينما قد تتطلب المواد العضوية الغنية (أنسجة الأوراق) أقل بكثير.
- انقل جميع المواد الموجودة في علبة الوزن إلى خلية ASE مجهزة.
- ضع مرشحا آخر من الألياف الزجاجية في الجزء العلوي من الخلية ، ثم اضغط ببطء برفق لأسفل حتى يصل إلى الجزء العلوي من العينة باستخدام مكبس المرشح.
- أضف التراب الدياتومي (أو الرمل) إلى الخلية حتى تمتلئ تقريبا. احرص على إزالة أي حطام من خيوط جسم الخلية.
- قم بتغطية الجزء العلوي من الخلية بغطاء طرفي آخر.
- كرر الخطوات 3.1 - 3.6 لكل عينة.
4. تحضير قوارير التجميع
- قم بتسمية كل قارورة برقم الخلية المقابلة ( على سبيل المثال 1 - 22 أو فارغة) وغطاء بغطاء قارورة تجميع ASE.
5. الاستخراج
- ضع كل خلية عينة في فتحة مرقمة في درج ASE العلوي.
- ضع قارورة التجميع المقابلة في نفس فتحة الأرقام على درج ASE السفلي.
- قم بإنشاء طريقة الاستخراج باستخدام لوحة المفاتيح على ASE. يستخرج عند 100 درجة مئوية و 1,200 رطل لكل بوصة مربعة. استخرج كل عينة 3x مع ثبات ثابت لمدة 10 دقائق واغسل جسم الخلية بنسبة 50٪ من حجمها الإجمالي بين الحجوزات الثابتة.
- تأكد من أن زجاجة المذيبات تحتوي على مذيب كاف لاستخراج جميع العينات.
- اشطف ASE 3x قبل بدء التشغيل بالضغط على زر "شطف" على لوحة التحكم ASE.
- اضغط على ابدأ.
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
يعد استخراج المذيبات المتسارع تقنية سريعة وفعالة وعالية الإنتاجية تستخدم لفصل المؤشرات الحيوية العضوية عن أعداد كبيرة من عينات الرواسب الجيولوجية.
تقليديا ، يتم استخدام طرق الاستخراج مثل الصوتنة أو Soxhlet ، ومع ذلك ، فإن العيب في هذه البروتوكولات هو أنها بطيئة جدا في معالجة ما يكفي من المواد لإعادة بناء المناخ القديم التفصيلي. تم تطوير تقنية أحدث ، وهي طريقة استخراج المذيبات المعجل ، أو طريقة ASE ، مع وضع الكفاءة والإنتاجية العالية في الاعتبار.
تستخدم طريقة ASE مزيجا من درجات الحرارة المرتفعة والضغط العالي لاستخراج العينات ويمكنها إجراء عينات متعددة في عملية تحضير واحدة سريعة نسبيا.
هذا الفيديو هو الثالث في سلسلة توضح بالتفصيل كيفية استخراج المؤشرات الحيوية من الرواسب. سيغطي الإجراء ويوفر نظرة ثاقبة لمزايا ASE على الصوتنة أو استخراج Soxhlet.
في استخراج المذيبات المتسارع ، يتم تحميل العينات في خلايا فولاذية يتم تحميلها بعد ذلك على دائري. يتم أيضا تحميل قوارير التجميع لكل خلية عينة على دائري منفصل. تقوم الأداة بتحميل خلية عينة في فرن داخلي. يتم ضخ المذيب من زجاجة مذيبات من خلال سلسلة من الصمامات حتى يتم الوصول إلى ضغط كاف.
يتم الاحتفاظ بهذا الضغط لفترة زمنية تمليها العينة والتحليل. بعد ذلك ، يتم شطف المذيب من خلية العينة من خلال خط فولاذي في قارورة التجميع المقابلة. يمكن تكرار العملية عدة مرات. يمكن تخصيص درجة الحرارة والضغط والمدة للعينة.
تزيد درجة الحرارة المرتفعة المستخدمة من حركية الاستخراج بينما يمنع الضغط العالي المذيب من التطاير. تحتوي قارورة التجميع الآن على مستخلص دهني كامل ، وما تبقى في خلية العينة يسمى بقايا. وهي تتألف من مواد غير عضوية بالإضافة إلى مواد عضوية غير قابلة للاستخراج بالمذيبات ، تسمى الكيروجين.
الآن بعد أن أصبحنا على دراية بالمبادئ الكامنة وراء استخراج المذيبات المتسارع ، دعنا نلقي نظرة على كيفية تنفيذ ذلك في المختبر.
بعد جمع عينات ذات أهمية ؛ تجميد التجميد, تجانس, والتطهير كما هو موضح في مقطع فيديو آخر في هذه السلسلة.
بمجرد تحضير جميع العينات ، قم بتجميع خلية لكل واحدة ليتم استخراجها ، وواحدة إضافية لفراغ. للقيام بذلك ، قم بربط غطاء نهاية على جسم الخلية. باستخدام ملاقط مغسولة بالمذيبات ، ضع مرشحا محترقا من الألياف الزجاجية فوق كل واحدة. اضغط ببطء وبلطف على الفلتر لأسفل باستخدام المكبس.
قم بتسمية أجسام الخلايا بالرقم لكل عينة ، وقم بتسمية الفراغ بشكل منفصل. ضع علبة وزن محترقة على ميزان المختبر وقم بتفتيشها. اشطف الملعقة بالمذيب ، ثم استخدمها لنقل 5 إلى 10 جم من العينة إلى علبة الوزن ، وسجل الكتلة.
انقل جميع المواد الموجودة في علبة الوزن إلى الخلية المقابلة لها. ضع مرشحا آخر من الألياف الزجاجية في الأعلى ، ودكه برفق حتى يصل إلى أعلى العينة.
أضف مشتتا ، مثل التراب الدياتومي أو الرمل ، حتى يمتلئ تقريبا ، مع الحرص على تجنب دخول أي حطام إلى خيوط جسم الخلية. قم بتغطية الجزء العلوي من الخلية بغطاء طرفي آخر. كرر هذه الخطوات لكل عينة والفراغ.
قم بتسمية كل قارورة مجموعة برقم خلية العينة المقابلة أو فارغة ، وقم بغطاء قارورة. ضع كل خلية في فتحة مرقمة في درج ASE العلوي. قم بتعيين معلمات طريقة الاستخراج باستخدام لوحة المفاتيح الموجودة في ASE للاستخراج عند 100؟ ج?و 1,200 رطل لكل بوصة مربعة. استخرج كل عينة 3 مرات بثبات ثابت لمدة 10 دقائق واغسل جسم الخلية بنسبة 50٪ من حجمها الإجمالي بين الحجوزات الثابتة.
بعد ذلك ، تأكد من أن زجاجة المذيبات تحتوي على ما يكفي لاستخراج جميع العينات. اشطف خطوط الأداة؟ 3 مرات قبل بدء الجري. أخيرا ، اضغط على ابدأ.
قم بإزالة القارورة من ASE. الآن بعد أن تم استخراج المؤشرات الحيوية ، يجب تنقيتها قبل التحليل.
استخراج المذيبات المعجل هو تقنية متعددة الاستخدامات ، والتي يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من التطبيقات ، والتي يتم استكشاف بعضها هنا.
يمكن أيضا استخدام استخراج المذيبات المتسارع في أنواع أخرى من العينات ، بما في ذلك الطعام. يتم إجراء تحليل المخلفات لاختبار التلوث بمبيدات الآفات بشكل متكرر في المنشآت التنظيمية والصناعية للتأكد من سلامة وجودة المنتجات الغذائية مثل الفاكهة أو الخضروات. يمكن استخدام ASE لاستخراج مبيدات الآفات الكلورية العضوية من عينات الأغذية ، وتحديد أنواع أو مستويات المخلفات الموجودة في المنتج. يمكن بعد ذلك استخدام هذه المعلومات لتحديد ما إذا كانت المنتجات صالحة للاستهلاك البشري أو الحيواني. على سبيل المثال ، يجب العثور على dieldrin في حدود 0 إلى 0.1 جزء في المليون على الطعام ، اعتمادا على المنتج.
يمكن أيضا استخراج المكونات الغذائية الغذائية باستخدام ASE. على سبيل المثال ، يمكن استخراج منتجات مثل الشوكولاتة ، التي قد تحتوي على نسبة عالية من الدهون الوزنية. باستخدام ASE مع الأثير البترولي كمذيب ، يمكن فصل الدهون عن عينات الشوكولاتة وإخضاعها للتحليل الكمي لتحديد نسبة مئوية دقيقة من محتوى الدهون لكل كمية معروفة من الشوكولاتة. باستخدام هذه المعلومات ، يمكن للهيئات التنظيمية التحقق من الادعاءات التي قدمها مصنعو الشوكولاتة ، أو يمكن للمصنعين الحصول على معلومات لإنشاء ملصقات طعام دقيقة.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لاستخراج المؤشرات الحيوية للدهون باستخدام استخراج المذيبات المتسارع ، أو ASE. يمكن العثور على طرق لمزيد من المعالجة والتحليل في مقاطع الفيديو اللاحقة.
شكرا للمشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is accelerated solvent extraction better than sonication or Soxhlet extraction?
Accelerated solvent extraction is faster and more efficient than traditional methods like sonication or Soxhlet extraction. ASE combines high temperature and high pressure to extract biomarkers from sediment samples in a single, relatively fast preparation run. This high-throughput capability enables researchers to process hundreds or thousands of samples needed for detailed paleoclimate reconstruction, which older extraction methods cannot achieve.
Q2: How do temperature and pressure work together in accelerated solvent extraction?
In accelerated solvent extraction, high temperature increases the kinetics of the extraction process, speeding up biomarker separation from sediment. High pressure simultaneously keeps the solvent from volatizing, or evaporating, during extraction. This combination of elevated temperature and pressure allows the ASE method to efficiently extract organic compounds while maintaining solvent integrity throughout the procedure.
Q3: What materials are used to prepare samples for accelerated solvent extraction?
Samples are loaded into steel cells with combusted glass fiber filters placed above and below the sediment material. A dispersant such as diatomaceous earth or sand is added to fill the cell and improve solvent contact. End caps seal the cell, and collection vials receive the extracted material. All glassware and filters are combusted to remove organic contaminants before use.
Q4: What is the difference between a total lipid extract and kerogen in ASE?
A total lipid extract is the organic material dissolved by the solvent and collected in the vial after accelerated solvent extraction. Kerogen is the non-extractable organic material that remains in the sample cell after extraction. The residue left behind comprises both non-organic material and kerogen, representing compounds that are not solvent-extractable.
Q5: How can accelerated solvent extraction be used for food safety testing?
Accelerated solvent extraction can extract organochlorine pesticides and other residues from food samples like fruits and vegetables. ASE determines the types and levels of pesticide contamination present, helping regulatory and industrial facilities verify whether produce is safe for human or animal consumption. For example, dieldrin levels must remain within 0 to 0.1 parts per million depending on the product.
Q6: What role do biomarkers play in paleoclimate reconstruction?
Biomarkers like glycerol-dialkyl glycerol-tetraethers (GDGTs) are produced by archaea and bacteria and change predictably in response to air or water temperature. The distribution of these biomarkers in sediment sequences of known age allows scientists to reconstruct past temperature changes on decadal to millennial timescales. This paleoclimate data requires rapid analysis of hundreds or thousands of samples, making accelerated solvent extraction essential.
Q7: What happens to the extracted biomarkers after accelerated solvent extraction?
After accelerated solvent extraction, the total lipid extract containing biomarkers must be purified before analysis. The purification process removes unwanted compounds and concentrates the target biomarkers. Purification of a total lipid extract with column chromatography is a common next step in preparing samples for detailed chemical and paleoclimate analysis.