Why is dilution necessary when culturing bacteria from soil samples?

Soil typically contains over one million bacteria per gram, making direct plating impossible for accurate colony counting. Serial dilutions reduce bacterial concentration to levels where individual colonies can grow separately on media plates, enabling accurate enumeration and calculation of the original bacterial population in the soil sample.

What is the difference between bacteria and actinomycetes in soil?

Actinomycetes are filamentous bacteria that grow strung together to form hyphae, distinguishing them from typical bacteria. They account for approximately 10% of the total bacterial population in soil and preferentially grow on glycerol-casein based plates, whereas most bacteria grow on peptone-yeast agar plates.

How do you prepare serial dilutions of a soil sample for bacterial enumeration?

Weigh 10 grams of soil and add to 95 milliliters of deionized water, then shake well. Transfer 1 milliliter to 9 milliliters of fresh water and vortex. Repeat this process four times sequentially, creating dilutions from 10-1 through 10-5 grams of soil per milliliter, ensuring the soil does not settle between transfers.

What colony characteristics distinguish actinomycetes from other bacteria on agar plates?

Actinomycete colonies appear chalky, firm, and leathery, breaking under pressure when touched with a sterile loop. In contrast, typical bacterial colonies are slimy and range from colorless to bright orange, yellow, or pink, smearing when touched. These tactile differences allow easy distinction between colony types.

How is the colony forming unit count calculated from dilution plates?

Multiply the number of colonies counted on the plate by the reciprocal of the dilution factor. For example, 46 colonies on a 10-5 dilution plate with 0.1 milliliter inoculant equals 46 million CFUs per gram of soil. Only count plates containing 30-200 colonies for accuracy.

What do bacterial counts reveal about soil health?

Healthy soil contains between 10-6 and 10-8 bacteria per gram. Counts below 10-6 or above 10-8 indicate unhealthy soil, potentially caused by nutrient deficiency, organic matter loss, extreme pH, or contamination. Bacterial enumeration serves as a key indicator for assessing soil ecosystem health and quality.

How can isolated soil bacteria be used to identify antibiotic compounds?

Test bacteria or compounds are added to plates containing bacterial lawns, and growth inhibition is observed. Clear patches where growth was inhibited may indicate antibiotic activity. This method allows scientists to screen isolated soil bacteria for potential new antibiotic compounds with medical applications.

استزراع وتعداد البكتيريا من عينات التربة

0 مشاهدة10:57 دقيقة

1. تحضير تخفيفات التربة

لبدء الإجراء ، قم بوزن 10 جم من عينة التربة وأضفها إلى 95 مل من الماء منزوع الأيونات. رج التعليق جيدا ، وقم بتسمية "A".
قبل أن تستقر التربة ، قم بإزالة 1 مل من التعليق بماصة معقمة وانقله إلى ماء منزوع الأيونات سعة 9 مل. دوامة تماما ، وتسميتها باسم "B".
كرر خطوة التخفيف هذه ثلاث مرات ، في كل مرة مع 1 مل من التعليق السابق وماء منزوع الأيونات سعة 9 مل. قم بتسمية هذه بالتسلسل على أنها أنابيب C و D و E. ينتج عن هذا تخفيفات متسلسلة من ^10-1 إلى ^10-5 جرامات من التربة لكل مل

2. صنع لوحات انتشار للثقافة البكتيرية

لزراعة المستعمرات البكتيرية ، خذ ثلاث ألواح أجار خميرة البيبتون المعدة مسبقا وقم بتسميتها على أنها C و D و E. عينات دوامة C و D و E ، وماصة 0.1 مل على كل لوحة. هذا يزيد من قيمة التخفيف أكثر ، بمعامل عشرة (C = ^10-3 ، D = ^10-4 ، E = ^10-5).
بعد ذلك ، اغمس موزعة الزجاج في الإيثانول. ضع الموزعة في اللهب لبضع ثوان لإشعال الإيثانول وحرقه. سيؤدي ذلك إلى تعقيم الموزعة.
أمسك الموزعة فوق اللوحة الأولى حتى يتم إطفاء اللهب. افتح اللوحة بسرعة ، مع الاحتفاظ بالغطاء بالقرب منك. المس الموزعة إلى الأجار بعيدا عن اللقاح (اللقاح = الخلايا المستخدمة لبدء الثقافة) لتبرد ، ثم انشر قطرة اللقاح حول سطح الأجار حتى تختفي آثار السائل الحر. استبدل غطاء اللوحة.
أعد اللهب على الموزعة وكرر العملية مع اللوحة التالية ، واعمل بسرعة حتى لا تلوث الأجار بالكائنات الحية المحمولة جوا
احتضان صفائح البكتيريا في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 أسبوع. تأكد من قلب الألواح أثناء الحضانة لمنع قطرات الرطوبة من التكثيف من السقوط على سطح الأجار.

3. صنع لوحات انتشار للفطريات الشعاعية

لزراعة الفطريات الشعاعية ، خذ ثلاث ألواح جلسرين كازين معدة مسبقا وقم بتسميتها ب B و C و D. باستخدام التقنيات الموضحة سابقا ، انشر اللوحة 0.1 مل من المعلقات B و C و D. يتم استخدام التخفيفات السفلية لأن الفطريات الشعاعية موجودة عادة على أنها 1/10^من مجموعة البكتيريا (B = ^10-2 ، C = ^10-3 ، D = ^10-4).
احتضان ألواح الفطريات الشعاعية (مقلوبة) في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوعين.

4. عدد البكتيريا والفطريات الشعاعية

بعد الحضانة ، افحص جميع صفائح البكتيريا بعناية ، ولاحظ الاختلافات في حجم المستعمرة وشكلها. عندما تنمو البكتيريا على أجار ، تنتج مستعمرات لزجة تتراوح من عديمة اللون إلى البرتقالي الفاتح أو الأصفر أو الوردي. في المقابل ، تكون مستعمرات الفطريات الشعاعية طباشيرية ، صلبة ، جلدية ، وسوف تنكسر تحت الضغط ، حيث تلطخ المستعمرات البكتيرية الأخرى. هذا يسمح بتمييز المستعمرات عن طريق اللمس بحلقة معقمة.
عد وسجل عدد المستعمرات البكتيرية ، بما في ذلك أي فطريات شعاعية. عد فقط اللوحات التي تحتوي على 30-200 مستعمرة لكل طبق.

5. عزل الثقافات النقية

حدد مستعمرات بكتيرية فردية من أي من اللوحات. يمكن اختيار المزيد من المستعمرات إذا كان هناك اهتمام خاص بالتربة. استخدم صفيحة عالية التخفيف ، لأنها تميل إلى أن يكون لها مستعمرات نقية مفصولة جيدا. اختر فقط المستعمرات المنفصلة جيدا عن المستعمرات المجاورة وتبدو متميزة شكليا عن بعضها البعض.
عقم الحلقة عن طريق غمسها في الكحول وإشعال النيران. افتح طبق بتري محل الاهتمام بسرعة ، ولمس الحلقة إلى بقعة عارية في الأجار لتبريدها. ثم قم بإزالة كمية صغيرة من مستعمرة ذات أهمية على الحلقة.
أخذ طبق خميرة ببتون طازج ، اصنع خطا بطول بضعة سنتيمترات على جانب واحد. قم بتعقيمها وتبريدها مرة أخرى ، ثم قم بعمل خط يعبر الخط الأولي فقط في التمريرة الأولى. كرر هذه العملية مرتين أخريين بنفس الطريقة. ينتج عن هذا "التخفيف" المخطط فصل الخلايا الموجودة على الحلقة عن بعضها البعض. ضع الطبق في مكان مظلم لتحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوعين.

يعد

تحديد عدد دقيق للبكتيريا البيئية أمرا بالغ الأهمية لتقييم صحة النظام البيئي للتربة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق زراعة المستعمرات البكتيرية بالتخفيفات المناسبة.

تعد

بكتيريا التربة جزءا مهما من النظام البيئي الصحي للتربة، حيث تلعب أدوارا في التحلل وتثبيت النيتروجين ودورة المغذيات. التربة السطحية عبارة عن ركيزة من الجزيئات العضوية وغير العضوية التي تشكل مصفوفة معقدة تحيط بالمسام التي تمتلئ بالهواء أو الماء. تخلق هذه الظروف نظاما بيئيا مثاليا للبكتيريا ، حيث تحتوي التربة السطحية عادة على ما يزيد عن مليون بكتيريا لكل جرام.

بسبب هذا التركيز العالي للبكتيريا ، فإن التخفيف ضروري قبل الطلاء على وسط النمو. يمكن أن تقلل التخفيفات التسلسلية من تركيز عينة التربة الأصلية إلى مستويات منخفضة بما يكفي لزراعة مستعمرات مفردة على ألواح الوسائط ، مما يسمح بحساب التعداد الأولي للبكتيريا في عينة التربة.

سيوضح هذا الفيديو كيفية تحضير التخفيفات التسلسلية لعينات التربة ، وكيفية صفيحة هذه العينات البكتيرية ، وكيفية حساب تعداد بكتيريا التربة من ألواح التخفيف.

البكتيريا هي كائنات بدائية النواة بسيطة ، ولكنها متنوعة للغاية من حيث الأنواع والنظام البيئي. الفطريات الشعاعية هي مجموعة فرعية من البكتيريا التي غالبا ما تعتبر مجموعة فريدة بسبب بنيتها الخيطية ، حيث تنمو متشابكة معا لتشكيل خيوط.

عادة ما تمثل الفطريات الشعاعية 10٪ من إجمالي البكتيريا في التربة. البكتيريا والفطريات الشعاعية وفيرة في كل بيئة تقريبا على وجه الأرض ، ولكنها توجد في تنوع ووفرة لا مثيل لهما في التربة.

يتم تعداد بكتيريا التربة ، ومن المحتمل أن يتم زراعتها وتحديدها عن طريق الطلاء المخفف. هنا ، يتم تخفيف عينة التربة بشكل متسلسل في الماء ، ثم يتم تشتيتها على ألواح نمو الأجار. ثم يتم حساب المستعمرات الناتجة. تستخدم هذه القيمة ، جنبا إلى جنب مع عامل التخفيف ، لتوضيح التركيز الأولي للبكتيريا في التربة.

يعد طلاء التخفيف طريقة شائعة وغير مكلفة وبسيطة لتعداد البكتيريا ، ولكنه يعاني من العديد من العيوب. لا ينبغي السماح للتربة بالاستقرار أثناء التخفيفات ، مما قد يؤدي إلى نمو متحيز. لن تزرع بعض بكتيريا التربة على الألواح ، أو تنمو ببطء شديد بحيث لا يمكن ملاحظتها. بالإضافة إلى ذلك ، تفترض هذه الطريقة أن المستعمرات تتكون من بكتيريا واحدة ، لكنها قد تنشأ من كتل من خلايا متعددة.

تنمو بعض الأنواع البكتيرية بشكل أفضل على وسائط النمو المختلفة. الركيزة الشائعة لزراعة مجموعة واسعة من البكتيريا هي صفيحة خميرة أجار ببتون. تنمو الفطريات الشعاعية بشكل تفضيلي على ألواح أساسها الجلسرين والكازين ، والتي تناسب بشكل أفضل نمو هذه البكتيريا الخيطية.

الآن بعد أن فهمت المفهوم الكامن وراء تعداد البكتيريا ، دعنا نرى كيف تتم هذه العملية في المختبر.

لبدء الإجراء ، قم بوزن 10 جم من عينة التربة ، وأضفها إلى 95 مل من الماء منزوع الأيونات. رج التعليق جيدا ، وقم بتسمية "A". قبل أن تستقر التربة ، قم بإزالة 1 مل من المعلق بماصة معقمة وانقله إلى 9 مل من الماء منزوع الأيونات. دوامة تماما ، وتسميتها باسم "B".

كرر خطوة التخفيف هذه 3 مرات ، في كل مرة مع 1 مل من التعليق السابق و 9 مل من الماء منزوع الأيونات. قم بتسمية هذه بالتسلسل على أنها أنابيب C و D و E. ينتج عن هذا تخفيفات متسلسلة من ^10-1 إلى ^10-5 جرام من التربة لكل مل.

لزراعة المستعمرات البكتيرية ، خذ 3 ألواح أجار خميرة البيبتون المعدة مسبقا وقم بتسميتها على أنها C و D و E. Vortex العينات المقابلة والماصة 0.1 مل على كل لوحة. نظرا لأنه يتم الإبلاغ عن CFUs لكل مل ، فإن استخدام 0.1 مل يزيد من التخفيف بمعامل عشرة.

بعد ذلك ، اغمس موزعة الزجاج في الإيثانول. ضع الموزعة في اللهب لبضع ثوان لإشعال الإيثانول وحرقه. سيؤدي ذلك إلى تعقيم الموزعة.

أمسك الموزعة فوق اللوحة الأولى حتى يتم إطفاء اللهب. افتح اللوحة بسرعة ، مع الاحتفاظ بالغطاء بالقرب منك. المس الموزعة على الأجار بعيدا عن اللقاح لتبرد ، ثم انشر قطرة اللقاح حول السطح حتى تختفي آثار السائل الحر. استبدل غطاء اللوحة.

أعد لهب الموزعة وكرر العملية مع اللوحة التالية ، واعمل بسرعة حتى لا تلوث اللوحة بالكائنات الحية المحمولة جوا. اقلب الألواح لمنع سقوط قطرات الرطوبة على الأجار ، واحتضان الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوع واحد.

لزراعة الفطريات الشعاعية ، خذ ثلاث ألواح جلسرين كازين معدة مسبقا وقم بتسميتها ب B و C و D. باستخدام التقنيات الموضحة سابقا ، انشر اللوحة 0.1 مل من المعلقات B و C و D. يتم استخدام التخفيفات السفلية لأن الفطريات الشعاعية موجودة عادة على أنها 1/10 من مجموعة البكتيريا.

أخيرا ، اقلب هذه الأطباق واحفظها في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوعين.

بعد الحضانة ، افحص جميع صفائح البكتيريا بعناية ، ولاحظ الاختلافات في حجم المستعمرة وشكلها. عندما تنمو البكتيريا على أجار ، تنتج مستعمرات لزجة تتراوح من عديمة اللون إلى البرتقالي الفاتح أو الأصفر أو الوردي. في المقابل ، تكون مستعمرات الفطريات الشعاعية طباشيرية ، صلبة ، جلدية ، وسوف تنكسر تحت الضغط ، حيث تلطخ المستعمرات البكتيرية الأخرى. هذا يسمح بتمييز المستعمرات عن طريق اللمس بحلقة معقمة.

عد وسجل عدد المستعمرات البكتيرية ، بما في ذلك أي فطريات شعاعية. عد فقط اللوحات التي تحتوي على 30-200 مستعمرة لكل طبق.

لزراعة ثقافات من بكتيريا فردية معينة ، حدد مستعمرات منفصلة من أي من الصفائح ، واختر مستعمرات منفصلة جيدا عن المستعمرات المجاورة. قم بتعقيم حلقة منتشرة ، ثم افتح اللوحة ولمس الحلقة في مكان فارغ لتبرد. بعد ذلك ، اختر كمية صغيرة من المستعمرة ذات الأهمية في الحلقة.

أخذ طبق خميرة ببتون طازج ، اصنع خطا بطول بضعة سنتيمترات على جانب واحد. قم بتعقيمها وتبريدها مرة أخرى ، ثم قم بعمل خط يعبر الخط الأولي فقط في التمريرة الأولى. كرر هذه العملية مرتين أخريين بنفس الطريقة. ينتج عن هذا "التخفيف" المخطط فصل الخلايا الموجودة على الحلقة عن بعضها البعض. ضع الطبق في مكان مظلم لتحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوعين.

من عدد مستعمرات البكتيريا والفطريات الشعاعية ، يمكن تحديد وحدات تشكيل المستعمرة لكل جرام من التربة. عدد المستعمرات لكل جرام من التربة يساوي عدد المستعمرات المحسوبة على اللوحة ، مضروبا في مقلوب التخفيف المطلي. على سبيل المثال ، إذا تم حساب 46 مستعمرة على لوحة تخفيف من ^10-5 مع لقاح 0.1 مل ، فإن CFU لكل جرام من التربة يساوي ^10-6 بواسطة 46 ، أو 46 مليون CFU لكل جرام من التربة.

يعد

إجراء تعداد البكتيريا والثقافات خطوة أولى رئيسية في العديد من التحقيقات أو البروتوكولات العلمية.

تحتوي

التربة السليمة على ما بين 10 6 و 10⁸ بكتيريا لكل جرام. يمكن استخدام التعداد البكتيري للتربة لتحديد صحة التربة ذات الأهمية ، ويشير تعداد أقل من 10 6 و 10 ⁸ بكتيريا لكل جرام إلى تربة غير صحية أو فقيرة. قد يكون سبب ذلك نقص العناصر الغذائية أو المواد العضوية ، أو الإجهاد اللاأحيائي بسبب درجة الحموضة الشديدة في التربة ، أو تلوث التربة.

تم التعرف على العديد من أنواع المضادات الحيوية المستخدمة في الطب اليوم لأول مرة من البكتيريا أو الفطريات التي تعيش في التربة. يمكن أن يساعد عزل السلالات النقية من مزارع التربة في مساعدة العلماء على تحديد مركبات المضادات الحيوية الجديدة. هنا ، يمكن إضافة بكتيريا الاختبار أو المركبات المعزولة ذات الأهمية إلى الألواح المزروعة بالمروج البكتيرية ، وتسجيل آثارها على نمو العشب. قد تشير البقع الشفافة في المروج البكتيرية حيث تم تثبيط النمو بواسطة بكتيريا الاختبار أو مركب الاختبار إلى نشاط المضادات الحيوية.

تعتمد النباتات البقولية بما في ذلك البازلاء والفاصوليا على العلاقات التكافلية مع البكتيريا المثبتة للنيتروجين. تعيش هذه البكتيريا بحرية في التربة أو داخل العقيدات في نظام الجذر ، وتنتج مركبات النيتروجين التي يستخدمها النبات. في التربة الفقيرة ، قد يؤدي استكمال المحاصيل البقولية بالبكتيريا المثبتة للنيتروجين المستزرعة من التربة إلى تعزيز نمو النباتات وصحتها. يمكن أن يؤدي ذلك إلى نباتات أكبر وأكثر صلابة ، والتي بدورها تعطي إنتاجية أكبر من المحاصيل.

لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE للتعداد البكتيري. يجب أن تفهم الآن كيفية إجراء تخفيفات عينات التربة ، وكيفية صفيحة عد المستعمرات وعزل المستعمرة ، وكيفية حساب أعداد البكتيريا في عينات التربة. شكرا للمشاهدة!