استزراع وتعداد البكتيريا من عينات التربة
185,588 Views
Overview
المصدر: مختبرات الدكتور إيان بيبر والدكتور تشارلز جيربا – جامعة أريزونا
المؤلفون المظاهرون: برادلي شميتز ولويزا إيكنر
التربة السطحية عبارة عن مزيج غير متجانس من الجسيمات غير العضوية والعضوية التي تتحد معا لتشكيل مجاميع ثانوية. داخل وبين الركام توجد فراغات أو مسام تحتوي بصريا على كل من الهواء والماء. تخلق هذه الظروف نظاما بيئيا مثاليا للبكتيريا ، لذلك تحتوي جميع أنواع التربة على أعداد كبيرة من البكتيريا ، عادة أكثر من مليون لكل جرام من التربة.
البكتيريا هي أبسط الكائنات الحية الدقيقة ، والمعروفة باسم بدائيات النوى. ضمن هذه المجموعة بدائية النواة ، توجد الميكروبات الخيطية المعروفة باسم الفطريات الشعاعية. الفطريات الشعاعية هي في الواقع بكتيريا ، لكنها غالبا ما تعتبر مجموعة فريدة من نوعها في تصنيف البكتيريا بسبب تركيبها الخيطي ، والذي يتكون من خلايا متعددة متشابكة معا لتشكيل خيوط. تستخدم هذه التجربة وسائط حالة الجلسرين التي تختار مستعمرات الفطريات الشعاعية ، أثناء التخفيف والطلاء. عادة ما تشكل الفطريات الشعاعية حوالي 10٪ من إجمالي البكتيريا. تم العثور على البكتيريا والفطريات الشعاعية في كل بيئة على الأرض ، لكن وفرة وتنوع هذه الميكروبات في التربة لا مثيل لها. هذه الميكروبات ضرورية أيضا لحياة الإنسان وتؤثر على ما يأكله الناس أو يشربون أو يتنفسون أو يلمسونه. بالإضافة إلى ذلك ، هناك أنواع بكتيرية يمكن أن تصيب الناس وتسبب المرض ، وهناك بكتيريا يمكن أن تنتج منتجات طبيعية قادرة على شفاء الناس. الفطريات الشعاعية مهمة بشكل خاص لإنتاج المضادات الحيوية ، مثل الستربتومايسين. البكتيريا ضرورية لدورة المغذيات ونمو النبات وتدهور الملوثات العضوية.
البكتيريا متنوعة للغاية من حيث عدد الأنواع التي يمكن العثور عليها في التربة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى أنها متنوعة من الناحية الفسيولوجية والتمثيل الغذائي. يمكن أن تكون البكتيريا غير متجانسة التغذية ، مما يعني أنها تستخدم مركبات عضوية ، مثل الجلوكوز ، للغذاء والطاقة ، أو ذاتية التغذية ، مما يعني أنها تستخدم مركبات غير عضوية ، مثل عنصر الكبريت ، للغذاء والطاقة. يمكن أن تكون أيضا هوائية ، أو تستخدم الأكسجين للتنفس ، أو لاهوائية ، باستخدام أشكال مشتركة من الأكسجين ، مثل النترات أو الكبريتات ، للتنفس. يمكن لبعض البكتيريا استخدام الأكسجين أو الأشكال المركبة من الأكسجين وتعرف باسم اللاهوائية الاختيارية.
Principles
تتمثل إحدى طرق تعداد عدد البكتيريا الموجودة في عينة التربة في استخدام منهجية التخفيف والطلاء. تستخدم هذه المنهجية أجار كوسيط لنمو البكتيريا ، وهي عملية تسمى “التكنولوجيا القابلة للزراعة”. بسبب الأعداد الهائلة من البكتيريا الموجودة داخل التربة ، يتم تخفيف عينة صغيرة من التربة بشكل متسلسل في الماء ، قبل أن يتم طلاؤها على أجار داخل صفيحة بتري. عادة ما يتم “انتشر” كمية صغيرة من التربة الموجودة في 0.1 إلى 1 مل من معلق التربة المخفف على سطح صفيحة الأجار. تحتوي الألواح على أجار ، وهو منصهر عندما يكون ساخنا ، ولكنه صلب عندما يبرد. بالإضافة إلى الأجار ، تتم إضافة العناصر الغذائية ، مثل خميرة الببتون أو المنتج المتاح تجاريا مثل R2A ، إلى الوسط للسماح بنمو البكتيريا غير المتجانسة.
التخفيف والطلاء هي تقنية غير مكلفة وبسيطة نسبيا لتعداد بكتيريا التربة. ومع ذلك ، هناك العديد من العيوب لهذه التقنية. بعض الأخطاء والافتراضات الشائعة المرتبطة بمقايسات التخفيف والطلاء هي كما يلي: من المفترض أن كل بكتيريا تربة تؤدي إلى ظهور مستعمرة ، ولكن في الواقع قد تنشأ مستعمرة من مجموعة من الخلايا ، مما يؤدي إلى التقليل من العدد الحقيقي القابل للزراعة. أثناء التخفيف التسلسلي للتربة ، يمكن أن تستقر جزيئات التربة (تسقط في القاع) ، لذلك لا يتم تمرير الحصة الحقيقية للتربة إلى التخفيف التالي. العديد من ميكروبات التربة قابلة للحياة ولكنها غير قابلة للزراعة. قد لا تؤدي البكتيريا بطيئة النمو إلى مستعمرات مرئية خلال إطار زمني معقول (1-2 أسابيع).
أيضا ، لا تنمو البكتيريا اللاهوائية في ظل الظروف الهوائية ، ويتم اختيار البكتيريا التي تنمو من خلال العناصر الغذائية المضافة إلى الوسط. وهكذا يختار R2A البكتيريا غير المتجانسة ، بينما يختار عنصر الكبريت مؤكسدات الكبريت ذاتية التغذية. بشكل عام ، تشير التقديرات إلى أنه يمكن استزراع 0.1 إلى 1٪ فقط من جميع بكتيريا التربة. لذلك ، فإن تخفيف وطلاء بكتيريا التربة لا يمثل سوى البكتيريا القابلة للزراعة ويقلل من تقدير عدد التربة الحقيقي القابل للحياة بمقدار واحد إلى ترتيبين من حيث الحجم. يظهر مثال على المستعمرات البكتيرية غير المتجانسة التي نتجت عن تخفيف التربة والطلاء في الشكل 1. لاحظ أن هناك حاجة إلى ما يقرب من 1 مليون خلية بكتيرية حتى تكون المستعمرة مرئية للعين المجردة.
توضح هذه التجربة منهجية التخفيف والطلاء المنتشر المستخدمة لتعداد عدد البكتيريا داخل عينة التربة. على وجه التحديد ، يتم استخدام وسائطين: واحدة مصممة لجميع البكتيريا ، والأخرى تختار الفطريات الشعاعية. بمجرد نمو المستعمرات البكتيرية على ألواح الأجار ، قم بعزل الثقافات النقية للمستعمرات المختارة باستخدام تقنية لوحة الخط. يمكن بعد ذلك تحليل هذه الثقافات النقية وتمييزها بسمات ووظائف محددة.
الشكل 1. مستعمرات غير متجانسة التغذية على لوحة أجار R2A. ينشأ عدد من المستعمرات المنفصلة ذات التشكل المتنوع بعد التخفيف والطلاء من التربة. إذن الاستخدام الممنوح من قبل المطبعة الأكاديمية.
Procedure
1. تحضير تخفيفات التربة
- لبدء الإجراء ، قم بوزن 10 جم من عينة التربة وأضفها إلى 95 مل من الماء منزوع الأيونات. رج التعليق جيدا ، وقم بتسمية “A”.
- قبل أن تستقر التربة ، قم بإزالة 1 مل من التعليق بماصة معقمة وانقله إلى ماء منزوع الأيونات سعة 9 مل. دوامة تماما ، وتسميتها باسم “B”.
- كرر خطوة التخفيف هذه ثلاث مرات ، في كل مرة مع 1 مل من التعليق السابق وماء منزوع الأيونات سعة 9 مل. قم بتسمية هذه بالتسلسل على أنها أنابيب C و D و E. ينتج عن هذا تخفيفات متسلسلة من 10-1 إلى 10-5 جرامات من التربة لكل مل
2. صنع لوحات انتشار للثقافة البكتيرية
- لزراعة المستعمرات البكتيرية ، خذ ثلاث ألواح أجار خميرة البيبتون المعدة مسبقا وقم بتسميتها على أنها C و D و E. عينات دوامة C و D و E ، وماصة 0.1 مل على كل لوحة. هذا يزيد من قيمة التخفيف أكثر ، بمعامل عشرة (C = 10-3 ، D = 10-4 ، E = 10-5).
- بعد ذلك ، اغمس موزعة الزجاج في الإيثانول. ضع الموزعة في اللهب لبضع ثوان لإشعال الإيثانول وحرقه. سيؤدي ذلك إلى تعقيم الموزعة.
- أمسك الموزعة فوق اللوحة الأولى حتى يتم إطفاء اللهب. افتح اللوحة بسرعة ، مع الاحتفاظ بالغطاء بالقرب منك. المس الموزعة إلى الأجار بعيدا عن اللقاح (اللقاح = الخلايا المستخدمة لبدء الثقافة) لتبرد ، ثم انشر قطرة اللقاح حول سطح الأجار حتى تختفي آثار السائل الحر. استبدل غطاء اللوحة.
- أعد اللهب على الموزعة وكرر العملية مع اللوحة التالية ، واعمل بسرعة حتى لا تلوث الأجار بالكائنات الحية المحمولة جوا
- احتضان صفائح البكتيريا في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 أسبوع. تأكد من قلب الألواح أثناء الحضانة لمنع قطرات الرطوبة من التكثيف من السقوط على سطح الأجار.
3. صنع لوحات انتشار للفطريات الشعاعية
- لزراعة الفطريات الشعاعية ، خذ ثلاث ألواح جلسرين كازين معدة مسبقا وقم بتسميتها ب B و C و D. باستخدام التقنيات الموضحة سابقا ، انشر اللوحة 0.1 مل من المعلقات B و C و D. يتم استخدام التخفيفات السفلية لأن الفطريات الشعاعية موجودة عادة على أنها 1/10من مجموعة البكتيريا (B = 10-2 ، C = 10-3 ، D = 10-4).
- احتضان ألواح الفطريات الشعاعية (مقلوبة) في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوعين.
4. عدد البكتيريا والفطريات الشعاعية
- بعد الحضانة ، افحص جميع صفائح البكتيريا بعناية ، ولاحظ الاختلافات في حجم المستعمرة وشكلها. عندما تنمو البكتيريا على أجار ، تنتج مستعمرات لزجة تتراوح من عديمة اللون إلى البرتقالي الفاتح أو الأصفر أو الوردي. في المقابل ، تكون مستعمرات الفطريات الشعاعية طباشيرية ، صلبة ، جلدية ، وسوف تنكسر تحت الضغط ، حيث تلطخ المستعمرات البكتيرية الأخرى. هذا يسمح بتمييز المستعمرات عن طريق اللمس بحلقة معقمة.
- عد وسجل عدد المستعمرات البكتيرية ، بما في ذلك أي فطريات شعاعية. عد فقط اللوحات التي تحتوي على 30-200 مستعمرة لكل طبق.
5. عزل الثقافات النقية
- حدد مستعمرات بكتيرية فردية من أي من اللوحات. يمكن اختيار المزيد من المستعمرات إذا كان هناك اهتمام خاص بالتربة. استخدم صفيحة عالية التخفيف ، لأنها تميل إلى أن يكون لها مستعمرات نقية مفصولة جيدا. اختر فقط المستعمرات المنفصلة جيدا عن المستعمرات المجاورة وتبدو متميزة شكليا عن بعضها البعض.
- عقم الحلقة عن طريق غمسها في الكحول وإشعال النيران. افتح طبق بتري محل الاهتمام بسرعة ، ولمس الحلقة إلى بقعة عارية في الأجار لتبريدها. ثم قم بإزالة كمية صغيرة من مستعمرة ذات أهمية على الحلقة.
- أخذ طبق خميرة ببتون طازج ، اصنع خطا بطول بضعة سنتيمترات على جانب واحد. قم بتعقيمها وتبريدها مرة أخرى ، ثم قم بعمل خط يعبر الخط الأولي فقط في التمريرة الأولى. كرر هذه العملية مرتين أخريين بنفس الطريقة. ينتج عن هذا “التخفيف” المخطط فصل الخلايا الموجودة على الحلقة عن بعضها البعض. ضع الطبق في مكان مظلم لتحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوعين.
تحديد عدد دقيق للبكتيريا البيئية أمرا بالغ الأهمية لتقييم صحة النظام البيئي للتربة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق زراعة المستعمرات البكتيرية بالتخفيفات المناسبة.
تعدبكتيريا التربة جزءا مهما من النظام البيئي الصحي للتربة، حيث تلعب أدوارا في التحلل وتثبيت النيتروجين ودورة المغذيات. التربة السطحية عبارة عن ركيزة من الجزيئات العضوية وغير العضوية التي تشكل مصفوفة معقدة تحيط بالمسام التي تمتلئ بالهواء أو الماء. تخلق هذه الظروف نظاما بيئيا مثاليا للبكتيريا ، حيث تحتوي التربة السطحية عادة على ما يزيد عن مليون بكتيريا لكل جرام.
بسبب هذا التركيز العالي للبكتيريا ، فإن التخفيف ضروري قبل الطلاء على وسط النمو. يمكن أن تقلل التخفيفات التسلسلية من تركيز عينة التربة الأصلية إلى مستويات منخفضة بما يكفي لزراعة مستعمرات مفردة على ألواح الوسائط ، مما يسمح بحساب التعداد الأولي للبكتيريا في عينة التربة.
سيوضح هذا الفيديو كيفية تحضير التخفيفات التسلسلية لعينات التربة ، وكيفية صفيحة هذه العينات البكتيرية ، وكيفية حساب تعداد بكتيريا التربة من ألواح التخفيف.
البكتيريا هي كائنات بدائية النواة بسيطة ، ولكنها متنوعة للغاية من حيث الأنواع والنظام البيئي. الفطريات الشعاعية هي مجموعة فرعية من البكتيريا التي غالبا ما تعتبر مجموعة فريدة بسبب بنيتها الخيطية ، حيث تنمو متشابكة معا لتشكيل خيوط.
عادة ما تمثل الفطريات الشعاعية 10٪ من إجمالي البكتيريا في التربة. البكتيريا والفطريات الشعاعية وفيرة في كل بيئة تقريبا على وجه الأرض ، ولكنها توجد في تنوع ووفرة لا مثيل لهما في التربة.
يتم تعداد بكتيريا التربة ، ومن المحتمل أن يتم زراعتها وتحديدها عن طريق الطلاء المخفف. هنا ، يتم تخفيف عينة التربة بشكل متسلسل في الماء ، ثم يتم تشتيتها على ألواح نمو الأجار. ثم يتم حساب المستعمرات الناتجة. تستخدم هذه القيمة ، جنبا إلى جنب مع عامل التخفيف ، لتوضيح التركيز الأولي للبكتيريا في التربة.
يعد طلاء التخفيف طريقة شائعة وغير مكلفة وبسيطة لتعداد البكتيريا ، ولكنه يعاني من العديد من العيوب. لا ينبغي السماح للتربة بالاستقرار أثناء التخفيفات ، مما قد يؤدي إلى نمو متحيز. لن تزرع بعض بكتيريا التربة على الألواح ، أو تنمو ببطء شديد بحيث لا يمكن ملاحظتها. بالإضافة إلى ذلك ، تفترض هذه الطريقة أن المستعمرات تتكون من بكتيريا واحدة ، لكنها قد تنشأ من كتل من خلايا متعددة.
تنمو بعض الأنواع البكتيرية بشكل أفضل على وسائط النمو المختلفة. الركيزة الشائعة لزراعة مجموعة واسعة من البكتيريا هي صفيحة خميرة أجار ببتون. تنمو الفطريات الشعاعية بشكل تفضيلي على ألواح أساسها الجلسرين والكازين ، والتي تناسب بشكل أفضل نمو هذه البكتيريا الخيطية.
الآن بعد أن فهمت المفهوم الكامن وراء تعداد البكتيريا ، دعنا نرى كيف تتم هذه العملية في المختبر.
لبدء الإجراء ، قم بوزن 10 جم من عينة التربة ، وأضفها إلى 95 مل من الماء منزوع الأيونات. رج التعليق جيدا ، وقم بتسمية “A”. قبل أن تستقر التربة ، قم بإزالة 1 مل من المعلق بماصة معقمة وانقله إلى 9 مل من الماء منزوع الأيونات. دوامة تماما ، وتسميتها باسم “B”.
كرر خطوة التخفيف هذه 3 مرات ، في كل مرة مع 1 مل من التعليق السابق و 9 مل من الماء منزوع الأيونات. قم بتسمية هذه بالتسلسل على أنها أنابيب C و D و E. ينتج عن هذا تخفيفات متسلسلة من 10-1 إلى 10-5 جرام من التربة لكل مل.
لزراعة المستعمرات البكتيرية ، خذ 3 ألواح أجار خميرة البيبتون المعدة مسبقا وقم بتسميتها على أنها C و D و E. Vortex العينات المقابلة والماصة 0.1 مل على كل لوحة. نظرا لأنه يتم الإبلاغ عن CFUs لكل مل ، فإن استخدام 0.1 مل يزيد من التخفيف بمعامل عشرة.
بعد ذلك ، اغمس موزعة الزجاج في الإيثانول. ضع الموزعة في اللهب لبضع ثوان لإشعال الإيثانول وحرقه. سيؤدي ذلك إلى تعقيم الموزعة.
أمسك الموزعة فوق اللوحة الأولى حتى يتم إطفاء اللهب. افتح اللوحة بسرعة ، مع الاحتفاظ بالغطاء بالقرب منك. المس الموزعة على الأجار بعيدا عن اللقاح لتبرد ، ثم انشر قطرة اللقاح حول السطح حتى تختفي آثار السائل الحر. استبدل غطاء اللوحة.
أعد لهب الموزعة وكرر العملية مع اللوحة التالية ، واعمل بسرعة حتى لا تلوث اللوحة بالكائنات الحية المحمولة جوا. اقلب الألواح لمنع سقوط قطرات الرطوبة على الأجار ، واحتضان الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوع واحد.
لزراعة الفطريات الشعاعية ، خذ ثلاث ألواح جلسرين كازين معدة مسبقا وقم بتسميتها ب B و C و D. باستخدام التقنيات الموضحة سابقا ، انشر اللوحة 0.1 مل من المعلقات B و C و D. يتم استخدام التخفيفات السفلية لأن الفطريات الشعاعية موجودة عادة على أنها 1/10 من مجموعة البكتيريا.
أخيرا ، اقلب هذه الأطباق واحفظها في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوعين.
بعد الحضانة ، افحص جميع صفائح البكتيريا بعناية ، ولاحظ الاختلافات في حجم المستعمرة وشكلها. عندما تنمو البكتيريا على أجار ، تنتج مستعمرات لزجة تتراوح من عديمة اللون إلى البرتقالي الفاتح أو الأصفر أو الوردي. في المقابل ، تكون مستعمرات الفطريات الشعاعية طباشيرية ، صلبة ، جلدية ، وسوف تنكسر تحت الضغط ، حيث تلطخ المستعمرات البكتيرية الأخرى. هذا يسمح بتمييز المستعمرات عن طريق اللمس بحلقة معقمة.
عد وسجل عدد المستعمرات البكتيرية ، بما في ذلك أي فطريات شعاعية. عد فقط اللوحات التي تحتوي على 30-200 مستعمرة لكل طبق.
لزراعة ثقافات من بكتيريا فردية معينة ، حدد مستعمرات منفصلة من أي من الصفائح ، واختر مستعمرات منفصلة جيدا عن المستعمرات المجاورة. قم بتعقيم حلقة منتشرة ، ثم افتح اللوحة ولمس الحلقة في مكان فارغ لتبرد. بعد ذلك ، اختر كمية صغيرة من المستعمرة ذات الأهمية في الحلقة.
أخذ طبق خميرة ببتون طازج ، اصنع خطا بطول بضعة سنتيمترات على جانب واحد. قم بتعقيمها وتبريدها مرة أخرى ، ثم قم بعمل خط يعبر الخط الأولي فقط في التمريرة الأولى. كرر هذه العملية مرتين أخريين بنفس الطريقة. ينتج عن هذا “التخفيف” المخطط فصل الخلايا الموجودة على الحلقة عن بعضها البعض. ضع الطبق في مكان مظلم لتحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوعين.
من عدد مستعمرات البكتيريا والفطريات الشعاعية ، يمكن تحديد وحدات تشكيل المستعمرة لكل جرام من التربة. عدد المستعمرات لكل جرام من التربة يساوي عدد المستعمرات المحسوبة على اللوحة ، مضروبا في مقلوب التخفيف المطلي. على سبيل المثال ، إذا تم حساب 46 مستعمرة على لوحة تخفيف من 10-5 مع لقاح 0.1 مل ، فإن CFU لكل جرام من التربة يساوي 10-6 بواسطة 46 ، أو 46 مليون CFU لكل جرام من التربة.
إجراء تعداد البكتيريا والثقافات خطوة أولى رئيسية في العديد من التحقيقات أو البروتوكولات العلمية.
تحتويالتربة السليمة على ما بين 10 6 و 108 بكتيريا لكل جرام. يمكن استخدام التعداد البكتيري للتربة لتحديد صحة التربة ذات الأهمية ، ويشير تعداد أقل من 10 6 و 10 8 بكتيريا لكل جرام إلى تربة غير صحية أو فقيرة. قد يكون سبب ذلك نقص العناصر الغذائية أو المواد العضوية ، أو الإجهاد اللاأحيائي بسبب درجة الحموضة الشديدة في التربة ، أو تلوث التربة.
تم التعرف على العديد من أنواع المضادات الحيوية المستخدمة في الطب اليوم لأول مرة من البكتيريا أو الفطريات التي تعيش في التربة. يمكن أن يساعد عزل السلالات النقية من مزارع التربة في مساعدة العلماء على تحديد مركبات المضادات الحيوية الجديدة. هنا ، يمكن إضافة بكتيريا الاختبار أو المركبات المعزولة ذات الأهمية إلى الألواح المزروعة بالمروج البكتيرية ، وتسجيل آثارها على نمو العشب. قد تشير البقع الشفافة في المروج البكتيرية حيث تم تثبيط النمو بواسطة بكتيريا الاختبار أو مركب الاختبار إلى نشاط المضادات الحيوية.
تعتمد النباتات البقولية بما في ذلك البازلاء والفاصوليا على العلاقات التكافلية مع البكتيريا المثبتة للنيتروجين. تعيش هذه البكتيريا بحرية في التربة أو داخل العقيدات في نظام الجذر ، وتنتج مركبات النيتروجين التي يستخدمها النبات. في التربة الفقيرة ، قد يؤدي استكمال المحاصيل البقولية بالبكتيريا المثبتة للنيتروجين المستزرعة من التربة إلى تعزيز نمو النباتات وصحتها. يمكن أن يؤدي ذلك إلى نباتات أكبر وأكثر صلابة ، والتي بدورها تعطي إنتاجية أكبر من المحاصيل.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE للتعداد البكتيري. يجب أن تفهم الآن كيفية إجراء تخفيفات عينات التربة ، وكيفية صفيحة عد المستعمرات وعزل المستعمرة ، وكيفية حساب أعداد البكتيريا في عينات التربة. شكرا للمشاهدة!
Results
يتم تحليل عينة 10 جم من التربة ذات المحتوى الرطوبي بنسبة 20٪ على أساس الوزن الجاف بحثا عن بكتيريا قابلة للزراعة قابلة للحياة عن طريق تقنيات التخفيف والطلاء. تم إجراء التخفيفات كما هو موضح في الجدول 1 . يتم سكب 1 مل من المحلول E على وسط مناسب وينتج عنه 200 مستعمرة بكتيرية.
ولكن ، بالنسبة ل 10 جم من التربة الرطبة ،
لذلك ،
| الخطوة | التخفيف | |
| 10 جم تربة (وزن / حجم) | 95 مل محلول ملحي (محلول أ) | 10-1 |
| 1 مل محلول A (حجم / مجلد) | 9 مل محلول ملحي (محلول B) | 10-2 |
| 1 مل محلول B (الحجم / المجلد) | 9 مل محلول ملحي (محلول C) | 10-3 |
| 1 مل محلول C (حجم/حجم) | 9 مل محلول ملحي (محلول D) | 10-4 |
| 1 مل محلول D (الحجم / المجلد) | 9 مل محلول ملحي (محلول E) | 10-5 |
الجدول 1: تخفيف العينات وتصفيحها.
Applications and Summary
There are two fundamental applications of dilution and plating of soil bacteria. The first application is the enumeration of culturable bacteria within a particular soil. The quantification of the number of soil bacteria gives an indication of soil health. For example, if there are 106 to 108 culturable bacteria present per gram of soil, this would be considered a healthy number. A number less than 106 per gram indicates poorer soil health, which may be due to a lack of nutrients as found in low organic matter soils; abiotic stress imposed by extreme soil pH values (pH < 5 or > 8); or toxicity imposed by organic or inorganic anthropogenic contaminants.
The second major application is the visualization and isolation of pure cultures of bacteria. The pure cultures can subsequently be characterized and evaluated for specific characteristics that may be useful in either medical or environmental applications. Examples include: antibiotic production; biodegradation of toxic organics; or specific rhizobia useful for nitrogen fixation by leguminous crops, such as peas or beans.
Transcript
تحديد عدد دقيق للبكتيريا البيئية أمرا بالغ الأهمية لتقييم صحة النظام البيئي للتربة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق زراعة المستعمرات البكتيرية بالتخفيفات المناسبة.
تعدبكتيريا التربة جزءا مهما من النظام البيئي الصحي للتربة، حيث تلعب أدوارا في التحلل وتثبيت النيتروجين ودورة المغذيات. التربة السطحية عبارة عن ركيزة من الجزيئات العضوية وغير العضوية التي تشكل مصفوفة معقدة تحيط بالمسام التي تمتلئ بالهواء أو الماء. تخلق هذه الظروف نظاما بيئيا مثاليا للبكتيريا ، حيث تحتوي التربة السطحية عادة على ما يزيد عن مليون بكتيريا لكل جرام.
بسبب هذا التركيز العالي للبكتيريا ، فإن التخفيف ضروري قبل الطلاء على وسط النمو. يمكن أن تقلل التخفيفات التسلسلية من تركيز عينة التربة الأصلية إلى مستويات منخفضة بما يكفي لزراعة مستعمرات مفردة على ألواح الوسائط ، مما يسمح بحساب التعداد الأولي للبكتيريا في عينة التربة.
سيوضح هذا الفيديو كيفية تحضير التخفيفات التسلسلية لعينات التربة ، وكيفية صفيحة هذه العينات البكتيرية ، وكيفية حساب تعداد بكتيريا التربة من ألواح التخفيف.
البكتيريا هي كائنات بدائية النواة بسيطة ، ولكنها متنوعة للغاية من حيث الأنواع والنظام البيئي. الفطريات الشعاعية هي مجموعة فرعية من البكتيريا التي غالبا ما تعتبر مجموعة فريدة بسبب بنيتها الخيطية ، حيث تنمو متشابكة معا لتشكيل خيوط.
عادة ما تمثل الفطريات الشعاعية 10٪ من إجمالي البكتيريا في التربة. البكتيريا والفطريات الشعاعية وفيرة في كل بيئة تقريبا على وجه الأرض ، ولكنها توجد في تنوع ووفرة لا مثيل لهما في التربة.
يتم تعداد بكتيريا التربة ، ومن المحتمل أن يتم زراعتها وتحديدها عن طريق الطلاء المخفف. هنا ، يتم تخفيف عينة التربة بشكل متسلسل في الماء ، ثم يتم تشتيتها على ألواح نمو الأجار. ثم يتم حساب المستعمرات الناتجة. تستخدم هذه القيمة ، جنبا إلى جنب مع عامل التخفيف ، لتوضيح التركيز الأولي للبكتيريا في التربة.
يعد طلاء التخفيف طريقة شائعة وغير مكلفة وبسيطة لتعداد البكتيريا ، ولكنه يعاني من العديد من العيوب. لا ينبغي السماح للتربة بالاستقرار أثناء التخفيفات ، مما قد يؤدي إلى نمو متحيز. لن تزرع بعض بكتيريا التربة على الألواح ، أو تنمو ببطء شديد بحيث لا يمكن ملاحظتها. بالإضافة إلى ذلك ، تفترض هذه الطريقة أن المستعمرات تتكون من بكتيريا واحدة ، لكنها قد تنشأ من كتل من خلايا متعددة.
تنمو بعض الأنواع البكتيرية بشكل أفضل على وسائط النمو المختلفة. الركيزة الشائعة لزراعة مجموعة واسعة من البكتيريا هي صفيحة خميرة أجار ببتون. تنمو الفطريات الشعاعية بشكل تفضيلي على ألواح أساسها الجلسرين والكازين ، والتي تناسب بشكل أفضل نمو هذه البكتيريا الخيطية.
الآن بعد أن فهمت المفهوم الكامن وراء تعداد البكتيريا ، دعنا نرى كيف تتم هذه العملية في المختبر.
لبدء الإجراء ، قم بوزن 10 جم من عينة التربة ، وأضفها إلى 95 مل من الماء منزوع الأيونات. رج التعليق جيدا ، وقم بتسمية “A”. قبل أن تستقر التربة ، قم بإزالة 1 مل من المعلق بماصة معقمة وانقله إلى 9 مل من الماء منزوع الأيونات. دوامة تماما ، وتسميتها باسم “B”.
كرر خطوة التخفيف هذه 3 مرات ، في كل مرة مع 1 مل من التعليق السابق و 9 مل من الماء منزوع الأيونات. قم بتسمية هذه بالتسلسل على أنها أنابيب C و D و E. ينتج عن هذا تخفيفات متسلسلة من 10-1 إلى 10-5 جرام من التربة لكل مل.
لزراعة المستعمرات البكتيرية ، خذ 3 ألواح أجار خميرة البيبتون المعدة مسبقا وقم بتسميتها على أنها C و D و E. Vortex العينات المقابلة والماصة 0.1 مل على كل لوحة. نظرا لأنه يتم الإبلاغ عن CFUs لكل مل ، فإن استخدام 0.1 مل يزيد من التخفيف بمعامل عشرة.
بعد ذلك ، اغمس موزعة الزجاج في الإيثانول. ضع الموزعة في اللهب لبضع ثوان لإشعال الإيثانول وحرقه. سيؤدي ذلك إلى تعقيم الموزعة.
أمسك الموزعة فوق اللوحة الأولى حتى يتم إطفاء اللهب. افتح اللوحة بسرعة ، مع الاحتفاظ بالغطاء بالقرب منك. المس الموزعة على الأجار بعيدا عن اللقاح لتبرد ، ثم انشر قطرة اللقاح حول السطح حتى تختفي آثار السائل الحر. استبدل غطاء اللوحة.
أعد لهب الموزعة وكرر العملية مع اللوحة التالية ، واعمل بسرعة حتى لا تلوث اللوحة بالكائنات الحية المحمولة جوا. اقلب الألواح لمنع سقوط قطرات الرطوبة على الأجار ، واحتضان الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوع واحد.
لزراعة الفطريات الشعاعية ، خذ ثلاث ألواح جلسرين كازين معدة مسبقا وقم بتسميتها ب B و C و D. باستخدام التقنيات الموضحة سابقا ، انشر اللوحة 0.1 مل من المعلقات B و C و D. يتم استخدام التخفيفات السفلية لأن الفطريات الشعاعية موجودة عادة على أنها 1/10 من مجموعة البكتيريا.
أخيرا ، اقلب هذه الأطباق واحفظها في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوعين.
بعد الحضانة ، افحص جميع صفائح البكتيريا بعناية ، ولاحظ الاختلافات في حجم المستعمرة وشكلها. عندما تنمو البكتيريا على أجار ، تنتج مستعمرات لزجة تتراوح من عديمة اللون إلى البرتقالي الفاتح أو الأصفر أو الوردي. في المقابل ، تكون مستعمرات الفطريات الشعاعية طباشيرية ، صلبة ، جلدية ، وسوف تنكسر تحت الضغط ، حيث تلطخ المستعمرات البكتيرية الأخرى. هذا يسمح بتمييز المستعمرات عن طريق اللمس بحلقة معقمة.
عد وسجل عدد المستعمرات البكتيرية ، بما في ذلك أي فطريات شعاعية. عد فقط اللوحات التي تحتوي على 30-200 مستعمرة لكل طبق.
لزراعة ثقافات من بكتيريا فردية معينة ، حدد مستعمرات منفصلة من أي من الصفائح ، واختر مستعمرات منفصلة جيدا عن المستعمرات المجاورة. قم بتعقيم حلقة منتشرة ، ثم افتح اللوحة ولمس الحلقة في مكان فارغ لتبرد. بعد ذلك ، اختر كمية صغيرة من المستعمرة ذات الأهمية في الحلقة.
أخذ طبق خميرة ببتون طازج ، اصنع خطا بطول بضعة سنتيمترات على جانب واحد. قم بتعقيمها وتبريدها مرة أخرى ، ثم قم بعمل خط يعبر الخط الأولي فقط في التمريرة الأولى. كرر هذه العملية مرتين أخريين بنفس الطريقة. ينتج عن هذا “التخفيف” المخطط فصل الخلايا الموجودة على الحلقة عن بعضها البعض. ضع الطبق في مكان مظلم لتحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوعين.
من عدد مستعمرات البكتيريا والفطريات الشعاعية ، يمكن تحديد وحدات تشكيل المستعمرة لكل جرام من التربة. عدد المستعمرات لكل جرام من التربة يساوي عدد المستعمرات المحسوبة على اللوحة ، مضروبا في مقلوب التخفيف المطلي. على سبيل المثال ، إذا تم حساب 46 مستعمرة على لوحة تخفيف من 10-5 مع لقاح 0.1 مل ، فإن CFU لكل جرام من التربة يساوي 10-6 بواسطة 46 ، أو 46 مليون CFU لكل جرام من التربة.
يعدإجراء تعداد البكتيريا والثقافات خطوة أولى رئيسية في العديد من التحقيقات أو البروتوكولات العلمية.
تحتوي التربة السليمة على ما بين 106 و 108 بكتيريا لكل جرام. يمكن استخدام التعداد البكتيري للتربة لتحديد صحة التربة ذات الأهمية ، ويشير عدد أقل من 106 و 108 بكتيريا لكل جرام إلى تربة غير صحية أو فقيرة. قد يكون سبب ذلك نقص العناصر الغذائية أو المواد العضوية ، أو الإجهاد اللاأحيائي بسبب درجة الحموضة الشديدة في التربة ، أو تلوث التربة.
تم التعرف على العديد من أنواع المضادات الحيوية المستخدمة في الطب اليوم لأول مرة من البكتيريا أو الفطريات التي تعيش في التربة. يمكن أن يساعد عزل السلالات النقية من مزارع التربة في مساعدة العلماء على تحديد مركبات المضادات الحيوية الجديدة. هنا ، يمكن إضافة بكتيريا الاختبار أو المركبات المعزولة ذات الأهمية إلى الألواح المزروعة بالمروج البكتيرية ، وتسجيل آثارها على نمو العشب. قد تشير البقع الشفافة في المروج البكتيرية حيث تم تثبيط النمو بواسطة بكتيريا الاختبار أو مركب الاختبار إلى نشاط المضادات الحيوية.
تعتمد النباتات البقولية بما في ذلك البازلاء والفاصوليا على العلاقات التكافلية مع البكتيريا المثبتة للنيتروجين. تعيش هذه البكتيريا بحرية في التربة أو داخل العقيدات في نظام الجذر ، وتنتج مركبات النيتروجين التي يستخدمها النبات. في التربة الفقيرة ، قد يؤدي استكمال المحاصيل البقولية بالبكتيريا المثبتة للنيتروجين المستزرعة من التربة إلى تعزيز نمو النباتات وصحتها. يمكن أن يؤدي ذلك إلى نباتات أكبر وأكثر صلابة ، والتي بدورها تعطي إنتاجية أكبر من المحاصيل.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE للتعداد البكتيري. يجب أن تفهم الآن كيفية إجراء تخفيفات عينات التربة ، وكيفية صفيحة عد المستعمرات وعزل المستعمرة ، وكيفية حساب أعداد البكتيريا في عينات التربة. شكرا للمشاهدة!
Tags
تقدير محتوى الرطوبة في التربة
Environmental Microbiology
360.4K المشاهدات
تقنية التعقيم في العلوم البيئية
Environmental Microbiology
127.0K المشاهدات
تلطيخ الجرام للبكتيريا من المصادر البيئية
Environmental Microbiology
101.7K المشاهدات
تصور الكائنات الحية الدقيقة في التربة عبر مقايسة شريحة التلامس والفحص المجهري
Environmental Microbiology
42.9K المشاهدات
الفطريات الخيطية
Environmental Microbiology
59.2K المشاهدات
استخراج الحمض النووي المجتمعي من المستعمرات البكتيرية
Environmental Microbiology
29.2K المشاهدات
الكشف عن الكائنات الحية الدقيقة البيئية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي للهلام
Environmental Microbiology
45.0K المشاهدات
تحليل الحمض النووي الريبي للعينات البيئية باستخدام RT-PCR
Environmental Microbiology
41.2K المشاهدات
القياس الكمي للكائنات الحية الدقيقة والفيروسات البيئية باستخدام qPCR
Environmental Microbiology
48.4K المشاهدات
تحليل جودة المياه عبر الكائنات الحية المرجعية
Environmental Microbiology
30.2K المشاهدات
عزل البكتيريا البرازية من عينات المياه عن طريق الترشيح
Environmental Microbiology
40.3K المشاهدات
الكشف عن العاثيات في العينات البيئية
Environmental Microbiology
41.1K المشاهدات
استزراع وتعداد البكتيريا من عينات التربة
Environmental Microbiology
185.6K المشاهدات
تحليل منحنى نمو البكتيريا وتطبيقاته البيئية
Environmental Microbiology
297.1K المشاهدات
تعداد الطحالب عبر منهجية قابلة للزراعة
Environmental Microbiology
14.1K المشاهدات