تحليل منحنى نمو البكتيريا وتطبيقاته البيئية

Bacterial Growth Curve Analysis and its Environmental Applications

JoVE Science Education
Environmental Microbiology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Environmental Microbiology

Bacterial Growth Curve Analysis and its Environmental Applications

2.6: Community DNA Extraction from Bacterial Colonies

2.15: Algae Enumeration via Culturable Methodology

297,116 Views

•

12:23 min

•

February 23, 2015

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Overview

المصدر: مختبرات الدكتور إيان بيبر والدكتور تشارلز جيربا – جامعة أريزونا
المؤلف التوضيحي: لويزا إيكنر

البكتيريا هي من بين أكثر أشكال الحياة وفرة على وجه الأرض. توجد في كل نظام بيئي وهي حيوية للحياة اليومية. على سبيل المثال ، تؤثر البكتيريا على ما يأكله الناس ويشربهم ويتنفسونه ، وهناك في الواقع خلايا بكتيرية داخل جسم الشخص أكثر من خلايا الثدييات. نظرا لأهمية البكتيريا ، يفضل دراسة أنواع معينة من البكتيريا في المختبر. للقيام بذلك ، تزرع البكتيريا في ظل ظروف خاضعة للرقابة في ثقافة نقية ، مما يعني أن نوعا واحدا فقط من البكتيريا قيد الدراسة. تنمو البكتيريا بسرعة في الثقافة النقية ، وتزداد أعداد الخلايا بشكل كبير في فترة زمنية قصيرة. من خلال قياس معدل زيادة عدد الخلايا بمرور الوقت ، يجب تطوير “منحنى النمو”. هذا مهم عند الاستهداف إلى استخدام أو تلقيح أعداد معروفة من العزل البكتيري ، على سبيل المثال لتعزيز نمو النبات ، أو زيادة التحلل البيولوجي للمواد العضوية السامة ، أو إنتاج المضادات الحيوية أو المنتجات الطبيعية الأخرى على نطاق صناعي.

Principles

يحدث التكاثر البكتيري عن طريق الانشطار الثنائي ، حيث تنقسم خلية بكتيرية واحدة وتصبح خليتين (الشكل 1). يعرف الوقت اللازم لانقسام الخلايا بمتوسط وقت التوليد ، أو وقت مضاعفة ، وهو الوقت اللازم لمضاعفة عدد الخلايا.

الشكل 1. انقسام الخلايا الأسية. ينتج عن كل انقسام خلية مضاعفة عدد الخلية. في أعداد الخلايا المنخفضة ، الزيادة ليست كبيرة جدا. ومع ذلك ، بعد بضعة أجيال ، تزداد أعداد الخلايا بشكل متفجر. بعد n قسمة ، هناك 2ⁿ خلية.

لفهم وتحديد نمو كائنات دقيقة معينة ، يتم وضعها في قارورة ، حيث يتم التحكم في إمدادات المغذيات والظروف البيئية. إذا كان الوسط السائل يوفر جميع العناصر الغذائية اللازمة للنمو والمعلمات البيئية التي تؤدي إلى النمو ، فيمكن قياس الزيادة في الأعداد كدالة للوقت للحصول على منحنى النمو. يمكن ملاحظة العديد من مراحل النمو المميزة داخل منحنى النمو (الشكل 2). وتشمل هذه المرحلة المتأخرة ، والمرحلة الأسية أو اللوغاريتمية ، والمرحلة الثابتة ، ومرحلة الموت ، وكل منها يرتبط بتغيرات فسيولوجية محددة (الجدول 1).

طور الخصائص مرحلة التأخر النمو البطيء أو قلة النمو بسبب التكيف الفسيولوجي للخلايا مع ظروف الثقافة أو تخفيف الإنزيمات الخارجية بسبب كثافة الخلايا المنخفضة الأولية. المرحلة الأسية أو اللوغاريتمية معدلات النمو المثلى ، حيث تتضاعف أعداد الخلايا على فترات زمنية منفصلة تعرف باسم متوسط وقت الجيل. المرحلة الثابتة النمو (انقسام الخلية) وموت الخلايا يوازن بعضهما البعض مما يؤدي إلى عدم وجود زيادة صافية في أعداد الخلايا. عادة ما يكون معدل النمو المنخفض بسبب نقص العناصر الغذائية و / أو تراكم مكونات النفايات السامة. مرحلة الموت معدل الوفيات يتجاوز معدل النمو مما يؤدي إلى فقدان صافي للخلايا القابلة للحياة.

الجدول 1. المراحل الأربع لنمو البكتيريا.

الشكل 2. منحنى نمو نموذجي لمجموعة بكتيرية. قارن شكل المنحنيات بناء على وحدات تشكيل المستعمرات (CFUs) مقابل الكثافة البصرية ، خاصة في مرحلة الموت. يرجع الاختلاف إلى حقيقة أن الخلايا الميتة لا تزال تؤدي إلى التعكر ، لكنها لا تستطيع تكوين مستعمرات قابلة للحياة في الثقافة.

بشكل عام ، غالبا ما يكون من الأهمية بمكان تحديد حركية نمو البكتيريا لعزل بكتيري معين ، من أجل معرفة عدد الخلايا البكتيرية الموجودة في الوسط السائل. هناك طرق مختلفة لقياس النمو في وسط سائل ، بما في ذلك قياسات التعكر باستخدام مقياس الطيف الضوئي اللوني ، والطلاء التسلسلي للتخفيف تعتمد قياسات التعكر على حقيقة أنه كلما زاد عدد الخلايا الموجودة في الوسط السائل ، زاد تعكر السائل. يتضمن طلاء التخفيف التسلسلي فحص عدد الخلايا في الوسط السائل التي يمكن أن تشكل مستعمرات قابلة للحياة في الثقافة الصلبة ، وهو قياس يعرف باسم “وحدات تكوين المستعمرات” للثقافة. لاحظ ، مع ذلك ، أنه لا يمكن استخدام فحوصات الطلاء هذه إلا للبكتيريا التي هي في الواقع قابلة للزراعة.

Procedure

1. مجموعة من Aliquots للثقافة البكتيرية

قبل يوم واحد من جمع النقاط الزمنية للنمو ، قم بتلقيح 20 مل من وسط مرق الصويا (TSB) في قارورة سعة 50 مل باستخدام الإشريكية القولونية.
احتضان بين عشية وضحاها عند 27 درجة مئوية. تؤدي فترة الحضانة الطويلة نسبيا هذه إلى مجموعة مرحلية ثابتة من النوع البري بكتريا قولونية تبلغ حوالي 10⁹ CFU / mL.
في اليوم التالي ، استخدم 100 ميكرولتر من المزرعة المحضرة لتلقيح 250 مل من TSB (في قارورة 500 مل). تخلط جيدا. قم بإزالة كمية 5 مل وضعها في الثلاجة على الفور عند 4 درجات مئوية. هذه هي T = 0 أو T₀ نقطة زمنية ، ويجب أن تحتوي على ما يقرب من 4 × 10⁵ CFU / مل.
ضع قارورة الإشريكية القولونية المتبقية (245 مل) في حاضنة اهتزاز 37 درجة مئوية. قم بإزالة 5 مل من المزرعة كل ساعة ، حتى 8 ساعات. قم بتخزين كل حصة عند 4 درجات مئوية. قم بتعيين هذه الحصص من T₁ إلى T₈.

2. التخفيف التسلسلي

قم بإزالة كميات من الإشريكية القولونية من الثلاجة وضعها على الثلج لنقلها. احتفظ بجميع الثقافات على الجليد حتى الاستخدام.
قم بإعداد سلسلة من أنابيب التخفيف للحصول على تخفيفات مختلفة لكل ثقافة بكتريا قولونية (الشكل 3). أنابيب الطرد الدقيقة مناسبة لهذه الوظيفة. يجب أن يحتوي كل أنبوب تخفيف على 900 ميكرولتر من سائل التخفيف (محلول ملحي معقم). هناك حاجة إلى سلسلة تخفيف لكل ثقافة الإشريكية القولونية (T₀ إلى T₈) ؛ قم بتسمية كل أنبوب وفقا للجدول 2.

الشكل 3. تخطيطي يوضح إجراء طلاء الإشريكية القولونية.
ابدأ التخفيفات بإضافة 100 ميكرولتر من الإشريكية القولونية من الأنبوب المسمى T₀ (ثقافة الإشريكية القولونية الأولية) إلى الأنبوب A ، وهو التخفيف ^10-1 ل T₀. دوامة الأنبوب لمدة 5 ثوان.
بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الأنبوب A إلى الأنبوب التالي من المحلول الملحي ، الأنبوب B ، وهو تخفيف ^10-2 ل T₀. استمر في سلسلة التخفيف المطلوبة لكل حصة من النقاط الزمنية. تذكر أن تدور كل أنبوب قبل النقل. من المهم أيضا استخدام طرف ماصة جديد لكل عملية نقل.

ثقافة الإشريكية القولونية التخفيفات اللازمة والأنبوب # أ ب ج د ه ويف ز تي₀ ^10-1 ^10-2 تي₁ ^10-1 ^10-2 تي₂ ^10-1 ^10-2 ^10-3 تي₃ ^10-1 ^10-2 ^10-3 ^10-4 تي₄ ^10-1 ^10-2 ^10-3 ^10-4 ^10-5 تي₅ ^10-1 ^10-2 ^10-3 ^10-4 ^10-5 ^10-6 تي₆ ^10-1 ^10-2 ^10-3 ^10-4 ^10-5 ^10-6 ^10-7 تي₇ ^10-1 ^10-2 ^10-3 ^10-4 ^10-5 ^10-6 تي₈ ^10-1 ^10-2 ^10-3 ^10-4 ^10-5 ^10-6

الجدول 2. سلسلة التخفيف المطلوبة لكل ثقافة الإشريكية القولونية.

فئة

3. الطلاء

سيتم طلاء ثلاثة تخفيفات لكل حصة زمنية لزراعة الإشريكية القولونية ، وفقا للجدول 3. قم بتسمية اللوحات مع النقطة الزمنية (T₁ إلى T₈) ، وعامل التخفيف ، والحجم المراد إضافته. استخدم أطباق ثلاثية لكل تخفيف.
أضف 100 ميكرولتر من كل تخفيف إلى اللوحة عن طريق سحب الكمية إلى مركز لوحة أجار (الشكل 3). انشر الكمية على الفور باستخدام قضيب زجاجي معقم باللهب على شكل حرف “L”. إذا لم ينتشر اللقب على الفور ، فإنه يمتص في الموقع على اللوحة ، مما يؤدي إلى فرط نمو البكتيريا في مكان التلقيح الأولي.
كرر الطلاء لكل سلسلة تخفيف للنقاط الزمنية من T₁ إلى T₈. تذكر تعقيم القضيب بين الألواح وخاصة بين التخفيفات المختلفة.
بمجرد أن تجف الأطباق لبضع دقائق ، اقلبها وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل. يمنع قلب الألواح التكثيف من السقوط على لوحة الأجار. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، يجب تخزين الأطباق في الثلاجة.

ثقافة الإشريكية القولونية التخفيفات المراد طلاؤها تي₀ ^10-1 ^10-2 ^10-3 تي₁ ^10-1 ^10-2 ^10-3 تي₂ ^10-2 ^10-3 ^10-4 تي₃ ^10-3 ^10-4 ^10-5 تي₄ ^10-4 ^10-5 ^10-6 تي₅ ^10-5 ^10-6 ^10-7 تي₆ ^10-6 ^10-7 ^10-8 تي_7* ^10-5 ^10-6 ^10-7 تي_8* ^10-4 ^10-5 ^10-6

^* تأخذ التخفيفات المنخفضة في الاعتبار انخفاض عدد السكان بسبب مرحلة الوفاة.

الجدول 3. بروتوكول الطلاء لمزارع الإشريكية القولونية.

4. عد المستعمرات وحساب متوسط وقت التوليد

افحص الألواح للتأكد من توحيد المستعمرات وعدم وجود تلوث.
لكل نقطة زمنية (T₀ إلى T₈) ، اختر مخففا واحدا يحتوي على ما بين 30 و 300 مستعمرة ، واحسب الألواح الثلاثية.
باستخدام عامل التخفيف ، قم بحساب عدد الخلايا لكل مل من الثقافة الأصلية في النقاط الزمنية من T₀ إلى T₈. على سبيل المثال ، إذا كان عدد المستعمرات الناتجة عن التخفيف ^10-4 هو 30 و 28 و 32:
متوسط عدد المستعمرات = 30 مستعمرة
نشأت هذه من 0.1 مل من ^10-4 تخفيف
عدد المستعمرات لكل مل = 30 × 10⁴ = 3 × 10⁶
سجل_{المؤامرة 10} CFU / مل مقابل الوقت (بالساعات).
من الرسم البياني ، حدد المرحلة الأسية للنمو. باستخدام نقطتين زمنيتين ضمن مرحلة النمو الأسي وأرقام الخلايا المقابلة في كل مرة ، احسب متوسط وقت الجيل.

يعد قياس معدل نمو البكتيريا تقنية ميكروبيولوجية أساسية ، ولها استخدام واسع النطاق في البحوث الأساسية وكذلك في التطبيقات الزراعية والصناعية.

تعد

البكتيريا من بين أكثر أشكال الحياة وفرة على وجه الأرض ، حيث توجد في كل نظام بيئي ، بما في ذلك جسم الإنسان. بعض الأنواع البكتيرية قابلة للتتبع وراثيا أيضا ، وقد تم تسخيرها كنماذج بحثية أو لإنتاج منتجات طبيعية أو اصطناعية على نطاق صناعي. ومع ذلك ، لا يمكن استزراع جميع الأنواع البكتيرية في المختبر. بالنسبة لأولئك الذين يستطيعون ذلك ، فإن السمة المهمة هي معدل الضرب ، أو “حركية النمو”.

يمكن أن يؤدي قياس معدل نمو المزرعة البكتيرية إلى إبلاغ العلماء بوظائفها الفسيولوجية والتمثيل الغذائي ، كما أنه مفيد في الحصول على عدد دقيق للخلايا من البكتيريا للتطبيقات النهائية.

سيقدم هذا الفيديو المبادئ الكامنة وراء تحليل معدل نمو البكتيريا ، ويوضح بروتوكولا لتوصيف معدل النمو باستخدام “منحنى النمو” ، وأخيرا ، يستكشف العديد من تطبيقات العلوم البيئية لقياس حركية نمو البكتيريا.

تتكاثر البكتيريا بشكل عام لاجنسيا ، وتتكاثر في الانشطار الثنائي البسيط حيث تنقسم خلية أبوية واحدة إلى خليتين ابنتيتين متطابقتين. في ظل ظروف النمو المواتية حيث تتوفر العناصر الغذائية بكثرة وتكون المعلمات البيئية مثل درجة الحرارة كلها مواتية للنمو ، فإن معدل الضرب يتجاوز معدل الوفيات بكثير. هذا يؤدي إلى نمو أسي.

من خلال قياس كمية البكتيريا في الثقافة كدالة للوقت ، يمكن الحصول على منحنى النمو. ينتج عن نمو البكتيريا في مزرعة سائلة في ظل الظروف المثلى منحنى نمو ذو شكل مميز يمكن تقسيمه إلى مراحل مختلفة. يبدأ المنحنى ب “مرحلة التأخر” ، عندما يكون النمو بطيئا بينما تتأقلم البكتيريا مع ظروف الاستزراع. التالي هو “السجل” أو “المرحلة الأسية” ، عندما تشهد البكتيريا نموا أسيا. يتوقف النمو في النهاية بمجرد استنفاد العناصر الغذائية وتراكم النفايات ، مما يؤدي إلى “مرحلة ثابتة”. أخيرا ، بمجرد تجاوز معدل الضرب بمعدل موت الخلايا ، تدخل الثقافة “مرحلة الموت”.

لبناء منحنى النمو ، يتم حساب الأعداد البكتيرية في قارورة من الثقافة السائلة في نقاط زمنية مختلفة خلال فترة معينة من الزراعة. يمكن الحصول على أعداد البكتيريا بعدد من الطرق المختلفة. أحد الطرق الشائعة هو قياس الكثافة الضوئية – أو “OD” – 600 ، وهو امتصاص المحلول البكتيري للضوء بطول موجي يبلغ 600 نانومتر.

طريقة أخرى هي تحديد “CFU” ، أو وحدات تشكيل المستعمرة ، لكل مليلتر من الثقافة. نظرا للطبيعة النسيلة لنمو البكتيريا ، يمكن لبكتيريا واحدة في الثقافة أن تتوسع نظريا إلى مستعمرة واحدة يمكن ملاحظتها على صفيحة أجار. من خلال طلاء سلسلة من التخفيفات للثقافة البكتيرية للوصول إلى تركيز بكتيري حيث يمكن ملاحظة مستعمرات فردية منفصلة ، وهي طريقة تسمى “طلاء التخفيف التسلسلي” ، يمكن استخدام عدد المستعمرات لحساب تركيز البكتيريا مرة أخرى من حيث CFU لكل مل.

الآن بعد أن فهمت كيف يمكن تحليل نمو البكتيريا ، دعنا ننتقل إلى بروتوكول لإجراء تحليل منحنى النمو على الثقافات النقية لنموذج بكتيري راسخ ، الإشريكية القولونية ، باستخدام طريقة طلاء التخفيف التسلسلي.

قبل يوم واحد من جمع النقطة الزمنية ، قم بتلقيح 20 مل من مرق الصويا التربتيكاز المعقم مسبقا ، أو TSB ، المتوسط في قارورة سعة 50 مل بمستعمرة واحدة من الإشريكية القولونية.

احتضان المزرعة طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الرج. بالنسبة للإشريكية القولونية ، سيؤدي ذلك إلى طور ثابت يبلغ حوالي 10⁹ CFU / mL.

في اليوم التالي ، قم بتلقيح 100 ميكرولتر من المزرعة الليلية في 250 مل من TSB في قارورة سعة 500 مل. تخلط جيدا. ينتج عن هذا ثقافة مخففة تبلغ حوالي 4 × 10⁵ CFU / مل. قم بتخزين 5 مل من هذه المزرعة المخففة في أنبوب الاستزراع. هذا هو الاقتباس من النقطة الزمنية 0 ، أو T₀. ضعيها في الثلاجة على الفور عند 4 درجات مئوية.

احتضان الحجم المتبقي من المزرعة عند 37 درجة مئوية مع الرج. في كل ساعة بعد ذلك لمدة تصل إلى 8 ساعات ، اجمع 5 مل من الثقافة. قم بتعيين هذه العينات من T₁ إلى T₈ ، وقم بتخزينها جميعا عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

في يوم التجربة ، قم بإزالة الإشريكية القولونية من الثلاجة واحتفظ بها على الجليد. استخدم أنابيب ميكروفيج معقمة ، تحتوي كل منها على 900 ميكرولتر من محلول ملحي معقم ، لإعداد سلسلة تخفيف لكل كمية وفقا للجدول التالي.

امزج ثقافة T₀ جيدا عن طريق الدوامة برفق ، ثم أضف 100 ميكرولتر إلى الأنبوب A من سلسلة التخفيف الخاصة به ، مما يجعل التخفيف 1 في 10 ، أو ^10-1. أنبوب الدوامة A للخلط ، وباستخدام طرف ماصة جديد ، أضف 100 ميكرولتر من الأنبوب A إلى الأنبوب B ، مما يجعل التخفيف 1 في 100 ، أو ^10-2.

كرر العملية لكل حصة ثقافة وقم بعمل سلسلة التخفيف المناسبة وفقا للجدول 2. بمجرد إجراء سلسلة التخفيف لجميع عينات النقطة الزمنية ، احصل على العدد المناسب من ألواح أجار الصويا المعقمة المعدة للطلاء البكتيري.

سيتم طلاء 3 تخفيفات لكل ثقافة نقطة زمنية بثلاث نسخ وفقا للجدول التالي. قم بتسمية اللوحات وفقا لذلك. بعد ذلك، قم بوضع ماصة 100 ميكرولتر من كل مزرعة مخففة بشكل مناسب في وسط صفيحة الأجار المعنية. قم بتعقيم قضيب زجاجي على شكل حرف “L” باللهب ، وقم بتبريده عن طريق لمس القضيب إلى الأجار بعيدا عن اللقاح ، ثم انشر السائل على الفور على سطح الأجار. يرجى ملاحظة أن التأخير في الانتشار قد يؤدي إلى فرط نمو البكتيريا في مكان التلقيح.

استمر في طلاء كل سلسلة من التخفيف لجميع ثقافات النقاط الزمنية 9 ، وتعقيم قضيب نشر الزجاج باللهب بين كل سلسلة تخفيف.

بمجرد السماح للألواح بالجفاف لبضع دقائق ، اقلبها وضعها في الحاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل. بعد هذه الفترة من النمو ، يمكن تخزين الألواح عند 4 درجات مئوية.

بعد حضانة ألواح التخفيف طوال الليل ، افحصها بحثا عن تلوث وتوحيد المستعمرات. لكل ثقافة نقطة زمنية ، اختر مخففا يوجد فيه ما بين 30-300 مستعمرة لكل طبق. احسب عدد المستعمرات على كل لوحة من الألواح الثلاثية لهذا التخفيف.

باستخدام متوسط عدد المستعمرات لكل تخفيف وعامل التخفيف ، احسب تركيز البكتيريا في المزرعة الأصلية في كل نقطة زمنية في CFU / mL. على سبيل المثال ، إذا كان هناك في المتوسط 30 مستعمرة من مجموعة الألواح الثلاثية التي تم الحصول عليها من 0.1 مل من التخفيف ^10-4 ، أو 1 في 10,000 ، فسيكون هناك 30 مقسوما على 0.1 مل مضروبا في 10,000 ، أو 3 ملايين CFU / مل.

باستخدام التركيز البكتيري المحسوب لكل نقطة زمنية ، ارسم رسما بيانيا لسجل القاعدة 10 للتركيزات البكتيرية ، في CFU / مل ، مقابل الوقت بالساعات. من الرسم البياني ، حدد مرحلة السجل لنمو الثقافة البكتيرية الأصلية واختر نقطتين من النقاط الزمنية داخل مرحلة السجل ، وقم بتعيين أول هذه النقاط الزمنية على أنها t = 0. احسب متوسط وقت التوليد باستخدام المعادلة X يساوي 2 أس n مضروبا في X₀ حيث X هو تركيز البكتيريا في الوقت t ، و X₀ هو التركيز الأولي عند t = 0 ، و n هو عدد الأجيال المنقضية بين النقطتين الزمنيتين.

على سبيل المثال ، لنفترض أن X₀ يساوي 1,000 CFU / مل ، وعند t = 6 h ، يكون التركيز 16,000 CFU / mL. باستخدام المعادلة ، نحصل على أن 4 أجيال حدثت في غضون 6 ساعات ، وهو ما يعطي وقت التوليد 6 مقسوما على 4 أو 1.5 ساعة لكل جيل.

يعد قياس حركية نمو البكتيريا أمرا أساسيا للعديد من التطبيقات لأغراض البحث أو الزراعة أو الهندسة الحيوية.

أحد الاستخدامات لمعرفة معدل نمو البكتيريا هو السماح بالحصول على كمية دقيقة من الثقافة البكتيرية لتلقيح مزرعة أو وسيط آخر. على سبيل المثال ، تحتاج بعض المحاصيل ، مثل البقوليات ، إلى زراعتها مع البكتيريا التكافلية المعروفة باسم الجذور التي تستعمر جذور النباتات لتكوين عقيدات و “إصلاح” النيتروجين – وتحويل النيتروجين في الغلاف الجوي إلى أمونيا يمكن أن يستخدمها النبات. بالنسبة للتطبيقات الزراعية ، تتم إضافة كمية معروفة من الجذور إلى وسط كربوني قائم على الخث ، والذي يستخدم بعد ذلك لتلقيح بذور البقوليات لتأسيس التعايش النباتي والبكتيري.

يمكن أيضا استخدام تحليل النمو لتحديد الأنواع البكتيرية التي يمكن أن تتحلل النفايات الصناعية وربما تولد منتجات ثانوية قيمة. في هذا المثال ، حقق الباحثون في كيفية تأثير وسائط النمو المكملة بالخمور السوداء ، وهو منتج نفايات من لب الخشب وإنتاج الورق ، على نمو عزلة ميكروبية بيئية.

لم تظهر البكتيريا نموا معززا مع الخمور السوداء فحسب ، بل أظهرت أيضا نمط نمو “ثنائي الأطوار” ، مما يشير إلى وجود أكثر من مصدر كربون في الخمور السوداء التي يمكن للبكتيريا استقلابها. يمكن بعد ذلك استخراج المكونات الفردية للخمور السوداء لتحليل نمو أكثر تفصيلا.

أخيرا ، تعد قياسات معدل النمو مفيدة أيضا لتوصيف البكتيريا التي تم تصميمها لأغراض صناعية معينة ، على سبيل المثال ، لمعالجة التلوث النفطي. هنا ، ابتكر العلماء سلالات بكتيرية معدلة وراثيا تحتوي على إنزيمات لتحلل المكونات الهيدروكربونية للنفط. تم إجراء تحليل النمو ، على سبيل المثال ، للتحقق من أن البكتيريا المهندسة قد زادت من معدل النمو من البكتيريا العادية في وجود الهيدروكربونات السامة ، مما يشير إلى تحسن التحمل الذي سيسمح للبكتيريا المهندسة بأداء وظيفة تنظيف التلوث.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول تحليل معدلات نمو البكتيريا مع منحنيات النمو. يجب أن تفهم الآن مراحل النمو المختلفة للثقافات البكتيرية ، وكيفية إجراء تجربة للحصول على منحنى نمو باستخدام مجموعة النقاط الزمنية والطلاء التسلسلي للتخفيف ، وكيف يمكن تطبيق تحليل النمو على الأغراض البحثية والصناعية. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!

Results

بعد تجربة طلاء التخفيف التسلسلي ، تم الحصول على البيانات التالية. في بداية النمو الأسي المعين هنا على أنه الوقت t = 0 ، يكون التركيز الأولي للخلايا البكتيرية 1,000 CFU / mL. في الوقت t = 6 ساعات ، يكون تركيز الخلايا 16,000 CFU / مل.

الآن ، X = 2ⁿ x X₀

أين: X₀ = التركيز الأولي للخلايا = 1,000 CFU/mL
X = تركيز الخلايا بعد الوقت t = 16,000 CFU / mL
n = عدد الأجيال
16,000 = 2ⁿ x 1,000
2ⁿ = 16
log₁₀ 2ⁿ = log₁₀ 16
n x 0.301 = 1.204
n = 1.204 = 4
0.301

انقضت أربعة أجيال في 6 ساعات ، لذلك

متوسط وقت التوليد = 6/4 = 1.5 ساعة.

الشكل 4. عقدة جذر تحتوي على بكتيريا مثبتة للنيتروجين.

Applications and Summary

Knowledge of bacterial growth kinetics and bacterial numbers in a culture medium is important from both a research and commercial point of view. In research, it is often critical to know the number of bacteria in a sample, so the experiment can be replicated, if need be, with the exact same numbers. For example, during experiments in which bacterial inoculants are added to a plot of soil, a minimum of 10⁴ CFU needs to be added per gram of soil to get the desired effect, such as enhanced biodegradation of toxic organic soil contaminants. Another example is the case of commercially produced rhizobial inoculants, where known numbers of rhizobia (bacteria that enter into symbiotic relationships with the roots of plants) are impregnated into a peat-based carbon medium (Figure 4). The medium is then used to inoculate legume seeds to enhance biological nitrogen fixation (i.e., the conversion of molecular nitrogen into organic forms that can be used by organisms as nutrients).

Growth kinetics is also useful for assessing whether particular strains of bacteria are adapted to metabolize certain substrates, such as industrial waste or oil pollution. Bacteria that are genetically engineered to clean up oil spills, for example, can be grown in the presence of complex hydrocarbons to ensure that their growth would not be repressed by the toxic effects of oil. Similarly, the slope and shape of growth curves produced from bacteria grown with mixtures of industrial waste products can inform scientists whether the bacteria can metabolize the particular substance, and how many potential energy sources for the bacteria can be found in the waste mixture.

Transcript

يعد قياس معدل نمو البكتيريا تقنية ميكروبيولوجية أساسية ، ولها استخدام واسع النطاق في البحوث الأساسية وكذلك في التطبيقات الزراعية والصناعية.

تعد البكتيريا من بين أكثر أشكال الحياة وفرة على وجه الأرض ، حيث توجد في كل نظام بيئي ، بما في ذلك جسم الإنسان. بعض الأنواع البكتيرية قابلة للتتبع وراثيا أيضا ، وقد تم تسخيرها كنماذج بحثية أو لإنتاج منتجات طبيعية أو اصطناعية على نطاق صناعي. ومع ذلك ، لا يمكن استزراع جميع الأنواع البكتيرية في المختبر. بالنسبة لأولئك الذين يستطيعون ذلك ، فإن السمة المهمة هي معدل الضرب ، أو “حركية النمو”.

يمكن أن يؤدي قياس معدل نمو المزرعة البكتيرية إلى إبلاغ العلماء بوظائفها الفسيولوجية والتمثيل الغذائي ، كما أنه مفيد في الحصول على عدد دقيق للخلايا من البكتيريا للتطبيقات النهائية.

سيقدم هذا الفيديو المبادئ الكامنة وراء تحليل معدل نمو البكتيريا ، ويوضح بروتوكولا لتوصيف معدل النمو باستخدام “منحنى النمو” ، وأخيرا ، يستكشف العديد من تطبيقات العلوم البيئية لقياس حركية نمو البكتيريا.

تتكاثر البكتيريا بشكل عام لاجنسيا ، وتتكاثر في الانشطار الثنائي البسيط حيث تنقسم خلية أبوية واحدة إلى خليتين ابنتيتين متطابقتين. في ظل ظروف النمو المواتية حيث تتوفر العناصر الغذائية بكثرة وتكون المعلمات البيئية مثل درجة الحرارة كلها مواتية للنمو ، فإن معدل الضرب يتجاوز معدل الوفيات بكثير. هذا يؤدي إلى نمو أسي.

من خلال قياس كمية البكتيريا في الثقافة كدالة للوقت ، يمكن الحصول على منحنى النمو. ينتج عن نمو البكتيريا في مزرعة سائلة في ظل الظروف المثلى منحنى نمو ذو شكل مميز يمكن تقسيمه إلى مراحل مختلفة. يبدأ المنحنى ب “مرحلة التأخر” ، عندما يكون النمو بطيئا بينما تتأقلم البكتيريا مع ظروف الاستزراع. التالي هو “السجل” أو “المرحلة الأسية” ، عندما تشهد البكتيريا نموا أسيا. يتوقف النمو في النهاية بمجرد استنفاد العناصر الغذائية وتراكم النفايات ، مما يؤدي إلى “مرحلة ثابتة”. أخيرا ، بمجرد تجاوز معدل الضرب بمعدل موت الخلايا ، تدخل الثقافة “مرحلة الموت”.

لبناء منحنى النمو ، يتم حساب الأعداد البكتيرية في قارورة من الثقافة السائلة في نقاط زمنية مختلفة خلال فترة معينة من الزراعة. يمكن الحصول على أعداد البكتيريا بعدد من الطرق المختلفة. أحد الطرق الشائعة هو قياس الكثافة الضوئية – أو “OD” – 600 ، وهو امتصاص المحلول البكتيري للضوء بطول موجي يبلغ 600 نانومتر.

طريقة أخرى هي تحديد “CFU” ، أو وحدات تشكيل المستعمرة ، لكل مليلتر من الثقافة. نظرا للطبيعة النسيلة لنمو البكتيريا ، يمكن لبكتيريا واحدة في الثقافة أن تتوسع نظريا إلى مستعمرة واحدة يمكن ملاحظتها على صفيحة أجار. من خلال طلاء سلسلة من التخفيفات للثقافة البكتيرية للوصول إلى تركيز بكتيري حيث يمكن ملاحظة مستعمرات فردية منفصلة ، وهي طريقة تسمى “طلاء التخفيف التسلسلي” ، يمكن استخدام عدد المستعمرات لحساب تركيز البكتيريا مرة أخرى من حيث CFU لكل مل.

الآن بعد أن فهمت كيف يمكن تحليل نمو البكتيريا ، دعنا ننتقل إلى بروتوكول لإجراء تحليل منحنى النمو على الثقافات النقية لنموذج بكتيري راسخ ، الإشريكية القولونية ، باستخدام طريقة طلاء التخفيف التسلسلي.

قبل يوم واحد من جمع النقطة الزمنية ، قم بتلقيح 20 مل من مرق الصويا التربتيكاز المعقم مسبقا ، أو TSB ، المتوسط في قارورة سعة 50 مل بمستعمرة واحدة من الإشريكية القولونية.

احتضان الثقافة بين عشية وضحاها في سن 37؟ ج مع الاهتزاز. بالنسبة للإشريكية القولونية ، سيؤدي ذلك إلى طور ثابت يبلغ حوالي 109 CFU / mL.

في اليوم التالي ، قم بتلقيح 100 ؟ L من المزرعة الليلية إلى 250 مل من TSB في قارورة سعة 500 مل. تخلط جيدا. ينتج عن هذا ثقافة مخففة تبلغ حوالي 4 × 105 CFU/mL. قم بتخزين 5 مل من هذه المزرعة المخففة في أنبوب الاستزراع. هذا هو الحصة من النقطة الزمنية 0 ، أو T0. ضعه في الثلاجة على الفور في 4 درجة مئوية

احتضان الحجم المتبقي من الثقافة عند 37؟ ج مع الاهتزاز. في كل ساعة بعد ذلك لمدة تصل إلى 8 ساعات ، اجمع 5 مل من الثقافة. قم بتعيين هذه العينات من T1 إلى T8 ، وقم بتخزينها جميعا في 4؟ ج حتى الاستخدام.

في يوم التجربة ، قم بإزالة الإشريكية القولونية من الثلاجة واحتفظ بها على الجليد. استخدم أنابيب ميكروفوج معقمة ، كل منها يحتوي على 900؟ L من محلول ملحي معقم ، لإعداد سلسلة تخفيف لكل حصة وفقا للجدول التالي.

امزج ثقافة T0 جيدا عن طريق الدوامة برفق ، ثم أضف 100؟ L إلى الأنبوب A من سلسلة التخفيف الخاصة به ، مما يجعل التخفيف 1 في 10 ، أو 10-1. أنبوب دوامة A للخلط ، وباستخدام طرف ماصة جديد ، أضف 100؟ L من الأنبوب A إلى الأنبوب B ، مما يجعل التخفيف 1 في 100 ، أو 10-2.

كرر العملية لكل حصة ثقافة وقم بعمل سلسلة التخفيف المناسبة وفقا للجدول 2. بمجرد إجراء سلسلة التخفيف لجميع عينات النقطة الزمنية ، احصل على العدد المناسب من ألواح أجار الصويا المعقمة المعدة للطلاء البكتيري.

3 تخفيفات لكل ثقافة نقطة زمنية سيتم طلاؤها بثلاث نسخ وفقا للجدول التالي. قم بتسمية اللوحات وفقا لذلك. ثم ، ماصة 100؟ L من كل ثقافة مخففة بشكل مناسب في مركز لوحة الأجار المعنية. قم بتعقيم قضيب زجاجي على شكل حرف “L” باللهب ، وقم بتبريده عن طريق لمس القضيب إلى الأجار بعيدا عن اللقاح ، ثم انشر السائل على الفور على سطح الأجار. يرجى ملاحظة أن التأخير في الانتشار قد يؤدي إلى فرط نمو البكتيريا في مكان التلقيح.

استمر في طلاء كل سلسلة من التخفيف لجميع ثقافات النقاط الزمنية 9 ، وتعقيم قضيب نشر الزجاج باللهب بين كل سلسلة تخفيف.

بمجرد السماح للألواح بالجفاف لبضع دقائق ، اقلبها وضعها في 37؟ حاضنة C بين عشية وضحاها. بعد هذه الفترة من النمو ، يمكن تخزين الصفائح في درجة حرارة 4 درجة مئوية

بعد حضانة ألواح التخفيف طوال الليل ، قم بفحصها بحثا عن تلوث وتوحيد المستعمرات. لكل ثقافة نقطة زمنية ، اختر مخففا يوجد فيه ما بين 30-300 مستعمرة لكل طبق. احسب عدد المستعمرات على كل لوحة من الألواح الثلاثية لهذا التخفيف.

باستخدام متوسط عدد المستعمرات لكل تخفيف وعامل التخفيف ، احسب تركيز البكتيريا في المزرعة الأصلية في كل نقطة زمنية في CFU / mL. على سبيل المثال ، إذا كان هناك في المتوسط 30 مستعمرة من مجموعة الألواح الثلاثية التي تم الحصول عليها من 0.1 مل من التخفيف 10-4 ، أو 1 في 10,000 ، فسيكون هناك 30 مقسوما على 0.1 مل مضروبا في 10,000 ، أو 3 ملايين CFU / مل.

باستخدام التركيز البكتيري المحسوب لكل نقطة زمنية ، ارسم رسما بيانيا لسجل القاعدة 10 للتركيزات البكتيرية ، في CFU / مل ، مقابل الوقت بالساعات. من الرسم البياني ، حدد مرحلة السجل لنمو الثقافة البكتيرية الأصلية واختر نقطتين من النقاط الزمنية داخل مرحلة السجل ، وقم بتعيين أول هذه النقاط الزمنية على أنها t = 0. احسب متوسط وقت التوليد باستخدام المعادلة X يساوي 2 أس n مضروبا في X0 حيث X هو تركيز البكتيريا في الوقت t ، و X0 هو التركيز الأولي عند t = 0 ، و n هو عدد الأجيال المنقضية بين النقطتين الزمنيتين.

على سبيل المثال ، لنفترض أن X0 هو 1,000 CFU / مل ، وعند t = 6 h ، يكون التركيز 16,000 CFU / mL. باستخدام المعادلة ، نحصل على أن 4 أجيال حدثت في غضون 6 ساعات ، وهو ما يعطي وقت التوليد 6 مقسوما على 4 أو 1.5 ساعة لكل جيل.

يعد قياس حركية نمو البكتيريا أمرا أساسيا للعديد من التطبيقات لأغراض البحث أو الزراعة أو الهندسة الحيوية.

أحد الاستخدامات لمعرفة معدل نمو البكتيريا هو السماح بالحصول على كمية دقيقة من الثقافة البكتيرية لتلقيح مزرعة أو وسيط آخر. على سبيل المثال ، تحتاج بعض المحاصيل ، مثل البقوليات ، إلى زراعتها مع البكتيريا التكافلية المعروفة باسم الجذور التي تستعمر جذور النباتات لتكوين عقيدات و “إصلاح” النيتروجين – وتحويل النيتروجين في الغلاف الجوي إلى أمونيا يمكن أن يستخدمها النبات. بالنسبة للتطبيقات الزراعية ، تتم إضافة كمية معروفة من الجذور إلى وسط كربوني قائم على الخث ، والذي يستخدم بعد ذلك لتلقيح بذور البقوليات لتأسيس التعايش النباتي والبكتيري.

يمكن أيضا استخدام تحليل النمو لتحديد الأنواع البكتيرية التي يمكن أن تتحلل النفايات الصناعية وربما تولد منتجات ثانوية قيمة. في هذا المثال ، حقق الباحثون في كيفية تأثير وسائط النمو المكملة بالخمور السوداء ، وهو منتج نفايات من لب الخشب وإنتاج الورق ، على نمو عزلة ميكروبية بيئية.

لم تظهر البكتيريا نموا معززا مع الخمور السوداء فحسب ، بل أظهرت أيضا نمط نمو “ثنائي الأطوار” ، مما يشير إلى وجود أكثر من مصدر كربون في الخمور السوداء التي يمكن للبكتيريا استقلابها. يمكن بعد ذلك استخراج المكونات الفردية للخمور السوداء لتحليل نمو أكثر تفصيلا.

أخيرا ، تعد قياسات معدل النمو مفيدة أيضا لتوصيف البكتيريا التي تم تصميمها لأغراض صناعية معينة ، على سبيل المثال ، لمعالجة التلوث النفطي. هنا ، ابتكر العلماء سلالات بكتيرية معدلة وراثيا تحتوي على إنزيمات لتحلل المكونات الهيدروكربونية للنفط. تم إجراء تحليل النمو ، على سبيل المثال ، للتحقق من أن البكتيريا المهندسة قد زادت من معدل النمو من البكتيريا العادية في وجود الهيدروكربونات السامة ، مما يشير إلى تحسن التحمل الذي سيسمح للبكتيريا المهندسة بأداء وظيفة تنظيف التلوث.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول تحليل معدلات نمو البكتيريا مع منحنيات النمو. يجب أن تفهم الآن مراحل النمو المختلفة للثقافات البكتيرية ، وكيفية إجراء تجربة للحصول على منحنى نمو باستخدام مجموعة النقاط الزمنية والطلاء التسلسلي للتخفيف ، وكيف يمكن تطبيق تحليل النمو على الأغراض البحثية والصناعية. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!