تحليل منحنى نمو البكتيريا وتطبيقاته البيئية

p class = "jove_title" >1. مجموعة من Aliquots للثقافة البكتيرية

1. قبل يوم واحد من جمع النقاط الزمنية للنمو ، قم بتلقيح 20 مل من وسط مرق الصويا (TSB) في قارورة سعة 50 مل باستخدام الإشريكية القولونية.
2. احتضان بين عشية وضحاها عند 27 درجة مئوية. تؤدي فترة الحضانة الطويلة نسبيا هذه إلى مجموعة مرحلية ثابتة من النوع البري بكتريا قولونية تبلغ حوالي 10⁹ CFU / mL.
3. في اليوم التالي ، استخدم 100 ميكرولتر من المزرعة المحضرة لتلقيح 250 مل من TSB (في قارورة 500 مل). تخلط جيدا. قم بإزالة كمية 5 مل وضعها في الثلاجة على الفور عند 4 درجات مئوية. هذه هي T = 0 أو T₀ نقطة زمنية ، ويجب أن تحتوي على ما يقرب من 4 × 10⁵ CFU / مل.
4. ضع قارورة الإشريكية القولونية المتبقية (245 مل) في حاضنة اهتزاز 37 درجة مئوية. قم بإزالة 5 مل من المزرعة كل ساعة ، حتى 8 ساعات. قم بتخزين كل حصة عند 4 درجات مئوية. قم بتعيين هذه الحصص من T₁ إلى T₈.

2. التخفيف التسلسلي

1. قم بإزالة كميات من الإشريكية القولونية من الثلاجة وضعها على الثلج لنقلها. احتفظ بجميع الثقافات على الجليد حتى الاستخدام.
2. قم بإعداد سلسلة من أنابيب التخفيف للحصول على تخفيفات مختلفة لكل ثقافة بكتريا قولونية (الشكل 3). أنابيب الطرد الدقيقة مناسبة لهذه الوظيفة. يجب أن يحتوي كل أنبوب تخفيف على 900 ميكرولتر من سائل التخفيف (محلول ملحي معقم). هناك حاجة إلى سلسلة تخفيف لكل ثقافة الإشريكية القولونية (T₀ إلى T₈) ؛ قم بتسمية كل أنبوب وفقا للجدول 2.
   
   الشكل 3. تخطيطي يوضح إجراء طلاء الإشريكية القولونية.
3. ابدأ التخفيفات بإضافة 100 ميكرولتر من الإشريكية القولونية من الأنبوب المسمى T₀ (ثقافة الإشريكية القولونية الأولية) إلى الأنبوب A ، وهو التخفيف ^10-1 ل T₀. دوامة الأنبوب لمدة 5 ثوان.
4. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الأنبوب A إلى الأنبوب التالي من المحلول الملحي ، الأنبوب B ، وهو تخفيف ^10-2 ل T₀. استمر في سلسلة التخفيف المطلوبة لكل حصة من النقاط الزمنية. تذكر أن تدور كل أنبوب قبل النقل. من المهم أيضا استخدام طرف ماصة جديد لكل عملية نقل.

ثقافة الإشريكية القولونية التخفيفات اللازمة والأنبوب # أ ب ج د ه ويف ز تي₀ ^{10-1 10-2} تي₁ ^{10-1 10-2} تي₂ ^{10-1 10-2 10-3} تي₃ ^{10-1 10-2 10-3 10-4} تي₄ ^{10-1 10-2 10-3 10-4 10-5} تي₅ ^{10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6} تي₆ ^{10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7} تي₇ ^{10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6} تي₈ ^{10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6} < p class = "jove_content" > الجدول 2. سلسلة التخفيف المطلوبة لكل ثقافة الإشريكية القولونية. فئة

3. الطلاء

1. سيتم طلاء ثلاثة تخفيفات لكل حصة زمنية لزراعة الإشريكية القولونية ، وفقا للجدول 3. قم بتسمية اللوحات مع النقطة الزمنية (T₁ إلى T₈) ، وعامل التخفيف ، والحجم المراد إضافته. استخدم أطباق ثلاثية لكل تخفيف.
2. أضف 100 ميكرولتر من كل تخفيف إلى اللوحة عن طريق سحب الكمية إلى مركز لوحة أجار (الشكل 3). انشر الكمية على الفور باستخدام قضيب زجاجي معقم باللهب على شكل حرف "L". إذا لم ينتشر اللقب على الفور ، فإنه يمتص في الموقع على اللوحة ، مما يؤدي إلى فرط نمو البكتيريا في مكان التلقيح الأولي.
3. كرر الطلاء لكل سلسلة تخفيف للنقاط الزمنية من T₁ إلى T₈. تذكر تعقيم القضيب بين الألواح وخاصة بين التخفيفات المختلفة.
4. بمجرد أن تجف الأطباق لبضع دقائق ، اقلبها وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل. يمنع قلب الألواح التكثيف من السقوط على لوحة الأجار. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، يجب تخزين الأطباق في الثلاجة.

ثقافة الإشريكية القولونية التخفيفات المراد طلاؤها تي₀ ^{10-1 10-2 10-3} تي₁ ^{10-1 10-2 10-3} تي₂ ^{10-2 10-3 10-4} تي₃ ^{10-3 10-4 10-5} تي₄ ^{10-4 10-5 10-6} تي₅ ^{10-5 10-6 10-7} تي₆ ^{10-6 10-7 10-8} تي_7* ^{10-5 10-6 10-7} تي_8* ^{10-4 10-5 10-6}

^* تأخذ التخفيفات المنخفضة في الاعتبار انخفاض عدد السكان بسبب مرحلة الوفاة.

< p class = "jove_content" >الجدول 3. بروتوكول الطلاء لمزارع الإشريكية القولونية. < p class = "jove_title" >4. عد المستعمرات وحساب متوسط وقت التوليد

1. افحص الألواح للتأكد من توحيد المستعمرات وعدم وجود تلوث.
2. لكل نقطة زمنية (T₀ إلى T₈) ، اختر مخففا واحدا يحتوي على ما بين 30 و 300 مستعمرة ، واحسب الألواح الثلاثية.
3. باستخدام عامل التخفيف ، قم بحساب عدد الخلايا لكل مل من الثقافة الأصلية في النقاط الزمنية من T₀ إلى T₈. على سبيل المثال ، إذا كان عدد المستعمرات الناتجة عن التخفيف ^10-4 هو 30 و 28 و 32:
   متوسط عدد المستعمرات = 30 مستعمرة
   نشأت هذه من 0.1 مل من ^10-4 تخفيف
   عدد المستعمرات لكل مل = 30 × 10⁴ = 3 × 10⁶
4. سجل_{المؤامرة 10} CFU / مل مقابل الوقت (بالساعات).
5. من الرسم البياني ، حدد المرحلة الأسية للنمو. باستخدام نقطتين زمنيتين ضمن مرحلة النمو الأسي وأرقام الخلايا المقابلة في كل مرة ، احسب متوسط وقت الجيل.