تحليل الحمض النووي الريبي للعينات البيئية باستخدام RT-PCR

1. جمع العينات: عينة التربة

1. ابحث عن موقع عينة عبر نظام تحديد المواقع العالمي (GPS) أو الإحداثيات أو الرؤية.
2. لأخذ العينات العشوائية ، اختر نقاطا عشوائية داخل منطقة للحصول على تعداد عام للموائل الميكروبية. يتم جمع أخذ العينات العرضية من نقاط على طول خط مستقيم ، على سبيل المثال ، بجوار مجرى مجرى النفق. يتم أخذ عينات الشبكة بشكل منهجي من النقاط على فترات منتظمة ، وهي مفيدة لرسم خرائط المجتمعات الميكروبية في منطقة غير معروفة أو متغيرة.
3. يوفر أخذ العينات على عمق 3-6 بوصات (7.5-15 سم) الوصول إلى النشاط الميكروبي الأكثر وفرة بالقرب من الغلاف الجذري ، ولكن ليس داخله (المنطقة الضيقة من التربة التي تتأثر بشكل مباشر بجذور النباتات والكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بها).
4. لجمع عينة التربة ، ادفع وثقب يدوي في الأرض إلى العمق المحدد مسبقا.
5. ارفع المثقاب. تم العثور على التربة داخل الجذع المجوف للمثقاب.
6. اكشط التربة الموجودة في قاع المثقاب في كيس تجميع التربة. تأكد من عدم لمس التربة أو تلويثها.
7. قم بتسمية الحقيبة بشكل صحيح بالموقع والاسم والتاريخ والوقت.
8. في المختبر ، مرر التربة عبر غربال 2 مم لإزالة أي حصى وصخور.
9. تحليل جزء من التربة لمحتوى رطوبة التربة. للحصول على تفاصيل حول هذه الخطوة ، يرجى الرجوع إلى فيديو JoVE Science Education حول رطوبة التربة.

2. جمع العينة: عينة المياه

1. ابحث عن موقع العينة عبر نظام تحديد المواقع العالمي (GPS) أو الإحداثيات أو البصر.
2. اجمع الماء في زجاجة تخزين. تسجيل حجم المياه التي تم جمعها ؛ إذا تم فحص الميكروبات في العينة كميا ، فيمكن تحديد التركيز الميكروبي بناء على الحجم الذي تم جمعه.
3. اختبر الماء على الفور بحثا عن أي معلمات مطلوبة للتجربة (درجة الحرارة ، الأس الهيدروجيني ، الموصلية ، الملوحة ، محتوى النيتروجين والفوسفور ، إلخ) باستخدام المجسات الإلكترونية المناسبة.
4. ضع الزجاجة التي تحتوي على عينة الماء في مبرد به ثلج. انقل المبرد إلى المختبر.

3. استخراج الحمض النووي الريبي

1. لجمع وتركيز الكائنات الحية الدقيقة من العينة البيئية ، يرجى الرجوع إلى فيديو JoVE Science Education حول استخراج الحمض النووي المجتمعي.
2. استخراج الحمض النووي الريبي من الفيروسات باستخدام مجموعة أدوات استخراج تجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
3. باختصار ، قم أولا بخلط العينات مع محلول التحلل المكمل بالإيثانول ، ثم أضف العينات إلى أعمدة الدوران.
4. الطرد المركزي الأعمدة عند حوالي 12,000 × جم ، وتجاهل التدفق. أضف مخزن الغسيل إلى الأعمدة وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى.
5. أضف الماء الخالي من RNase إلى الأعمدة وجهاز الطرد المركزي لمدة 30 ثانية لتصفية الحمض النووي الريبي إلى أنابيب ميكرو بقيمة 1.5 مل معقمة منخفضة الالتصاق.

4. النسخ العكسي - تفاعل البوليميراز المتسلسل

1. استرجع الكواشف التالية من الفريزر -20 درجة مئوية: dNTP ، مركز ( على سبيل المثال ، 10x) مخزن مؤقت للنسخ العكسي ، بادئات (في هذا المثال ، بادئات عشوائية). قم بإذابة الثلج أو في درجة حرارة الغرفة داخل غطاء نظيف ، واحتفظ بها على الجليد بمجرد إذابتها. استرجع أيضا النسخ العكسي ومثبط RNase واحتفظ بهما على الجليد.
2. احسب أحجام الكاشف اللازمة لعمل "مزيج رئيسي" يجمع بين جميع الكواشف الثابتة بين كل تفاعل (انظر الجدول 1 للحصول على تفاعل عينة). قم بإعداد مزيج رئيسي كاف لكل عينة ، بالإضافة إلى عنصر تحكم إيجابي (باستخدام قالب نسخ معروف) وتحكم سلبي ( على سبيل المثال ، بدون نسخ عكسي ، مع الماء فقط كقالب ، وما إلى ذلك). قم بتضمين 10٪ إضافية في الحجم.
3. قم بتجميع المزيج الرئيسي في أنابيب ميكروفوج منخفضة الالتصاق سعة 1.5 مل. هذا يقلل من ارتباط جزيئات الكاشف بالجدران البلاستيكية للأنابيب.
4. عندما يتم إذابة الكواشف ، أضف أحجام محسوبة إلى أنبوب الطرد الدقيق. قم بدوامة الطرد المركزي برفق لكل أنبوب قبل الإضافة. تأكد من تغيير أطراف الماصة بين إضافة كل كاشف لمنع التلوث.
5. بعد إضافة جميع الكواشف ، الدوامة والطرد المركزي المزيج الرئيسي لضمان خليط متجانس. ضع الكواشف مرة أخرى في التخزين عند -20 درجة مئوية.
6. قم بإعداد وتسمية شرائط PCR ذات 8 أنابيب ، مع تعيين أنبوب واحد لكل عينة أو تفاعل تحكم.
7. Aliquot حجم متساو من المزيج الرئيسي في كل أنبوب. ثم أضف مكونات خاصة بالتفاعل ، مثل مستخلصات الحمض النووي الريبي.
8. ضع غطاء الشريط بإحكام على شريط PCR ، وجهاز الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي صغير باستخدام محول أنبوب شريطي لضمان جمع كل السائل في قاع كل أنبوب ( الشكل 2 ).
9. ضع شريط PCR بإحكام في الدراجة الحرارية. اضغط لأسفل للتأكد من تأمين الأنابيب.
10. اضبط المشغل الحراري لتشغيل البرنامج المناسب ل RT المستخدم (انظر الجدول 2 للحصول على نموذج بروتوكول). عند اكتمال البرنامج ، ستحتوي الأنابيب على منتجات (كدنا) ، والتي يمكن أن تخضع بعد ذلك لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لمزيد من التفاصيل ، يرجى الرجوع إلى مقاطع فيديو JoVE Science Education حول تفاعل البوليميراز المتسلسل وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. قم بتخزين (كدنا) عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

الشكل 2. شريط مغطى من 8 أنابيب يحتوي على مزيج واستخراج رئيسي.

Reagent	الحجم لكل تفاعل 1 (μL)
10x RT Buffer	2.0
25x dNTPs	0.8
10x تمهيدي عشوائي	2.0
متعدد الكتبة	1.0
مثبط الرناس	1.0
الدرجة الجزيئية H2O	3.2
الحجم الإجمالي	10

الجدول 1. مكونات RT Master Mix.

الخطوة 1	الخطوة 2	الخطوة 3	الخطوة 4
25 درجة مئوية , 10 دقائق	37 درجة مئوية , 120 دقيقة	85 درجة مئوية , 5 دقائق	4 درجة مئوية ، ∞

الجدول 2. برنامج RT Reaction Thermocycleer.