تنقية مستخلص الدهون الكلي باستخدام كروماتوغرافيا العمود

Purification of a Total Lipid Extract with Column Chromatography

JoVE Science Education
Earth Science

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Earth Science

Purification of a Total Lipid Extract with Column Chromatography

3.8: An Overview of bGDGT Biomarker Analysis for Paleoclimatology

3.15: Removal of Branched and Cyclic Compounds by Urea Adduction for U^k’₃₇ Paleothermometry

12,776 Views

•

09:18 min

•

February 27, 2015

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Overview

المصدر: مختبر جيف سالاكوب – جامعة ماساتشوستس أمهيرست

غالبا ما يكون نتاج استخراج المذيبات العضوية ، وهو مستخلص الدهون الكلي (TLE) ، مزيجا معقدا من مئات ، إن لم يكن الآلاف ، من المركبات المختلفة. غالبا ما يهتم الباحث فقط بعدد قليل من المركبات. قد تنتمي المركبات ذات الأهمية إلى واحدة من عدة فئات من المركبات ، مثل الألكانات أو الكيتونات أو الكحول أو الأحماض ( الشكل 1 ) ، وقد يكون من المفيد إزالة فئات المركبات التي لا تنتمي إليها من أجل الحصول على رؤية أوضح للمركبات التي تهتم بها. على سبيل المثال ، قد يحتوي TLE على 1,000 مركب ، لكن وكيل درجة حرارة سطح البحر U ^k’ ₃₇ يعتمد على مركبين فقط (ألكينونات) ويعتمد وكيل درجة حرارة سطح البحر TEX ⁸⁶ على أربعة فقط (رباعي الإيثرات الجلسرين ثنائي الألكيل الجلسرين). سيكون من الواجب على الباحث إزالة أكبر عدد ممكن من المركبات التي لا يهتمون بها. هذا يجعل التحليل الآلي للمركبات ذات الأهمية (الألكينونات أو GDGTs) أقل احتمالا للتعقيد بسبب المركبات الدخيلة الأخرى.

في حالات أخرى ، قد تكون تقنية التنقية الأولية قد أنتجت مركبات ترغب الآن في إزالتها من العينة ، مثل إنتاج الأحماض الكربوكسيلية أثناء التصبن في الفيديو السابق. في كلتا الحالتين المذكورتين أعلاه ، تكون تقنية التنقية المسماة كروماتوغرافيا العمود مفيدة للغاية.

الشكل 1. المجموعات الوظيفية ذات الأهمية الجيوكيميائية. من Killops و Killops¹.

Principles

كروماتوغرافيا عمود هلام السيليكا هي تقنية تنقية تستخدم الارتباطات المختلفة لفئات المركبات المنفصلة لمرحلة صلبة من السيليكا ، وهو مسحوق ناعم يسمى الهلام. يتم تحميل ماصة صغيرة نصف ممتلئة تقريبا بالهلام (الشكل 2). ثم يتم تشبع هذا العمود بمذيب قطبي ، غالبا ما يكون هكسان. ثم يتم تحميل عينة على الجزء العلوي من الجل في العمود ، ويتم تمرير سلسلة من المذيبات ذات القطبية المتزايدة بالتتابع عبر العينة من أجل فصلها إلى فئات مركبة منفصلة. يعتمد الفصل على تقارب فئات المركبات المختلفة إما للطور الصلب أو المرحلة المذيبة. ترتبط المركبات القطبية بقوة أكبر بالسيليكا وبالتالي تأخذ المزيد من المذيبات القطبية ليتم غسلها من العمود. وبالتالي ، باستخدام عمود واحد وعينة واحدة ، يمكن فصل تلك العينة إلى عدة كسور. على سبيل المثال ، الأقطاب (الهيدروكربونات) ، والأقطاب الوسطى (الكيتونات والكحولات) ، والأقطاب (الأحماض والمركبات الوظيفية الأخرى).

الشكل 2. صورة لرف مخصص يسمح بتنقية ما يصل إلى 12 عينة في المرة الواحدة.

كروماتوغرافيا العمود هي تقنية مرنة لتنقية الخليط المعقد من المركبات الموجودة في الرواسب. تنفصل المخاليط أثناء تحركها عبر العمود ويتم جمعها في كسور ، يحتوي كل منها على فئة كيميائية مختلفة من المركبات. لذلك ، غالبا ما يتم استخدام كروماتوغرافيا العمود كخطوة تنقية إضافية بعد العزل الأولي للمركب المطلوب. قد تكون المستخلصات العضوية مثل مستخلصات الدهون الكلية مخاليط معقدة من العديد من المركبات. تقدم بعض تقنيات التنقية ، مثل التصبن ، مركبات يمكن أن تلحق الضرر بالأدوات التحليلية وبالتالي يجب إزالتها قبل التحليل. هذا الفيديو جزء من سلسلة حول استخراج الدهون وتنقيتها وتحليلها من الرواسب. بمجرد جمع مستخلص الدهون الكلي من عينة رسوبية ، يتم استخدام كروماتوغرافيا العمود لتنقية كل من الألكينونات و GDGTs ، اعتمادا على التحليل المطلوب.

في كروماتوغرافيا العمود ، يتم تحميل خليط من المركبات الكيميائية على مرحلة ثابتة صلبة مثل هلام السيليكا. ثم يتم استخدام مرحلة متحركة مثل المذيب العضوي لإزالة أو إزالة المركبات من العمود. يعتمد الترتيب الذي يتم فيه تصفية المركبات على قوة تفاعلات المركبات مع هلام السيليكا ومع المادة المسيحة.

يتم جمع التحطيف في أجزاء ، يحتوي كل منها على مركبات مختلفة من الخليط. اعتمادا على خصائص المركبات ، قد يوفر مذيب واحد فصلا كافيا ويزيل جميع المركبات ذات الأهمية. خلاف ذلك ، يتم استخدام مذيبات متعددة لتصفية كل مركب ذي أهمية بدوره.

تمتص المركبات القطبية ، التي لها توزيع غير متساو للشحنة ، بقوة إلى هلام السيليكا القطبي ، بينما تمتص المركبات القطبية بشكل ضعيف. المذيبات القطبية لها تقارب أكبر مع هلام السيليكا وبالتالي فهي مواد أقوى من المذيبات القطبية. وبالتالي ، فإن المذيبات القطبية تتخلص فقط من المركبات القطبية ، في حين أن المذيبات القطبية تتخلص من المركبات القطبية والقطبية.

عندما تكون المركبات المرغوبة قطبية معتدلة ، يجب غسل المركبات القطبية من العمود بمذيب قطبي قبل استخدام مذيب قطبي. لتجنب التخلص من المركبات شديدة القطبية غير المرغوب فيها مثل الأحماض ، يجب ألا يكون للشطف القطبي قوة تصفية أكثر من المطلوب للمركب الأكثر قطبا مرغوبا.

الآن بعد أن فهمت مبادئ كروماتوغرافيا العمود ، دعنا ننتقل إلى إجراء لتنقية المؤشرات الحيوية للدهون من مستخلص الدهون الكلي بواسطة كروماتوغرافيا عمود هلام السيليكا.

لإزالة الملوثات العضوية، احتراق الماصات الزجاجية البورسليكات وقوارير زجاج البورسليكات والصوف الزجاجي لمدة 6 ساعات عند 550 درجة مئوية. بمجرد أن تصبح الأواني الزجاجية جاهزة للاستخدام ، قم بإعداد رف لحمل الماصات والقوارير. احصل على لمبات ماصة ، وملاقط نظيفة ، وملعقة مختبرية ، وهلام السيليكا ، والهكسان ، وثنائي كلورو الميثان ، والميثانول. باستخدام ملاقط نظيفة ، ضع خصلة صغيرة من الصوف الزجاجي في فم الماصة. ادفع الصوف الزجاجي برفق إلى قاع الماصة باستخدام جذع ماصة أخرى لتشكيل سدادة مفكوكة. قم بتحميل هلام السيليكا بحذر في الماصة حتى تمتلئ نصفها. قم بتثبيت الماصة في وضع مستقيم في الحامل. قم بتأمين قارورة زجاجية من البورسليكات سعة 4 مل أسفل طرف الماصة لتجميع النفايات. في قارورة زجاجية أخرى من البورسليكات ، قم بتعليق ما يصل إلى 10 مجم من العينة الجافة من عملية التصبن في الهكسان. إذا التصقت العينة بجدران القارورة ، فقم بصوتنة القارورة لمدة 5 دقائق. يمكن الآن بدء إجراء الكروماتوغرافيا.

لبدء الكروماتوغرافيا ، اغسل عمود هلام السيليكا ب 3 أحجام من الهكسان لإزالة فقاعات الهواء والشوائب. ثم استبدل قارورة النفايات بقارورة فارغة للجزء القطبي. باستخدام ماصة زجاجية ، قم بتحميل العينة على العمود واترك التعليق يمتص في هلام السيليكا. اعمل بسرعة حتى لا يجف العمود أثناء العملية. اشطف قارورة العينة مرتين بأجزاء صغيرة من الهكسان وانقل كل شطف إلى العمود. استمر في إضافة الهكسان إلى العمود حتى تمتلئ قارورة التجميع تقريبا. اسمح لكل الهكسان بالانتهاء من دخول هلام السيليكا. ثم استبدل القارورة المملوءة بقارورة فارغة للجزء القطبي الأوسط. بعد ذلك ، اشطف قارورة العينة باستخدام DCM وأضفها إلى العمود 3 مرات. استمر في إضافة DCM إلى العمود حتى تمتلئ قارورة التجميع تقريبا. اسمح ل DCM بإنهاء النقع في هلام السيليكا ثم استبدل القارورة المملوءة بقارورة فارغة للجزء القطبي. كرر هذه العملية مع الميثانول.

بمجرد أن تمتلئ القارورة تقريبا ، اترك الميثانول ينتهي من التنقيط في القارورة ثم قم بتغطية جميع القوارير. يحتوي الجزء القطبي المتوسط على الألكينونات المرغوبة ، بينما توجد GDGTs في الجزء القطبي. بالنسبة لعينات الألكينون المتسخة أو المعقدة بشكل خاص ، يجب تنقية الجزء القطبي الأوسط بشكل أكبر مع تقريب اليوريا ، قبل التحليل.

يستخدم كروماتوغرافيا العمود على نطاق واسع في الكيمياء كتقنية تحليلية وتنقية.

تستخدم الأنابيب النانوية الكربونية بشكل متزايد في العديد من الصناعات ، ولكن هناك قلق متزايد بشأن آثارها على صحة الإنسان. إن تغيير خصائص الأنابيب الكربونية الكربونية يغير كيفية تصرفها في الماء والتربة. للتحقيق في مدى احتفاظ الوسائط المسامية مثل الرمل والأوساخ بالأنابيب النانوية الكربونية ، تم إعداد عمود بتربة مسامية كمرحلة ثابتة. أولا ، تم جمع الكسور أثناء تحميل محلول CNT على العمود لتحليل نقل الأنابيب النانوية الكربونية عبر التربة. بعد ذلك ، تم مسح الأنابيب النانوية الكربونية التي لا تزال ممتصة في التربة وتم تحليل الكسور لكمية الأنابيب النانوية الكربونية التي بقيت في التربة. تضفي النتائج نظرة ثاقبة على العلاقة بين وظائف سطح النانو الكربوني وآليات نقلها في البيئة.

يمكن تشغيل كروماتوغرافيا العمود على نطاقات كبيرة وصغيرة ، وبالتالي يتم استخدامه عند تصميم التوليفات للتطبيقات الصناعية. يتمتع حرير العنكبوت بقوة شد وليونة ممتازة ، ولكن لا يمكن حصاده على نطاق صناعي. بعد تخليق بروتين الحرير ، يتم تنقية بروتينات الحرير المؤتلفة عن طريق كروماتوغرافيا التقارب ، حيث تم تصميم المرحلة الثابتة لاحتجاز الجزيء المطلوب فقط. يمنح الغسيل والشطف الشامل أجزاء البروتين النقي اللازمة لتدوير حرير العنكبوت على نطاق واسع.

تتوفر العديد من المراحل الثابتة لكروماتوغرافيا العمود. قد لا تكون المرحلة الثابتة الواحدة مناسبة لجميع المنتجات المحتملة للتوليف ذي النطاق البديل الواسع ، مثل تخليق اليودوازيريدين هذا. يتم خلط المنتج الخام مع مراحل ثابتة مختلفة وتحلل تم تقييمه بواسطة البروتون بالرنين المغناطيسي النووي. نظرا لأن الرنين المغناطيسي النووي للبروتون حساس للغاية ، يمكن فحص العديد من المراحل الثابتة بحثا عن تحلل المنتج باستخدام كمية صغيرة من المنتج الخام. ثم يتم إجراء كروماتوغرافيا العمود بالمرحلة الثابتة المثلى ، مما يسمح بتنقية المركبات الجديدة وعالية التفاعل.

لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لكروماتوغرافيا العمود لتنقية مستخلص الدهون الكلي. سيوضح الفيديو التالي كيفية تنقية الخلائط المعقدة التي تحتوي على الألكينونات.

شكرا للمشاهدة!

Procedure

1. إعداد وإعداد المواد

الحصول على مستخلص الدهون الكلي (TLE) باستخدام طريقة استخراج المذيبات (Sonication أو Soxhlet أو استخراج المذيبات المتسارع (ASE)).
اجمع ما يلي: الماصات والمصابيح الزجاجية البورسليكات المحترقة ، وهلام السيليكا ، والهكسان ، وثنائي كلورو الميثان (DCM) ، والميثانول.
1. يمكن شراء هذه المواد من أي بائع تجزئة للمواد الكيميائية. يجب أن تكون الكواشف نقية وخالية من الهيدروكربونات.
احصل أيضا على الصوف الزجاجي المحترق وقوارير زجاجية من البورسليكات سعة 4 مل.
تأكد من أن لديك وسيلة لدعم العمود وقوارير التجميع أثناء الإجراء. على سبيل المثال ، حامل مع المشابك ورف حقير. صممت العديد من المختبرات رفوف مخصصة تحتوي على العديد من الأعمدة وقوارير التجميع (الشكل 2). يسمح هذا بتشغيل العديد من الأعمدة في نفس الوقت.

2. الطرق

ابدأ بالعينة الجافة في قارورة سعة 4 مل. إذا كانت العينة تزن أكثر من ~ 10 مجم عندما تجف ، فقد تحتاج إلى تقسيمها قبل تنفيذ الخطوات التالية حيث لا يمكن أن يتفاعل هلام السيليكا إلا مع كتلة محدودة من المواد العضوية.
العينة في كمية صغيرة من الهكسان. هذا هو القطب الأول والأقل من بين المذيبات الثلاثة المستخدمة في هذه التجربة.
إذا كانت هناك عينة عالقة في داخل القارورة ، فقم بصوتنة العينات لمدة 5 دقائق.
قم بتحميل كمية صغيرة من الصوف الزجاجي في الجزء العلوي من الماصة باستخدام مجموعة من الملقط النظيف. ادفع الصوف الزجاجي برفق إلى أسفل الماصة باستخدام ماصة أخرى لتشكيل سدادة.
انقل هلام السيليكا بحذر إلى الماصة حتى تمتلئ نصفها تقريبا.
ضع قارورة جمع النفايات سعة 4 مل أسفل العمود.
انقع هلام السيليكا في الماصة مع 3 أحجام من الهكسان. هذا يرطب العمود ويزيل فقاعات الهواء ويشطف أي شوائب من هلام السيليكا.
بمجرد الانتهاء من الغسيل النهائي ، قم بإزالة قارورة جمع النفايات واستبدلها بقارورة لجمع الجزء القطبي.
انقل العينة بأكملها في الهكسان بعناية إلى العمود باستخدام ماصة. اشطف قارورة العينة مرتين أخريين بكميات صغيرة من الهكسان ، وانقلها إلى العمود. اسمح للهكسان الذي تم نقل العينة فيه لينقع تماما في هلام السيليكا. يجب ألا يجف هلام السيليكا في أي وقت أثناء الإجراء.
استمر في إضافة الهكسان إلى الجزء العلوي من العينة حتى تمتلئ قارورة التجميع أسفل العمود تقريبا (~ 4 مل).
1. اسمح لكل الهكسان بدخول هلام السيليكا قبل البدء بالمذيب التالي.
ضع قارورة التجميع متوسطة القطبية أسفل العمود.
أضف DCM إلى أعلى العمود حتى تمتلئ قارورة التجميع تقريبا. مرة أخرى ، اسمح لكل DCM بالدخول إلى قارورة التجميع قبل بدء المذيب التالي.
ضع قارورة التجميع القطبية أسفل العمود.
أضف الميثانول إلى الجزء العلوي من العمود حتى تمتلئ المجموعة الخسيسة تقريبا.

كروماتوغرافيا العمود هي تقنية مرنة لتنقية الخليط المعقد من المركبات الموجودة في الرواسب. تنفصل المخاليط أثناء تحركها عبر العمود ويتم جمعها في كسور ، يحتوي كل منها على فئة كيميائية مختلفة من المركبات. لذلك ، غالبا ما يتم استخدام كروماتوغرافيا العمود كخطوة تنقية إضافية بعد العزل الأولي للمركب المطلوب. قد تكون المستخلصات العضوية مثل مستخلصات الدهون الكلية مخاليط معقدة من العديد من المركبات. تقدم بعض تقنيات التنقية ، مثل التصبن ، مركبات يمكن أن تلحق الضرر بالأدوات التحليلية وبالتالي يجب إزالتها قبل التحليل. هذا الفيديو جزء من سلسلة حول استخراج الدهون وتنقيتها وتحليلها من الرواسب. بمجرد جمع مستخلص الدهون الكلي من عينة رسوبية ، يتم استخدام كروماتوغرافيا العمود لتنقية كل من الألكينونات و GDGTs ، اعتمادا على التحليل المطلوب.

في كروماتوغرافيا العمود ، يتم تحميل خليط من المركبات الكيميائية على مرحلة ثابتة صلبة مثل هلام السيليكا. ثم يتم استخدام مرحلة متحركة مثل المذيب العضوي لإزالة أو إزالة المركبات من العمود. يعتمد الترتيب الذي يتم فيه تصفية المركبات على قوة تفاعلات المركبات مع هلام السيليكا ومع المادة المسيحة.

يتم جمع التحطيف في أجزاء ، يحتوي كل منها على مركبات مختلفة من الخليط. اعتمادا على خصائص المركبات ، قد يوفر مذيب واحد فصلا كافيا ويزيل جميع المركبات ذات الأهمية. خلاف ذلك ، يتم استخدام مذيبات متعددة لتصفية كل مركب ذي أهمية بدوره.

تمتص المركبات القطبية ، التي لها توزيع غير متساو للشحنة ، بقوة إلى هلام السيليكا القطبي ، بينما تمتص المركبات القطبية بشكل ضعيف. المذيبات القطبية لها تقارب أكبر مع هلام السيليكا وبالتالي فهي مواد أقوى من المذيبات القطبية. وبالتالي ، فإن المذيبات القطبية تتخلص فقط من المركبات القطبية ، في حين أن المذيبات القطبية تتخلص من المركبات القطبية والقطبية.

عندما تكون المركبات المرغوبة قطبية معتدلة ، يجب غسل المركبات القطبية من العمود بمذيب قطبي قبل استخدام مذيب قطبي. لتجنب التخلص من المركبات شديدة القطبية غير المرغوب فيها مثل الأحماض ، يجب ألا يكون للشطف القطبي قوة تصفية أكثر من المطلوب للمركب الأكثر قطبا مرغوبا.

الآن بعد أن فهمت مبادئ كروماتوغرافيا العمود ، دعنا ننتقل إلى إجراء لتنقية المؤشرات الحيوية للدهون من مستخلص الدهون الكلي بواسطة كروماتوغرافيا عمود هلام السيليكا.

لإزالة الملوثات العضوية، احتراق الماصات الزجاجية البورسليكات وقوارير زجاج البورسليكات والصوف الزجاجي لمدة 6 ساعات عند 550 درجة مئوية. بمجرد أن تصبح الأواني الزجاجية جاهزة للاستخدام ، قم بإعداد رف لحمل الماصات والقوارير. احصل على لمبات ماصة ، وملاقط نظيفة ، وملعقة مختبرية ، وهلام السيليكا ، والهكسان ، وثنائي كلورو الميثان ، والميثانول. باستخدام ملاقط نظيفة ، ضع خصلة صغيرة من الصوف الزجاجي في فم الماصة. ادفع الصوف الزجاجي برفق إلى قاع الماصة باستخدام جذع ماصة أخرى لتشكيل سدادة مفكوكة. قم بتحميل هلام السيليكا بحذر في الماصة حتى تمتلئ نصفها. قم بتثبيت الماصة في وضع مستقيم في الحامل. قم بتأمين قارورة زجاجية من البورسليكات سعة 4 مل أسفل طرف الماصة لتجميع النفايات. في قارورة زجاجية أخرى من البورسليكات ، قم بتعليق ما يصل إلى 10 مجم من العينة الجافة من عملية التصبن في الهكسان. إذا التصقت العينة بجدران القارورة ، فقم بصوتنة القارورة لمدة 5 دقائق. يمكن الآن بدء إجراء الكروماتوغرافيا.

لبدء الكروماتوغرافيا ، اغسل عمود هلام السيليكا ب 3 أحجام من الهكسان لإزالة فقاعات الهواء والشوائب. ثم استبدل قارورة النفايات بقارورة فارغة للجزء القطبي. باستخدام ماصة زجاجية ، قم بتحميل العينة على العمود واترك التعليق يمتص في هلام السيليكا. اعمل بسرعة حتى لا يجف العمود أثناء العملية. اشطف قارورة العينة مرتين بأجزاء صغيرة من الهكسان وانقل كل شطف إلى العمود. استمر في إضافة الهكسان إلى العمود حتى تمتلئ قارورة التجميع تقريبا. اسمح لكل الهكسان بالانتهاء من دخول هلام السيليكا. ثم استبدل القارورة المملوءة بقارورة فارغة للجزء القطبي الأوسط. بعد ذلك ، اشطف قارورة العينة باستخدام DCM وأضفها إلى العمود 3 مرات. استمر في إضافة DCM إلى العمود حتى تمتلئ قارورة التجميع تقريبا. اسمح ل DCM بإنهاء النقع في هلام السيليكا ثم استبدل القارورة المملوءة بقارورة فارغة للجزء القطبي. كرر هذه العملية مع الميثانول.

بمجرد أن تمتلئ القارورة تقريبا ، اترك الميثانول ينتهي من التنقيط في القارورة ثم قم بتغطية جميع القوارير. يحتوي الجزء القطبي المتوسط على الألكينونات المرغوبة ، بينما توجد GDGTs في الجزء القطبي. بالنسبة لعينات الألكينون المتسخة أو المعقدة بشكل خاص ، يجب تنقية الجزء القطبي الأوسط بشكل أكبر مع تقريب اليوريا ، قبل التحليل.

يستخدم كروماتوغرافيا العمود على نطاق واسع في الكيمياء كتقنية تحليلية وتنقية.

تستخدم الأنابيب النانوية الكربونية بشكل متزايد في العديد من الصناعات ، ولكن هناك قلق متزايد بشأن آثارها على صحة الإنسان. إن تغيير خصائص الأنابيب الكربونية الكربونية يغير كيفية تصرفها في الماء والتربة. للتحقيق في مدى احتفاظ الوسائط المسامية مثل الرمل والأوساخ بالأنابيب النانوية الكربونية ، تم إعداد عمود بتربة مسامية كمرحلة ثابتة. أولا ، تم جمع الكسور أثناء تحميل محلول CNT على العمود لتحليل نقل الأنابيب النانوية الكربونية عبر التربة. بعد ذلك ، تم مسح الأنابيب النانوية الكربونية التي لا تزال ممتصة في التربة وتم تحليل الكسور لكمية الأنابيب النانوية الكربونية التي بقيت في التربة. تضفي النتائج نظرة ثاقبة على العلاقة بين وظائف سطح النانو الكربوني وآليات نقلها في البيئة.

يمكن تشغيل كروماتوغرافيا العمود على نطاقات كبيرة وصغيرة ، وبالتالي يتم استخدامه عند تصميم التوليفات للتطبيقات الصناعية. يتمتع حرير العنكبوت بقوة شد وليونة ممتازة ، ولكن لا يمكن حصاده على نطاق صناعي. بعد تخليق بروتين الحرير ، يتم تنقية بروتينات الحرير المؤتلفة عن طريق كروماتوغرافيا التقارب ، حيث تم تصميم المرحلة الثابتة لاحتجاز الجزيء المطلوب فقط. يمنح الغسيل والشطف الشامل أجزاء البروتين النقي اللازمة لتدوير حرير العنكبوت على نطاق واسع.

تتوفر العديد من المراحل الثابتة لكروماتوغرافيا العمود. قد لا تكون المرحلة الثابتة الواحدة مناسبة لجميع المنتجات المحتملة للتوليف ذي النطاق البديل الواسع ، مثل تخليق اليودوازيريدين هذا. يتم خلط المنتج الخام مع مراحل ثابتة مختلفة وتحلل تم تقييمه بواسطة البروتون بالرنين المغناطيسي النووي. نظرا لأن الرنين المغناطيسي النووي للبروتون حساس للغاية ، يمكن فحص العديد من المراحل الثابتة بحثا عن تحلل المنتج باستخدام كمية صغيرة من المنتج الخام. ثم يتم إجراء كروماتوغرافيا العمود بالمرحلة الثابتة المثلى ، مما يسمح بتنقية المركبات الجديدة وعالية التفاعل.

لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لكروماتوغرافيا العمود لتنقية مستخلص الدهون الكلي. سيوضح الفيديو التالي كيفية تنقية الخلائط المعقدة التي تحتوي على الألكينونات.

شكرا للمشاهدة!

Results

تنتج تقنية التنقية هذه ثلاث قوارير مختلفة ، تحتوي كل منها على فئة مركبة مختلفة أو مجموعة من الفئات المركبة. تم تقليل تعقيد أي عينة يتم تحليلها على أداة بشكل كبير. تزيل هذه العملية أيضا المركبات ، مثل الأحماض المنتجة أثناء التصبن ، والتي يمكن أن تلتصق بالفعل بأجزاء من الأدوات ، بسبب تقلبها المنخفض ، مما يقلل من دقتها ودقتها وعمرها.

Applications and Summary

Alkenones and isoprenoidal GDGTs are both very common constituents of marine sediments and can be found across the world's oceans. Alkenones are being increasingly detected in lake sediments, although the organisms responsible for their production are different than in the ocean, and thus the relationship between the U^k'₃₇ ratio and water temperature (calibration) is different from the ocean and even between separate lakes. Isoprenoidal GDGTs are found in some large lakes and just like alkenones, often need a local calibration.

The alkenones and GDGTs we are interested in come out in the ketone and polar fractions, respectively. In marine sediments we often analyze both sea surface temperature (SST) proxies from one sample. This allows the construction of two independent SST records, which show the evolution of water temperature at the core site through time. This comparison, called a multi-proxy approach, often highlights times when the two proxies agree and times when they don't. This agreement or discrepancy itself contains information. If the two proxies agree, maybe the producing organisms occupied the same depth habitat, or maybe they lived at separate depths but a well-mixed water column led to the vertical homogenization of temperature (water usually cools with depth). If the two proxies disagree, it could be that the two populations lived at separate depths; one living in warm, shallow waters and one in cooler, deeper water. Or it could be that the compounds were produced during different times of the year and so reflect the temperatures of different seasons. These questions are created by the analysis of two different SST proxies at the same site and they highlight the care organic geochemists and paleo-climatologists need to take when interpreting their data.

Because of the high relative stability of apolar hydrocarbons, the apolar fraction contains many interesting organic compounds. Alkanes are important constituents of a leaf's outer waxy layer and they are used in sediment records for many reasons. Their average chain length (number of carbon atoms) contains information on the dominance of aquatic vs. terrestrial plants, temperature, and precipitation. The isotopic ratio of carbon in alkanes is related to the C3 vs. C4 plant-type of the plant that produced it and the hydrogen isotopic ratio is related to local to global temperature and precipitation. Steranes and hopanes are also found in the apolar fraction. These biomarkers are the geostable versions of bioactive compounds like hopanoids and steroids, which serve important biochemical roles in prokaryotes and eukaryotes, respectively.

The mid-polarity fraction contains our alkenones. Alkenones are ketones, which are important recorders of ancient surface temperatures via the U^k'₃₇ sea surface temperature proxy. Some ketones also come from the same leaf waxes the alkanes do, although there are generally far less.

The polar fraction contains carboxylic acids, another important constituent in leaf wax, that is slightly less specific and harder to work with than alkanes (low volatility) but can nonetheless relate some of the same information. Glycerol dialkyl glycerol tetraethers (GDGTs) are in the polar fraction and are another important recorder of ancient water and air temperatures.

Transcript

كروماتوغرافيا العمود هي تقنية مرنة لتنقية الخليط المعقد من المركبات الموجودة في الرواسب. تنفصل المخاليط أثناء تحركها عبر العمود ويتم جمعها في كسور ، يحتوي كل منها على فئة كيميائية مختلفة من المركبات. لذلك ، غالبا ما يتم استخدام كروماتوغرافيا العمود كخطوة تنقية إضافية بعد العزل الأولي للمركب المطلوب. قد تكون المستخلصات العضوية مثل مستخلصات الدهون الكلية مخاليط معقدة من العديد من المركبات. تقدم بعض تقنيات التنقية ، مثل التصبن ، مركبات يمكن أن تلحق الضرر بالأدوات التحليلية وبالتالي يجب إزالتها قبل التحليل. هذا الفيديو جزء من سلسلة حول استخراج الدهون وتنقيتها وتحليلها من الرواسب. بمجرد جمع مستخلص الدهون الكلي من عينة رسوبية ، يتم استخدام كروماتوغرافيا العمود لتنقية كل من الألكينونات و GDGTs ، اعتمادا على التحليل المطلوب.

في كروماتوغرافيا العمود ، يتم تحميل خليط من المركبات الكيميائية على مرحلة ثابتة صلبة مثل هلام السيليكا. ثم يتم استخدام مرحلة متحركة مثل المذيب العضوي لإزالة أو إزالة المركبات من العمود. يعتمد الترتيب الذي يتم فيه تصفية المركبات على قوة تفاعلات المركبات مع هلام السيليكا ومع المادة المسيحة.

يتم جمع التحطيف في أجزاء ، يحتوي كل منها على مركبات مختلفة من الخليط. اعتمادا على خصائص المركبات ، قد يوفر مذيب واحد فصلا كافيا ويزيل جميع المركبات ذات الأهمية. خلاف ذلك ، يتم استخدام مذيبات متعددة لتصفية كل مركب ذي أهمية بدوره.

تمتص المركبات القطبية ، التي لها توزيع غير متساو للشحنة ، بقوة إلى هلام السيليكا القطبي ، بينما تمتص المركبات القطبية بشكل ضعيف. المذيبات القطبية لها تقارب أكبر مع هلام السيليكا وبالتالي فهي مواد أقوى من المذيبات القطبية. وبالتالي ، فإن المذيبات القطبية تتخلص فقط من المركبات القطبية ، في حين أن المذيبات القطبية تتخلص من المركبات القطبية والقطبية.

عندما تكون المركبات المرغوبة قطبية معتدلة ، يجب غسل المركبات القطبية من العمود بمذيب قطبي قبل استخدام مذيب قطبي. لتجنب التخلص من المركبات شديدة القطبية غير المرغوب فيها مثل الأحماض ، يجب ألا يكون للشطف القطبي قوة تصفية أكثر من المطلوب للمركب الأكثر قطبا مرغوبا.

الآن بعد أن فهمت مبادئ كروماتوغرافيا العمود ، دعنا ننتقل إلى إجراء لتنقية المؤشرات الحيوية للدهون من مستخلص الدهون الكلي بواسطة كروماتوغرافيا عمود هلام السيليكا.

لإزالة الملوثات العضوية ، احتراق الماصات الزجاجية البورسليكات ، والقوارير الزجاجية البورسليكات ، والصوف الزجاجي لمدة 6 ساعات عند 550 درجة مئوية. بمجرد أن تصبح الأواني الزجاجية جاهزة للاستخدام ، قم بإعداد رف لحمل الماصات والقوارير. احصل على لمبات ماصة ، وملاقط نظيفة ، وملعقة مختبرية ، وهلام السيليكا ، والهكسان ، وثنائي كلورو الميثان ، والميثانول. باستخدام ملاقط نظيفة ، ضع خصلة صغيرة من الصوف الزجاجي في فم الماصة. ادفع الصوف الزجاجي برفق إلى قاع الماصة باستخدام جذع ماصة أخرى لتشكيل سدادة مفكوكة. قم بتحميل هلام السيليكا بحذر في الماصة حتى تمتلئ نصفها. قم بتثبيت الماصة في وضع مستقيم في الحامل. قم بتأمين قارورة زجاجية من البورسليكات سعة 4 مل أسفل طرف الماصة لتجميع النفايات. في قارورة زجاجية أخرى من البورسليكات ، قم بتعليق ما يصل إلى 10 مجم من العينة الجافة من عملية التصبن في الهكسان. إذا التصقت العينة بجدران القارورة ، فقم بصوتنة القارورة لمدة 5 دقائق. يمكن الآن بدء إجراء الكروماتوغرافيا.

لبدء الكروماتوغرافيا ، اغسل عمود هلام السيليكا ب 3 أحجام من الهكسان لإزالة فقاعات الهواء والشوائب. ثم استبدل قارورة النفايات بقارورة فارغة للجزء القطبي. باستخدام ماصة زجاجية ، قم بتحميل العينة على العمود واترك التعليق يمتص في هلام السيليكا. اعمل بسرعة حتى لا يجف العمود أثناء العملية. اشطف قارورة العينة مرتين بأجزاء صغيرة من الهكسان وانقل كل شطف إلى العمود. استمر في إضافة الهكسان إلى العمود حتى تمتلئ قارورة التجميع تقريبا. اسمح لكل الهكسان بالانتهاء من دخول هلام السيليكا. ثم استبدل القارورة المملوءة بقارورة فارغة للجزء القطبي الأوسط. بعد ذلك ، اشطف قارورة العينة باستخدام DCM وأضفها إلى العمود 3 مرات. استمر في إضافة DCM إلى العمود حتى تمتلئ قارورة التجميع تقريبا. اسمح ل DCM بإنهاء النقع في هلام السيليكا ثم استبدل القارورة المملوءة بقارورة فارغة للجزء القطبي. كرر هذه العملية مع الميثانول.

بمجرد أن تمتلئ القارورة تقريبا ، اترك الميثانول ينتهي من التنقيط في القارورة ثم قم بتغطية جميع القوارير. يحتوي الجزء القطبي المتوسط على الألكينونات المرغوبة ، بينما توجد GDGTs في الجزء القطبي. بالنسبة لعينات الألكينون المتسخة أو المعقدة بشكل خاص ، يجب تنقية الجزء القطبي الأوسط بشكل أكبر مع تقريب اليوريا ، قبل التحليل.

يستخدم كروماتوغرافيا العمود على نطاق واسع في الكيمياء كتقنية تحليلية وتنقية.

تستخدم الأنابيب النانوية الكربونية بشكل متزايد في العديد من الصناعات ، ولكن هناك قلق متزايد بشأن آثارها على صحة الإنسان. إن تغيير خصائص الأنابيب الكربونية الكربونية يغير كيفية تصرفها في الماء والتربة. للتحقيق في مدى احتفاظ الوسائط المسامية مثل الرمل والأوساخ بالأنابيب النانوية الكربونية ، تم إعداد عمود بتربة مسامية كمرحلة ثابتة. أولا ، تم جمع الكسور أثناء تحميل محلول CNT على العمود لتحليل نقل الأنابيب النانوية الكربونية عبر التربة. بعد ذلك ، تم مسح الأنابيب النانوية الكربونية التي لا تزال ممتصة في التربة وتم تحليل الكسور لكمية الأنابيب النانوية الكربونية التي بقيت في التربة. تضفي النتائج نظرة ثاقبة على العلاقة بين وظائف سطح النانو الكربوني وآليات نقلها في البيئة.

يمكن تشغيل كروماتوغرافيا العمود على نطاقات كبيرة وصغيرة ، وبالتالي يتم استخدامه عند تصميم التوليفات للتطبيقات الصناعية. يتمتع حرير العنكبوت بقوة شد وليونة ممتازة ، ولكن لا يمكن حصاده على نطاق صناعي. بعد تخليق بروتين الحرير ، يتم تنقية بروتينات الحرير المؤتلفة عن طريق كروماتوغرافيا التقارب ، حيث تم تصميم المرحلة الثابتة لاحتجاز الجزيء المطلوب فقط. يمنح الغسيل والشطف الشامل أجزاء البروتين النقية اللازمة لتدوير حرير العنكبوت على نطاق واسع.

تتوفر العديد من المراحل الثابتة لكروماتوغرافيا العمود. قد لا تكون المرحلة الثابتة الواحدة مناسبة لجميع المنتجات المحتملة للتوليف ذي النطاق البديل الواسع ، مثل تخليق اليودوازيريدين هذا. يتم خلط المنتج الخام مع مراحل ثابتة مختلفة وتحلل تم تقييمه بواسطة البروتون بالرنين المغناطيسي النووي. نظرا لأن الرنين المغناطيسي النووي للبروتون حساس للغاية ، يمكن فحص العديد من المراحل الثابتة بحثا عن تحلل المنتج باستخدام كمية صغيرة من المنتج الخام. ثم يتم إجراء كروماتوغرافيا العمود بالمرحلة الثابتة المثلى ، مما يسمح بتنقية المركبات الجديدة وعالية التفاعل.

لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لكروماتوغرافيا العمود لتنقية مستخلص الدهون الكلي. سيوضح الفيديو التالي كيفية تنقية الخلائط المعقدة التي تحتوي على الألكينونات.

شكرا للمشاهدة!

Tags

كروماتوغرافيا العمود التنقية مستخلص الدهون الكلي المركبات الرواسب الكسور الطبقة الكيميائية تقنيات التنقية التصبن الأدوات التحليلية الألكينونات GDGTs الطور الثابت هلام السيليكا الطور المتحرك اللوت التفاعلات المزيل التصفية