Why is column chromatography used to purify total lipid extracts?

Column chromatography separates complex mixtures of compounds into distinct fractions based on their chemical properties. Total lipid extracts often contain hundreds or thousands of compounds, but researchers typically need only a handful. This technique removes unwanted compound classes and contaminants introduced by upstream purification methods, making instrumental analysis of target compounds like alkenones or GDGTs more reliable and less complicated by extraneous compounds.

How do polar and apolar compounds behave differently on a silica gel column?

Polar compounds have uneven charge distribution and adsorb strongly to polar silica gel, while apolar compounds adsorb weakly. Polar solvents have greater affinity for silica gel and elute both apolar and polar compounds, whereas apolar solvents elute only apolar compounds. This difference allows researchers to selectively remove unwanted compound classes by choosing appropriate eluents in sequence.

What is the purpose of using multiple solvents in column chromatography?

Multiple solvents allow sequential elution of different compound classes based on their polarity. When moderately polar compounds are desired, an apolar solvent first removes apolar impurities, then a polar solvent elutes the target compounds. This staged approach prevents unwanted highly polar compounds from being eluted while ensuring complete recovery of desired compounds with controlled eluting power.

What happens during the fraction collection phase of column chromatography?

As the mobile phase moves through the silica gel column, compounds elute at different rates and are collected in separate vials called fractions. Each fraction contains different chemical classes of compounds based on their interaction strength with the stationary phase and eluent. For lipid biomarker purification, the mid-polar fraction typically contains alkenones while the polar fraction contains GDGTs, depending on the desired analysis target.

Why must glassware be combusted before column chromatography?

Combusting borosilicate glass pipettes, vials, and glass wool at 550°C for 6 hours removes organic contaminants that could interfere with chromatographic separation and compromise sample purity. Clean glassware is essential because any residual organic compounds would mix with the sample and complicate the separation process, potentially contaminating the final purified fractions.

When is further purification needed after column chromatography?

For particularly dirty or complex alkenone samples, the mid-polar fraction must undergo additional purification through urea adduction before instrumental analysis. This secondary purification step removes branched and cyclic compounds that column chromatography alone cannot separate, ensuring the highest purity for accurate paleothermometry measurements and biomarker analysis.

How does column chromatography apply to different research and industrial contexts?

Column chromatography operates at both small and large scales, making it valuable for analytical work and industrial synthesis design. Researchers use it to screen stationary phases for reactive compounds, while industries employ affinity chromatography to purify recombinant proteins like spider silk. Its flexibility allows optimization for diverse products and applications, from environmental monitoring of carbon nanotubes to pharmaceutical synthesis.

تنقية مستخلص الدهون الكلي باستخدام كروماتوغرافيا العمود

0 مشاهدة09:18 دقيقة

1. إعداد وإعداد المواد

الحصول على مستخلص الدهون الكلي (TLE) باستخدام طريقة استخراج المذيبات (Sonication أو Soxhlet أو استخراج المذيبات المتسارع (ASE)).
اجمع ما يلي: الماصات والمصابيح الزجاجية البورسليكات المحترقة ، وهلام السيليكا ، والهكسان ، وثنائي كلورو الميثان (DCM) ، والميثانول.
1. يمكن شراء هذه المواد من أي بائع تجزئة للمواد الكيميائية. يجب أن تكون الكواشف نقية وخالية من الهيدروكربونات.
احصل أيضا على الصوف الزجاجي المحترق وقوارير زجاجية من البورسليكات سعة 4 مل.
تأكد من أن لديك وسيلة لدعم العمود وقوارير التجميع أثناء الإجراء. على سبيل المثال ، حامل مع المشابك ورف حقير. صممت العديد من المختبرات رفوف مخصصة تحتوي على العديد من الأعمدة وقوارير التجميع (الشكل 2). يسمح هذا بتشغيل العديد من الأعمدة في نفس الوقت.

2. الطرق

ابدأ بالعينة الجافة في قارورة سعة 4 مل. إذا كانت العينة تزن أكثر من ~ 10 مجم عندما تجف ، فقد تحتاج إلى تقسيمها قبل تنفيذ الخطوات التالية حيث لا يمكن أن يتفاعل هلام السيليكا إلا مع كتلة محدودة من المواد العضوية.
العينة في كمية صغيرة من الهكسان. هذا هو القطب الأول والأقل من بين المذيبات الثلاثة المستخدمة في هذه التجربة.
إذا كانت هناك عينة عالقة في داخل القارورة ، فقم بصوتنة العينات لمدة 5 دقائق.
قم بتحميل كمية صغيرة من الصوف الزجاجي في الجزء العلوي من الماصة باستخدام مجموعة من الملقط النظيف. ادفع الصوف الزجاجي برفق إلى أسفل الماصة باستخدام ماصة أخرى لتشكيل سدادة.
انقل هلام السيليكا بحذر إلى الماصة حتى تمتلئ نصفها تقريبا.
ضع قارورة جمع النفايات سعة 4 مل أسفل العمود.
انقع هلام السيليكا في الماصة مع 3 أحجام من الهكسان. هذا يرطب العمود ويزيل فقاعات الهواء ويشطف أي شوائب من هلام السيليكا.
بمجرد الانتهاء من الغسيل النهائي ، قم بإزالة قارورة جمع النفايات واستبدلها بقارورة لجمع الجزء القطبي.
انقل العينة بأكملها في الهكسان بعناية إلى العمود باستخدام ماصة. اشطف قارورة العينة مرتين أخريين بكميات صغيرة من الهكسان ، وانقلها إلى العمود. اسمح للهكسان الذي تم نقل العينة فيه لينقع تماما في هلام السيليكا. يجب ألا يجف هلام السيليكا في أي وقت أثناء الإجراء.
استمر في إضافة الهكسان إلى الجزء العلوي من العينة حتى تمتلئ قارورة التجميع أسفل العمود تقريبا (~ 4 مل).
1. اسمح لكل الهكسان بدخول هلام السيليكا قبل البدء بالمذيب التالي.
ضع قارورة التجميع متوسطة القطبية أسفل العمود.
أضف DCM إلى أعلى العمود حتى تمتلئ قارورة التجميع تقريبا. مرة أخرى ، اسمح لكل DCM بالدخول إلى قارورة التجميع قبل بدء المذيب التالي.
ضع قارورة التجميع القطبية أسفل العمود.
أضف الميثانول إلى الجزء العلوي من العمود حتى تمتلئ المجموعة الخسيسة تقريبا.

كروماتوغرافيا العمود هي تقنية مرنة لتنقية الخليط المعقد من المركبات الموجودة في الرواسب. تنفصل المخاليط أثناء تحركها عبر العمود ويتم جمعها في كسور ، يحتوي كل منها على فئة كيميائية مختلفة من المركبات. لذلك ، غالبا ما يتم استخدام كروماتوغرافيا العمود كخطوة تنقية إضافية بعد العزل الأولي للمركب المطلوب. قد تكون المستخلصات العضوية مثل مستخلصات الدهون الكلية مخاليط معقدة من العديد من المركبات. تقدم بعض تقنيات التنقية ، مثل التصبن ، مركبات يمكن أن تلحق الضرر بالأدوات التحليلية وبالتالي يجب إزالتها قبل التحليل. هذا الفيديو جزء من سلسلة حول استخراج الدهون وتنقيتها وتحليلها من الرواسب. بمجرد جمع مستخلص الدهون الكلي من عينة رسوبية ، يتم استخدام كروماتوغرافيا العمود لتنقية كل من الألكينونات و GDGTs ، اعتمادا على التحليل المطلوب.

في كروماتوغرافيا العمود ، يتم تحميل خليط من المركبات الكيميائية على مرحلة ثابتة صلبة مثل هلام السيليكا. ثم يتم استخدام مرحلة متحركة مثل المذيب العضوي لإزالة أو إزالة المركبات من العمود. يعتمد الترتيب الذي يتم فيه تصفية المركبات على قوة تفاعلات المركبات مع هلام السيليكا ومع المادة المسيحة.

يتم جمع التحطيف في أجزاء ، يحتوي كل منها على مركبات مختلفة من الخليط. اعتمادا على خصائص المركبات ، قد يوفر مذيب واحد فصلا كافيا ويزيل جميع المركبات ذات الأهمية. خلاف ذلك ، يتم استخدام مذيبات متعددة لتصفية كل مركب ذي أهمية بدوره.

تمتص المركبات القطبية ، التي لها توزيع غير متساو للشحنة ، بقوة إلى هلام السيليكا القطبي ، بينما تمتص المركبات القطبية بشكل ضعيف. المذيبات القطبية لها تقارب أكبر مع هلام السيليكا وبالتالي فهي مواد أقوى من المذيبات القطبية. وبالتالي ، فإن المذيبات القطبية تتخلص فقط من المركبات القطبية ، في حين أن المذيبات القطبية تتخلص من المركبات القطبية والقطبية.

عندما تكون المركبات المرغوبة قطبية معتدلة ، يجب غسل المركبات القطبية من العمود بمذيب قطبي قبل استخدام مذيب قطبي. لتجنب التخلص من المركبات شديدة القطبية غير المرغوب فيها مثل الأحماض ، يجب ألا يكون للشطف القطبي قوة تصفية أكثر من المطلوب للمركب الأكثر قطبا مرغوبا.

الآن بعد أن فهمت مبادئ كروماتوغرافيا العمود ، دعنا ننتقل إلى إجراء لتنقية المؤشرات الحيوية للدهون من مستخلص الدهون الكلي بواسطة كروماتوغرافيا عمود هلام السيليكا.

لإزالة الملوثات العضوية، احتراق الماصات الزجاجية البورسليكات وقوارير زجاج البورسليكات والصوف الزجاجي لمدة 6 ساعات عند 550 درجة مئوية. بمجرد أن تصبح الأواني الزجاجية جاهزة للاستخدام ، قم بإعداد رف لحمل الماصات والقوارير. احصل على لمبات ماصة ، وملاقط نظيفة ، وملعقة مختبرية ، وهلام السيليكا ، والهكسان ، وثنائي كلورو الميثان ، والميثانول. باستخدام ملاقط نظيفة ، ضع خصلة صغيرة من الصوف الزجاجي في فم الماصة. ادفع الصوف الزجاجي برفق إلى قاع الماصة باستخدام جذع ماصة أخرى لتشكيل سدادة مفكوكة. قم بتحميل هلام السيليكا بحذر في الماصة حتى تمتلئ نصفها. قم بتثبيت الماصة في وضع مستقيم في الحامل. قم بتأمين قارورة زجاجية من البورسليكات سعة 4 مل أسفل طرف الماصة لتجميع النفايات. في قارورة زجاجية أخرى من البورسليكات ، قم بتعليق ما يصل إلى 10 مجم من العينة الجافة من عملية التصبن في الهكسان. إذا التصقت العينة بجدران القارورة ، فقم بصوتنة القارورة لمدة 5 دقائق. يمكن الآن بدء إجراء الكروماتوغرافيا.

لبدء الكروماتوغرافيا ، اغسل عمود هلام السيليكا ب 3 أحجام من الهكسان لإزالة فقاعات الهواء والشوائب. ثم استبدل قارورة النفايات بقارورة فارغة للجزء القطبي. باستخدام ماصة زجاجية ، قم بتحميل العينة على العمود واترك التعليق يمتص في هلام السيليكا. اعمل بسرعة حتى لا يجف العمود أثناء العملية. اشطف قارورة العينة مرتين بأجزاء صغيرة من الهكسان وانقل كل شطف إلى العمود. استمر في إضافة الهكسان إلى العمود حتى تمتلئ قارورة التجميع تقريبا. اسمح لكل الهكسان بالانتهاء من دخول هلام السيليكا. ثم استبدل القارورة المملوءة بقارورة فارغة للجزء القطبي الأوسط. بعد ذلك ، اشطف قارورة العينة باستخدام DCM وأضفها إلى العمود 3 مرات. استمر في إضافة DCM إلى العمود حتى تمتلئ قارورة التجميع تقريبا. اسمح ل DCM بإنهاء النقع في هلام السيليكا ثم استبدل القارورة المملوءة بقارورة فارغة للجزء القطبي. كرر هذه العملية مع الميثانول.

بمجرد أن تمتلئ القارورة تقريبا ، اترك الميثانول ينتهي من التنقيط في القارورة ثم قم بتغطية جميع القوارير. يحتوي الجزء القطبي المتوسط على الألكينونات المرغوبة ، بينما توجد GDGTs في الجزء القطبي. بالنسبة لعينات الألكينون المتسخة أو المعقدة بشكل خاص ، يجب تنقية الجزء القطبي الأوسط بشكل أكبر مع تقريب اليوريا ، قبل التحليل.

يستخدم كروماتوغرافيا العمود على نطاق واسع في الكيمياء كتقنية تحليلية وتنقية.

تستخدم الأنابيب النانوية الكربونية بشكل متزايد في العديد من الصناعات ، ولكن هناك قلق متزايد بشأن آثارها على صحة الإنسان. إن تغيير خصائص الأنابيب الكربونية الكربونية يغير كيفية تصرفها في الماء والتربة. للتحقيق في مدى احتفاظ الوسائط المسامية مثل الرمل والأوساخ بالأنابيب النانوية الكربونية ، تم إعداد عمود بتربة مسامية كمرحلة ثابتة. أولا ، تم جمع الكسور أثناء تحميل محلول CNT على العمود لتحليل نقل الأنابيب النانوية الكربونية عبر التربة. بعد ذلك ، تم مسح الأنابيب النانوية الكربونية التي لا تزال ممتصة في التربة وتم تحليل الكسور لكمية الأنابيب النانوية الكربونية التي بقيت في التربة. تضفي النتائج نظرة ثاقبة على العلاقة بين وظائف سطح النانو الكربوني وآليات نقلها في البيئة.

يمكن تشغيل كروماتوغرافيا العمود على نطاقات كبيرة وصغيرة ، وبالتالي يتم استخدامه عند تصميم التوليفات للتطبيقات الصناعية. يتمتع حرير العنكبوت بقوة شد وليونة ممتازة ، ولكن لا يمكن حصاده على نطاق صناعي. بعد تخليق بروتين الحرير ، يتم تنقية بروتينات الحرير المؤتلفة عن طريق كروماتوغرافيا التقارب ، حيث تم تصميم المرحلة الثابتة لاحتجاز الجزيء المطلوب فقط. يمنح الغسيل والشطف الشامل أجزاء البروتين النقي اللازمة لتدوير حرير العنكبوت على نطاق واسع.

تتوفر العديد من المراحل الثابتة لكروماتوغرافيا العمود. قد لا تكون المرحلة الثابتة الواحدة مناسبة لجميع المنتجات المحتملة للتوليف ذي النطاق البديل الواسع ، مثل تخليق اليودوازيريدين هذا. يتم خلط المنتج الخام مع مراحل ثابتة مختلفة وتحلل تم تقييمه بواسطة البروتون بالرنين المغناطيسي النووي. نظرا لأن الرنين المغناطيسي النووي للبروتون حساس للغاية ، يمكن فحص العديد من المراحل الثابتة بحثا عن تحلل المنتج باستخدام كمية صغيرة من المنتج الخام. ثم يتم إجراء كروماتوغرافيا العمود بالمرحلة الثابتة المثلى ، مما يسمح بتنقية المركبات الجديدة وعالية التفاعل.

لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لكروماتوغرافيا العمود لتنقية مستخلص الدهون الكلي. سيوضح الفيديو التالي كيفية تنقية الخلائط المعقدة التي تحتوي على الألكينونات.

شكرا للمشاهدة!

المصدر: مختبر جيف سالاكوب - جامعة ماساتشوستس أمهيرست

غالبا ما يكون نتاج استخراج المذيبات العضوية ، وهو مستخلص الدهون الكلي (TLE) ، مزيجا معقدا من مئات…

Browse More Videos

GDGTs