$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
الفيروسات هي جزيئات بيولوجية معدية مسؤولة عن العديد من الأمراض ، البرد والإنفلونزا ، والتهاب الكبد وفيروس نقص المناعة البشرية.
الفيروسات هي جزيئات بيولوجية تتكون إما من جينوم الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ، ملفوفة داخل طبقة بروتينية تعرف باسم القفيصة ، وأحيانا مع غلاف دهني إضافي. ليس للفيروسات قدرة أيضية أو إنجابية من تلقاء نفسها ، ويجب أن تغزو الخلايا الحية وتختطف آلاتها الخلوية من أجل عمل المزيد من النسخ من نفسها.
يمكن أن تصاب كل من الخلايا بدائية النواة ، مثل البكتيريا ، والخلايا حقيقية النواة ، مثل تلك الموجودة في البشر ، بفئات معينة من الفيروسات. على وجه التحديد ، العاثيات هي فيروسات تصيب البكتيريا. على سبيل المثال ، القولونيات هي تلك العاثيات التي تصيب الإشريكية القولونية ، وهي بكتيريا معوية شائعة ، يمكن أن تسبب بعض سلالاتها التسمم الغذائي ، وهي مؤشر على تلوث البراز لإمدادات المياه.
في حين أن العاثيات نفسها غير معروفة عموما بأنها مسببة للأمراض لدى البشر ، إلا أن هناك أدلة على أنها مؤشرات بديلة موثوقة للفيروسات المعوية المسببة للأمراض والتي تنتقل أيضا عن طريق البراز ولكن يصعب فحصها. إن توفر طرق سريعة وغير مكلفة نسبيا لتعداد العاثيات يجعلها أداة جذابة لتقييم تلوث البراز في العينات البيئية.
سيقدم هذا الفيديو المبادئ الكامنة وراء تعداد العاثيات. إظهار بروتوكول لقياس العاثيات ، المعروف باسم مقايسة البلاك ؛ وأخيرا ، استكشاف العديد من تطبيقات العلوم البيئية للكشف عن العاثيات والفيروسات الأخرى وعدها.
يجب أن تتطفل العاثيات ، مثل جميع الفيروسات ، على الخلايا الحية ، في هذه الحالة البكتيريا ، من أجل التكاثر.
تقوم العاثيات بذلك عن طريق الهبوط والالتصاق بسطح الخلية البكتيرية وحقن موادها الوراثية في الخلية. بمجرد دخوله إلى الخلية ، يتم تكرار الجينوم الفيروسي ويتم إنتاج مكونات البروتين في القفيصة الفيروسية ، وكلاهما باستخدام الآلية الكيميائية الحيوية للخلية المضيفة. بمجرد تجميع جزيئات العاثيات ، يتم إطلاقها من البكتيريا ، غالبا عن طريق تحلل المضيف وانفجارها ، مما يؤدي إلى قتل الخلية المضيفة في هذه العملية.
تستفيد الطريقة المستخدمة على نطاق واسع لتحديد تركيز العاثيات في العينة من هذا النشاط اللايتي. في هذه التقنية ، يتم خلط العاثية من العينة مع البكتيريا والأجار الناعم. يسكب هذا الخليط على أطباق بتري مع أجار منتظم كركيزة ، وتشكل الطبقة العليا تراكبا.
البكتيريا بتركيز عال لدرجة أنها تشكل عشبا مستمرا. يجب الحصول على البكتيريا من الثقافة التي هي في مرحلة النمو اللوغاريتمية ، للتأكد من أن كل بكتيريا تصيبها العاثيات على قيد الحياة وتسمح للعاثية بإنتاج ذرية.
عندما يصيب جسيم العاثية البكتيريا ويحللها ، فإن ذرية العاثية تنتشر إلى الخلايا البكتيرية القريبة وتستمر في العدوى. يقيد الأجار الناعم انتشار جزيئات العاثية. في النهاية ، سيتم تشكيل منطقة مقاصة ، تعرف باسم اللويحات.
إذا تم تخفيف العاثية إلى تركيز منخفض بما فيه الكفاية ، فيمكن ملاحظة لويحات فردية منفصلة على العشب البكتيري. يمكن عدها واستخدامها لحساب عدد وحدات تشكيل البلاك ، أو PFUs ، من العاثية لكل مل من العينة الأصلية.
الآن بعد أن فهمت كيف تصيب العاثيات البكتيريا وكيف يمكن استخدام هذا النشاط لقياس تركيز العاثيات ، دعنا ننتقل إلى بروتوكول لاستخدام اختبار البلاك لتعداد العاثيات في عينات المياه البيئية.
قبل يوم واحد من إجراء الفحص ، قم بتلقيح مستعمرة من الإشريكية القولونية سلالة ATCC 15597 في 100 مل من مرق الصويا التربتيكاز في قارورة إرلينماير سعة 250 مل. احتضنها مع الاهتزاز في 35؟ ج بين عشية وضحاها.
قبل 3 ساعات من الفحص ، قم بتلقيح 1 مل من ثقافة الإشريكية القولونية بين عشية وضحاها في 100 مل من المرق. ضع هذه الثقافة الجديدة في حمام مائي مهتز عند درجة حرارة تتراوح بين 35 و 37 درجة مئوية. هذا يضمن أن البكتيريا في مرحلة النمو اللوغاريتمية عندما يبدأ الفحص.
لبدء فحص البلاك ، قم بإجراء تخفيفات تسلسلية 10 و 100 أضعاف لعينة الماء ، باستخدام 9 مل من المخزن المؤقت Tris.
باستخدام حمام بخار ، قم بإذابة ثلاثة أنابيب سعة 5 مل من أجار ناعم بنسبة 0.7٪ ، إما فول الصويا أو أجار المغذيات. بمجرد الذوبان ، ضعه في حمام مائي عند 45 إلى 48؟ C لمدة 15 دقيقة على الأقل حتى تنخفض درجة حرارة الأجار إلى 45 درجة مئوية
إلى الأنبوب الأول من الأجار الناعم ، أضف 1 مل من ثقافة الإشريكية القولونية المعدة مسبقا و 1 مل من عينة الماء غير المخففة. قم بإزالة الأنبوب من الحمام المائي وقم بتأرجح برفق بين يديك لمدة 2-3 ثوان لخلط التعليق.
يسكب الأجار الناعم فوق طبق بتري معد مسبقا مع فول الصويا أو أجار المغذيات. قم بتدوير اللوحة بسرعة لتنتشر ، وتأكد من أنها تغطي السطح بالكامل.
كرر التلقيح والطلاء للأنبوب الآخر ، باستخدام 1 مل من كل عينة مخففة.
بمجرد أن يصلب الأجار العلوي ، اقلب الأطباق واحتضانها عند 37؟ C لمدة 48 ساعة.
بعد الحضانة ، احسب عدد الأوبئة على كل لوحة. من العد ، احسب تركيز العاثية في العينة الأصلية
على سبيل المثال ، إذا تم الحصول على 9 لويحات من لوحة التخفيف 10 أضعاف ، فهناك 9 في 10 مقسومة على 1 مل ، أو 90 PFUs / مل من القرص في عينة الماء الأصلية.
الآن بعد أن رأيت كيفية إجراء فحوصات لويحات العاثية ، دعنا نلقي نظرة على كيفية استخدام فحوصات البلاك لتعداد العاثيات وأنواع أخرى من الفيروسات من مجموعة متنوعة من المصادر.
يمكن استخدام الطرق القائمة على فحص البلاك لعزل العاثيات من عينات بيئية مختلفة مثل التربة. في هذا المثال ، جمع الباحثون أولا العاثيات من التربة عن طريق الترشيح. ثم تم استخدام العاثية لإصابة بكتيريا التربة الشائعة Arthrobacter في مقايسة البلاك. تم قطف العاثيات من اللوحات الفردية وخطها على ألواح أجار جديدة ، ثم تم تغطيتها بأجار علوي يحتوي على البكتيريا. ينخفض تركيز العاثيات على طول الخط ، بحيث يمكن الحصول على لويحات منفصلة ، من المحتمل أن تكون من نوع واحد من العاثيات. يمكن بعد ذلك اختيار هذه اللويحات الفردية لتحليل العاثيات الموجودة بداخلها.
بالإضافة إلى العاثيات ، يمكن أيضا إجراء فحوصات اللويحات مع فيروسات أخرى ، بما في ذلك تلك ، مثل الأنفلونزا ، التي تصيب الثدييات. للقيام بذلك ، تنمو خلايا الثدييات أولا كطبقات أحادية في أطباق زراعة الأنسجة. ثم تضاف الوسائط التي تحتوي على الفيروسات إلى الخلايا للسماح بحدوث العدوى ، قبل أن يتم تراكب الخلايا بوسط ثابت مثل الاغاروز الشبيه بالهلام. بعد فترة حضانة يمكن أن تستمر لمدة تصل إلى أسبوعين ، يتم تثبيت الخلايا المصابة وتلطيخها للسماح بتصور اللويحات وعدها.
أخيرا ، بالإضافة إلى العينات التي تم جمعها من البيئة ، فإن فحوصات البلاك مفيدة للكشف عن الفيروسات في عينات الأنسجة من الأفراد المصابين وتعداد الفيروسات. هنا ، حصل الباحثون على أنسجة الرئة وتجانسها من الفئران المصابة بفيروسات جاما الهربس. ثم تم استخدام هذا المتجانس المحتوي على الفيروس لإصابة زراعة خلايا الثدييات. يمكن بعد ذلك حساب عدد اللويحات لتوفير تقدير للعيار الفيروسي في أنسجة الرئة المصابة.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول الكشف عن العاثيات في العينات البيئية. يجب أن تفهم الآن علم الأحياء الأساسي للعاثيات ، وكيفية إجراء فحص البلاك لقياس العاثيات في عينة بيئية ، وكيف يمكن استخدام فحوصات البلاك لدراسة العاثيات والفيروسات الأخرى في العينات البيئية أو السريرية. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
