$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
طريقة الإضافة القياسية هي تقنية تحليل كمي تستخدم لتقليل تأثيرات المصفوفة التي تتداخل مع إشارات القياس التحليلية.
غالبا ما يتم توضيح تركيزات المكونات غير المعروفة من خلال مجموعة من التقنيات التحليلية ، مثل التحليل الطيفي للضوء وقياس الطيف الكتلي والكيمياء الكهربائية. ومع ذلك ، يمكن أن يتأثر القياس بمكونات أخرى في العينة ، تسمى المصفوفة ، وتسبب تقليلا أو تحسينا غير مقصود للإشارة ، تسمى تأثيرات المصفوفة. يمكن أن تؤدي هذه التأثيرات إلى تحريف النتائج وتسبب أخطاء كبيرة في التحليل.
يمكن استخدام طريقة الجمع المعيارية لتقليل تأثيرات المصفوفة على إشارات القياس. يتم ذلك عن طريق إضافة أحجام دقيقة لمحلول تحليلي معروف إلى العينة.
سيقدم هذا الفيديو أساسيات طريقة إضافة المعايير ، ويوضح كيفية إجراء هذه التقنية في المختبر باستخدام قياس الفلورة.
يمكن أن تنشأ تأثيرات المصفوفة في عينات معقدة حيث يتفاعل عدد من الجزيئات الأخرى مع المادة التحليلية. على سبيل المثال ، يمكن أن يحدث هذا عندما ترتبط الجزيئات أو تتكتل مع المادة التحليلية ، وبالتالي تغير قدرتها على التألق. أو قد تغير المصفوفة القوة الأيونية للمحلول الكلي ، مما يؤدي إلى تغيير الخصائص المحددة للمادة التحليلية.
للتخفيف من هذه التأثيرات باستخدام طريقة الجمع القياسي ، تتم إضافة مجموعة من أحجام محلول التحليل القياسي - إلى أحجام متساوية من العينة. ثم يتم جعل أحجام المحلول متساوية باستخدام المذيب.
بعد ذلك ، يتم قياس الإشارة للعينات مع الإضافة القياسية وبدونها. يتم رسم البيانات ككثافة مقابل مقدار المعيار المضاف إلى العينة ، بدلا من منحنى المعايرة الكلاسيكي. يتم تحديد التركيز الفعلي للمادة التحليلية في أي قارورة معينة من خلال المعادلة التالية. ستساوي الاستجابة الآلية بعض النقاط الثابتة في تركيز المادة التحليلية. تأخذ المعادلة الناتجة الشكل الخطي y = mx + b. وبالتالي ، عندما يتم استقراء المؤامرة إلى امتصاص صفري ، يكون الاعتراض مساويا للتركيز غير المعروف للعينة.
يجب أن يكون مخطط الإشارة خطيا فوق نطاق التركيز المثير للقلق. كما ينبغي ألا يختلف التداخل مع تغير نسبة المادة المراد تحليلها إلى مصفوفة العينة. أخيرا ، يجب ألا تولد المصفوفة نفسها أي إشارات قياس من تلقاء نفسها.
تدرس التجربة التالية الألومنيوم ، وهو نوع غير فلوري ، من خلال تفاعله مع 8-hydroxyquinoline ، أو 8HQ ، لتشكيل مركب ALQ3 الفلوري.
يتم قياس تألق مركب الألومنيوم في مذيب عضوي ، ثم يرتبط بتركيز محلول الألمنيوم الأصلي. هذا النهج شائع في تحليل أيونات المعادن.
الآن بعد أن تم تحديد أساسيات طريقة الإضافة القياسية ، وشرح أساسيات التجربة ، دعنا ننفذ هذه التقنية في المختبر.
أولا ، قم بإعداد محلول مخزون الألمنيوم 100 جزء في المليون في الماء ، ثم استخدمه لتحضير محلول قياسي 1 جزء في المليون.
بعد ذلك ، أضف 2 جم من 8-hydroxyquinoline ، أو 8HQ ، إلى قارورة حجمية سعة 100 مل.
أضف 5.74 مل من حمض الخليك الجليدي بعناية ، ثم خفف إلى علامة 100 مل بالماء منزوع الأيونات. تمكن هذه الخطوة 8HQ من الذوبان في المرحلة المائية.
بعد ذلك ، قم بإعداد المخزن المؤقت عن طريق إضافة 20 جم من أسيتات الأمونيوم و 7 مل من هيدروكسيد الأمونيوم بنسبة 30٪ إلى زجاجة 100 مل وقم بتخفيفها. تحقق من الرقم الهيدروجيني باستخدام عصا مؤشر الأس الهيدروجيني. يساعد هذا المخزن المؤقت على تحييد الحمض في محلول 8HQ عند دمجه.
تشمل الكواشف الأخرى اللازمة كبريتات الصوديوم اللامائية والكلوروفورم من الدرجة الطيفي.
الآن إعداد العينات, في هذه الحالة عن طريق استخراج العينة المائية في المرحلة العضوية باستخدام استخراج السائل السائل.? ضع ستة قمع منفصل سعة 125 مل على حلقات حامل حلقة داخل الغطاء. تأكد من أن جميع الأواني الزجاجية نظيفة بدقة ، لأن الأواني الزجاجية المتسخة ستحرف النتائج. قم بتسمية مسارات التحويل بالتتابع بأنها "فارغة" و "0" و "1" و "2" و "3" و "4".
باستخدام ماصة ، أضف 25 مل من محلول الألمنيوم غير المعروف إلى كل من القمع الفاصل الخمسة المسمى "0" إلى "4". قم بإعداد الفراغ بإضافة 25 مل من الماء منزوع الأيونات إلى القمع المسمى "فارغ".
بعد ذلك ، أضف 1 و 2 و 3 و 4 مل من الحل القياسي 1 جزء في المليون إلى مسارات التحويل المرقمة المقابلة. لا تضيف أي حل قياسي إلى مسارات التحويل الفارغة أو 0.
أضف 1 مل من محلول 8HQ و 3 مل من محلول المخزن المؤقت لكل من مسارات التحويل الستة.
قم بإجراء استخراج سائل سائل عن طريق إضافة 10 مل من الكلوروفورم إلى كل قارورة. هز القمع بقوة ، وأحيانا تنفيس القمع لتحرير تراكم الضغط. ضع القمع مرة أخرى في الحلقة ، واترك طبقات السائل تنفصل.
بعد ذلك ، اجمع مرحلة الكلوروفورم في دورق نظيف وجاف ومصنف سعة 100 مل. نظرا لأن الكلوروفورم له كثافة أعلى من الماء ، فهو الطبقة السفلية في القمع.
انقل مستخلص الكلوروفورم إلى قارورة حجمية سعة 25 مل ، وقم بتغطية كل قارورة لمنع التبخر.
قم بإجراء استخراج سائل سائل ثان على المحلول المائي المتبقي ، عن طريق إضافة 10 مل من الكلوروفورم إلى كل قمع. هز القمع ، كما كان من قبل ، لنقل أي مادة تحليلية متبقية إلى مرحلة الكلوروفورم. يجب ألا يتبقى لون أصفر في المرحلة المائية العليا.
كرر الاستخراج الثاني لكل قمع ، ثم اجمع مراحل الكلوروفورم في أكواب مصنفة مقابلة. صب الكلوروفورم الذي تم جمعه في قوارير حجمية خاصة بها ، وقم بتخفيفه إلى العلامة بالكلوروفورم الطازج.
لإزالة المياه النزرة ، أضف حوالي 1 جم من كبريتات الصوديوم اللامائية إلى كل من الأكواب الستة سعة 100 مل. انقل المحاليل مرة أخرى إلى أكوابها الخاصة بها ، وقم بتدويرها لتسهيل جفاف العينة.
صب مستخلص الكلوروفورم في خلية مقياس فلور الكوارتز.
قم بإعداد مقياس الفلور وفقا لتعليمات الشركة المصنعة واضبط الجهد على 400 فولت. بعد ذلك ، افتح برنامج الحصول على البيانات على الكمبيوتر.
استخدم العينة 2 لتحديد أفضل أطوال موجية للإثارة والانبعاث. اضبط الطول الموجي للانبعاث على 500 نانومتر ، وقم بإجراء مسح الإثارة من 335 × 435 نانومتر ، بسرعة مسح 2 نانومتر / ثانية.
من مخطط التألق ، حدد الحد الأقصى للطول الموجي للإثارة. اضبط الأداة على قيمة الطول الموجي للإثارة ، في هذه الحالة 399 نانومتر.
بعد ذلك ، حدد الطول الموجي للانبعاث عن طريق إجراء مسح من 450 × 550 نانومتر. من مخطط التألق الناتج ، حدد الحد الأقصى للطول الموجي واضبط الطول الموجي للانبعاث ، في هذه الحالة 520 نانومتر.
قم بقياس كل عينة ، بما في ذلك الفراغ عند الطول الموجي للإثارة والانبعاث المحدد. سجل كل قراءة لشدة التألق.
اطرح التألق المقاس للعينة الفارغة من كل عينة من العينات ال 5 الأخرى.
ارسم شدة التألق لكل عينة من العينات الخمس مقابل كمية الألمنيوم المضافة إلى العينة. حدد قيمة المربعات الصغرى للمؤامرة الناتجة ، وسجل المنحدر والاعتراض.
أسفرت مخطط شدة التألق مقابل كمية الألمنيوم المضافة عن خط مربع أقل كما هو موضح. يمكن بعد ذلك حساب كمية الألمنيوم في العينة باستخدام هذا الخط. نظرا لأن كمية المجهول المضافة كانت 25 مل ، فإن القيمة المحددة ، 2.916 جم مقسومة على 25 مل. هذا يعطي نتيجة نهائية قدرها 0.117 جم / مل ، أو 0.117 جزء في المليون. هذا قريب جدا من القيمة المعروفة البالغة 0.110 جزء في المليون.
الآن ، دعونا نلقي نظرة على بعض التقنيات التحليلية الأخرى التي يمكن أن يكون لها نتائج منحرفة بسبب تأثيرات المصفوفة.
التحليل الطيفي للامتصاص الذري هو طريقة تحليلية تقيس امتصاص الضوء بواسطة مادة تحليلية مستهدفة في الطور الغازي. بالنسبة لمعظم العينات ، يمكن أن يكون منحنى المعايرة البسيط المتعلق بالامتصاص بتركيز العينة بمثابة طريقة موثوقة لتحديد تركيز غير معروف.
ومع ذلك ، يمكن أن تفقد هذه التقنية الدقة إذا تفاعلت مكونات أخرى من الخليط مع المادة التحليلية المستهدفة وتمنع أو تعزز الامتصاص. يمكن استخدام طريقة الإضافة القياسية في هذه الحالة لحساب تأثيرات هذه التفاعلات ، خاصة في العينات التي لا يمكن فيها إزالة المصفوفة قبل التحليل.
تلعب معايرة الجهاز دورا مهما في دقة القياس. غالبا ما تستخدم طريقة الإضافة القياسية للمساعدة في معايرة الأدوات مثل ICP-MS. ICP-MS هي طريقة مقارنة ، مما يعني أن قياس عينة غير معروفة يعتمد على قياس معيار كيميائي.
وبالتالي ، فإن عدم اليقين في قياس المجهول لا يمكن أن يكون أفضل من عدم اليقين في المعايرة. وبالتالي يمكن استخدام طريقة الإضافة القياسية لإنشاء منحنى معايرة أكثر دقة من الطريقة القياسية ، ويأخذ في الاعتبار تفاعلات المصفوفة في العينة.
يتم تحليل العديد من الجزيئات البيولوجية باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ، أو HPLC. HPLC هي تقنية تفصل وتحلل الخلائط المعقدة بناء على خصائص الجزيء مثل القطبية والشحنة والحجم. يتيح الوقت الذي يغادر فيه التحليل العمود للمستخدم تحديد كل مكون في الخليط.
يمكن أن تتفاعل الجزيئات البيولوجية في كثير من الأحيان في خليط ، وتتأثر بشكل كبير بالمصفوفة المعلقة فيها. في كثير من الأحيان ، يتم استخدام طريقة الإضافة القياسية لإنشاء منحنى معايرة يفسر هذه التأثيرات.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لطريقة الإضافة القياسية. يجب أن تفهم الآن كيفية تنفيذ هذه التقنية لحساب تأثيرات المصفوفة في تحليل العينات.
شكرا للمشاهدة!
