عزل البكتيريا البرازية من عينات المياه عن طريق الترشيح

الترشيح الغشائي والاستزراع اللاحق للبكتيريا التي تم جمعها تقنية مفيدة لتقييم جودة ونظافة مصدر المياه.

جودة المياه المخصصة للاستخدام في البيئات الزراعية أو الترفيهية أو المنزلية ذات أهمية كبيرة ، نظرا لاحتمال تفشي الأمراض المنقولة بالمياه. إذا كانت المياه ملوثة بالبراز من أو البشر ، فقد تنتشر الطفيليات أو البكتيريا أو الفيروسات المسببة للأمراض إلى مضيفين جدد عند ابتلاعها. ولذلك فإن رصد مصادر المياه لمثل هذه الكائنات المسببة للأمراض أمر بالغ الأهمية لضمان الصحة العامة.

إن العدد الهائل وتنوع مسببات الأمراض البرازية الفموية التي قد تكون موجودة في مصدر المياه يجعل من غير العملي فحص كل منها بشكل مستقل وعلى أساس منتظم. بدلا من ذلك ، تستخدم المقايسات الميكروبيولوجية الشائعة لجودة المياه بكتيريا مؤشر القولونيات. لمزيد من المعلومات حول هذه العملية ، انظر فيديو هذه المجموعة حول الكائنات الحية المؤشرة.

سيوضح هذا الفيديو عملية الترشيح الغشائي على عينة مياه بيئية ، ويوضح كيفية استزراع عدة أنواع من بكتيريا مؤشر البراز بما في ذلك القولونيات الكلية ، والقولونيات البرازية ، والمكورات المعوية البرازية ، ويصف كيفية التحقق من وجود تلوث براز.

تقنية الترشيح الغشائي الضغط السلبي لسحب عينات المياه عبر المرشح واحتجاز البكتيريا. المرشح عبارة عن غشاء متخصص بمتوسط حجم مسام لا يقل عن 0.45 ميكرومتر يسمح بالتقاط البكتيريا ، والتي يبلغ حجمها عادة حوالي 1 ميكرومتر. بعد الترشيح ، يتم تطبيق الغشاء على وسط نمو الاغاروز ، ويتم احتضانه في الظروف المناسبة لزراعة الكائنات الحية الدقيقة المستهدفة.

هذه التقنية هي الأكثر مثالية لمصادر التعكر المنخفضة مثل مياه الشرب أو حمامات السباحة أو البحيرات والخزانات. يمكن أن يؤدي الماء الذي يحتوي على نسبة عالية من الجسيمات إلى تلوث أو انسداد المرشح ، مما يحد من الحجم الذي يمكن معالجته. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الترشيح الغشائي ليس عمليا لمصادر المياه التي تحتوي على أعداد كبيرة من الخلفية ، أو البكتيريا غير القولونية ، مثل مياه الصرف الصحي الخام ، حيث يمكن أن يزيد ذلك من صعوبة تعداد القولونيات المستهدفة عند الاستزراع والحضانة.

بمجرد أن يتم احتجاز العينات البكتيرية في الفلتر، يمكن نقلها إلى ألواح النمو لتحديد أنواع البكتيريا المؤشرة الموجودة في عينات المياه. يختار الطلاء على أنواع الوسائط المختلفة أنواعا مختلفة من البكتيريا ، ويمكن أن يسمح بالتعرف السريع.

بعد النمو على صفائح محددة للثقافة ، يمكن إجراء مزيد من التأكيد على هويات بكتيريا المؤشر باستخدام تقنيات مثل التقاط المستعمرات في الوسائط السائلة واستخدام أنابيب دورهام لالتقاط الغازات ، والتي يجب إنتاجها فقط في وجود القولونيات البرازية أو القولونيات الكلية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تأكيد المكورات المعوية البرازية المشتبه بها من خلال مزيج من تلطيخ الجرام الإيجابي ، جنبا إلى جنب مع اختبار بيروكسيد الهيدروجين الكاتلاز السلبي.

الآن بعد أن أصبحنا على دراية بالمبادئ الكامنة وراء الترشيح الغشائي لعينات المياه ، دعنا نلقي نظرة على كيفية تنفيذ هذا الإجراء.

لبدء الإجراء ، قم أولا بجمع عينات المياه من مصادر مياه الاختبار ذات الأهمية. تأكد من جمع العينات في زجاجات معقمة سعة 1 لتر. بمجرد اكتمال الجمع ، ضع العينات على الجليد ، وانقلها إلى المختبر لتحليلها الميكروبي.

لبدء التحليل ، قم أولا بتعقيم مشعب الترشيح الغشائي بعد ذلك ، قم بتوصيل المشعب بمضخة تفريغ وقارورة نفايات الترشيح التي تحتوي على مبيض.

ملقط الإيثانول المعقم باللهب وإزالة غشاء شبكي معقم من العبوة. ضع الفلتر في وسط منطقة الترشيح الغشائي للمشعب ، وقم بتطبيق قمع مرشح معقم على الوحدة ، ثم ثبته في مكانه.

قم بقياس الحجم المطلوب من مياه الاختبار في القمع. ضع فراغا جزئيا لسحب عينة الاختبار من خلال الفلتر. سيتم احتجاز المواد الصلبة العالقة ، بما في ذلك البكتيريا والمواد العضوية الأخرى ، التي يزيد حجمها عن 0.45 ميكرومتر على المرشح أو داخله ، بينما ستمر الجسيمات الأصغر والفيروسات والمواد الصلبة الذائبة إلى قارورة النفايات التي تحتوي على مواد التبييض.

بعد مرور العينة عبر الفلتر ، اشطف الجزء الداخلي من القمع ب 25 مل من الماء المعقم 3 مرات ، مما يسمح بالمرور عبر الفلتر. عند اكتمال الشطف النهائي ، افصل المكنسة الكهربائية وقم بإزالة القمع من المشعب.

بعد ذلك ، قم بتعقيم ملقط الإيثانول باللهب وقم بإزالة مرشح الغشاء على الفور من الوحدة. ضعه على لوحة النمو المناسبة للكائن الحي الدقيق المستهدف باستخدام حركة متدحرجة لضمان التلامس الكامل مع السطح وتجنب احتجاز فقاعات الهواء.

لمعالجة كل عينة أخرى ، قم بتعقيم مشعب الفولاذ المقاوم للصدأ واستخدم قمعا معقما لمنع التلوث المتبادل. أخيرا ، ضع الألواح في حاضنة لفترة الحضانة المناسبة.

بعد فترة الحضانة ، قم بإزالة الألواح من الحاضنة للتعداد. إذا أمكن ، قم بإجراء عمليات العداء تحت تكبير منخفض الطاقة باستخدام مصدر ضوء أبيض بارد. لتحديد إجمالي القولونيات ، حدد عد المستعمرات التي تظهر باللون الوردي إلى الأحمر الداكن ، ولها لمعان سطح معدني يغطي المستمرة كليا أو جزئيا. قد تظهر المستعمرات القولونية الكلية غير النمطية باللون الأحمر الداكن أو المخاطي أو النواة بدون لمعان.

المستعمرات التي تظهر باللون الأزرق أو الأبيض أو عديم اللون أو الوردي بدون لمعان غير قولونية ، ولا ينبغي تضمينها في إجمالي عدد القولونيات.

ستظهر مستعمرات القولونيات البرازية كظلال مختلفة من اللون الأزرق ، ويجب احتسابها كفئة منفصلة. عادة ما تكون المستعمرات القولونية غير البرازية رمادية إلى كريمية اللون ، ويجب أيضا تسجيلها في فئة فردية. أخيرا ، تتراوح مستعمرات المكورات المعوية البرازية من اللون الوردي إلى الأحمر الداكن ويجب احتسابها بشكل منفصل.

للتحقق من إجمالي مستعمرات القولونيات ، قم بتطبيق حلقة تلقيح معقمة ومبردة على مستعمرة واحدة ذات أهمية. انقل المستعمرة المختارة إلى وعاء زجاجي يحتوي على مرق لوريل تريبتوز وأنبوب دورهام. بعد ذلك ، ضع الثقافات في حاضنة. إن وجود العكارة جنبا إلى جنب مع إنتاج الغاز الذي تم التقاطه بواسطة أنبوب دورهام يتحقق من أن المستعمرة هي القولونيات الكاملة.

للتحقق من القولونيات البرازية ، انقل المستعمرات باللون الأزرق إلى أوعية زجاجية تحتوي على وسط EC معقم وأنبوب دورهام. ضع الأنابيب الملقحة في حاضنة. بعد الحضانة ، تؤكد اللقاحات العكرة بالتزامن مع إنتاج الغاز أن المستعمرة هي القولونيات البرازية.

لتأكيد المكورات المعوية البرازية ، انقل المستعمرات المشتبه بها ذات التشكل الصحيح إلى ألواح أجار تسريب الدماغ والقلب ، واحتضنها. بعد ذلك ، انقل النمو من مستعمرة معزولة في BHIA إلى شريحتين زجاجيتين معقمين.

أضف 2-3 قطرات من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ إلى إحدى الشرائح الزجاجية. يشير الإنتاج السريع للغاز إلى بكتيريا موجبة الكاتلاز مثل Citrobacter. بكتيريا المكورات المعوية البرازية سلبية الكاتلاز. لذلك ، لا يلاحظ أي فقاعات. بالنسبة للمستعمرات سالبة الكاتلاز التي لا تظهر فقاعات ، قم بإجراء صبغة جرام. كمكورات معوية برازية ، يجب أن تظهر موجبة الجرام ، بيضاوية الشكل ، ويتم تجميعها في الغالب في أزواج أو سلاسل قصيرة.

يشير العثور على أي من هذه البكتيريا المؤشرة في مصدر المياه إلى وجود تلوث. وإذا تبين أن أكثر من 5٪ من العينات ملوثة على مدى شهر واحد، فقد يعتبر المصدر غير صالح للاستهلاك البشري.

يستخدم الترشيح الغشائي بشكل شائع في عدد من التطبيقات البيولوجية ، ويمكن أيضا اكتشاف الكائنات الحية ذات المؤشرات البرازية من خلال الإجراءات التجريبية الأخرى. يتم استكشاف بعض هذه التطبيقات هنا.

يمكن أيضا استخدام الترشيح الغشائي في التقاط الفيروسات من عينات المياه. نظرا لأن الفيروسات ستكون موجودة عادة عند مستويات منخفضة جدا ، يجب تركيز عينات المياه من أجل التقاطها لتحليلها. يمكن بعد ذلك إطلاق الفيروسات التي تم التقاطها من المرشحات ، وتحديدها باستخدام تقنيات مثل فحوصات عدوى زراعة الخلايا أو تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

يستخدم الترشيح الغشائي أيضا في إنتاج المياه عالية النقاء للاستخدام الصناعي أو المختبري. تتطلب العديد من الصناعات مياه عالية النقاء لعملياتها التشغيلية ، ويمكن أن يعمل الترشيح الغشائي على إزالة الملوثات ، بما في ذلك المعادن الذائبة غير المرغوب فيها والأملاح من الماء. يمكن استخدامه أيضا في تحلية المياه المالحة لإنتاج مياه الشرب.

لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لتحديد الكائنات الحية المؤشرة في الماء عن طريق الترشيح الغشائي يجب أن تفهم الآن كيفية تصفية عينات المياه الغشائية ، وكيفية زراعة عدة أنواع من بكتيريا مؤشر البراز من الغشاء ، وكيفية تأكيدها ككائنات مؤشرة. شكرا للمشاهدة!