Why is membrane filtration ideal for testing drinking water quality?

Membrane filtration works best for low turbidity water sources like drinking water, swimming pools, and lakes because the 0.45 micrometer pore size efficiently traps bacteria without clogging. High particulate matter can foul the filter and limit sample volume processing. This technique allows rapid bacterial enumeration and identification on selective growth media.

What do total coliforms indicate about water contamination?

Total coliforms are non-pathogenic bacteria from warm-blooded animal intestines that indicate fecal release into water. Their presence signals that pathogenic microorganisms may also be present. Detection of coliforms means the water source has experienced fecal contamination and warrants further investigation for harmful pathogens.

How are total coliform colonies identified after membrane filtration?

Total coliform colonies appear pink to dark red with a metallic surface sheen on selective media. Atypical colonies may be dark red, mucoid, or nucleated without sheen. Verification involves transferring colonies to lauryl tryptose broth with a Durham tube; turbidity plus gas production confirms total coliforms.

What distinguishes fecal enterococci from other indicator bacteria?

Fecal enterococci colonies appear pink to dark red on selective media. They are confirmed by Gram staining as positive, ovoid bacteria grouped in pairs or short chains, combined with a negative catalase test showing no bubbling with hydrogen peroxide. This combination distinguishes them from catalase-positive bacteria like Citrobacter.

What happens to water samples during the membrane filtration process?

Negative pressure draws water across a 0.45 micrometer filter, trapping bacteria and particles larger than the pore size. Smaller particles, viruses, and dissolved solids pass through into waste. After filtration, the membrane is rinsed three times with sterile water, then transferred to growth plates for culturing target microorganisms.

Why are coliform indicator bacteria used instead of testing for all pathogens?

The sheer number and variety of fecal-oral pathogens makes individual testing impractical and expensive. Coliform indicator bacteria are consistently excreted in feces from warm-blooded animals, making them reliable markers of fecal contamination. Their presence suggests pathogenic organisms may also be present in the water source.

When is a water source considered unfit for human consumption?

If more than 5% of water samples collected over a one-month period test positive for indicator bacteria, the source may be considered unfit for human consumption. This threshold indicates consistent fecal contamination and potential presence of disease-causing organisms that pose public health risks.

عزل البكتيريا البرازية من عينات المياه عن طريق الترشيح

0 مشاهدة10:58 دقيقة

فئة

1. جمع عينات المياه ومعالجتها

اجمع عدة عينات من المياه سعة 1 لتر من مصدر مياه الاختبار (مثل نوافير المياه وحمامات السباحة والخزانات وأنظمة توزيع المياه ومياه الصرف الصحي الخام أو المعالجة) ونقلها على الجليد إلى المختبر لتحليلها الميكروبي.
تعقيم أو تعقيم مجموعة مشعب الترشيح الغشائي قبل الاستخدام عن طريق التعقيم أو التعرض للأشعة فوق البنفسجية (2 دقيقة) أو اشتعال لهب الإيثانول.
عند تبريد جميع الأجزاء ، قم بتوصيل المشعب بشكل صحيح بمضخة تفريغ وقارورة نفايات الترشيح الفراغي التي تحتوي على مواد التبييض.
لهب الإيثانول بتعقيم زوج من الملقط ومعهم قم بإزالة مرشح غشاء معقم شبكي من عبوته. عادة ما يتم استخدام أغشية قطرها 47 مم بحجم مسام 0.45 ميكرومتر. ومع ذلك ، يمكن استخدام الأقطار البديلة وأحجام المسام بشرط أن يكون حجم المسام يحبس الكائنات الحية الدقيقة المستهدفة بشكل كاف ، ويتكون ما لا يقل عن 70٪ من مساحة المرشح من مساحة المسام.
ضع الفلتر في وسط منطقة الترشيح الغشائي للمشعب ، وقم بتطبيق قمع مرشح معقم على الوحدة وثبته في مكانه.
قم بقياس الحجم المطلوب من ماء الاختبار (على سبيل المثال 100 مل) وأضفه إلى القمع (تظهر علامة خط 100 مل على القمع).
قم بتطبيق فراغ جزئي [فرق ضغط من 34 إلى 51 كيلو باسكال (كيلو باسكال)] لسحب عينة الاختبار من خلال المرشح. يتم احتجاز إجمالي المواد الصلبة العالقة ، بما في ذلك البكتيريا والمواد العضوية المتحللة ، أكبر من متوسط حجم المسام البالغ 0.45 ميكرومتر على المرشح. سوف تمر الجسيمات الأصغر بما في ذلك الفيروسات والمواد الصلبة الذائبة مثل كميات صغيرة من المواد العضوية والأملاح ، عبر الغشاء وإلى قارورة تفريغ حاوية النفايات التي تحتوي على مواد التبييض.
بعد المرور الكامل للعينة عبر الفلتر ، اشطف الجزء الداخلي من القمع بحجمين إلى ثلاثة أحجام من 20-30 مل من الماء المعقم.
بإيقاف تشغيل المكنسة الكهربائية وإزالة القمع من المشعب عند إغلاق الشطف النهائي.
باستخدام ملقط معقم بلهب الإيثانول ، قم بإزالة مرشح الغشاء على الفور من الوحدة وضعه على الفور على وسط الاغاروز المناسب للكائن الحي الدقيق المستهدف (يسرد الجدول 1 وسائط النمو الموصى بها وظروف الحضانة لكل منها).
ضع مرشح الغشاء على سطح الاغاروز بحركة من نوع اللف لضمان التلامس الكامل للغشاء مع وسط النمو ، ولتجنب انحباس فقاعات الهواء.
استبدل قمع الترشيح المستخدم بوحدة معقمة بين معالجة كل عينة ، وقم بتعقيم مشعب الفولاذ المقاوم للصدأ بالإيثانول من أجل منع التلوث المتبادل.

< p class = "jove_title" >2. تعداد المستعمرة

بعد فترة الحضانة ، قم بإزالة ألواح النمو من الحاضنة للتعداد.
من الناحية المثالية ، قم بإجراء عمليات الإعدام تحت تكبير منخفض الطاقة باستخدام مصدر ضوء أبيض بارد.
إجمالي القولونيات
1. عادة ما تكون المستعمرات القولونية الكلية وردية إلى حمراء داكنة اللون مع لمعان سطح معدني. قد يغطي اللمعان نفسه المستعمرة جزئيا أو كليا. قد تكون أشكال مستعمرة القولونيات الكلية غير النمطية حمراء داكنة أو مخاطية أو ذات نواة بدون لمعان.
2. المستعمرات ذات اللون الوردي أو الأزرق أو الأبيض أو عديم اللون بينما تفتقر إلى اللمعان غير قولونيات.
القولونيات البرازية
1. تظهر مستعمرات القولونيات البرازية بظلال مختلفة من اللون الأزرق.
2. المستعمرات القولونية غير البرازية رمادية إلى كريمية اللون.
المكورات المعوية البرازية
1. تتراوح مستعمرات المكورات المعوية البرازية من اللون الوردي إلى الأحمر الداكن.

< p class = "jove_title" >3. التحقق من المستعمرة

إجمالي القولونيات
1. للتحقق من الوجود والغياب ، امسح الغشاء بالكامل باستخدام حلقة تلقيح معقمة. بالنسبة للمستعمرات ، يفضل التحقق من خمسة أشكال نموذجية وغير نمطية على الأقل.
2. انقل المستعمرة المختارة إلى وعاء زجاجي يحتوي على مرق لوريل تريبتوز بأنبوب دورهام. احتضان الأنابيب الملقحة عند 35±0.5 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. إن وجود التعكر الذي يشير إلى النمو بالتزامن مع إنتاج الغاز يتحقق من أن المستعمرة هي القولونيات.
القولونيات البرازية
1. انقل المستعمرات ذات اللون الأزرق بشكل معقم إلى أوعية زجاجية تحتوي على وسط EC معقم باستخدام أنبوب دورهام. احتضان الأنابيب الملقحة عند 44.5 ± 0.2 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. إن وجود التعكر الذي يشير إلى النمو بالتزامن مع إنتاج الغاز يتحقق من أن المستعمرة هي القولونيات البرازية.
المكورات المعوية البرازية
1. اضرب المستعمرات التي تميز مورفولوجيا المكورات المعوية البرازية للعزل بشكل معقم على أجار تسريب الدماغ والقلب (BHIA) ، واحتضانها عند 35 ± 0.5 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة.
2. انقل النمو من مستعمرة معزولة في BHIA إلى شريحتين زجاجيتين تم تنظيفهما مسبقا.
3. أضف قطرتين إلى ثلاث قطرات من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ إلى اللطاخات المحضرة على الشرائح. يشير الظهور السريع للفقاعات إلى نتيجة "إيجابية الكاتلاز" ، والعزل ليس بكتيريا المكورات العقدية البرازية.
4. قم بإجراء صبغة جرام للعزلات التي تم اختبارها على أنها "سلبية الكاتلاز" (لم يتم ملاحظة فقاعات). المكورات المعوية البرازية موجبة الجرام ، بيضاوية الشكل ، وتظهر في الغالب في أزواج أو سلاسل قصيرة.

مؤشر بكتيري البراز الوسائط الموصى بها
(درجة حرارة الحضانة ، الوقت) ¹ إجمالي القولونيات LES Endo Agar (35 ± 5 °C ، 24 ساعة)
M-Endo متوسط (35 ± 5 درجة مئوية ، 24 ساعة) القولونيات البرازية m-FC متوسط (44.5 ± 0.2 درجة مئوية ، 24 ساعة) المكورات المعوية البرازية م المكورات المعوية أجار (35 ± 0.5 درجة مئوية ، 48 ساعة)

الجدول 1. وسائط نمو الاستزراع شائعة الاستخدام للكشف عن مؤشرات البكتيريا البرازية في العينات البيئية
¹ على النحو الموصى به في الطرق القياسية لفحص المياه والصرف الصحي (جمعية الصحة العامة الأمريكية وجمعية أعمال المياه الأمريكية ، الطبعة 22 ، 2012)

يعد

الترشيح الغشائي والاستزراع اللاحق للبكتيريا التي تم جمعها تقنية مفيدة لتقييم جودة ونظافة مصدر المياه.

تعتبر

جودة المياه المخصصة للاستخدام في البيئات الزراعية أو الترفيهية أو المنزلية ذات أهمية كبيرة ، نظرا لاحتمال تفشي الأمراض المنقولة بالمياه. إذا كانت المياه ملوثة بالبراز من أو البشر ، فقد تنتشر الطفيليات أو البكتيريا أو الفيروسات المسببة للأمراض إلى مضيفين جدد عند ابتلاعها. ولذلك فإن رصد مصادر المياه لمثل هذه الكائنات المسببة للأمراض أمر بالغ الأهمية لضمان الصحة العامة.

إن العدد الهائل وتنوع مسببات الأمراض البرازية الفموية التي قد تكون موجودة في مصدر المياه يجعل من غير العملي فحص كل منها بشكل مستقل وعلى أساس منتظم. بدلا من ذلك ، تستخدم المقايسات الميكروبيولوجية الشائعة لجودة المياه بكتيريا مؤشر القولونيات. لمزيد من المعلومات حول هذه العملية ، انظر فيديو هذه المجموعة حول الكائنات الحية المؤشرة.

سيوضح هذا الفيديو عملية الترشيح الغشائي على عينة مياه بيئية ، ويوضح كيفية استزراع عدة أنواع من بكتيريا مؤشر البراز بما في ذلك القولونيات الكلية ، والقولونيات البرازية ، والمكورات المعوية البرازية ، ويصف كيفية التحقق من وجود تلوث براز.

تستخدم

تقنية الترشيح الغشائي الضغط السلبي لسحب عينات المياه عبر المرشح واحتجاز البكتيريا. المرشح عبارة عن غشاء متخصص بمتوسط حجم مسام لا يقل عن 0.45 ميكرومتر يسمح بالتقاط البكتيريا ، والتي يبلغ حجمها عادة حوالي 1 ميكرومتر. بعد الترشيح ، يتم تطبيق الغشاء على وسط نمو الاغاروز ، ويتم احتضانه في الظروف المناسبة لزراعة الكائنات الحية الدقيقة المستهدفة.

هذه التقنية هي الأكثر مثالية لمصادر التعكر المنخفضة مثل مياه الشرب أو حمامات السباحة أو البحيرات والخزانات. يمكن أن يؤدي الماء الذي يحتوي على نسبة عالية من الجسيمات إلى تلوث أو انسداد المرشح ، مما يحد من الحجم الذي يمكن معالجته. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الترشيح الغشائي ليس عمليا لمصادر المياه التي تحتوي على أعداد كبيرة من الخلفية ، أو البكتيريا غير القولونية ، مثل مياه الصرف الصحي الخام ، حيث يمكن أن يزيد ذلك من صعوبة تعداد القولونيات المستهدفة عند الاستزراع والحضانة.

بمجرد أن يتم احتجاز العينات البكتيرية في الفلتر، يمكن نقلها إلى ألواح النمو لتحديد أنواع البكتيريا المؤشرة الموجودة في عينات المياه. يختار الطلاء على أنواع الوسائط المختلفة أنواعا مختلفة من البكتيريا ، ويمكن أن يسمح بالتعرف السريع.

بعد النمو على صفائح محددة للثقافة ، يمكن إجراء مزيد من التأكيد على هويات بكتيريا المؤشر باستخدام تقنيات مثل التقاط المستعمرات في الوسائط السائلة واستخدام أنابيب دورهام لالتقاط الغازات ، والتي يجب إنتاجها فقط في وجود القولونيات البرازية أو القولونيات الكلية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تأكيد المكورات المعوية البرازية المشتبه بها من خلال مزيج من تلطيخ الجرام الإيجابي ، جنبا إلى جنب مع اختبار بيروكسيد الهيدروجين الكاتلاز السلبي.

الآن بعد أن أصبحنا على دراية بالمبادئ الكامنة وراء الترشيح الغشائي لعينات المياه ، دعنا نلقي نظرة على كيفية تنفيذ هذا الإجراء.

لبدء الإجراء ، قم أولا بجمع عينات المياه من مصادر مياه الاختبار ذات الأهمية. تأكد من جمع العينات في زجاجات معقمة سعة 1 لتر. بمجرد اكتمال الجمع ، ضع العينات على الجليد ، وانقلها إلى المختبر لتحليلها الميكروبي.

لبدء التحليل ، قم أولا بتعقيم مشعب الترشيح الغشائي بعد ذلك ، قم بتوصيل المشعب بمضخة تفريغ وقارورة نفايات الترشيح التي تحتوي على مبيض.

ملقط الإيثانول المعقم باللهب وإزالة غشاء شبكي معقم من العبوة. ضع الفلتر في وسط منطقة الترشيح الغشائي للمشعب ، وقم بتطبيق قمع مرشح معقم على الوحدة ، ثم ثبته في مكانه.

قم بقياس الحجم المطلوب من مياه الاختبار في القمع. ضع فراغا جزئيا لسحب عينة الاختبار من خلال الفلتر. سيتم احتجاز المواد الصلبة العالقة ، بما في ذلك البكتيريا والمواد العضوية الأخرى ، التي يزيد حجمها عن 0.45 ميكرومتر على المرشح أو داخله ، بينما ستمر الجسيمات الأصغر والفيروسات والمواد الصلبة الذائبة إلى قارورة النفايات التي تحتوي على مواد التبييض.

بعد مرور العينة عبر الفلتر ، اشطف الجزء الداخلي من القمع ب 25 مل من الماء المعقم 3 مرات ، مما يسمح بالمرور عبر الفلتر. عند اكتمال الشطف النهائي ، افصل المكنسة الكهربائية وقم بإزالة القمع من المشعب.

بعد ذلك ، قم بتعقيم ملقط الإيثانول باللهب وقم بإزالة مرشح الغشاء على الفور من الوحدة. ضعه على لوحة النمو المناسبة للكائن الحي الدقيق المستهدف باستخدام حركة متدحرجة لضمان التلامس الكامل مع السطح وتجنب احتجاز فقاعات الهواء.

لمعالجة كل عينة أخرى ، قم بتعقيم مشعب الفولاذ المقاوم للصدأ واستخدم قمعا معقما لمنع التلوث المتبادل. أخيرا ، ضع الألواح في حاضنة لفترة الحضانة المناسبة.

بعد فترة الحضانة ، قم بإزالة الألواح من الحاضنة للتعداد. إذا أمكن ، قم بإجراء عمليات العداء تحت تكبير منخفض الطاقة باستخدام مصدر ضوء أبيض بارد. لتحديد إجمالي القولونيات ، حدد عد المستعمرات التي تظهر باللون الوردي إلى الأحمر الداكن ، ولها لمعان سطح معدني يغطي المستمرة كليا أو جزئيا. قد تظهر المستعمرات القولونية الكلية غير النمطية باللون الأحمر الداكن أو المخاطي أو النواة بدون لمعان.

تعتبر

المستعمرات التي تظهر باللون الأزرق أو الأبيض أو عديم اللون أو الوردي بدون لمعان غير قولونية ، ولا ينبغي تضمينها في إجمالي عدد القولونيات.

ستظهر مستعمرات القولونيات البرازية كظلال مختلفة من اللون الأزرق ، ويجب احتسابها كفئة منفصلة. عادة ما تكون المستعمرات القولونية غير البرازية رمادية إلى كريمية اللون ، ويجب أيضا تسجيلها في فئة فردية. أخيرا ، تتراوح مستعمرات المكورات المعوية البرازية من اللون الوردي إلى الأحمر الداكن ويجب احتسابها بشكل منفصل.

للتحقق من إجمالي مستعمرات القولونيات ، قم بتطبيق حلقة تلقيح معقمة ومبردة على مستعمرة واحدة ذات أهمية. انقل المستعمرة المختارة إلى وعاء زجاجي يحتوي على مرق لوريل تريبتوز وأنبوب دورهام. بعد ذلك ، ضع الثقافات في حاضنة. إن وجود العكارة جنبا إلى جنب مع إنتاج الغاز الذي تم التقاطه بواسطة أنبوب دورهام يتحقق من أن المستعمرة هي القولونيات الكاملة.

للتحقق من القولونيات البرازية ، انقل المستعمرات باللون الأزرق إلى أوعية زجاجية تحتوي على وسط EC معقم وأنبوب دورهام. ضع الأنابيب الملقحة في حاضنة. بعد الحضانة ، تؤكد اللقاحات العكرة بالتزامن مع إنتاج الغاز أن المستعمرة هي القولونيات البرازية.

لتأكيد المكورات المعوية البرازية ، انقل المستعمرات المشتبه بها ذات التشكل الصحيح إلى ألواح أجار تسريب الدماغ والقلب ، واحتضنها. بعد ذلك ، انقل النمو من مستعمرة معزولة في BHIA إلى شريحتين زجاجيتين معقمين.

أضف 2-3 قطرات من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ إلى إحدى الشرائح الزجاجية. يشير الإنتاج السريع للغاز إلى بكتيريا موجبة الكاتلاز مثل Citrobacter. بكتيريا المكورات المعوية البرازية سلبية الكاتلاز. لذلك ، لا يلاحظ أي فقاعات. بالنسبة للمستعمرات سالبة الكاتلاز التي لا تظهر فقاعات ، قم بإجراء صبغة جرام. كمكورات معوية برازية ، يجب أن تظهر موجبة الجرام ، بيضاوية الشكل ، ويتم تجميعها في الغالب في أزواج أو سلاسل قصيرة.

يشير العثور على أي من هذه البكتيريا المؤشرة في مصدر المياه إلى وجود تلوث. وإذا تبين أن أكثر من 5٪ من العينات ملوثة على مدى شهر واحد، فقد يعتبر المصدر غير صالح للاستهلاك البشري.

يستخدم الترشيح الغشائي بشكل شائع في عدد من التطبيقات البيولوجية ، ويمكن أيضا اكتشاف الكائنات الحية ذات المؤشرات البرازية من خلال الإجراءات التجريبية الأخرى. يتم استكشاف بعض هذه التطبيقات هنا.

يمكن أيضا استخدام الترشيح الغشائي في التقاط الفيروسات من عينات المياه. نظرا لأن الفيروسات ستكون موجودة عادة عند مستويات منخفضة جدا ، يجب تركيز عينات المياه من أجل التقاطها لتحليلها. يمكن بعد ذلك إطلاق الفيروسات التي تم التقاطها من المرشحات ، وتحديدها باستخدام تقنيات مثل فحوصات عدوى زراعة الخلايا أو تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

يستخدم الترشيح الغشائي أيضا في إنتاج المياه عالية النقاء للاستخدام الصناعي أو المختبري. تتطلب العديد من الصناعات مياه عالية النقاء لعملياتها التشغيلية ، ويمكن أن يعمل الترشيح الغشائي على إزالة الملوثات ، بما في ذلك المعادن الذائبة غير المرغوب فيها والأملاح من الماء. يمكن استخدامه أيضا في تحلية المياه المالحة لإنتاج مياه الشرب.

لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لتحديد الكائنات الحية المؤشرة في الماء عن طريق الترشيح الغشائي يجب أن تفهم الآن كيفية تصفية عينات المياه الغشائية ، وكيفية زراعة عدة أنواع من بكتيريا مؤشر البراز من الغشاء ، وكيفية تأكيدها ككائنات مؤشرة. شكرا للمشاهدة!