استخراج الحمض النووي المجتمعي من المستعمرات البكتيرية
1. استخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري
- لبدء الإجراء ، قم بوزن 100 غرام من التربة المنخلة. أضف هذا إلى وعاء من مادة البولي بروبلين ، وأضف 100 مل من مخزن الاستخراج المخزن المؤقت المكون من مخزن ثلاثي المخزن المؤقت المعدل باستخدام EDTA لتعزيز إطلاق البكتيريا من مصفوفة التربة ، ثم رجها باليد.
- بعد ذلك ، قم بوزن 100 غرام من الخرز الزجاجي ، وأضفها إلى وعاء الخلط. حرك العينة لمدة 5 دقائق باستخدام جهاز ضرب الخرزة أو شاكر ميكانيكي للمعصم لمدة 15 دقيقة. أضف 10 مل 20٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم ، أو SDS ، إلى الخليط ، ثم حركه لمدة دقيقة إضافية. احتضان عند درجة حرارة عالية من 60 إلى 65 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- قم بتوزيع العينة بالتساوي بين أنابيب منفصلة سعة 50 مل ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 6,000 × جم. انقل المادة الطافية من الأنابيب إلى حاوية واحدة معقمة. بعد ذلك, كرر الاستخراج على حبيبات التربة كما هو موضح سابقا, باستخدام حجم جديد من المخزن المؤقت للاستخراج.
- بعد ذلك ، أضف الحجم الإجمالي للطافي المعالج ، حوالي 200 مل ، إلى أنبوب نظيف سعة 50 مل مملوء بنصف الحجم بمحلول 30٪ بولي إيثيلين جلايكول و 1.6 مليون كلوريد الصوديوم. اقلب الزجاجات عدة مرات باليد لخلطها ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 20 دقيقة لحبيبات الحمض النووي.
- قم بإزالة المادة الطافية بعناية من أنبوب الطرد المركزي ، تاركا وراءها حبيبات الحمض النووي المنقاة جزئيا. أضف 20 مل من TE Buffer و 1.5 مل من محلول أسيتات البوتاسيوم 7.5 M لإعادة تعليق الحبيبات ، ثم الدوامة. ضع المعلق على الثلج لمدة 5 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لترسيب البروتينات والسكريات.
- بعد ذلك ، أضف RNAse و proteinase K إلى العينة ، واخلطها برفق باليد ، واتركها للحظة. أضف حجما مكافئا من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل (خليط نسبي 25:24: 1) إلى المعلق المراد استخراجه ، واخلطه برفق باليد. الطرد المركزي التحضير لمدة 10 دقائق عند 13,000 × جم. قم بإزالة الوعاء بعناية من جهاز الطرد المركزي ، ولاحظ الطبقتين.
- تتكون الطبقة السفلية الأثقل من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل والحطام المستخرج ، والطبقة العليا هي المائية وتحتوي على الحمض النووي. ضع الطور المائي في وعاء معقم ، وأضف حجما مكافئا من الأيزوبروبانول ، واقلبها برفق لبدء ترسيب الحمض النووي. احتضان التعليق في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. بيليه الحمض النووي المنقى عن طريق الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية لأن الحمض النووي المحبب قد يكون مرئيا أو لا يكون مرئيا في قاع الوعاء ، ثم أعد تعليقه في 1 مل من TE Buffer.
- باستخدام مقياس الطيف الضوئي أو مقياس فلوري القياس الكمي للحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، قم بقياس مستوى الحمض النووي المستخرج من العينة. تقدر كمية الحمض النووي من قراءة 260 نانومتر. قراءة الامتصاص 1.0 تعادل 50 ميكروغرام من الحمض النووي لكل مل من المحلول. إذا كان التركيز مرتفعا جدا لإجراء قراءات دقيقة ، فقم بتخفيف المعلق من 1 إلى 10 ، أو 1 إلى 100 باستخدام الماء الجزيئي.
- يقدر نقاء الحمض النووي من نسبة القراءة عند 260 نانومتر إلى تلك عند 280 نانومتر. تشير القيمة > 1.7 إلى الحمض النووي النقي نسبيا. القيمة النظرية القصوى هي 2.0.
استخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري هو عملية يتم من خلالها الحصول على الحمض النووي من أنواع بكتيرية متعددة داخل المجتمع أثناء إجراء استخراج واحد.
عادة ما تتضمن التحليلات التقليدية للمجتمعات الميكروبية في التربة فحوصات ثقافية ، باستخدام منهجية التخفيف والطلاء على وسائط انتقائية مختلفة. ومع ذلك ، فإن العديد من البكتيريا تنمو بشكل سيئ في ظل ظروف المختبر أو في ظروف وسائط النمو المحددة المختارة ، مما يعني أنها قد تفوتك أو ممثلة تمثيلا ناقصا بشدة.
في الآونة الأخيرة ، سمح استخراج الحمض النووي للمجتمع من عينات بكتيرية التربة بأخذ عينات أكثر شمولا من المجتمعات البكتيرية. يعتقد أن هذا النهج غير القائم على الثقافة أكثر تمثيلا للمجتمعات الفعلية الحالية من الأساليب التقليدية القائمة على الثقافة.
سيوضح هذا الفيديو طريقة غير مزروعة لاستخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري ، وكيفية التحقق من جودة وكمية الحمض النووي المستخرج ، واستكشاف كيفية استخدام هذا الحمض النووي لدراسة التنوع البكتيري.
يمكن إجراء استخراج الحمض النووي من التربة بإحدى طريقتين. في طريقة التجزئة ، يتم فصل الخلايا أولا عن مصفوفة التربة قبل استخراج المادة الوراثية. ثم تخضع العينة لدورات متتالية من المزج والطرد المركزي البطيء من أجل جمع الخلايا السليمة في الحبيبات.
ثم تضاف الليزوزيم إلى الخلايا ، ويتم تحضين المعلق. الليزوزيم هي إنزيمات تكسر جدران الخلايا البكتيرية. بمجرد اختراق بنية جدار الخلية ، يمكن بعد ذلك تحرير الحمض النووي للتنقية. ومع ذلك ، فقد ثبت أن الطريقة الثانية لاستخراج الحمض النووي المجتمعي ، وهي الطريقة في الموقع ، تنتج تركيزا أكبر للحمض النووي.
هنا ، يتم دمج كتلة من التربة مع حجم مكافئ من مخزن الاستخراج Tris-EDTA والخرز الزجاجي ، ويتم خلطها بقوة لتسهيل فصل الخلايا عن جزيئات التربة. ثم يضاف المنظف ، بشكل عام كبريتات دوديسيل الصوديوم ، أو SDS ، ويتم مزج العينة بشكل أكبر لتعزيز تحلل الخلايا وإطلاق محتوياتها ، بما في ذلك الحمض النووي.
ثم يتم إجراء الحضانة عند درجة حرارة عالية لتحلل أي خلايا بكتيرية متبقية. يتم طرد العينات ، ويتم إجراء استخراج واحتضان البولي إيثيلين جلايكول على المادة الطافية من أجل ترسيب الحمض النووي ، والذي يتم طرده بعد ذلك في حبيبات.
يتم إعادة تعليق الحمض النووي في TE Buffer وخلات البوتاسيوم من أجل غسل الحمض النووي للبروتينات والسكريات ، ثم يتم إجراء الطرد المركزي لحبيبات هذه المكونات غير المرغوب فيها. تتم إزالة المادة الطافية المائية التي تحتوي على الحمض النووي ، وإخضاعها لاستخراج الفينول كلوروفورم وترسيب الأيزوبروبانول لمزيد من التنظيف والتركيز على الحمض النووي. بعد فترة حضانة درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ، يتم طرد الحمض النووي وإعادة تعليقه في TE Buffer للتخزين حتى التحليل.
الآن بعد أن أصبحنا على دراية بالمفاهيم والعمليات الكامنة وراء استخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري ، دعنا نلقي نظرة على كيفية إجراؤه في المختبر.
لبدء الإجراء ، قم بوزن 100 غرام من التربة المنخلة. أضف هذا إلى وعاء من مادة البولي بروبلين ، وأضف 100 مل من مخزن الاستخراج المخزن المؤقت المكون من مخزن ثلاثي المخزن المؤقت المعدل باستخدام EDTA لتعزيز إطلاق البكتيريا من مصفوفة التربة ، ثم رجها باليد.
بعد ذلك ، قم بوزن 100 غرام من الخرز الزجاجي ، وأضفها إلى وعاء الخلط. حرك العينة لمدة 5 دقائق باستخدام جهاز ضرب الخرزة أو شاكر ميكانيكي للمعصم. أضف 10 مل 20٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم ، أو SDS ، إلى الخليط ، ثم حركه لمدة دقيقة إضافية. احتضان على درجة حرارة عالية لمدة 60 دقيقة.
قم بتوزيع العينة بالتساوي بين أنابيب منفصلة سعة 50 مل ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 6,000 × جم. انقل المادة الطافية من الأنابيب إلى حاوية واحدة معقمة. بعد ذلك, كرر الاستخراج على حبيبات التربة كما هو موضح سابقا, باستخدام حجم جديد من المخزن المؤقت للاستخراج.
بعد ذلك ، أضف الحجم الإجمالي للطافي المعالج إلى أنبوب نظيف سعة 50 مل مملوء بنصف الحجم بمحلول 30٪ من البولي إيثيلين جلايكول و 1.6 مليون كلوريد الصوديوم. اقلب الزجاجات عدة مرات باليد لخلطها ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 20 دقيقة لحبيبات الحمض النووي.
قم بإزالة المادة الطافية بعناية من أنبوب الطرد المركزي ، تاركا وراءها حبيبات الحمض النووي المنقاة جزئيا. أضف 20 مل من TE Buffer و 1.5 مل من محلول أسيتات البوتاسيوم 7.5 M لإعادة تعليق الحبيبات ، ثم الدوامة. ضع المعلق على الثلج لمدة 5 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لترسيب البروتينات والسكريات.
بعد ذلك ، أضف RNAse و proteinase K إلى العينة ، واخلطها برفق باليد ، واتركها للحظة. أضف حجما مكافئا من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل إلى المعلق المراد استخراجه ، واخلطه برفق باليد. الطرد المركزي التحضير لمدة 10 دقائق عند 13,000 × جم. قم بإزالة الوعاء بعناية من جهاز الطرد المركزي ، ولاحظ الطبقتين.
تتكون الطبقة السفلية الأثقل من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل والحطام المستخرج ، والطبقة العليا هي المائية وتحتوي على الحمض النووي. ضع الطور المائي في وعاء معقم ، وأضف حجما مكافئا من الأيزوبروبانول ، واقلبها برفق لبدء ترسيب الحمض النووي. احتضان التعليق في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. بيليه الحمض النووي المنقى عن طريق الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية لأن الحمض النووي المحبب قد يكون مرئيا أو لا يكون مرئيا في قاع الوعاء ، ثم أعد تعليقه في 1 مل من TE Buffer.
باستخدام مقياس الطيف الضوئي أو مقياس فلوري القياس الكمي للحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، قم بقياس مستوى الحمض النووي المستخرج من العينة. ستنتج مقاييس فلورية الحمض النووي / الحمض النووي الريبي مستويات الحمض النووي بوحدات نانوجرام لكل ملليلتر. إذا كان التركيز مرتفعا جدا لإجراء قراءات دقيقة ، فقم بتخفيف المعلق من 1 إلى 10 ، أو 1 إلى 100 باستخدام الماء الجزيئي.
بمجرد الحصول على الحمض النووي من مجتمع بكتيري ، يمكن استخدام ذلك بعدة طرق مختلفة. يتم استكشاف بعض هذه التطبيقات هنا.
يمكن أن توفر التحليلات الطيفية للحمض النووي المستخرج من الحمض النووي للمجتمع نظرة ثاقبة لعدد الخلايا البكتيرية الموجودة في عينة معينة من التربة. يمكن ربط الكمية المقدرة للحمض النووي في نانوغرام لكل مل من المحلول بالحجم الإجمالي للحمض النووي المستخرج في المحلول ، لإعطاء الكمية الإجمالية للحمض النووي لكل غرام من التربة. بمعرفة القيمة النظرية للحمض النووي لكل خلية ، يمكن حساب العدد الإجمالي للخلايا لكل غرام من التربة.
بالنسبة للتطبيقات الأكثر استهدافا ، يمكن إخضاع الحمض النووي المستخرج من المجتمعات البكتيرية لتفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد ما إذا كان نوع معين موجودا داخل المجتمع. على سبيل المثال ، قد يرغب العلماء في تحديد ما إذا كانت عينات التربة تحتوي على مسببات أمراض معينة ، مثل Clostridium perfringens أو Bacillus anthracis.
أخيرا ، للحصول على فهم أكثر شمولا للبكتيريا الموجودة في المجتمع ، يمكن أن تخضع عينات الحمض النووي للتوصيف "الصوتي" والمعلوماتية الحيوية التي تسمح بتحليل أعمق للبكتيريا الأصلية داخل العينة. يصف "Omics" مجموعة من التقنيات التي تستكشف أدوار وعلاقات وإجراءات الجزيئات في الكائنات الحية أو المجتمعات. يتضمن ذلك دراسات الجينات ووظيفتها ، أو "علم الجينوم" ، و "البروتينات" ، دراسة البروتينات وأدوارها. على سبيل المثال ، يمكن أن يسمح تسلسل 16S RNA من العينات بتحديد ميتاجينومي لأنواع معينة داخل المجتمع ، مما يعطي تقديرا أكثر تفصيلا للتنوع. يمكن أن يمنح هذا النهج العلماء فهما أفضل لتكوين الأنواع في المجتمع ، والأدوار التي قد يقومون بها.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لاستخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري. يجب أن تفهم الآن كيفية استخراج الحمض النووي من مجتمع بكتيري ، وكيفية التحقق من جودة هذا الحمض النووي ، وكيف يمكن استخدام هذا الحمض النووي للتحقيقات في تكوين المجتمع البكتيري. شكرا للمشاهدة!
المصدر: مختبرات الدكتور إيان بيبر والدكتور تشارلز جيربا - جامعة أريزونا
المؤلف التوضيحي: لويزا إيكنر
عادة ما تتضمن الطرق التقليدية للتحليل للمجتمعات ا…
1. استخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري
- لبدء الإجراء ، قم بوزن 100 غرام من التربة المنخلة. أضف هذا إلى وعاء من مادة البولي بروبلين ، وأضف 100 مل من مخزن الاستخراج المخزن المؤقت المكون من مخزن ثلاثي المخزن المؤقت المعدل باستخدام EDTA لتعزيز إطلاق البكتيريا من مصفوفة التربة ، ثم رجها باليد.
- بعد ذلك ، قم بوزن 100 غرام من الخرز الزجاجي ، وأضفها إلى وعاء الخلط. حرك العينة لمدة 5 دقائق باستخدام جهاز ضرب الخرزة أو شاكر ميكانيكي للمعصم لمدة 15 دقيقة. أضف 10 مل 20٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم ، أو SDS ، إلى الخليط ، ثم حركه لمدة دقيقة إضافية. احتضان عند درجة حرارة عالية من 60 إلى 65 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- قم بتوزيع العينة بالتساوي بين أنابيب منفصلة سعة 50 مل ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 6,000 × جم. انقل المادة الطافية من الأنابيب إلى حاوية واحدة معقمة. بعد ذلك, كرر الاستخراج على حبيبات التربة كما هو موضح سابقا, باستخدام حجم جديد من المخزن المؤقت للاستخراج.
- بعد ذلك ، أضف الحجم الإجمالي للطافي المعالج ، حوالي 200 مل ، إلى أنبوب نظيف سعة 50 مل مملوء بنصف الحجم بمحلول 30٪ بولي إيثيلين جلايكول و 1.6 مليون كلوريد الصوديوم. اقلب الزجاجات عدة مرات باليد لخلطها ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 20 دقيقة لحبيبات الحمض النووي.
- قم بإزالة المادة الطافية بعناية من أنبوب الطرد المركزي ، تاركا وراءها حبيبات الحمض النووي المنقاة جزئيا. أضف 20 مل من TE Buffer و 1.5 مل من محلول أسيتات البوتاسيوم 7.5 M لإعادة تعليق الحبيبات ، ثم الدوامة. ضع المعلق على الثلج لمدة 5 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لترسيب البروتينات والسكريات.
- بعد ذلك ، أضف RNAse و proteinase K إلى العينة ، واخلطها برفق باليد ، واتركها للحظة. أضف حجما مكافئا من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل (خليط نسبي 25:24: 1) إلى المعلق المراد استخراجه ، واخلطه برفق باليد. الطرد المركزي التحضير لمدة 10 دقائق عند 13,000 × جم. قم بإزالة الوعاء بعناية من جهاز الطرد المركزي ، ولاحظ الطبقتين.
- تتكون الطبقة السفلية الأثقل من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل والحطام المستخرج ، والطبقة العليا هي المائية وتحتوي على الحمض النووي. ضع الطور المائي في وعاء معقم ، وأضف حجما مكافئا من الأيزوبروبانول ، واقلبها برفق لبدء ترسيب الحمض النووي. احتضان التعليق في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. بيليه الحمض النووي المنقى عن طريق الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية لأن الحمض النووي المحبب قد يكون مرئيا أو لا يكون مرئيا في قاع الوعاء ، ثم أعد تعليقه في 1 مل من TE Buffer.
- باستخدام مقياس الطيف الضوئي أو مقياس فلوري القياس الكمي للحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، قم بقياس مستوى الحمض النووي المستخرج من العينة. تقدر كمية الحمض النووي من قراءة 260 نانومتر. قراءة الامتصاص 1.0 تعادل 50 ميكروغرام من الحمض النووي لكل مل من المحلول. إذا كان التركيز مرتفعا جدا لإجراء قراءات دقيقة ، فقم بتخفيف المعلق من 1 إلى 10 ، أو 1 إلى 100 باستخدام الماء الجزيئي.
- يقدر نقاء الحمض النووي من نسبة القراءة عند 260 نانومتر إلى تلك عند 280 نانومتر. تشير القيمة > 1.7 إلى الحمض النووي النقي نسبيا. القيمة النظرية القصوى هي 2.0.
استخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري هو عملية يتم من خلالها الحصول على الحمض النووي من أنواع بكتيرية متعددة داخل المجتمع أثناء إجراء استخراج واحد.
عادة ما تتضمن التحليلات التقليدية للمجتمعات الميكروبية في التربة فحوصات ثقافية ، باستخدام منهجية التخفيف والطلاء على وسائط انتقائية مختلفة. ومع ذلك ، فإن العديد من البكتيريا تنمو بشكل سيئ في ظل ظروف المختبر أو في ظروف وسائط النمو المحددة المختارة ، مما يعني أنها قد تفوتك أو ممثلة تمثيلا ناقصا بشدة.
في الآونة الأخيرة ، سمح استخراج الحمض النووي للمجتمع من عينات بكتيرية التربة بأخذ عينات أكثر شمولا من المجتمعات البكتيرية. يعتقد أن هذا النهج غير القائم على الثقافة أكثر تمثيلا للمجتمعات الفعلية الحالية من الأساليب التقليدية القائمة على الثقافة.
سيوضح هذا الفيديو طريقة غير مزروعة لاستخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري ، وكيفية التحقق من جودة وكمية الحمض النووي المستخرج ، واستكشاف كيفية استخدام هذا الحمض النووي لدراسة التنوع البكتيري.
يمكن إجراء استخراج الحمض النووي من التربة بإحدى طريقتين. في طريقة التجزئة ، يتم فصل الخلايا أولا عن مصفوفة التربة قبل استخراج المادة الوراثية. ثم تخضع العينة لدورات متتالية من المزج والطرد المركزي البطيء من أجل جمع الخلايا السليمة في الحبيبات.
ثم تضاف الليزوزيم إلى الخلايا ، ويتم تحضين المعلق. الليزوزيم هي إنزيمات تكسر جدران الخلايا البكتيرية. بمجرد اختراق بنية جدار الخلية ، يمكن بعد ذلك تحرير الحمض النووي للتنقية. ومع ذلك ، فقد ثبت أن الطريقة الثانية لاستخراج الحمض النووي المجتمعي ، وهي الطريقة في الموقع ، تنتج تركيزا أكبر للحمض النووي.
هنا ، يتم دمج كتلة من التربة مع حجم مكافئ من مخزن الاستخراج Tris-EDTA والخرز الزجاجي ، ويتم خلطها بقوة لتسهيل فصل الخلايا عن جزيئات التربة. ثم يضاف المنظف ، بشكل عام كبريتات دوديسيل الصوديوم ، أو SDS ، ويتم مزج العينة بشكل أكبر لتعزيز تحلل الخلايا وإطلاق محتوياتها ، بما في ذلك الحمض النووي.
ثم يتم إجراء الحضانة عند درجة حرارة عالية لتحلل أي خلايا بكتيرية متبقية. يتم طرد العينات ، ويتم إجراء استخراج واحتضان البولي إيثيلين جلايكول على المادة الطافية من أجل ترسيب الحمض النووي ، والذي يتم طرده بعد ذلك في حبيبات.
يتم إعادة تعليق الحمض النووي في TE Buffer وخلات البوتاسيوم من أجل غسل الحمض النووي للبروتينات والسكريات ، ثم يتم إجراء الطرد المركزي لحبيبات هذه المكونات غير المرغوب فيها. تتم إزالة المادة الطافية المائية التي تحتوي على الحمض النووي ، وإخضاعها لاستخراج الفينول كلوروفورم وترسيب الأيزوبروبانول لمزيد من التنظيف والتركيز على الحمض النووي. بعد فترة حضانة درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ، يتم طرد الحمض النووي وإعادة تعليقه في TE Buffer للتخزين حتى التحليل.
الآن بعد أن أصبحنا على دراية بالمفاهيم والعمليات الكامنة وراء استخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري ، دعنا نلقي نظرة على كيفية إجراؤه في المختبر.
لبدء الإجراء ، قم بوزن 100 غرام من التربة المنخلة. أضف هذا إلى وعاء من مادة البولي بروبلين ، وأضف 100 مل من مخزن الاستخراج المخزن المؤقت المكون من مخزن ثلاثي المخزن المؤقت المعدل باستخدام EDTA لتعزيز إطلاق البكتيريا من مصفوفة التربة ، ثم رجها باليد.
بعد ذلك ، قم بوزن 100 غرام من الخرز الزجاجي ، وأضفها إلى وعاء الخلط. حرك العينة لمدة 5 دقائق باستخدام جهاز ضرب الخرزة أو شاكر ميكانيكي للمعصم. أضف 10 مل 20٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم ، أو SDS ، إلى الخليط ، ثم حركه لمدة دقيقة إضافية. احتضان على درجة حرارة عالية لمدة 60 دقيقة.
قم بتوزيع العينة بالتساوي بين أنابيب منفصلة سعة 50 مل ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 6,000 × جم. انقل المادة الطافية من الأنابيب إلى حاوية واحدة معقمة. بعد ذلك, كرر الاستخراج على حبيبات التربة كما هو موضح سابقا, باستخدام حجم جديد من المخزن المؤقت للاستخراج.
بعد ذلك ، أضف الحجم الإجمالي للطافي المعالج إلى أنبوب نظيف سعة 50 مل مملوء بنصف الحجم بمحلول 30٪ من البولي إيثيلين جلايكول و 1.6 مليون كلوريد الصوديوم. اقلب الزجاجات عدة مرات باليد لخلطها ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 20 دقيقة لحبيبات الحمض النووي.
قم بإزالة المادة الطافية بعناية من أنبوب الطرد المركزي ، تاركا وراءها حبيبات الحمض النووي المنقاة جزئيا. أضف 20 مل من TE Buffer و 1.5 مل من محلول أسيتات البوتاسيوم 7.5 M لإعادة تعليق الحبيبات ، ثم الدوامة. ضع المعلق على الثلج لمدة 5 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لترسيب البروتينات والسكريات.
بعد ذلك ، أضف RNAse و proteinase K إلى العينة ، واخلطها برفق باليد ، واتركها للحظة. أضف حجما مكافئا من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل إلى المعلق المراد استخراجه ، واخلطه برفق باليد. الطرد المركزي التحضير لمدة 10 دقائق عند 13,000 × جم. قم بإزالة الوعاء بعناية من جهاز الطرد المركزي ، ولاحظ الطبقتين.
تتكون الطبقة السفلية الأثقل من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل والحطام المستخرج ، والطبقة العليا هي المائية وتحتوي على الحمض النووي. ضع الطور المائي في وعاء معقم ، وأضف حجما مكافئا من الأيزوبروبانول ، واقلبها برفق لبدء ترسيب الحمض النووي. احتضان التعليق في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. بيليه الحمض النووي المنقى عن طريق الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية لأن الحمض النووي المحبب قد يكون مرئيا أو لا يكون مرئيا في قاع الوعاء ، ثم أعد تعليقه في 1 مل من TE Buffer.
باستخدام مقياس الطيف الضوئي أو مقياس فلوري القياس الكمي للحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، قم بقياس مستوى الحمض النووي المستخرج من العينة. ستنتج مقاييس فلورية الحمض النووي / الحمض النووي الريبي مستويات الحمض النووي بوحدات نانوجرام لكل ملليلتر. إذا كان التركيز مرتفعا جدا لإجراء قراءات دقيقة ، فقم بتخفيف المعلق من 1 إلى 10 ، أو 1 إلى 100 باستخدام الماء الجزيئي.
بمجرد الحصول على الحمض النووي من مجتمع بكتيري ، يمكن استخدام ذلك بعدة طرق مختلفة. يتم استكشاف بعض هذه التطبيقات هنا.
يمكن أن توفر التحليلات الطيفية للحمض النووي المستخرج من الحمض النووي للمجتمع نظرة ثاقبة لعدد الخلايا البكتيرية الموجودة في عينة معينة من التربة. يمكن ربط الكمية المقدرة للحمض النووي في نانوغرام لكل مل من المحلول بالحجم الإجمالي للحمض النووي المستخرج في المحلول ، لإعطاء الكمية الإجمالية للحمض النووي لكل غرام من التربة. بمعرفة القيمة النظرية للحمض النووي لكل خلية ، يمكن حساب العدد الإجمالي للخلايا لكل غرام من التربة.
بالنسبة للتطبيقات الأكثر استهدافا ، يمكن إخضاع الحمض النووي المستخرج من المجتمعات البكتيرية لتفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد ما إذا كان نوع معين موجودا داخل المجتمع. على سبيل المثال ، قد يرغب العلماء في تحديد ما إذا كانت عينات التربة تحتوي على مسببات أمراض معينة ، مثل Clostridium perfringens أو Bacillus anthracis.
أخيرا ، للحصول على فهم أكثر شمولا للبكتيريا الموجودة في المجتمع ، يمكن أن تخضع عينات الحمض النووي للتوصيف "الصوتي" والمعلوماتية الحيوية التي تسمح بتحليل أعمق للبكتيريا الأصلية داخل العينة. يصف "Omics" مجموعة من التقنيات التي تستكشف أدوار وعلاقات وإجراءات الجزيئات في الكائنات الحية أو المجتمعات. يتضمن ذلك دراسات الجينات ووظيفتها ، أو "علم الجينوم" ، و "البروتينات" ، دراسة البروتينات وأدوارها. على سبيل المثال ، يمكن أن يسمح تسلسل 16S RNA من العينات بتحديد ميتاجينومي لأنواع معينة داخل المجتمع ، مما يعطي تقديرا أكثر تفصيلا للتنوع. يمكن أن يمنح هذا النهج العلماء فهما أفضل لتكوين الأنواع في المجتمع ، والأدوار التي قد يقومون بها.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لاستخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري. يجب أن تفهم الآن كيفية استخراج الحمض النووي من مجتمع بكتيري ، وكيفية التحقق من جودة هذا الحمض النووي ، وكيف يمكن استخدام هذا الحمض النووي للتحقيقات في تكوين المجتمع البكتيري. شكرا للمشاهدة!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
استخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري هو عملية يتم من خلالها الحصول على الحمض النووي من أنواع بكتيرية متعددة داخل المجتمع أثناء إجراء استخراج واحد.
عادة ما تتضمن التحليلات التقليدية للمجتمعات الميكروبية في التربة فحوصات ثقافية ، باستخدام منهجية التخفيف والطلاء على وسائط انتقائية مختلفة. ومع ذلك ، فإن العديد من البكتيريا تنمو بشكل سيئ في ظل ظروف المختبر أو في ظروف وسائط النمو المحددة المختارة ، مما يعني أنها قد تفوتك أو ممثلة تمثيلا ناقصا بشدة.
في الآونة الأخيرة ، سمح استخراج الحمض النووي للمجتمع من عينات بكتيرية التربة بأخذ عينات أكثر شمولا من المجتمعات البكتيرية. يعتقد أن هذا النهج غير القائم على الثقافة أكثر تمثيلا للمجتمعات الفعلية الحالية من الأساليب التقليدية القائمة على الثقافة.
سيوضح هذا الفيديو طريقة غير مزروعة لاستخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري ، وكيفية التحقق من جودة وكمية الحمض النووي المستخرج ، واستكشاف كيفية استخدام هذا الحمض النووي لدراسة التنوع البكتيري.
يمكن إجراء استخراج الحمض النووي من التربة بإحدى طريقتين. في طريقة التجزئة ، يتم فصل الخلايا أولا عن مصفوفة التربة قبل استخراج المادة الوراثية. ثم تخضع العينة لدورات متتالية من المزج والطرد المركزي البطيء من أجل جمع الخلايا السليمة في الحبيبات.
ثم تضاف الليزوزيم إلى الخلايا ، ويتم تحضين المعلق. الليزوزيم هي إنزيمات تكسر جدران الخلايا البكتيرية. بمجرد اختراق بنية جدار الخلية ، يمكن بعد ذلك تحرير الحمض النووي للتنقية. ومع ذلك ، فقد ثبت أن الطريقة الثانية لاستخراج الحمض النووي المجتمعي ، وهي الطريقة في الموقع ، تنتج تركيزا أكبر للحمض النووي.
هنا ، يتم دمج كتلة من التربة مع حجم مكافئ من مخزن الاستخراج Tris-EDTA والخرز الزجاجي ، ويتم خلطها بقوة لتسهيل فصل الخلايا عن جزيئات التربة. ثم يضاف المنظف ، بشكل عام كبريتات دوديسيل الصوديوم ، أو SDS ، ويتم مزج العينة بشكل أكبر لتعزيز تحلل الخلايا وإطلاق محتوياتها ، بما في ذلك الحمض النووي.
ثم يتم إجراء الحضانة عند درجة حرارة عالية لتحلل أي خلايا بكتيرية متبقية. يتم طرد العينات ، ويتم إجراء استخراج واحتضان البولي إيثيلين جلايكول على المادة الطافية من أجل ترسيب الحمض النووي ، والذي يتم طرده بعد ذلك في حبيبات.
يتم إعادة تعليق الحمض النووي في TE Buffer وخلات البوتاسيوم من أجل غسل الحمض النووي للبروتينات والسكريات ، ثم يتم إجراء الطرد المركزي لحبيبات هذه المكونات غير المرغوب فيها. تتم إزالة المادة الطافية المائية التي تحتوي على الحمض النووي ، وإخضاعها لاستخراج الفينول كلوروفورم وترسيب الأيزوبروبانول لمزيد من التنظيف والتركيز على الحمض النووي. بعد فترة حضانة درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ، يتم طرد الحمض النووي وإعادة تعليقه في TE Buffer للتخزين حتى التحليل.
الآن بعد أن أصبحنا على دراية بالمفاهيم والعمليات الكامنة وراء استخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري ، دعنا نلقي نظرة على كيفية إجراؤه في المختبر.
لبدء الإجراء ، قم بوزن 100 غرام من التربة المنخلة. أضف هذا إلى وعاء من مادة البولي بروبلين ، وأضف 100 مل من مخزن الاستخراج المخزن المؤقت المكون من مخزن ثلاثي المخزن المؤقت المعدل باستخدام EDTA لتعزيز إطلاق البكتيريا من مصفوفة التربة ، ثم رجها باليد.
بعد ذلك ، قم بوزن 100 غرام من الخرز الزجاجي ، وأضفها إلى وعاء الخلط. حرك العينة لمدة 5 دقائق باستخدام جهاز ضرب الخرزة أو شاكر ميكانيكي للمعصم. أضف 10 مل 20٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم ، أو SDS ، إلى الخليط ، ثم حركه لمدة دقيقة إضافية. احتضن العينة على درجة حرارة عالية لمدة 60 دقيقة.
قم بتوزيع العينة بالتساوي بين أنابيب منفصلة سعة 50 مل ، وجهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 6,000 × جم. انقل المادة الطافية من الأنابيب إلى حاوية واحدة معقمة. بعد ذلك, كرر الاستخراج على حبيبات التربة كما هو موضح سابقا, باستخدام حجم جديد من المخزن المؤقت للاستخراج.
بعد ذلك ، أضف الحجم الإجمالي للطافي المعالج إلى أنبوب نظيف سعة 50 مل مملوء بنصف الحجم بمحلول 30٪ من البولي إيثيلين جلايكول و 1.6 مليون كلوريد الصوديوم. اقلب الزجاجات عدة مرات باليد لخلطها ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 20 دقيقة لحبيبات الحمض النووي.
قم بإزالة المادة الطافية بعناية من أنبوب الطرد المركزي ، تاركا وراءها حبيبات الحمض النووي المنقاة جزئيا. أضف 20 مل من TE Buffer و 1.5 مل من محلول أسيتات البوتاسيوم 7.5 M لإعادة تعليق الحبيبات ، ثم الدوامة. ضع المعلق على الثلج لمدة 5 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4؟ C لترسيب البروتينات والسكريات.
بعد ذلك ، أضف RNAse و proteinase K إلى العينة ، واخلطها برفق باليد ، واتركها للحظة. أضف حجما مكافئا من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل إلى المعلق المراد استخراجه ، واخلطه برفق باليد. الطرد المركزي التحضير لمدة 10 دقائق عند 13,000 × جم. قم بإزالة الوعاء بعناية من جهاز الطرد المركزي ، ولاحظ الطبقتين.
تتكون الطبقة السفلية الأثقل من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل والحطام المستخرج ، والطبقة العليا هي المائية وتحتوي على الحمض النووي. ضع الطور المائي في وعاء معقم ، وأضف حجما مكافئا من الأيزوبروبانول ، واقلبها برفق لبدء ترسيب الحمض النووي. احتضان التعليق في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. بيليه الحمض النووي المنقى عن طريق الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية لأن الحمض النووي المحبب قد يكون مرئيا أو لا يكون مرئيا في قاع الوعاء ، ثم أعد تعليقه في 1 مل من TE Buffer.
باستخدام مقياس الطيف الضوئي أو مقياس فلوري القياس الكمي للحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، قم بقياس مستوى الحمض النووي المستخرج من العينة. ستنتج مقاييس فلورية الحمض النووي / الحمض النووي الريبي مستويات الحمض النووي بوحدات نانوجرام لكل ملليلتر. إذا كان التركيز مرتفعا جدا لإجراء قراءات دقيقة ، فقم بتخفيف المعلق من 1 إلى 10 ، أو 1 إلى 100 باستخدام الماء الجزيئي.
بمجرد الحصول على الحمض النووي من مجتمع بكتيري ، يمكن استخدام ذلك بعدة طرق مختلفة. يتم استكشاف بعض هذه التطبيقات هنا.
يمكن أن توفر التحليلات الطيفية للحمض النووي المستخرج من الحمض النووي للمجتمع نظرة ثاقبة لعدد الخلايا البكتيرية الموجودة في عينة معينة من التربة. يمكن ربط الكمية المقدرة للحمض النووي في نانوغرام لكل مل من المحلول بالحجم الإجمالي للحمض النووي المستخرج في المحلول ، لإعطاء الكمية الإجمالية للحمض النووي لكل غرام من التربة. بمعرفة القيمة النظرية للحمض النووي لكل خلية ، يمكن حساب العدد الإجمالي للخلايا لكل غرام من التربة.
بالنسبة للتطبيقات الأكثر استهدافا ، يمكن إخضاع الحمض النووي المستخرج من المجتمعات البكتيرية لتفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد ما إذا كان نوع معين موجودا داخل المجتمع. على سبيل المثال ، قد يرغب العلماء في تحديد ما إذا كانت عينات التربة تحتوي على مسببات أمراض معينة ، مثل Clostridium perfringens أو Bacillus anthracis.
أخيرا ، للحصول على فهم أكثر شمولا للبكتيريا الموجودة في المجتمع ، يمكن أن تخضع عينات الحمض النووي لتوصيف "أومي" والمعلوماتية الحيوية التي تسمح بتحليل أعمق للبكتيريا الأصلية داخل العينة. ? أوميكس؟ يصف مجموعة من التقنيات التي تستكشف أدوار وعلاقات وإجراءات الجزيئات في الكائنات الحية أو المجتمعات. وهذا يشمل دراسات الجينات ووظيفتها ، أو ؟ علم الجينوم؟، و؟ البروتينات؟, دراسة البروتينات وأدوارها.? على سبيل المثال ، تسلسل 16S؟ يمكن أن يسمح الحمض النووي الريبي من العينات بتحديد ميتاجينومي لأنواع معينة داخل المجتمع ، مما يعطي تقديرا أكثر تفصيلا للتنوع. يمكن أن يمنح هذا النهج العلماء فهما أفضل لتكوين الأنواع في المجتمع ، والأدوار التي قد يقومون بها.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لاستخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري. يجب أن تفهم الآن كيفية استخراج الحمض النووي من مجتمع بكتيري ، وكيفية التحقق من جودة هذا الحمض النووي ، وكيف يمكن استخدام هذا الحمض النووي للتحقيقات في تكوين المجتمع البكتيري. شكرا للمشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is community DNA extraction better than traditional culture-based methods for studying soil bacteria?
Community DNA extraction is a non-culture-based approach that captures DNA from multiple bacterial species in a single procedure, providing a more representative sample of actual communities. Traditional culture-based methods miss bacteria that grow poorly in laboratory conditions, capturing less than 1% of soil bacteria. DNA extraction reveals the true diversity and genetic potential of microbial communities.
Q2: What are the two main methods for extracting community DNA from soil?
The fractionation method separates cells from soil using blending and centrifugation, then uses lysozymes to break down cell walls before DNA extraction. The in situ method, which yields greater DNA concentration, combines soil with extraction buffer and glass beads, then adds detergent and heat to lyse cells directly in the soil matrix, releasing DNA for purification.
Q3: How do you measure the quality and quantity of extracted community DNA?
DNA concentration is measured using a spectrophotometer or DNA/RNA quantification fluorimeter, which outputs results in nanograms per milliliter. If the concentration is too high for accurate readings, dilute the sample 1:10 or 1:100 using molecular grade water. These measurements allow calculation of total DNA per gram of soil and estimation of bacterial cell numbers.
Q4: What role does phenol-chloroform extraction play in community DNA purification?
Phenol-chloroform extraction removes proteins, polysaccharides, and other contaminants from the DNA sample. The mixture separates into two layers during centrifugation: the bottom layer contains phenol-chloroform and debris, while the top aqueous layer contains purified DNA. This step is critical for obtaining clean DNA suitable for downstream molecular analysis.
Q5: How can community DNA be used to identify specific bacterial pathogens in soil?
DNA extracted from bacterial communities can be subjected to PCR to determine if particular species are present. Scientists can target specific pathogens such as Clostridium perfringens or Bacillus anthracis using detecting environmental microorganisms with the polymerase chain reaction and gel electrophoresis to confirm their presence in soil samples.
Q6: What is metagenomic analysis and how does it reveal bacterial community composition?
Metagenomic analysis uses omics technologies, including 16S RNA sequencing, to characterize genes and proteins in bacterial communities without culturing. Sequencing 16S RNA allows identification of specific species present and their relative abundance, providing a detailed estimate of community diversity and the functional roles different bacteria may undertake in the ecosystem.
Q7: Why is the in situ DNA extraction method preferred over the fractionation method?
The in situ method yields greater DNA concentration than the fractionation method because it lyses cells directly within the soil matrix using detergent and high-temperature incubation. This approach minimizes DNA loss during cell separation and extraction steps, making it more efficient for obtaining sufficient DNA from complex soil bacterial communities for comprehensive analysis.
الفصول في هذا الفيديو
0:00
Overview
1:18
Principles of Bacterial Community DNA Extraction
3:48
Bacterial Community DNA Extraction
7:35
Applications
9:32
Summary