سحب الدم I

يعد جمع الدم مطلبا شائعا للعديد من الدراسات البحثية التي تشمل الفئران والجرذان. يعتمد اختيار طريقة سحب الدم في هذه على العديد من العوامل مثل حجم الدم المطلوب ، وتكرار أخذ العينات ، والحالة الصحية للحيوان المراد نزيفه ، ومستوى مهارة الفني.

هنا ، سنراجع هذه الاعتبارات ونحدد إجراءات جمع الدم بما في ذلك نزيف العين الرجعي الحجاجي ، وقصاصات الذيل والشقوق ، بالإضافة إلى جمع الدم داخل القلب. للحصول على طرق أخرى ، انظر الفيديو الثاني في هذه السلسلة.

قبل الخوض في بروتوكولات سحب الدم ، دعنا أولا نراجع بعض الاعتبارات العامة بما في ذلك نوع العينة واختيار الإبرة والحد الأقصى لحجم الدم الذي يمكن جمعه. قبل جمع الدم من الفأر أو الفأر ، يجب تحديد نوع عينة الدم المطلوبة. قد تتطلب الإجراءات التجريبية دما كاملا أو بلازما أو مصل.

في حالة جمع الدم الكامل ، يجب إضافة مضاد للتخثر إلى العينة لمنع التخثر. تشمل مضادات التخثر شائعة الاستخدام الهيبارين وسيترات الصوديوم وحمض إيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك ، والمختصرة باسم EDTA. يمكن تحميل مضادات التخثر مباشرة في المحقنة لتغطية الأسطح. هذا يسمح بملامسة مضادات التخثر مباشرة حيث يتم سحب الدم مما يساعد في منع التخثر. نظرا لأن القوارض تتخثر الدم بسرعة ، فمن الضروري استخدام النسبة الصحيحة لمضادات التخثر إلى الدم. يتطلب جمع البلازما الطرد المركزي للدم كله بمضادات التخثر. بعد الدوران ، يكون السائل الشفاف فوق طبقة كرات الدم البيضاء والصفائح الدموية هو البلازما. يحتوي على الفيبرينوجين وعوامل التخثر الأخرى. من ناحية أخرى ، يتم جمع المصل من عينة الدم الكاملة بدون مضادات التخثر. ولأن العينة قد تجلت ، فإن المصل ، وهو اللاعب الأول ، لا يحتوي على الفيبرينوجين أو عوامل التخثر الأخرى.

يعتمد اختيار الإبرة على حجم وموقع بزل الوريد. بشكل عام ، تسبب الإبر ذات التجويف الكبير أضرارا أقل لخلايا الدم وتمكن من جمع الدم بشكل أسرع. ولكن من المرجح أن تتسبب في تلف الأوعية الدموية. يجب أيضا مراعاة طول الإبرة. إذا كانت الإبرة طويلة جدا ، فقد يكون استخدامها محرجا ، أو يمكن أن يبدأ الدم في التجلط بينما لا يزال داخل الإبرة. تتراوح خيارات الحجم من 18 إلى 29 مقياسا وطولها من 0.5 إلى 1.5 بوصة. ستتم مناقشة حجم الإبرة المناسب لكل طريقة في قسم الإجراءات.

أخيرا ، نظرا لصغر حجم القوارض ، هناك حد أقصى لكمية الدم التي يمكن جمعها من سحب دم واحد ، والتي لن تسبب ضررا خطيرا للكائن الحي. يمكن أن يكون سحب الدم بدون أو مع استبدال السوائل - وعادة ما يتم باستخدام محلول ملحي فسيولوجي بنسبة 0.9٪. يتم سرد الحد الأعلى في كل حالة في بروتوكول النص أدناه. علاوة على ذلك ، تتطلب بعض التجارب جمع عينات متعددة وفي مثل هذه الحالات ، سيحتاج إلى وقت بينهما لتجديد خلايا الدم أيضا. مرة أخرى ، هناك حد أقصى للمبلغ الذي يمكن تحصيله أثناء التجميع التسلسلي ، ويتم سرد الحدود العليا في البروتوكول أدناه.

بعد مراجعة بعض الاعتبارات العامة ، دعنا ننتقل إلى تقنيات سحب الدم المحددة ، بدءا من النزيف المداري الرجعي - وهي تقنية يستخدمها العلماء لجمع كميات صغيرة من الأوعية القريبة من العين. لاحظ أن التركيب التشريحي للمنطقة المدارية يختلف بين الفأر والجرذ. تحتوي الفئران على ضفيرة من الأوعية التي تتدفق خلف العين ، في حين أن الفأر لديه مجموعة من الأوعية التي تخلق جيبا أنفيا مداريا رجعيا ، مما يجعل من السهل تنفيذ هذا الإجراء في الفئران.

ابدأ بالامساك بأنبوب لجمع الدم. يفضل استخدام أنابيب الهيماتوكريت الدقيقة التي تحتوي على 50-75 ميكرولتر. ضع عدة مناشف ورقية أو مواد عازلة أخرى على سطح العمل. هذا للحفاظ على حرارة جسم أثناء العملية. الآن تخدير باستخدام مخدر استنشاق مثل الأيزوفلوران. بمجرد تخدير بالكامل ، أخرجه من الغرفة وضعه على جانبه الموجود في وضع الاستلقاء الجانبي. بعد ذلك ، ضع إصبعا على الجزء العلوي من الرأس وعلى طول خط الفك واسحب الجلد للخلف ولأسفل للحث على نتوء العين. تجنب الضغط على القصبة الهوائية لأن ذلك قد يسبب الوفاة بسبب الاختناق. بعد ذلك ، ضع أنبوب الهيماتوكريت الدقيق في القناة الإنسية للعين ووجهه ذيليا بزاوية 30 إلى 45 درجة من مستوى الأنف. اضغط أثناء تدوير الأنبوب برفق. سيؤدي ذلك إلى قطع أغشية الملتحمة وتمزق الضفيرة العينية أو الجيوب الأنفية. سوف يتدفق الدم إلى أنبوب الهيماتوكريت عن طريق العمل الشعري. تجنب دفع الأنبوب بعمق لدرجة أنك تصطدم بالعظم الموجود في الجزء الخلفي من تجويف العين. بمجرد أن يبدأ الدم في التدفق ، حافظ على الضغط للحفاظ على العين بارزة. لوقف النزيف ، حرر الجلد واترك العين تعود إلى وضعها الطبيعي. الضغط لتعزيز الإرقاء. لجمع العينات المتكررة ، اترك ما لا يقل عن 10 أيام بين النزيف. هذا يوفر للأنسجة بعض الوقت للشفاء.

على الرغم من أن النزيف الرجعي الحجاجي إجراء شائع ، إلا أن هناك العديد من المخاوف بشأن إنسانيته. وتشمل هذه التورم بسبب الحركة المفرطة لأنبوب الهيماتوكريت. وهذا بدوره يمكن أن يتسبب في نتوء مقلة العين وإعاقة إغلاق الجفن مما يؤدي إلى جفاف القرنية وتلفها وألم ، مما قد يؤدي إلى الخدش وتشويه الذات. يمكن أن يؤدي الوضع غير الصحيح للأنبوب الهيماتوكريتي إلى قطع العصب البصري مما يؤدي إلى العمى. من المضاعفات المحتملة الأخرى أنه يمكن إجبار العين على الخروج من المدار ، مما يسمح للجفون بالوقوع خلف مقلة العين. علاوة على ذلك ، يمكن أن تنشأ مشاكل من كسر عظام المدار الهشة ، أو تغلغل كرة العين مما يؤدي إلى فقدان الخلط الزجاجي ، أو تكوين ورم دموي خلف العين يمكن أن يؤدي إلى ألم شديد. على الرغم من كل هذه المخاوف ، إذا قام فني ماهر بإجراء العملية وتم تخدير بالكامل ، فإن النزيف الرجعي الحجاجي هو وسيلة فعالة لجمع الدم في القوارض.

الآن دعنا نراجع اعتبارات وإجراءات نزيف الذيل ، والتي تسمح بجمع عينات تسلسلية من الأحجام الصغيرة. تشمل المعدات اللازمة لهذا الإجراء مشرط معقم رقم 11. لا ينبغي استخدام المقص لأن القطع الذي يتم إجراؤه بواسطة المقص يسحق ، مما قد يعزز التخثر ويقلل من تدفق الدم. الأدوات الأخرى هي أنبوب تقييد يسمح بالوصول إلى ذيل. مناشف ورقية ماصة أنابيب الجمع أو الهيماتوكريت ومسحوق التمطيخ - للمساعدة في الإرقاء.

ابدأ بتأمين في أنبوب التقييد. ثم امسح الذيل بالماء الدافئ لإزالة الحطام والتسبب في توسع طفيف للأوعية. لا تستخدم الماء الساخن. قم بتمديد الذيل وباستخدام شفرة المشرط ، قم بقص نهاية الذيل لجمع الدم باستخدام الهيماتوكريت أو أنابيب التجميع. يمكن ضرب الذيل أو "حلبه" من الردف إلى الحافة لتشجيع تدفق الدم. ومع ذلك ، سيؤدي ذلك إلى تقليل جودة العينة.

لوقف النزيف ، اضغط على طرف الذيل باستخدام وسادة شاش. يمكن استخدام المسحوق الستيبتيك لتحقيق الإرقاء. افحص كل 5 إلى 10 دقائق للتأكد من تحقيق الإرقاء ، والذي قد يتأخر بعد أخذ العينات المتكررة. يمكن أن تحتوي العينة التي تم جمعها من قصاصة الذيل على كل من الدم الشرياني والوريدي ، إلى جانب تلوث منتج الأنسجة. ومع ذلك ، فإن هذا الإجراء لجمع الدم يسمح بالجمع التسلسلي عن طريق تعطيل الجرب أو الجلطة في القطع الأصلي في نهاية الذيل.

طريقة بديلة لجمع الدم لقصاصة الذيل هي شق وعاء الذيل ، وهو أقل توغلا نسبيا. لهذا الغرض ، باستخدام نفس شفرة المشرط ، قم بعمل قطع صغير مباشرة فوق وريد الذيل الجانبي ، ما يقرب من ثلثي المسافة من الردف. كما هو الحال مع قصاصات الذيل ، يمكن جمع الدم في أنابيب التجمع أو الهيماتوكريت. ومن الضروري ضمان الإرقاء عن طريق الضغط على الموقع وإعادة فحص كل 5-10 دقائق. ومع ذلك ، كما هو الحال مع قصاصة الذيل ، قد تكون العينات ملوثة بمنتجات الأنسجة.

غالبا ما تتطلب الدراسات التي تتطلب عينة دم كبيرة غير قابلة للبقاء على قيد الحياة ، والتي يتم إجراؤها من خلال النزيف عن طريق النزيف داخل القلب أو الوريد الأجوف الذيلي.

بالنسبة للطريقة داخل القلب في الفئران ، تحتاج إلى حقنة 3 سم مكعب بإبرة قياس 22-25 1 بوصة. وبالنسبة للفئران ، يفضل استخدام حقنة 10-12 سم مكعب بإبرة قياس 18 بوصة 1.5 بوصة. راجع البروتوكول أدناه لفهم سبب كون هذه الاحتياجات والمحاقن مثالية.

ابدأ بالقتل الرحيم للحيوان باستخدام ثاني أكسيد الكربون. بعد القتل الرحيم ، أمسك القوارض من القفص مع تعليق الجسم عموديا. هذا التقييد أمر بالغ الأهمية حيث يجب أن يكون الجسم مستقيما لمنع انحراف القلب أو التواء الصدر. لاحظ أن القلب يقع تقريبا على مستوى الكوع. يوجد جانب الإدخال في الشق على يسار الخنجري مباشرة ، بالتوازي مع العمود الفقري وتحت الأضلاع.

أدخل الإبرة ، شطبة ، في الصدر وثقب القلب. ضع ضغطا عكسيا طفيفا باستخدام المحقنة. إذا كانت الإبرة في القلب ، فسوف يتدفق الدم إلى المحقنة. انتظر حتى يملأ الدم البرميل قبل إضافة ضغط خلفي إضافي. يمكن جمع ما يقرب من نصف إجمالي حجم الدم من الفأر أو الجرذ عن طريق ثقب القلب. هذا يعادل ما يقرب من 1 مل من الدم من فأر متوسط وحوالي 10 مل من الدم من فأر متوسط

الوضع البديل هو الاستلقاء الظهري عند استخدام النهج الجانبي. في هذه الحالة ، ضع الإبرة بين الضلوع على الجانب الأيسر للحيوان. يتم قياس نقطة الدخول مقابل نقطة الكوع على جدار الصدر. أدخل الإبرة ، شطبة لأعلى ، عموديا على مستوى الطاولة عند نقطة في منتصف الطريق على جدار الصدر. ضع ضغطا خلفيا طفيفا باستخدام المحقنة. إذا كانت الإبرة في القلب ، فسوف يتدفق الدم إلى المحقنة. مرة أخرى ، انتظر حتى يملأ الدم البرميل قبل إضافة ضغط خلفي إضافي. لاحظ أنه في أي من الموضعين ، قد يؤدي الضغط الخلفي المفرط إلى انهيار القلب مما يؤدي إلى انسداد شطبة الإبرة وإيقاف تدفق الدم إلى المحقنة.

هناك طريقة أخرى لجمع دم القلب وهي من خلال الوريد الأجوف الذيلي. المعدات اللازمة لهذا الإجراء هي حقنة مناسبة مع إبرة ذات حجم صحيح مرفقة. مقص لفتح تجويف البطن ، ملقط الإبهام الصغير الرضحي وإسفنج الشاش. تتطلب هذه التقنية تخدير بعمق وصيانته تحت التخدير طوال العملية. CO2 الخدير ليس خيارا ، حيث يجب أن ينبض قلب لهذا الإجراء. ضع في وضع الاستلقاء الظهري ، وقم بتأمين الأطراف على المنصة. يجب تمديد الأطراف بعيدا عن الجسم.

الآن ارفع الجلد بالملقط واستخدم المقص لعمل قطع عرضي صغير عبر الجلد فوق الحوض مباشرة عند الإناث أو قلفة عند الذكور. بعد ذلك ، ضع نقطة المقص في القطع وقم بعمل شق خط الوسط عبر الجلد من الحوض أو القلفة إلى الخنجري. مع انعكاس الجلد بشكل جانبي ، ارفع العضلات وقم بعمل قطع عرضي صغير عبر العضلات ، فوق قطع الجلد مباشرة.

ضع نقطة المقص في البطن وقم بعمل شق خط الوسط عبر العضلة إلى الخنجري. تأكد من توجيه نقطة المقص لأعلى لمنع قطع أي أعضاء. قطع عرضيا على طول منحنى الأضلاع على كل جانب. احرص على عدم ثقب الكبد. حرك الأمعاء برفق إلى يسار لكشف الوريد الأجوف الخلفي. ضع وسادة شاش على الكبد ووضع السبابة والإصبع الأوسط عليها. بيدك الأخرى ، أدخل الإبرة ، وشروبها في الوريد الأجوف ، في منتصف الطريق بين تقاطع الأوعية الكلوية والتشعب الحرقفي. اسحب الدم ببطء أثناء الضغط على الكبد.

تجنب حركة اليد، حيث قد يتسبب ذلك في تمزق الوعاء الدموي. أيضا ، يمكن أن يتسبب سحب الدم السريع جدا في انهيار الوعاء الدموي على الشطبة مما يسد الفتحة ويمنع تجمع الدم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على جمع عينة معقمة لأن الإبرة لا تمر عبر الجلد.

أخيرا ، دعونا نلقي نظرة على بعض تطبيقات تقنيات سحب الدم هذه. علم الأورام المناعي هو مجال ناشئ ، وغالبا ما يقوم الباحثون في هذا المجال بجمع الدم لدراسة الخلايا المناعية في مراحل مختلفة من تطور السرطان. على سبيل المثال ، جمع الباحثون هنا دم القلب من الفئران الحاملة للسرطان لعزل العدلات وتحديدها في عشرة وعشرين وثلاثين يوما بعد نقش الورم.

من ناحية أخرى ، يتم أيضا دراسة تكوين الدم بشكل متكرر من قبل علماء وظائف الأعضاء. كما هو الحال في هذه الدراسة ، كان الباحثون مهتمين بتقييم وظائف الكلى في المصابة بالسكري. من أجل القيام بذلك ، قام هؤلاء العلماء أولا بحقن صبغة في نموذج حيواني لمرض السكري. بعد ذلك ، استخدموا بعد ذلك طريقة قص الذيل لجمع الدم في عدة نقاط زمنية لتقييم تركيز الصبغة في الدم ، والتي استخدمت في النهاية لحساب معدل الترشيح الكبيبي الذي سلط الضوء على الاختلاف في وظائف الكلى بعد تحريض مرض السكري.

أخيرا ، يستخدم باحثو الخلايا الجذعية عينات الدم لتقييم نجاح دمج الخلايا المانحة في نظام المتلقي. هنا ، قام الباحثون أولا بزرع خلايا نخاع العظم من فأر ذكر إلى نوع بري أنثوي معدل وراثيا عن طريق حقن وريد الذيل. بعد ذلك ، قاموا بجمع الدم من الجيوب الأنفية المدارية الرجعية للفأر المتلقي لدراسة الحمض النووي الجيني لخلايا الدم باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل. قدم هذا النسبة المئوية لنقش الخلايا المانحة في نوعي.

لقد شاهدت للتو الدفعة الأولى من JoVE حول تقنيات سحب الدم. يرجى مشاهدة الفيديو التالي في سلسلة لمراجعة كيفية أداء التقنيات الأخرى الشائعة الاستخدام لجمع الدم في المختبر. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!