كروماتوغرافيا التبادل الأيوني
المصدر: مختبر الدكتورة ب. جيل فينتون - جامعة فيرجينيا
كروماتوغرافيا التبادل الأيوني هي نوع من الكروماتوغرافيا التي تفصل بين التحليلات بناء على الشحنة.…
1. تحضير العينة والعمود
- في هذا العرض التوضيحي ، سيتم فصل خليط من بروتينين على عمود التبادل الكاتيوني: الهيموجلوبين والسيتوكروم C. أضف 0.2 مل من المخزن المؤقت للتوازن (الرقم الهيدروجيني 8.1) إلى عينة البروتين والدوامة لخلطها جيدا. جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة لإزالة أي رغوة.
- ضع عمود التبادل الكاتيوني في أنبوب اختبار لمدة 5 دقائق للسماح للراتنج بالاستقرار. قم بتثبيت أنبوب الاختبار مع العمود على حامل حلقي للتأكد من أنه في وضع مستقيم.
- افتح الغطاء العلوي للعمود ، ثم الغطاء السفلي. اسمح للمخزن المؤقت في العمود بالتنقيط تحت الجاذبية في أنبوب الاختبار.
- اغسل العمود مرتين بحجم عمود (في هذه الحالة يكون حجم العمود 0.3 مل) من المخزن المؤقت للتوازن. دع حجم العمود الأول (0.3 مل) من المخزن المؤقت للتوازن يتساقط في قارورة النفايات قبل إضافة حجم العمود الثاني. تتيح هذه الخطوة للعمود التوازن مع المخزن المؤقت للتوازن. أضف المخزن المؤقت للتوازن ببطء في هذه الخطوة حتى لا يزعج الراتنج.
2. تشغيل عينة بروتين من خلال عمود التبادل الكاتيوني
- ضع العمود في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل يسمى "غير مرتبط 1". قم بتحميل 0.1 مل من عينة البروتين بعناية في الجزء العلوي من العمود.
- بمجرد تحميل العينة في الجزء العلوي من العمود ، اغسلها ب 0.3 مل من المخزن المؤقت للتوازن عن طريق إضافة المخزن المؤقت في الجزء العلوي من العمود والسماح لها بالتنقيط بالكامل. كرر هذه الخطوة 4 مرات (ليصبح المجموع 5 غسلات) واجمع كل غسلة في أنبوب طرد مركزي منفصل سعة 2 مل. قم بتسمية الأنابيب على أنها "غير مرتبطة 1-5".
- في آخر غسلتين ، جهاز طرد مركزي لمدة 10 ثوان عند 1,000 × جم للتأكد من خروج جميع الأنواع غير المنضمة من العمود. يجب ألا تكون أي عينة ترتبط بالعمود في هذه الغسلات ، ولكن العينة التي لا تلتصق ستغسل دون الاحتفاظ بها. يوفر الطرد المركزي مزيدا من القوة لغسل المواد غير المنضمة من العمود.
- ضع العمود في أنبوب تجميع أجهزة الطرد المركزي الجديد سعة 2 مل المسمى "Bound 1". ضع 0.3 مل من محلول الشطف (ملح عالي ، درجة حموضة 5.5) أعلى العمود. جهاز الطرد المركزي المادة الناتجة لمدة 10 ثوان عند 1,000 × g.
- كرر خطوة الشطف مرتين أخريين عن طريق وضع العمود في أنبوب طرد مركزي جديد ، وإضافة 0.3 مل ، والطرد المركزي لمدة 10 ثوان. قم بتسمية هذه "ملزمة 2 و 3".
- سجل أي تغييرات في اللون أو ملاحظات حول الكسور. الهيموجلوبين هو بروتين ملون يبدو بنيا محمرا بينما السيتوكروم C لونه ضارب إلى الحمرة.
3. النتائج: التبادل الكاتيوني للهيموجلوبين والسيتوكروم C
- يحتوي السيتوكروم C على pI 10.5 والهيموجلوبين pI 6.8. وبالتالي ، عند استخدام مخزن مؤقت لتوازن الأس الهيدروجيني 8.1 ، لا يرتبط الهيموجلوبين بالعمود لأنه سالب الشحنة. يتم شحن السيتوكروم C بشكل إيجابي عند هذا الرقم الهيدروجيني ويرتبط بالعمود لأن الرقم الهيدروجيني < pI.
- لوحظ الهيموجلوبين في الكسور غير المنضمة لأنه غير مرتبط بالعمود.
- لوحظ السيتوكروم C في الكسور المرتبطة ، لأنه كان مرتبطا بعمود التبادل الكاتيوني.
الشكل 1. صورة للجزء غير المرتبط (الهيموجلوبين) والكسر المرتبط (السيتوكروم C).
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
يستخدم كروماتوغرافيا التبادل الأيوني على نطاق واسع في فصل وعزل المركبات المشحونة ، وخاصة الجزيئات الحيوية الكبيرة.
يستخدم هذا النوع من الكروماتوغرافيا السائلة عمودا من حبات الطور الثابتة المعبأة ، يسمى الراتنج. تفصل هذه التقنية بين التحليلات بناء على تقاربها مع الراتنج المشحون.
هناك نوعان رئيسيان من هذه التقنية. في كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني ، يتم استخدام الراتنج سالب الشحنة لربط التحليلات الموجبة الشحنة. وبالمثل ، في تبادل الأنيون ، ترتبط التحليلات سالبة الشحنة بالراتنج موجب الشحنة. يتم غسل المركبات غير المنضمة من خلال العمود ، ويمكن بعد ذلك جمع المادة التحليلية في حاوية منفصلة.
سيقدم هذا الفيديو أساسيات كروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، ويوضح هذه التقنية عن طريق فصل خليط البروتين في المختبر.
المرحلة الثابتة هي عنصر أساسي للفصل الناجح. عادة ما تتميز راتنجات التبادل الكاتيوني القوية بمجموعات وظيفية قوية من الحمض ، مثل حمض السلفونيك. تتميز راتنجات التبادل الكاتيوني الضعيفة بمجموعات ضعيفة ، مثل الأحماض الكربوكسيلية.
وبالمثل ، تستخدم راتنجات تبادل الأنيون القوية قواعد قوية ، مثل الأمينات الرباعية ، بينما تستخدم راتنجات تبادل الأنيون الضعيفة الأمينات الثانوية أو الثالثة. يعتمد اختيار الراتنج على خصائص خليط العينة والتحليل المثير للاهتمام.
تعتبر المخازن المؤقتة المستخدمة ، والتي تسمى مجتمعة المرحلة المتنقلة ، مهمة أيضا للفصل ، لا سيما من حيث الرقم الهيدروجيني. بالنسبة للبروتينات ، يتم تحديد الأس الهيدروجيني بناء على نقطته متساوية الكهرباء ، أو pI. عند درجة الحموضة التي تساوي نقطة الهيدروجين للبروتين ، يكون البروتين محايدا. فوق pI ، سيكون لها شحنة سالبة صافية ، بينما أسفل pI ، سيكون لها شحنة موجبة صافية. يجب اختيار الرقم الهيدروجيني العازل بحيث يتم شحن البروتين بشكل صحيح وقادر على الارتباط بالمرحلة الثابتة.
كروماتوغرافيا التبادل الأيوني هي بشكل عام عملية من أربع خطوات. أولا ، يتم موازنة العمود المعبأ الذي يحتوي على راتنج التبادل الأنيوني أو الكاتيوني باستخدام المخزن المؤقت. بالنسبة لأعمدة تبادل الأنيون ، يتضمن ذلك بروتونات الراتنج ، مما يضمن شحنه إيجابيا.
بعد ذلك ، يتم تحميل العينة على العمود. يجب أن يكون للمخزن المؤقت موصلية منخفضة ، حيث يمكن للأنواع المشحونة أن تتنافس مع العينة للتفاعلات مع الراتنج. ترتبط مركبات الشحنة المعاكسة بالراتنج. تظل الجزيئات غير المشحونة أو التي تحمل نفس الشحنة غير مرتبطة.
في الخطوة الثالثة ، يتم غسل العمود بمخزن مؤقت إضافي لإزالة المكونات غير المنضمة من العمود ، تاركا الرابط وراءه.
أخيرا ، الخطوة الرابعة هي شطف المادة المراد تحليلها المقلدة. يتم تحقيق ذلك إما باستخدام تدرج الملح ، حيث يزداد تركيز الملح تدريجيا ، أو باستخدام مخزن مؤقت عالي لشطف الملح.
سيتم تصفية الجزيئات ذات الارتباط الضعيف أولا ، لأن الملح المنخفض سوف يزعج ارتباطها الأيوني بالراتنج بسهولة. المركبات الأكثر ارتباطا بقوة سوف تتخلص بتركيزات ملح أعلى.
الآن بعد أن تم تحديد أساسيات كروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، دعنا نلقي نظرة على استخدامه في فصل بروتينين.
أولا ، لتحضير خليط البروتين للفصل ، أضف 0.2 مل من المخزن المؤقت الملزم ، والدوامة لخلطها جيدا. ثم قم بالطرد المركزي للخليط لإزالة أي رغوة. لتحضير عمود التبادل الكاتيوني ، قم بتثبيته عموديا على حامل دائري ، واترك الراتنج يستقر.
افتح الغطاء العلوي للعمود ، ثم الجزء السفلي. اسمح للمخزن المؤقت بالتنقيط تحت الجاذبية في أنبوب أدناه.
لإعداد العمود ، قم بتوازنه عن طريق تحميل حجم عمود من المخزن المؤقت ، في هذه الحالة 0.3 مل. دع المخزن المؤقت يقطر من العمود إلى قارورة نفايات. بعد خروج وحدة تخزين عمود من المخزن المؤقت ، كرر خطوة التوازن.
لإجراء التجربة ، ضع أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل يسمى "Unbound 1" أسفل العمود. قم بتحميل 0.1 مل من عينة البروتين بعناية في الجزء العلوي من العمود.
بمجرد تحميل العينة ، اغسلها بحجم عمود من المخزن المؤقت واتركها تتدفق بالكامل. كرر لمدة 5 غسلات. اجمع كل غسلة في أنبوبها الخاص ، المسمى "غير منضم 1" إلى "5".؟ في آخر غسلتين ، قم بالطرد المركزي للعمود لمدة 10 ثوان للتأكد من أن جميع الأنواع غير المنضمة تغسل العمود. ضع العمود في أنبوب تجميع أجهزة الطرد المركزي الجديد سعة 2 مل ، وقم بتسميته "Bound 1".؟ قم بتحميل 1 حجم عمود من المخزن المؤقت للشطف أعلى العمود. جهاز طرد مركزي لمدة 10 ثوان عند 1,000 × جم.
كرر خطوة الشطف 2 مرات أخرى لضمان جمع المادة التحليلية المقلدة. قم بتسمية الأنابيب "ملزمة 2" و "3".؟ سجل أي تغييرات في اللون أو ملاحظات حول الكسور.
في هذا المثال ، تم فصل الهيموجلوبين والسيتوكروم C. يحتوي الهيموجلوبين على pI 6.8 ، بينما يحتوي السيتوكروم C على pI 10.5. في المخزن المؤقت لدرجة الحموضة 8.1 ، يكون الهيموجلوبين سالبا الشحنة ولا يرتبط بالعمود. على العكس من ذلك ، يتم شحن السيتوكروم C بشكل إيجابي عند درجة الحموضة 8.1 ويرتبط بالعمود.
تم العثور على الهيموجلوبين ، وهو بروتين بني اللون ، في الكسور غير المرتبطة ، بينما لوحظ السيتوكروم C ، وهو بروتين محمر اللون ، في الجزء المرتبط.
هناك العديد من أشكال الكروماتوغرافيا السائلة ، ولكل منها قدرات مختلفة على فصل مكونات الخليط.
في هذا المثال ، تم استخدام كروماتوغرافيا العمود لفصل خليط من الحمض النووي أحادي ومزدوج الشريطة. هيدروكسيباتيت ، أو HA ، هو شكل بلوري من فوسفات الكالسيوم يستخدم عادة كمرحلة ثابتة بسبب أيونات الكالسيوم الموجبة الشحنة. في هذه الحالة ، كان عمود HA مثاليا لفصل الحمض النووي حيث يمكن أن يرتبط بالعمود الفقري سالب الشحنة للحمض النووي.
شكل آخر من أشكال كروماتوغرافيا العمود التي تستخدم بشكل متكرر لفصل البروتينات هو كروماتوغرافيا تقارب المعادن المجمدة ، أو IMAC. في IMAC ، تمتلك المرحلة الثابتة رابطا بأيون معدني ، والذي يرتبط بعلامة هيستيدين على البروتين ذي الأهمية.
جميع المكونات الأخرى للخليط تخرج من العمود. ثم يتم تقويض البروتين بمحلول إيميدازول ، الذي له بنية مشابهة للهيستيدين ، ويرتبط بقوة أكبر بأيون المعدن.
التطبيق الشائع لكروماتوغرافيا العمود هو الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ، أو HPLC. يستخدم HPLC على نطاق واسع في الكيمياء التحليلية لتحديد وفصل المركبات البيولوجية وغير البيولوجية في الخليط.
يشبه HPLC كروماتوغرافيا العمود الموضح في هذا الفيديو ، باستثناء أنه مؤتمت ويعمل بضغوط عالية جدا. يتيح ذلك استخدام حبات أصغر من الطور الثابت ، مع مساحة سطح أعلى إلى نسبة حجم. وبالتالي ، فإن التفاعلات المحسنة بين المرحلة الثابتة والمكونات في المرحلة المتنقلة ممكنة.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لكروماتوغرافيا التبادل الأيوني. يجب أن تفهم الآن المفاهيم الكامنة وراءها ، والخطوات الأربعة المتضمنة ، وبعض التقنيات ذات الصلة.
شكرا للمشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between cation-exchange and anion-exchange chromatography?
Cation-exchange chromatography uses negatively-charged resin to bind positively-charged analytes, while anion-exchange chromatography uses positively-charged resin to bind negatively-charged analytes. The choice depends on the charge properties of your sample mixture and the analyte of interest. Selection of the appropriate resin type is critical for successful separation.
Q2: How does pH affect protein binding in ion-exchange chromatography?
Protein charge depends on pH relative to its isoelectric point (pI). At pH equal to the pI, the protein is neutral and won't bind. Above the pI, proteins are negatively charged; below it, they are positively charged. Buffer pH must be selected so the protein has the correct charge to bind to the resin effectively.
Q3: What are the four main steps in an ion-exchange chromatography procedure?
First, equilibrate the column with buffer to charge the resin. Second, load the sample in low-conductivity buffer so analytes bind based on charge. Third, wash with buffer to remove unbound components. Fourth, elute bound analytes using a salt gradient or high-salt buffer to recover the purified sample.
Q4: Why does salt concentration matter during elution in ion-exchange chromatography?
Salt ions compete with analytes for binding sites on the resin. Weakly bound molecules elute first at low salt concentrations, while strongly bound compounds require higher salt concentrations to disrupt ionic interactions and elute from the column. This allows selective recovery of analytes based on binding strength.
Q5: What types of resin are used in strong versus weak ion-exchange chromatography?
Strong cation-exchange resins feature sulfonic acid groups, while weak cation-exchange resins use carboxylic acids. Strong anion-exchange resins utilize quaternary amines, and weak anion-exchange resins use secondary or tertiary amines. Selection depends on sample properties and the desired separation outcome for your analyte.
Q6: How does ion-exchange chromatography compare to other separation techniques?
Ion-exchange chromatography separates based on charge and is more general than affinity chromatography, which requires specific antibodies for each analyte. Unlike high-performance liquid chromatography, which operates at high pressures with automated systems, ion-exchange uses gravity-driven flow and can be adapted for many proteins with different eluting conditions.
Q7: What is the role of buffer conductivity when loading samples onto an ion-exchange column?
Low-conductivity buffer is essential during sample loading because high salt concentrations cause charged species to compete with the sample for interactions with the resin. This competition reduces binding efficiency and separation quality, so the loading buffer must have minimal salt content to maximize analyte capture on the column.