إعداد وحيدة الخلية معلقات من الطحال ماوس مع Dissociator gentleMACS

ستشاهد في هذا البروتوكول المرئي كيفية تفكيك طحال الفئران باستخدام جهاز Gentle Max، وهو جهاز آلي يوضع على طاولة المختبر يمكنه تفتيت الأنسجة ميكانيكياً باستخدام أنابيب خاصة لإنتاج معلقات خلوية قابلة للحياة. وبعد التفكيك، يتم ترشيح الطحال باستخدام مرشحات الفصل Max Pres، ثم إجراء عملية الطرد المركزي، وتعليق الخلايا من أجل تطبيقات إضافية. مرحباً، اسمي ميلاني ملو.

أنا عالم في شركة Milton Biotech هنا في منتزه BE Lab Park بألمانيا. سأعرض لكم اليوم كيفية تحضير معلق خلوي أحادي من طحال الفأر باستخدام نظام GenX dissociation. يتيح نظام GenX dissociation تحضير المعلق الخلوي الأحادي بطريقة سهلة وسريعة للغاية.

لنبدأ الآن. ولتجنب عمليات الفصل اليدوية المملة والمؤلمة غالباً، يتيح جهاز gentle max di associator فصل الأنسجة بكفاءة عالية تحت ظروف مضبوطة وقابلة للتكرار. يتم فصل الأنسجة بلطف باستخدام أنابيب violet C للحصول على معلقات من خلايا مفردة حيوية.

يوفر أنبوب C فتحة محكمة بسدادة في منتصف الغطاء، مما يسمح باستخدام الماصة من الأنبوب مع الحفاظ الدائم على التعقيم. لتعليق الخلايا المفككة، ستحتاج إلى استخدام محلول PBS-BSA-EDTA المنظم المناسب. يتم تحضير المحلول المنظم بإضافة جزء واحد من محلول BSA المخزون إلى 20 جزءاً من محلول AutoMax fencing الذي يحتوي على EDTA.

باستخدام مرشحات فصل Max Pres، يتم تحرير عينات الأنسجة المفككة من جميع التجمعات الخلوية مما يعزز نجاح الفصل الأقصى والتحليل اللاحق. لبدء الإجراء، نقوم بتعبئة الأنبوب C بحجم من المنظم. ووفقاً لكتلة الطحال، فإن الطحال السليم لفأرة خزعة أنثى تبلغ من ستة إلى سبعة أسابيع يزن حوالي 80 إلى 120 milligrams.

يتطلب كل طحال واحد إلى اثنين من هذه الكتلة ثلاثة مليلترات من المحلول المنظم. لا تتجاوز الحجم الإجمالي البالغ 10 مليلترات. يمكننا الآن إضافة الطحال الذي تم تشريحه إلى الأنبوب C الذي يحتوي على ثلاثة مليلترات من المحلول المنظم. غالباً ما تكون الطحال المأخوذة من الحيوانات الأكبر سناً أو الحيوانات المصابة بالعدوى أكبر حجماً ويجب وزنها في المحلول المنظم.

يجب بعد ذلك تعديل أحجام المحلول المنظم وفقًا لذلك، ولكن يجب ألا يتجاوز الحجم الإجمالي 10 milliliters مرة أخرى. الآن، تأكد من إحكام إغلاق غطاء الأنبوب C وقم بتوصيل الأنبوب C بجهاز التفكيك. مع توجيه الغطاء للأسفل، قم بتشغيل عملية التفكيك لواحد إلى اثنين من spleens واختر Program M spleen oh one. سيستغرق البرنامج 56 ثانية للاكتمال؛ وإذا كان عدد spleens أكبر، استخدم program M spleen oh four.

يمكن استخدام هذا البرنامج لما يصل إلى 720 milligrams من نسيج الطحال. بعد اكتمال البرنامج، يتم تفكيك نسيج الطحال الأصلي إلى معلق خلايا PLE، والذي يبدو بهذا الشكل؛ قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة لتجميع العينة في قاع الأنبوب. سيضمن ذلك خلو الدوار والجزء الثابت من جميع الخلايا التي تم تجميعها في قاع الأنبوب C.

نقوم بسحب العينة من خلال الفتحة المختومة بالسدادة في غطاء الأنبوب C باستخدام ماصة سعة 1000 µL. لبدء خطوة الترشيح، نضع النسيج المفكك على مرشح فصل مسبق أو مصفاة ذات حجم مسام 30 micron. يجب أن تكون المصفاة مناسبة لأنبوب سعة 15 milliliter في حال استخدام طحال واحد إلى اثنين، أو أنبوب سعة 50 milliliter في حال استخدام أكثر من طحالين.

اترك معلق الخلايا يمر عبر المرشح، ثم اغسل المرشح بإضافة 5 mL من المحلول المنظم. الآن، قم بطرد مركزي للأنبوب الذي يحتوي على معلق الخلايا عند 300 Gs في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لتجميع جميع الخلايا في كريّة من خلايا الطحال. وبعد الحصول على كريّة من الخلايا المفككة، يجب سحب السائل الطافي وإعادة تعليق كريّة الخلايا في كمية مناسبة من محلول تفكيك خلايا الطحال المنظم.

سيؤدي استخدام gentle max إلى الحصول على نسبة عالية من خلايا PLE الحية، وهو ما يتم إثباته بواسطة قياس التدفق الخلوي باستخدام max quant. يتم صبغ الخلايا الميتة بـ Propidium iodide كما هو موضح في المثال المقدم. يظهر مخطط النقاط للتشتت الجانبي والأمامي خلايا SP المُحضّرة. حسناً.

لقد أوضحت لكم كيفية تفكيك أنسجة الطحال باستخدام جهاز Gentle X للتفكيك اللطيف. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم ضبط كمية المحلول المنظم وفقاً لحجم العينة واختيار برنامج Gentle X المناسب. حسناً، هذا كل شيء.

بالتوفيق في تجربتك.