Name: إعداد وحيدة الخلية معلقات من الطحال ماوس مع Dissociator gentleMACS (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: تعلم إعداد معلقات وحيدة الخلية من طحال الفئران باستخدام جهاز gentleMACS Dissociator الآلي. تُنتج هذه الطريقة خلايا حية عالية الجودة مناسبة لتحليل الخلايا وتطبيقات المناعة المتقدمة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

مقدمة لمعدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الأنسجة بلطف ، وذلك باستخدام أنابيب البنفسج C إلى تعليق وحيد الخلية قادرة على البقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستخدم EDTA العازلة PBS / جيش صرب البوسنة لفصل الخلايا. مستعدة العازلة إضافة 1 جزء من الحل للسهم BSA إلى 20 أجزاء من autoMACS الشطف محلول يحتوي على EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستخدم في فصل تمهيدي MACS مرشحات بحيث ينفصل عينات الأنسجة خالية من جميع كتل الخلية ، وتعزيز نجاح MACS الانفصال وتحليل لاحقة. </li></ol> عدم الربط بين خلايا الطحال <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والطحال disscociated كله الى وحيد الخلية من معلقات splenocytes باستخدام Dissociator gentleMACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للبدء في الإجراءات ، تحميل أنبوب C مع حجم المخزن المؤقت وفقا لكتلة الطحال. والطحال السليم للماوس الكبار BALB / ج الشابات يزن حوالي 80-120 ملغ. كل الطحال 1 إلى 2 من هذه الكتلة يتطلب 3 مل من العازلة. الطحال من الحيوانات القديمة أو الحيوانات مع الالتهابات غالبا ما تكون أكبر ويجب أن يوزن العازلة. ويجب توسيع وحدات التخزين العازلة وفقا لذلك. لا يتجاوز حجم المخزن ما مجموعه 10 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الطحال إضافة إلى أنبوب C تحتوي على 3 مل من العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن غطاء الأنبوبة C ضيق ونعلق أنبوب جيم للdissociator مع الغطاء لأسفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السلطة حتى dissociator. لمدة 1-2 الطحال ، حدد m_spleen_01 البرنامج. البرنامج سوف يستغرق 56 ثانية لإكمال. إذا كان عدد الطحال هو أكبر ، واستخدام برنامج m_spleen_04 ، ويمكن استخدام هذا البرنامج لمدة تصل إلى 720 ملغ من نسيج الطحال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من برنامج نسيج الطحال الأم هي نأت الى تعليق خلية طحالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار تعليق خلية كاملة في 300xg في درجة حرارة الغرفة لمدة حوالي 30 ثانية. وهذا ضمان الافراج عن الدوار والجزء الثابت من كافة الخلايا التي يتم جمعها في الجزء السفلي من أنبوب C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عينة عن طريق فتح الحاجز مختومة في سقف الأنبوبة باستخدام C pipetter ميكروليتر 1000. </li></ol> خطوة الترشيح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء الخطوة الترشيح ، وتطبيق فصل الأنسجة إلى تصفية ما قبل الانفصال أو مصفاة مع حجم الخلية 30 ميكرومتر المسام. يجب أن تتناسب مع أنبوب مصفاة 15 مليلتر لمدة 1-2 الطحال أو أنبوب 50 مل لأكثر من 2 الطحال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك التعليق الخلية بالمرور. ثم يغسل التصفية من خلال تطبيق 5 مل من العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن ، وأجهزة الطرد المركزي في أنبوب مع تعليق خلية في 300xg ، في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة لجمع كل splenocytes في الطحال بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن ، ان لدينا من بيليه splenocytes فصلها ، يجب علينا أن نضح في وطاف بيليه resuspend في خلية في مبلغ مناسب للالعازلة. </li></ol> سوف تفارق الطحال باستخدام Dissociator gentleMACS العائد على نسبة عالية من splenocytes قابلة للحياة ، وهو ما يتضح من التدفق الخلوي باستخدام محلل MACSQuant. هي ملطخة الخلايا الميتة التي يوديد propidium. في المثال المقدمة ، مبعثر الجانب قدما مؤامرة نقطة يبين splenocytes المعدة.

كافة البروتوكولات وصحائف البيانات متوفرة في<a href="http://www.miltenyibiotec.com"&gt; http://www.miltenyibiotec.com.</a&gt;.

لتجنب dissociations دليل شاقة ومؤلمة في كثير من الأحيان ، وDissociator gentleMACS يسمح احد لفصل الأنسجة بكفاءة عالية في ظل ظروف رقابة واستنساخه. الإجراء تفارق مهادنا لأنسجة الخلايا والخلايا تعليق الغلة مع بقاء معدل مرتفع. تم تصميم Dissociator gentleMACS بالاشتراك مع جيم أنابيب لإعداد وحيدة الخلية تعليق من الأنسجة المختلفة. وقد تم تجهيز هذا الصك مع عدد من قبل مجموعة برامج لفصل الماوس الطحال والكبد والرئة ، أو الأنسجة العصبية. ستكون مجموعة من البرامج والبروتوكولات يتوسع ليشمل الأنسجة الإضافية.

<table><tbody><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; طقم البدء</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;رابط تشعبي =&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>أنابيب C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>&lt;أداة ربط تشعبية (a href=)&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&quot;&gt;أنابيب gentleMACS C&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>أنابيب سعة 13 مل</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-596</td><td>&lt;رابط تشعبي=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx&quot;&gt;أنابيب بسعة 13 مل لأعمدة LS&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS&amp;#8482; محلول الشطف </td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>&lt;أداة ربط تشعبية (a href=)&quot;محلول الشطف لجهاز autoMACS&quot;&gt;محلول شطف autoMACS&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>الفصل المغناطيسي للخلايا المنشط (MACS)&amp;#174; المحلول المخزني لـ BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>&lt;رابط تشعبي=&quot;محلول BSA المخزون لـ MACS&quot;&gt;محلول BSA المخزون لنظام MACS&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>مرشحات ما قبل الفصل </td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td>&lt;رابط تشعبي=&quot;مرشحات ما قبل الفصل&quot;&gt;مرشحات ما قبل الفصل (Pre-Separation Filters)&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>محلل MACSQuant</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-197</td><td></td></tr><tr><td>محلول يوديد البروبيديوم</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;رابط التشعبي=&quot;محلول بروبيديوم يوديد (Propidium Iodide Solution)&quot;&gt;محلول يوديد البروبيديوم (Propidium Iodide Solution)&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

إعداد وحيدة الخلية معلقات من الطحال ماوس مع dissociator gentlemacs

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

وحيدة الخلية المعلقات هي شرط مسبق لإجراء التجارب في فصل الخلايا ، خلية التحليل والثقافة الخلية. لتجنب dissociations دليل شاقة ومؤلمة في كثير من الأحيان Dissociator gentleMACS يسمح احد لفصل الأنسجة بكفاءة عالية في ظل ظروف رقابة واستنساخه. يمكن أن تنأى Dissociator gentleMACS الأمثل الماوس الطحال ، والجمع والتوحيد للوقت مع السلامة مستخدم. هذا الفيديو يصف كيفية فصل الطحال باستخدام الماوس Dissociator gentleMACS ، وهو المقعد الآلي قمة الجهاز الذي يمكن أن يحدث خللا ميكانيكيا الأنسجة باستخدام أنابيب خاصة لانتاج معلقات خلية قابلة للحياة. بعد تفكك ، يتم تصفية الطحال ، طرد ، ومعلق لمزيد من الطلبات.

هذا الفيديو يصف بسيطة ، لتوفير الوقت للتقنية تفارق نسيج الآلي باستخدام Dissociator gentleMACS لإعداد وحيدة الخلية تعليق splenocytes من الماوس.

إعداد وحيدة الخلية معلقات من الطحال ماوس مع Dissociator gentleMACS

تُعد المعلقات الخلوية أحادية الخلية شرطاً أساسياً لإجراء تجارب فصل الخلايا، وتحليل الخلايا، وزراعة الخلايا. ولتجنب العمليات اليدوية المملة والمؤلمة غالباً...

ستشاهد في هذا البروتوكول المرئي كيفية تفكيك طحال الفئران باستخدام جهاز Gentle Max، وهو جهاز آلي يوضع على طاولة المختبر يمكنه تفتيت الأنسجة ميكانيكياً باستخدام أنابيب خاصة لإنتاج معلقات خلوية قابلة للحياة. وبعد التفكيك، يتم ترشيح الطحال باستخدام مرشحات الفصل Max Pres، ثم إجراء عملية الطرد المركزي، وتعليق الخلايا من أجل تطبيقات إضافية. مرحباً، اسمي ميلاني ملو.أنا عالم في شركة Milton Biotech هنا في منتزه BE Lab Park بألمانيا. سأعرض لكم اليوم كيفية تحضير معلق خلوي أحادي من طحال الفأر باستخدام نظام GenX dissociation. يتيح نظام GenX dissociation تحضير المعلق الخلوي الأحادي بطريقة سهلة وسريعة للغاية.لنبدأ الآن. ولتجنب عمليات الفصل اليدوية المملة والمؤلمة غالباً، يتيح جهاز gentle max di associator فصل الأنسجة بكفاءة عالية تحت ظروف مضبوطة وقابلة للتكرار. يتم فصل الأنسجة بلطف باستخدام أنابيب violet C للحصول على معلقات من خلايا مفردة حيوية.يوفر أنبوب C فتحة محكمة بسدادة في منتصف الغطاء، مما يسمح باستخدام الماصة من الأنبوب مع الحفاظ الدائم على التعقيم. لتعليق الخلايا المفككة، ستحتاج إلى استخدام محلول PBS-BSA-EDTA المنظم المناسب. يتم تحضير المحلول المنظم بإضافة جزء واحد من محلول BSA المخزون إلى 20 جزءاً من محلول AutoMax fencing الذي يحتوي على EDTA.باستخدام مرشحات فصل Max Pres، يتم تحرير عينات الأنسجة المفككة من جميع التجمعات الخلوية مما يعزز نجاح الفصل الأقصى والتحليل اللاحق. لبدء الإجراء، نقوم بتعبئة الأنبوب C بحجم من المنظم. ووفقاً لكتلة الطحال، فإن الطحال السليم لفأرة خزعة أنثى تبلغ من ستة إلى سبعة أسابيع يزن حوالي 80 إلى 120 milligrams.يتطلب كل طحال واحد إلى اثنين من هذه الكتلة ثلاثة مليلترات من المحلول المنظم. لا تتجاوز الحجم الإجمالي البالغ 10 مليلترات. يمكننا الآن إضافة الطحال الذي تم تشريحه إلى الأنبوب C الذي يحتوي على ثلاثة مليلترات من المحلول المنظم. غالباً ما تكون الطحال المأخوذة من الحيوانات الأكبر سناً أو الحيوانات المصابة بالعدوى أكبر حجماً ويجب وزنها في المحلول المنظم.يجب بعد ذلك تعديل أحجام المحلول المنظم وفقًا لذلك، ولكن يجب ألا يتجاوز الحجم الإجمالي 10 milliliters مرة أخرى. الآن، تأكد من إحكام إغلاق غطاء الأنبوب C وقم بتوصيل الأنبوب C بجهاز التفكيك. مع توجيه الغطاء للأسفل، قم بتشغيل عملية التفكيك لواحد إلى اثنين من spleens واختر Program M spleen oh one. سيستغرق البرنامج 56 ثانية للاكتمال؛ وإذا كان عدد spleens أكبر، استخدم program M spleen oh four.يمكن استخدام هذا البرنامج لما يصل إلى 720 milligrams من نسيج الطحال. بعد اكتمال البرنامج، يتم تفكيك نسيج الطحال الأصلي إلى معلق خلايا PLE، والذي يبدو بهذا الشكل؛ قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة لتجميع العينة في قاع الأنبوب. سيضمن ذلك خلو الدوار والجزء الثابت من جميع الخلايا التي تم تجميعها في قاع الأنبوب C.نقوم بسحب العينة من خلال الفتحة المختومة بالسدادة في غطاء الأنبوب C باستخدام ماصة سعة 1000 µL. لبدء خطوة الترشيح، نضع النسيج المفكك على مرشح فصل مسبق أو مصفاة ذات حجم مسام 30 micron. يجب أن تكون المصفاة مناسبة لأنبوب سعة 15 milliliter في حال استخدام طحال واحد إلى اثنين، أو أنبوب سعة 50 milliliter في حال استخدام أكثر من طحالين.اترك معلق الخلايا يمر عبر المرشح، ثم اغسل المرشح بإضافة 5 mL من المحلول المنظم. الآن، قم بطرد مركزي للأنبوب الذي يحتوي على معلق الخلايا عند 300 Gs في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لتجميع جميع الخلايا في كريّة من خلايا الطحال. وبعد الحصول على كريّة من الخلايا المفككة، يجب سحب السائل الطافي وإعادة تعليق كريّة الخلايا في كمية مناسبة من محلول تفكيك خلايا الطحال المنظم.سيؤدي استخدام gentle max إلى الحصول على نسبة عالية من خلايا PLE الحية، وهو ما يتم إثباته بواسطة قياس التدفق الخلوي باستخدام max quant. يتم صبغ الخلايا الميتة بـ Propidium iodide كما هو موضح في المثال المقدم. يظهر مخطط النقاط للتشتت الجانبي والأمامي خلايا SP المُحضّرة. حسناً.لقد أوضحت لكم كيفية تفكيك أنسجة الطحال باستخدام جهاز Gentle X للتفكيك اللطيف. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم ضبط كمية المحلول المنظم وفقاً لحجم العينة واختيار برنامج Gentle X المناسب. حسناً، هذا كل شيء.بالتوفيق في تجربتك.

preparation-single-cell-suspensions-from-mouse-spleen-with-gentlemacs

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

وصفنا إعداد الخلايا التائية عامل النمو المستخدمة في المختبر في التوسع من الفئران محددة مستضد خطوط تي اللمفاوية.

إعداد عامل نمو الخلايا T من Splenocytes الجرذ

الفصل بين أنواع خلايا من نسيج معين يتطلب بارامترات محددة للتحريض الأنسجة للحصول على كميات كبيرة من الخلايا ، قابلة للحياة زروع. وgentleMACS Miltenyi dissociator يحسن هذه المهمة مع بروتوكول بسيطة وعملية. هذا المنشور هو شرح استخدام هذا الجهاز عن نسيج الرئة.

إعداد موحدة وحيدة الخلية معلقات من أنسجة الرئة باستخدام الماوس Dissociator gentleMACS

الفصل بين أنواع خلايا من نسيج معين يتطلب المعلمات محددة لaggitation الأنسجة للحصول على كميات كبيرة من الخلايا ، قابلة للحياة زروع. وgentleMACS Miltenyi Dissociator يحسن هذه المهمة مع بروتوكول بسيطة وعملية. في هذا الكتاب هو شرح لاستخدام هذا الجهاز على أنسجة nerual.

جيل وحيدة الخلية معلقات من الأنسجة العصبية ماوس

يوضح هذا الفيديو إجراء للنقل المتبنى للخلايا المتغصنة العارضة للمستضد المعالجة بالملح (DCs) إلى الفئران. تتعرض الخلايا المتغصنة في الفئران CD11c + (DCs) لوسط يحتوي على كميات عالية من الصوديوم ، مما يشكل مقاربات بروتين isolevuglandin (IsoLG) في الخلايا. تعمل هذه المقاربات كمستضدات جديدة ويتم تقديمها على سطح التيار المستمر. يتم حقن الخلايا المعالجة بالملح العالية في الفئران من خلال نقل الخلايا بالتبني.

طريقة لمعالجة الخلايا المتغصنة بالملح العالي ونقلها بالتبني إلى الفئران

يوضح الفيديو تحضير معلق أحادي الخلية للخلايا المناعية من أنسجة دماغ الفئران. يتضمن الهضم الأنزيمي لإطلاق الخلايا من أنسجة المخ ، يليه الطرد المركزي المتدرج للكثافة لعزل الخلايا المناعية بناء على كثافتها للحصول على تعليق الخلية الواحدة.

تحضير معلق أحادي الخلية للخلايا المناعية من أنسجة دماغ الفئران

التدفق الخلوي يمكن استخدامها لتقييم حالة لونين داخل الخلايا T. هذا البروتوكول يسمح العلماء لتفسير الأدلة من لونين decondensation خلال تنشيط الخلايا T يدل على زيادة في كثافة يعني الإزهار (MFI) من الفلورسنت الأجسام المضادة هيستون H3...

استخدام التدفق الخلوي لتقييم حالة لونين في خلايا T

نقدم هنا، بروتوكولا لعزل الخلايا الجذعية من الطحال مورين بفرز الخلايا المغناطيسية ونقل التبني اللاحقة في الفئران ساذجة. تم اختيار نموذج لتنشيط الخلايا الجذعية الملح عالية شرح إجراءات خطوة بخطوة لنقل التبني والتدفق الخلوي.

العزلة والتبني نقل الملح عالية يعامل عرض مستضد الخلايا الجذعية

نحن نصف هنا تحليلا بسيطا تجانس مقصورة الخلية B المناعية مورين في أنسجة الصفاق والطحال ونخاع العظام عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن تكييف البروتوكول وتوسيعه ليشمل أنسجة الماوس الأخرى.

تدفق توصيف القياسات الخلوية من مورين B تطوير الخلية

هنا نقدم طريقة بسيطة وفعالة لعزل الخلايا الجرثومية الحية الميوتيك وما بعد الومياء من الخصيات الماوس الكبار. باستخدام السمية الخلوية المنخفضة ، وصبغة ملزمة الحمض النووي ذات الحماس البنفسجي وفرز الخلايا المنشطة بالفلور ، يمكن للمرء عزل مجموعات الخلايا المنوية الغنية للغاية للعديد من تطبيقات المصب.

عزل الخلايا المنوية مورين باستخدام البنفسجي-متحمس خلية نفاذة صبغة ملزمة

توضح هذه المقالة بروتوكولا لتجميع خلايا الطحال وتغليفها داخل مصفوفة غشاء قاعدي شبه صلب. يمكن استخدام تركيبات مصفوفة الغشاء القاعدي في الثقافة ثلاثية الأبعاد لدراسة تطور الأعضاء ، أو لدراسات زرع الجسم الحي وتجديد الأنسجة.

مصفوفة الغشاء القاعدي المغلفة تجميع الخلايا للتحقيق في تكوين أنسجة طحال الفئران

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل الإكسوسومات المشتقة من طحال الفأر باستخدام مزيج من الهضم مع الكولاجيناز من النوع الأول والطرد المركزي الفائق.

عزل وتوصيف الإكسوسومات المشتقة من أنسجة طحال الفأر

تعلم إعداد معلقات وحيدة الخلية من طحال الفئران باستخدام جهاز gentleMACS Dissociator الآلي. تُنتج هذه الطريقة خلايا حية عالية الجودة مناسبة لتحليل الخلايا وتطبيقات المناعة المتقدمة.

إعداد وحيدة الخلية معلقات من الطحال ماوس مع Dissociator gentleMACS

استكشف المزيد من الفيديوهات