حصاد الأنسجة المعقمة

Sterile Tissue Harvest
JoVE Science Education
Lab Animal Research
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Science Education Lab Animal Research
Sterile Tissue Harvest

35,233 Views

12:24 min
August 24, 2015
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Overview

المصدر: كاي ستيوارت ، RVT ، RLATG ، CMAR. فاليري أ. شرودر ، RVT ، RLATG. جامعة نوتردام ، إنديانا

في عام 1959 ، تم تقديم 3 R بواسطة W.M.S. Russell و R.L. Burch في كتابهما مبادئ التقنية التجريبية الإنسانية. 3 R هي استبدال وتقليل وصقل استخدام في البحث. 1 يعد استخدام خطوط الخلايا ومزارع الأنسجة التي نشأت من البحث تقنية بديلة ، حيث يسمح بإجراء العديد من التجارب في المختبر. يتطلب حصاد الأنسجة والأعضاء لاستخدامها في مزارع الخلايا والأنسجة تقنية معقمة لتجنب تلوث الأنسجة. الحصاد المعقم ضروري أيضا لتحليل البروتين والحمض النووي الريبي والتنميط الأيضي للأنسجة. ستناقش هذه المخطوطة عملية حصاد الأعضاء المعقمة في الفئران والفئران.

Principles

يجب اتباع تقنية

للتأكد من عقم الأنسجة. يتم الحصاد في غطاء تدفق رقائقي تم تطهيره بالكحول. يجب تعقيم جميع المواد المستخدمة. يجب على الفني الذي يقوم بالحصاد ارتداء معدات الحماية الشخصية ، بما في ذلك القناع ، والردوب المنتفخ ، والجراحي المعقم ، والقفازات الجراحية المعقمة. يجب أن يغطي الثوب الرسغين لمنع تساقط خلايا الجلد في تجويف الجسم المفتوح أو أطباق بتري أو الوسط المعقم. للحفاظ على عقم الفني ، يتطلب هذا الإجراء أن يساعد فني ثان غير معقم الفني المعقم في القتل الرحيم للحيوانات.

في التجارب التي تتطلب الملامح الأيضية للأنسجة ، يكون لطريقة حصاد الأنسجة تأثير كبير على جودة البيانات التي تم جمعها. 2 يمكن أن يؤثر كل من إجراء القتل الرحيم وطول الوقت الذي يستغرقه الحصاد على سلامة الأنسجة. ثبت أن نقص الأكسجة ، وهو نتيجة للقتل الرحيم بثاني أكسيد الكربون ، له تأثير عميق على المستقلبات في الأنسجة. يحدث نزيف الأوعية الدموية في أنسجة الرئة أيضا بسبب استخدام ثاني أكسيد الكربون للقتل الرحيم. يمكن أن يتسبب ترتيب إزالة الأنسجة عند إجراء التشريح المتسلسل للأنسجة المستهدفة في حدوث تغيرات في التمثيل الغذائي ، حيث تبدأ الأنسجة في التقدم في العمر أو التحلل أثناء الحصاد.

في حين أن معظم المحاصيل المعقمة تستهدف عضوا واحدا ، فقد تكون هناك أوقات تكون فيها هناك حاجة إلى أكثر من عضو واحد. أثناء التشريح المتسلسل ، ستحدد الأنسجة المطلوبة الترتيب الذي يجب إزالتها به. 2 يجب حصاد الأنسجة التي تتحلل بسرعة في أسرع وقت ممكن بعد القتل الرحيم. للحفاظ على عقم الأدوات ، تتم إزالة الأعضاء التي يتم حصادها من تجويف البطن بالترتيب التالي: الطحال والكبد والكلى والغدد الكظرية والمبيض أو الخصيتين والأعضاء الجنسية الملحقة (البروستاتا ، الحويصلات المنوية ، الرحم ، قناتي فالوب) ، أنسجة البنكرياس ، الغدد الليمفاوية ، المثانة البولية ، والأمعاء المعوية (المعدة والأمعاء الدقيقة والغليظة). ترتيب حصاد الأعضاء من التجويف الصدري هو إزالة القلب والرئتين أولا متبوعا بجمع الغدة الصعترية والغدد الليمفاوية والمريء. 3 قفازات جديدة مطلوبة لكل فأر.

قد تحتاج إلى الحفاظ على بعض الأعضاء المعقمة التي تم حصادها. يتم الحفاظ على الأنسجة عن طريق التجميد السريع بالنيتروجين السائل (LN2) أو بمزيج من LN2 و 2-methylbutane. بالنسبة إلى LN2 وحده ، يتم شطف الأنسجة بمحلول ملحي معقم ، ويتم مسحها على قطعة قماش ماصة معقمة لاستنفاد الرطوبة الزائدة ، وتوضع في مربعات من رقائق الألومنيوم المعقمة ، وتغمرها على الفور في LN2. 2 بالنسبة للعينات المناعية ، يضاف 2-ميثيل بوتان. يتم غمر الأنسجة في الواقع في 2-ميثيل بوتان الذي تم تبريده بواسطة LN2. عندما تتحول الأنسجة إلى اللون الأبيض ، يتم إزالتها من 2-ميثيل بيوتان ، ووضعها في عبوات معقمة ، ثم توضع مباشرة في LN2.

Procedure

1. التحضير

  1. تشمل المواد المستخدمة بشكل شائع 70٪ كحول في زجاجة بخ ، وإبر معقمة قياس 20-25 ، وعبوتين من الأدوات المعقمة لمقص القزحية وملقط الإبهام (واحدة للجلد والأخرى للأنسجة الداخلية) ، والمناشف الورقية ، وقفازات الجراح المعقمة ، وطبق بتري معقم ، ووسط معقم ، ومحلول ملحي معقم.
  2. يجب أن تعمل مروحة غطاء المحرك لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل الإجراء ، ويجب تطهيرها بالكحول بنسبة 70٪.
  3. إذا كان غطاء المحرك مزودا بمصباح تعقيم بالأشعة فوق البنفسجية ، فيمكن استخدامه لمزيد من التطهير لسطح العمل.
  4. يتم ارتداء القفازات النظيفة لإعداد غطاء المحرك. يتم تحميل الجهاز في غطاء المحرك بالترتيب الذي سيتم استخدامه به ، عادة من اليسار إلى اليمين. يسمح ذلك بإجراء العمل في سير عمل أحادي الاتجاه ، مما يمنع العناصر المتسخة من تلويث العناصر النظيفة. سيحمي ذلك الأنسجة أو الأعضاء المحصودة من التلوث العرضي من جثث.
  5. يتم فتح حزم الأدوات المعقمة ، مع مراعاة الجزء الداخلي المعقم للعبوات. للحفاظ على العقم ، يتم وضع العبوة في وسط الطاولة ، ويتم فتح كل رفرف دون عبور الحقل المعقم أو داخل العبوة. يفتح الشخص غير المعقم أول رفرف علوي من خلال عكسها بعيدا له. ثم يتم فتح اللوحات الجانبية باستخدام كلتا يديك – واحدة على كل رفرف – وسحبها بعيدا عن العبوة. ثم يتم سحب السديلة النهائية نحو الشخص الذي يفتح العبوة ، مع الحرص على تجنب لمس أي من الأسطح الداخلية للعبوة.
  6. ضع المناشف الورقية في الغطاء ، وبللها بالكحول.
  7. الشخص غير المعقم سوف يقتل.
  8. يرتدي الشخص المعقم مجموعتين من القفازات الجراحية المعقمة.
  9. يضع الشخص غير المعقم الذبيحة على المناشف الورقية وينقع الذبيحة بالكامل بنسبة 70٪ من الكحول.
  10. باستخدام مجموعة واحدة من المقصات والملقط المعقم ، قم بعمل قطع أفقي في الجلد أمام القلفة (عند الذكور) أو عظم الحوض (عند الإناث). تجنب قطع عضلات البطن.
  11. ضع الأدوات جانبا.

2. حصاد الأنسجة

  1. قم بعمل قطع صغير أمام الحوض عند الإناث وفوق القلفة عند الذكور.
  2. ضع الإبهام تحت القطع وأمسك بحافة الجمجمة للقطع. باستخدام اليد الأخرى ، أمسك الأطراف الخلفية والذيل بإحكام أثناء سحب الجلد نحو الرأس.
  3. سوف يتمزق الجلد بعيدا عن الجسم فوق الأطراف الخلفية مباشرة ويمكن قلبها من الداخل إلى الخارج فوق الرأس والساقين الأمامية. هذا يزيل بشكل فعال ملوثات الشعر أثناء حصاد الأعضاء.
  4. انقع الجسم مرة أخرى مع 70٪ كحول ، وقم بإزالة زوج القفازات السطحي الذي لم يعد معقما.
  5. افتح تجويف البطن باستخدام أدوات معقمة.
    1. طحال
      1. لحصاد الطحال ، يتم وضع الجسم في الراقد الجانبي الأيمن.
      2. يمكن تصور الطحال من خلال عضلة البطن.
      3. يتم قطع المقص مباشرة فوق الطحال.
      4. يتم سحب الطحال بلطف من تجويف الجسم.
      5. عند قطع جميع المرفقات بين الطحال والمعدة وأنسجة البنكرياس ، تجنب ثقب العضو أو تمزيقه.
    2. كبد
      1. لحصاد أي أعضاء أخرى في البطن ، يتم وضع الجسم في الاستلقاء الظهري.
      2. يتم رفع عضلة البطن وقطعها بعيدا ، تاركة فتحة بيضاوية مباشرة فوق تجويف البطن.
      3. بعد تعريض تجويف البطن ، قم بعكس الكبد ذيليا بعيدا عن الحجاب الحاجز.
      4. اقطع بعناية أي أغشية تربط الكبد بالحجاب الحاجز.
      5. قم بعمل قطع عمودي على العمود الفقري من خلال الأوعية الدموية المرئية بين الكبد والحجاب الحاجز.
      6. ارفع الكبد وعكسه باتجاه الحجاب الحاجز لتصور المرفقات الموجودة تحته.
      7. ستكون هناك أغشية رقيقة تربط فصوص الكبد الأصغر بالمعدة والأمعاء الدقيقة ، والتي ستحتاج إلى تعطيل.
      8. أمسك العقدة الليفية في وسط الكبد على جانبها السفلي ، وارفع العضو للعثور على جميع المرفقات. افصل الكبد عن الأعضاء والأنسجة الأساسية.
      9. لاحظ أن الكبد هش ويمكن ثقبه بسهولة ، مما يؤدي إلى إطلاق الدم. لذلك ، يجب التعامل معها بعناية.
    3. كلى
      1. بعد تعريض تجويف البطن ، ادفع الأمعاء إلى اليسار لتصور الكلية اليمنى ، أو إلى اليمين لتصور الكلية اليسرى.
      2. لإزالة الكلى ، استخدم شفرات الملقط للإمساك بها أسفل الكلى لعزل العضو عن الجسم. باستخدام مقص أو شفرة مشرط ، اقطع الكلية بعيدا عن الجسم. قم بعمل القطع تحت الملقط لتجنب إتلاف الكلى.
      3. بمجرد إزالة الكلى ، يمكن قص أي دهون من العضو.
    4. مبيض
      1. بعد تعريض تجويف البطن ، حرك الأمعاء في الجمجمة لتصور الرحم.
      2. اتبع قرون الرحم اليسرى ، ثم اليمين ، إلى المبايض.
      3. المبايض صغيرة. في الأكبر سنا ، قد تكون مغروسة في الدهون.
      4. حرك الملقط تحت المبيض لعزله عن الجسم ، واقطعه بعيدا عن الدهون وقناتي فالوب.
    5. الخصيتين
      1. بعد فتح تجويف البطن ، أمسك وسادة الدهون الأربية برفق واسحبها إلى الأمام.
      2. سيؤدي ذلك إلى سحب الخصية من كيس الصفن.
      3. بمجرد أن تتعرض الخصية ، قم بقطع المرفقات بكيس الصفن والأسهر لتحريرها من الجسم.
      4. يتم ذلك لكل خصية.
  6. يتم فتح التجويف الصدري لإزالة الأعضاء الصدرية
    1. يتم وضع الجسم في الاستلقاء الظهري. من الضروري أن ينعكس الجلد فوق الرأس إذا كان سيتم حصاد أعضاء التجويف الصدري.
    2. أمسك عملية الخنجري وارفعها للسماح بقطع عضلة البطن فقط الذيلية إلى الأضلاع. قم بتمديد القطع على طول المنحنى السفلي للقفص الصدري على كلا الجانبين. سيسمح ذلك بتصور الحجاب الحاجز.
    3. ثقب الحجاب الحاجز عن طريق عمل قطع صغير في القفص الصدري عند أقصى نقطة جانبية ممكنة على كل جانب. قطع الحجاب الحاجز بعيدا عن الضلوع.
    4. ارفع الأضلاع عند الخنجري لتصور الأعضاء الصدرية
    5. قم بتمديد القطع الجانبي إلى الجزء العلوي من القص على كلا الجانبين ، وافتح الصدر.
    6. يمكن إزالة القلب والرئتين معا بسهولة.
      1. ضع الملقط بشكل عمودي على القصبة الهوائية ، وامسك القصبة الهوائية بإحكام.
      2. باستخدام المقص ، قم بعمل قطع عمودي على القصبة الهوائية أمام الملقط. يجب أن يقطع هذا القطع القصبة الهوائية والمريء.
      3. دون تخفيف قبضة القصبة الهوائية ، ارفع القصبة الهوائية لأعلى والذيلية. قص أي مرفقات للرئتين بسطح العمود الفقري في القفص الصدري.
      4. قد يحتاج المريء إلى القطع ليتمكن من رفع القلب والرئتين من تجويف الصدر.
    7. القلب فقط
      1. ارفع القلب ، واقطع كيس التامور بعناية.
      2. يقع الشريان الأورطي في الجانب الجمجمي للقلب على يسار.
      3. أمسك الشريان الأورطي بالملقط ، وقم بعمل قطع بعيد عن الملقط ، مع الاحتفاظ بالإمساك بالشريان الأورطي والقلب.
      4. أمسك الشريان الأورطي أثناء قطع الوريد الأجوف الأمامي والشرايين والأوردة الرئوية.
      5. ارفع القلب بعيدا عن التجويف الصدري بواسطة الشريان الأبهري.
    8. الأعضاء الصدرية الأخرى
      1. يتم حصاد الأعضاء بالترتيب التالي للحفاظ على عقم الأدوات: الغدة الصعترية والغدد الليمفاوية والمريء.
  7. دماغ
    1. في ظروف خاصة ، سيحتاج الدماغ إلى الحصاد للثقافة المعقمة.
    2. يتم حصاد الدماغ أخيرا بعد أي حصاد أعضاء آخر.
    3. في الحالات التي يكون فيها الدماغ هو العضو الوحيد الذي يتم جمعه ، لا يتم تجريد الجلد من الجسم ، ولكن بدلا من ذلك يتم إجراء قطع في مؤخرة العنق ويمتد على طول خط الوسط من منطقة عنق الرحم الظهرية إلى طرف الأنف.
    4. بعد سحب الجلد بعيدا عن الجمجمة بشكل جانبي ، يتم نقع العظم المكشوف بنسبة 70٪ من الكحول وإزالة القفازات العلوية المتسخة.
    5. باستخدام زوج مخصص من مقص حصاد الدماغ المعقم ، قم بعمل قطع في العمود الفقري عند قاعدة الجمجمة.
    6. افتح الجمجمة عن طريق وضع نقطة المقص في الثقبة الماغنوم والقطع على طول خط الوسط.
    7. استخدم الطرف المسطح لشفرة المقص لرفع العظام الجدارية بعيدا عن الدماغ.
    8. قم بتعطيل المرفقات العصبية في جذع الدماغ بعناية ، والتصلب البصري أسفل الدماغ ، باستخدام النقطة المغلقة لملقط الإبهام.
    9. بطريقة مماثلة ، حرك الملقط المغلق للأمام أسفل الدماغ وكسر المرفقات في المصابيح الشمية.
    10. يمكن بعد ذلك إسقاط الدماغ من الجمجمة إلى وسط معقم.
    11. عند حصاد الدماغ ، تعتبر إحدى اليدين غير معقمة لأنها تمسك الجلد من الجمجمة المنعكسة أسفل الذقن لتثبيت الرأس ، بينما يتم قطع الجمجمة وإزالة الدماغ.
  8. جلد
    1. الأنسجة الثديية
      1. تم العثور على الأنسجة الثديية من أعلى القص عند الوبروبريوم إلى الفتحة التناسلية على السطح البطني ، وتمتد بشكل جانبي لأعلى كلا الجانبين ، وتلامس تقريبا السطح الظهري عند الوركين والكتفين.
      2. افحص الأنسجة الثديية للبحث عن الكتل أو تغير اللون أو التشوهات. زيادة حجم أنسجة الثدي المرضعات أو الحوامل ، وقد يكون الحليب موجودا.
      3. يتطلب استئصال الغدد الثديية الإمساك بحافة الغدة باستخدام ملقط الإبهام واستخدام تشريح حاد لفك المرفقات بالجلد. بمجرد فصل الغدة عن الجلد ، يمكن استخدام مقص القزحية لقطع أي مرفقات متبقية.
      4. انقع الأسطح المكشوفة بنسبة 70٪ من الكحول وابدأ في حصاد الأنسجة باستخدام مجموعة جديدة من الأدوات المعقمة.
      5. يتم شطف الأنسجة المحصودة بمحلول ملحي معقم قبل وضعها في وسط الاستزراع.
    2. الأورام تحت الجلد
      1. في كثير من الأحيان ، يتم زرع الخلايا السرطانية بشكل متكرر في ، ثم يتم حصاد الورم الناتج للحفاظ على خط الخلايا السرطانية.
      2. من الضروري إجراء حصاد الأنسجة المعقمة للأورام تحت الجلد قبل انتهاك سلامة الجلد.
      3. إذا كانت الكتلة متآكلة أو نخرية ، فلن تكون الأنسجة التي تم جمعها ذات نوعية جيدة وقد لا تكون معقمة.
      4. يتم وضع الجسم لفضح منطقة الاهتمام. يتم قطع الجلد على طول جانب واحد من الورم.
      5. يعكس الجلد بعناية لفضح الورم. ضع أدوات الجلد على الجانب وانقع الأنسجة المكشوفة بنسبة 70٪ كحول.
      6. باستخدام أدوات معقمة جديدة ، قم بتشريح الكتلة من المرفقات الأساسية وقطع أي أوعية دموية تغذي الكتلة.
      7. ثم يتم وضع الورم في وسط الاستزراع.

تتطلب العديد من التجارب جمع الخلايا من الأنسجة المستقاصة. في مثل هذه الحالات ، من الضروري إجراء عملية حصاد الأنسجة بطريقة معقمة. يسمح استخدام خطوط الخلايا ومزارع الأنسجة التي تنشأ من الأبحاث بإجراء العديد من التجارب في المختبر ، مما يقلل بدوره من استخدام في البحث.

في هذا الفيديو ، سنناقش الطريقة المعقمة لحصاد الأعضاء المستخرجة بشكل شائع من المختبر. وسيتبع ذلك مراجعة قصيرة لبعض الأمثلة على التجارب التي تستخدم هذه التقنية المعقمة لتحقيق أهداف بحثية مختلفة.

لنبدأ بخطوات التحضير المطلوبة لضمان عقم المساحة والأدوات والأفراد أثناء حصاد الأنسجة الحيوانية.

يتم تنفيذ هذا الإجراء في غطاء التدفق الصفيحي. قبل العملية ، يجب أن تعمل مروحة غطاء المحرك لمدة 15 دقيقة على الأقل ويجب تطهير المنطقة بالكحول بنسبة 70٪. بعد ذلك ، ضع بعض المناشف الورقية في الغطاء وبللها بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، قم بتحميل المعدات المعقمة وتنظيمها حسب الترتيب الذي سيتم به استخدام كل أداة ، عادة من اليسار إلى اليمين. هذا يسمح بسير العمل بطريقة أحادية الاتجاه ، مما يمنع التلوث العرضي من جثة.

يوصى بوجود فني غير معقم لمساعدة الفني المعقم. يجب على كلا المشغلين ارتداء قناع ومنتفخ. يجب أن يرتدي الفني المعقم ثوبا معقما وزوجين من القفازات الجراحية المعقمة. لاحظ أن الثوب والقفازات يجب أن يغطيا الرسغين لمنع تساقط خلايا الجلد في تجويف الجسم المفتوح أو أطباق بتري أو الوسائط المعقمة.

يفتح الشخص غير المعقم حزمة الأدوات المعقمة دون لمس السطح الداخلي ، بحيث يمكن للشخص المعقم إزالة الأداة بشكل معقم. أخيرا ، يقوم الفني غير المعقم بالقتل الرحيم للحيوان ، ووضع الذبيحة على المناشف الورقية ونقعها بالكامل بنسبة 70٪ من الكحول ، حتى يتمكن الشخص المعقم من بدء الحصاد.

أولا ، سنراجع استخراج أعضاء البطن ، بما في ذلك الطحال والكبد والكلى والمبيضين والخصيتين.

باستخدام مجموعة من المقصات والملقط المعقم ، قم بعمل قطع أفقي في الجلد أمام القلفة عند الذكور وعظم الحوض عند الإناث. تجنب قطع عضلات البطن. بعد ذلك ، ضع إبهامك تحت القطع وامسك حافة الجمجمة للقطع. باستخدام اليد الأخرى ، أمسك الأطراف الخلفية والذيل بإحكام ، مع سحب الجلد نحو الرأس. سوف يتمزق الجلد بعيدا عن الجسم فوق الأطراف الخلفية مباشرة ، ويمكن قلبه من الداخل إلى الخارج فوق الرأس والساقين الأمامية. هذا يزيل بشكل فعال ملوثات الشعر التي قد تتداخل مع حصاد الأعضاء المعقمة. ثم انقع الجسم مرة أخرى بنسبة 70٪ من الكحول وقم بإزالة القفازات السطحية التي لم تعد معقمة. تخلص أيضا من جميع الأدوات التي تم استخدامها على الجلد.

لحصاد الطحال ، ضع الجسم في الاستلقاء الجانبي الأيمن. يجب أن يكون الطحال مرئيا من خلال عضلة البطن. استخدم المقص لعمل قطع مباشرة فوق الطحال ، وسحب العضو برفق من تجويف الجسم. قم بقص جميع المرفقات بين الطحال والمعدة وأنسجة البنكرياس ، ولكن تجنب ثقب العضو أو تمزيقه.

لحصاد جميع أعضاء البطن الأخرى ، ضع الجسم في الاستلقاء الظهري. بعد ذلك ، ارفع عضلة البطن واقطعها تاركة فتحة بيضاوية مباشرة فوق تجويف البطن. لحصاد الكبد ، اعكس العضو ذيليا بعيدا عن الحجاب الحاجز. استخدم الآن المقص لقطع أي أغشية بين الهيكلين بعناية. بعد ذلك ، قم بعمل قطع عمودي على العمود الفقري من خلال الأوعية الدموية. ثم ارفع الكبد وعكسه باتجاه الحجاب الحاجز لتصور المرفقات الموجودة تحته. ستكون هناك أغشية رقيقة تربط فصوص الكبد الأصغر بالمعدة والأمعاء الدقيقة. أمسك العقدة الليفية في وسط الكبد على الجانب السفلي وارفع العضو للعثور على جميع المرفقات. الآن افصل العضو عن الأنسجة الأساسية. لاحظ أن الكبد هش ويمكن ثقبه بسهولة مما يؤدي إلى الإفراط في إطلاق الدم. لذلك ، يجب التعامل معها بعناية.

لحصاد الكلى ، ادفع الأمعاء إلى اليسار لكشف الكلية اليمنى أو إلى اليمين لكشف الكلية اليسرى. استخدم الآن شفرات الملقط للإمساك بها تحت الكلى واستخدام المقص المقطوع تحت الملقط ، وإزالة العضو من الجسم.

لحصاد المبيضين ، حرك الأمعاء في الجمجمة لتصور الرحم. اتبع قرني الرحم الأيمن والأيسر إلى المبايض. هذه أعضاء صغيرة وفي الأكبر سنا قد تكون مغروسة في الدهون. حرك الملقط تحت المبيض لعزله عن الجسم وقطعه من الدهون وقناة فالوب.

في الذكور ، لإزالة الخصيتين ، أمسك بلطف وسادة الدهون الأربية واسحب إلى الأمام. سيؤدي ذلك إلى سحب الخصية من كيس الصفن. بمجرد أن تصبح مرئية ، قم بقص المرفقات بكيس الصفن والأسهر لتحرير هذه الهياكل من الجسم.

بعد ذلك ، دعنا نتعلم كيفية حصاد الأعضاء الصدرية ، مثل القلب والرئتين. يمكن إزالة القلب والرئتين معا بسهولة. لفتح التجويف الصدري ، ابدأ بوضع في الاستلقاء الظهري. أولا ، أمسك عملية الخنجري وارفعها. ثم قم بعمل قطع في عضلة البطن فقط الذيلية إلى الأضلاع. قم بتمديد القطع على طول المنحنى السفلي للقفص الصدري على كلا الجانبين ، مع تعريض الحجاب الحاجز.

بعد ذلك ، قم بثقب الحجاب الحاجز عن طريق عمل قطع صغير في القفص الصدري عند أقصى نقطة جانبية ممكنة على كل جانب. ثم اقطع الحجاب الحاجز بعيدا عن الأضلاع. الآن ارفع الأضلاع عند الخنجري لتصور الأعضاء الصدرية قم بتمديد القطع الجانبي إلى الجزء العلوي من القص على كلا الجانبين لفتح الصدر. ثم ضع الملقط بشكل عمودي على القصبة الهوائية وامسك القصبة الهوائية بإحكام. الآن ، باستخدام المقص ، قم بعمل قطع عمودي أمام الملقط. يجب أن يقطع هذا القصبة الهوائية والمريء. دون فك قبضة القصبة الهوائية ، ارفعها ذيليا وقص أي ملحقات للرئتين على سطح العمود الفقري في القفص الصدري. استمر حتى تتمكن من رفع القلب والرئتين من تجويف الصدر.

لإزالة القلب فقط ، ارفع العضو واقطع كيس التامور بعناية. بعد ذلك ، أمسك الشريان الأورطي بالملقط وقم بعمل قطع بعيد عن الملقط. ثم قطع الوريد الأجوف الأمامي والشرايين الرئوية والأوردة. بعد ذلك ، يجب أن تكون قادرا على رفع القلب من التجويف الصدري.

الآن ، دعنا نراجع إجراء حصاد الدماغ باستخدام تقنية التعقيم. في الحالات التي يكون فيها الدماغ هو العضو الوحيد الذي يتم جمعه ، تكون خطوات التحضير هي نفسها.

لبدء الحصاد ، قم بتشبع الجسم بالكحول ، وقم بتجريد الجلد من الجسم كما كان من قبل – لأعلى وفوق الجمجمة. هذا يسمح لكل شيء بأن يكون معقما من هذه النقطة فصاعدا. بعد ذلك ، قم بتشبع مرة أخرى بالكحول ، وقم بإزالة القفازات الخارجية وتخلص من الأدوات المستخدمة على الجلد. الآن قم بعمل قطع في مؤخرة العنق وقم بتمديده على طول خط الوسط من منطقة عنق الرحم الظهرية إلى طرف الأنف.

الآن ، باستخدام زوج مخصص من مقص حصاد الدماغ المعقم ، قم بعمل قطع في العمود الفقري عند قاعدة الجمجمة. لفتح الجمجمة ، ضع نقطة المقص في الثقبة الماغنوم واقطعها على طول خط الوسط. لاحظ أنه خلال إجراء حصاد الدماغ هذا ، تعتبر إحدى اليدين غير معقمة لأنها تمسك الجلد من الجمجمة المنعكسة أسفل الذقن لتثبيت الرأس ، بينما يتم استخدام اليد المعقمة لقطع الجمجمة. بعد ذلك ، استخدم الحافة المسطحة لشفرة المقص لرفع العظام الجدارية بعيدا عن الدماغ. وباستخدام الملعقة ، قم بتعطيل الملحقات العصبية بعناية في جذع الدماغ والتصلب البصري تحت الدماغ. أخيرا ، حرك الملقط المغلق للأمام وكسر المرفقات في المصابيح الشمية. ويمكن بعد ذلك إسقاط الدماغ من الجمجمة مباشرة إلى الوسط المعقم.

الآن بعد أن راجعنا أساسيات حصاد الأنسجة المعقمة ، دعنا نناقش بعض الاستخدامات العديدة لهذا الإجراء في البحوث الطبية الحيوية.

يستخدم باحثو الجذع العصبي تقنية الحصاد المعقم لاستخراج الأنسجة من دماغ الفئران حديثي الولادة ، لتنمية هذه الخلايا في المختبر . هذا يسمح لهم بدراسة دور الخلايا الجذعية العصبية في التطور وتطور السرطان.

مجال آخر نشط للبحث يتضمن حصاد الأنسجة هو التنميط الأيضي ، والذي يتضمن دراسة فسيولوجيا الأنسجة من خلال تحليل المستقلبات المختلفة في العينة. في هذا المثال ، قام العلماء ، باستخدام تقنية التعقيم ، بجمع خزعات الكبد من الفئران البرية والخالية من الجراثيم واستخدموا التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي ، أو الرنين المغناطيسي النووي ، لتوضيح الاختلاف في المظهر الأيضي للكبد بين مجموعتين من.

أخيرا ، غالبا ما يقوم علماء المناعة بحصاد الأنسجة المعقمة لدراسة انتشار العدوى. في هذه التجربة بالذات ، أجرى الباحثون حقنة بكتيريا الزائفة الزنجارية للحث على عدوى الرئة المزمنة. بعد ذلك ، تم القتل الرحيم للحيوانات واستخلاص الرئتين باستخدام تقنية معقمة لتحديد الحمل البكتيري بعد 3 و 7 و 14 و 28 يوما بعد الإصابة.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول حصاد الأنسجة من المختبر باستخدام تقنية التعقيم. يجب أن يكون لديك الآن إحساس أفضل بالخطوات التي تحتاج إلى اتخاذها لضمان الحفاظ على العقم طوال فترة الحصاد. ويجب أن تكون قادرا على استخراج أعضاء البطن والصدر والأدمغة من هذه دون التسبب في أي ضرر للأنسجة. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!

Applications and Summary

Although many of the procedures for sterile organ harvest are similar to a standard necropsy, the use of sterile technique is imperative for tissues to be of value for experimental procedures, which include harvesting cells from the excised tissues. Profiling or collecting RNA from tissues can be compromised if sterility is not maintained.

Transcript

تتطلب العديد من التجارب جمع الخلايا من الأنسجة المستقاصة. في مثل هذه الحالات ، من الضروري إجراء عملية حصاد الأنسجة بطريقة معقمة. يسمح استخدام خطوط الخلايا ومزارع الأنسجة التي تنشأ من الأبحاث بإجراء العديد من التجارب في المختبر ، مما يقلل بدوره من استخدام في البحث.

في هذا الفيديو ، سنناقش الطريقة المعقمة لحصاد الأعضاء المستخرجة بشكل شائع من المختبر. وسيتبع ذلك مراجعة قصيرة لبعض الأمثلة على التجارب التي تستخدم هذه التقنية المعقمة لتحقيق أهداف بحثية مختلفة.

لنبدأ بخطوات التحضير المطلوبة لضمان عقم المساحة والأدوات والأفراد أثناء حصاد الأنسجة الحيوانية.

يتم تنفيذ هذا الإجراء في غطاء التدفق الصفيحي. قبل العملية ، يجب أن تعمل مروحة غطاء المحرك لمدة 15 دقيقة على الأقل ويجب تطهير المنطقة بالكحول بنسبة 70٪. بعد ذلك ، ضع بعض المناشف الورقية في الغطاء وبللها بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، قم بتحميل المعدات المعقمة وتنظيمها حسب الترتيب الذي سيتم به استخدام كل أداة ، عادة من اليسار إلى اليمين. هذا يسمح بسير العمل بطريقة أحادية الاتجاه ، مما يمنع التلوث العرضي من جثة.

يوصى بوجود فني غير معقم لمساعدة الفني المعقم. يجب على كلا المشغلين ارتداء قناع ومنتفخ. يجب أن يرتدي الفني المعقم ثوبا معقما وزوجين من القفازات الجراحية المعقمة. لاحظ أن الثوب والقفازات يجب أن يغطيا الرسغين لمنع تساقط خلايا الجلد في تجويف الجسم المفتوح أو أطباق بتري أو الوسائط المعقمة.

يفتح الشخص غير المعقم حزمة الأدوات المعقمة دون لمس السطح الداخلي ، بحيث يمكن للشخص المعقم إزالة الأداة بشكل معقم. أخيرا ، يقوم الفني غير المعقم بالقتل الرحيم للحيوان ، ووضع الذبيحة على المناشف الورقية ونقعها بالكامل بنسبة 70٪ من الكحول ، حتى يتمكن الشخص المعقم من بدء الحصاد.

أولا ، سنراجع استخراج أعضاء البطن ، بما في ذلك الطحال والكبد والكلى والمبيضين والخصيتين.

باستخدام مجموعة من المقصات والملقط المعقم ، قم بعمل قطع أفقي في الجلد أمام القلفة عند الذكور وعظم الحوض عند الإناث. تجنب قطع عضلات البطن. بعد ذلك ، ضع إبهامك تحت القطع وامسك حافة الجمجمة للقطع. باستخدام اليد الأخرى ، أمسك الأطراف الخلفية والذيل بإحكام ، مع سحب الجلد نحو الرأس. سوف يتمزق الجلد بعيدا عن الجسم فوق الأطراف الخلفية مباشرة ، ويمكن قلبه من الداخل إلى الخارج فوق الرأس والساقين الأمامية. هذا يزيل بشكل فعال ملوثات الشعر التي قد تتداخل مع حصاد الأعضاء المعقمة. ثم انقع الجسم مرة أخرى بنسبة 70٪ من الكحول وقم بإزالة القفازات السطحية التي لم تعد معقمة. تخلص أيضا من جميع الأدوات التي تم استخدامها على الجلد.

لحصاد الطحال ، ضع الجسم في الاستلقاء الجانبي الأيمن. يجب أن يكون الطحال مرئيا من خلال عضلة البطن. استخدم المقص لعمل قطع مباشرة فوق الطحال ، وسحب العضو برفق من تجويف الجسم. قم بقص جميع المرفقات بين الطحال والمعدة وأنسجة البنكرياس ، ولكن تجنب ثقب العضو أو تمزيقه.

لحصاد جميع أعضاء البطن الأخرى ، ضع الجسم في الاستلقاء الظهري. بعد ذلك ، ارفع عضلة البطن واقطعها تاركة فتحة بيضاوية مباشرة فوق تجويف البطن. لحصاد الكبد ، اعكس العضو ذيليا بعيدا عن الحجاب الحاجز. استخدم الآن المقص لقطع أي أغشية بين الهيكلين بعناية. بعد ذلك ، قم بعمل قطع عمودي على العمود الفقري من خلال الأوعية الدموية. ثم ارفع الكبد وعكسه باتجاه الحجاب الحاجز لتصور المرفقات الموجودة تحته. ستكون هناك أغشية رقيقة تربط فصوص الكبد الأصغر بالمعدة والأمعاء الدقيقة. أمسك العقدة الليفية في وسط الكبد على الجانب السفلي وارفع العضو للعثور على جميع المرفقات. الآن افصل العضو عن الأنسجة الأساسية. لاحظ أن الكبد هش ويمكن ثقبه بسهولة مما يؤدي إلى الإفراط في إطلاق الدم. لذلك ، يجب التعامل معها بعناية.

لحصاد الكلى ، ادفع الأمعاء إلى اليسار لكشف الكلية اليمنى أو إلى اليمين لكشف الكلية اليسرى. استخدم الآن شفرات الملقط للإمساك بها تحت الكلى واستخدام المقص المقطوع تحت الملقط ، وإزالة العضو من الجسم.

لحصاد المبيضين ، حرك الأمعاء في الجمجمة لتصور الرحم. اتبع قرني الرحم الأيمن والأيسر إلى المبايض. هذه أعضاء صغيرة وفي الأكبر سنا قد تكون مغروسة في الدهون. حرك الملقط تحت المبيض لعزله عن الجسم وقطعه من الدهون وقناة فالوب.

في الذكور ، لإزالة الخصيتين ، أمسك بلطف وسادة الدهون الأربية واسحب إلى الأمام. سيؤدي ذلك إلى سحب الخصية من كيس الصفن. بمجرد أن تصبح مرئية ، قم بقص المرفقات بكيس الصفن والأسهر لتحرير هذه الهياكل من الجسم.

بعد ذلك ، دعنا نتعلم كيفية حصاد الأعضاء الصدرية ، مثل القلب والرئتين. يمكن إزالة القلب والرئتين معا بسهولة. لفتح التجويف الصدري ، ابدأ بوضع في الاستلقاء الظهري. أولا ، أمسك عملية الخنجري وارفعها. ثم قم بعمل قطع في عضلة البطن فقط الذيلية إلى الأضلاع. قم بتمديد القطع على طول المنحنى السفلي للقفص الصدري على كلا الجانبين ، مع تعريض الحجاب الحاجز.

بعد ذلك ، قم بثقب الحجاب الحاجز عن طريق عمل قطع صغير في القفص الصدري عند أقصى نقطة جانبية ممكنة على كل جانب. ثم اقطع الحجاب الحاجز بعيدا عن الأضلاع. الآن ارفع الأضلاع عند الخنجري لتصور الأعضاء الصدرية قم بتمديد القطع الجانبي إلى الجزء العلوي من القص على كلا الجانبين لفتح الصدر. ثم ضع الملقط بشكل عمودي على القصبة الهوائية وامسك القصبة الهوائية بإحكام. الآن ، باستخدام المقص ، قم بعمل قطع عمودي أمام الملقط. يجب أن يقطع هذا القصبة الهوائية والمريء. دون فك قبضة القصبة الهوائية ، ارفعها ذيليا وقص أي ملحقات للرئتين على سطح العمود الفقري في القفص الصدري. استمر حتى تتمكن من رفع القلب والرئتين من تجويف الصدر.

لإزالة القلب فقط ، ارفع العضو واقطع كيس التامور بعناية. بعد ذلك ، أمسك الشريان الأورطي بالملقط وقم بعمل قطع بعيد عن الملقط. ثم قطع الوريد الأجوف الأمامي والشرايين الرئوية والأوردة. بعد ذلك ، يجب أن تكون قادرا على رفع القلب من التجويف الصدري.

الآن ، دعنا نراجع إجراء حصاد الدماغ باستخدام تقنية التعقيم. في الحالات التي يكون فيها الدماغ هو العضو الوحيد الذي يتم جمعه ، تكون خطوات التحضير هي نفسها.

لبدء الحصاد ، قم بتشبع الجسم بالكحول ، وقم بتجريد الجلد من الجسم كما كان من قبل – لأعلى وفوق الجمجمة. هذا يسمح لكل شيء بأن يكون معقما من هذه النقطة فصاعدا. بعد ذلك ، قم بتشبع مرة أخرى بالكحول ، وقم بإزالة القفازات الخارجية وتخلص من الأدوات المستخدمة على الجلد. الآن قم بعمل قطع في مؤخرة العنق وقم بتمديده على طول خط الوسط من منطقة عنق الرحم الظهرية إلى طرف الأنف.

الآن ، باستخدام زوج مخصص من مقص حصاد الدماغ المعقم ، قم بعمل قطع في العمود الفقري عند قاعدة الجمجمة. لفتح الجمجمة ، ضع نقطة المقص في الثقبة الماغنوم واقطعها على طول خط الوسط. لاحظ أنه خلال إجراء حصاد الدماغ هذا ، تعتبر إحدى اليدين غير معقمة لأنها تمسك الجلد من الجمجمة المنعكسة أسفل الذقن لتثبيت الرأس ، بينما يتم استخدام اليد المعقمة لقطع الجمجمة. بعد ذلك ، استخدم الحافة المسطحة لشفرة المقص لرفع العظام الجدارية بعيدا عن الدماغ. وباستخدام الملعقة ، قم بتعطيل الملحقات العصبية بعناية في جذع الدماغ والتصلب البصري تحت الدماغ. أخيرا ، حرك الملقط المغلق للأمام وكسر المرفقات في المصابيح الشمية. ويمكن بعد ذلك إسقاط الدماغ من الجمجمة مباشرة إلى الوسط المعقم.

الآن بعد أن راجعنا أساسيات حصاد الأنسجة المعقمة ، دعنا نناقش بعض الاستخدامات العديدة لهذا الإجراء في البحوث الطبية الحيوية.

يستخدم باحثو الجذع العصبي تقنية الحصاد المعقمة لاستخراج الأنسجة من دماغ الفئران حديثي الولادة ، لتنمية هذه الخلايا في المختبر. هذا يسمح لهم بدراسة دور الخلايا الجذعية العصبية في التطور وتطور السرطان.

مجال آخر نشط للبحث يتضمن حصاد الأنسجة هو التنميط الأيضي ، والذي يتضمن دراسة فسيولوجيا الأنسجة من خلال تحليل المستقلبات المختلفة في العينة. في هذا المثال ، قام العلماء ، باستخدام تقنية التعقيم ، بجمع خزعات الكبد من الفئران البرية والخالية من الجراثيم واستخدموا التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي ، أو الرنين المغناطيسي النووي ، لتوضيح الاختلاف في المظهر الأيضي للكبد بين مجموعتين من.

أخيرا ، غالبا ما يقوم علماء المناعة بحصاد الأنسجة المعقمة لدراسة انتشار العدوى. في هذه التجربة بالذات ، أجرى الباحثون حقنة البكتيريا الزنجارية في القصبة الهوائية للحث على عدوى الرئة المزمنة. بعد ذلك ، تم القتل الرحيم للحيوانات واستخلاص الرئتين باستخدام تقنية معقمة لتحديد الحمل البكتيري بعد 3 و 7 و 14 و 28 يوما بعد الإصابة.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول حصاد الأنسجة من المختبر باستخدام تقنية التعقيم. يجب أن يكون لديك الآن إحساس أفضل بالخطوات التي تحتاج إلى اتخاذها لضمان الحفاظ على العقم طوال فترة الحصاد. ويجب أن تكون قادرا على استخراج أعضاء البطن والصدر والأدمغة من هذه دون التسبب في أي ضرر للأنسجة. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!