طرق جزيء واحد لرصد التغيرات في خصائص طبقة ثنائية مطاطا

مرحباً، أنا الدكتورة أولا أندرسون من قسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية في كلية ويل كورنيل الطبية في مدينة نيويورك. اسمي أولسون، وأنا طالب في الطب الحيوي الحسابي في مختبر أوليف أندرسون.

وأنا شيل كولينجوود، فنية أبحاث من مختبر أندرسون أيضاً. سنوضح لكم اليوم كيفية تكوين طبقة حيوية مسطحة، وكيفية عزل غشاء صغير باستخدام قطب الثقب للطبقة الحيوية، وكيفية تسجيل نشاط القناة الواحدة وتحليل النتائج، وبالتالي استخدام قنوات Gramin كمجسات لخصائص الطبقة الحيوية الليبيدية. في فيديو سابق، أوضحنا لكم كيفية الاستعداد لهذه التجارب.

لقد أوضحنا لكم كيفية تحضير الغرفة التي استخدمناها، وكيفية تحضير قطب الثقب ثنائي الطبقة (Bilayer punch electrode) الذي نستخدمه لعزل طبقة صغيرة من الغشاء حيث نقوم بتسجيل نشاط القناة. لذا، دعونا نقم بثقب بعض الطبقات الثنائية. لبدء الإعداد لتجارب الطبقة الثنائية، أضف 2.5 mils من محلول الإلكتروليت المتوازن حرارياً إلى كل قسم من أقسام الغرفة المطلية مسبقاً. المحلول الذي نستخدمه عادةً هو كلوريد الصوديوم بتركيز 1 molar بالإضافة إلى 10 millimolar.

قم بضبط المحلول المنظم إلى pH seven، ثم اضبط المجهر ومصدر الضوء بحيث تكون الفتحة الموجودة في التيفلون متمركزة في مجال الرؤية ومضاءة بشكل جيد. أدخل الماصة الزجاجية الدقيقة في حامل القطب الدقيق. قم بتوصيل حقنة بالحامل باستخدام قطعة من أنابيب tigon.

املأ الماصة الموجودة في حامل القطب الكهربائي عن طريق الشفط. احرص على تجنب الفقاعات لأنها قد تقطع الاتصال الكهربائي بين حبيبة الفضة في حامل القطب وطرف الماصة. ضع كمية صغيرة من الفازلين على البرغي، ثم ضعه في حامل القطب الكهربائي الدقيق.

يساعد الفازلين (petroleum jelly) في إنشاء سداد محكم للهواء. قم بتوصيل حامل القطب الكهربائي بمرحلة رأس مثبت تثبيت الرقعة (patch clamp head stage) داخل قفص فاراداي. ضع طرف الماصة الدقيقة في المركز ومباشرة خلف الفتحة الموجودة في حاجز التفلون.

ضع القطب الفضي الملفوف في الغرفة الأمامية. ثبته في مكانه باستخدام صلصال التشكيل وقم بتوصيله بدائرة التحكم في الجهد. وأخيراً، قم بموازنة الأقطاب الكهربائية.

يعد هذا الأمر بالغ الأهمية لأن القطبين، القطب الموجود في المقدمة والقطب الموجود في حامل القطب الدقيق، قد يمتلكان جهود نصف خلية مختلفة قليلاً. جهد نصف الخلية هو الفرق بين معدن الفضة والقطب والمحلول الإلكتروليتي المجاور لطلاء كلوريد الفضة. قم بموازنة الأقطاب عن طريق ضبط الإزاحة اليدوية بحيث يتذبذب التيار المتدفق بين الحجيرتين بين 200- و 200+ picoamps في جهاز patch clamp.

سيتغير جهد الإزاحة بمرور الوقت، لذا يجب موازنة الأقطاب الكهربائية على فترات منتظمة طوال التجربة لتكوين غشاء الطبقة الليبيدية المزدوجة. قم بتنظيف ماصة مصقولة باللهب باستخدام محلول fch كما هو موضح في الفيديو المرفق. اغمس الماصة المنظفة في محلول التغليف الليبيدي واتركه يرتفع حوالي 1 mm داخل الماصة.

ضع طرف الماصة أمام الفتحة الموجودة في حاجز التفلون مباشرةً، وقم بطلاء فقاعة من المحلول الليبيدي بلطف فوق الفتحة. عند النجاح، تتشكل فقاعة ليبيدية زاهية اللون عبر الفتحة مع وجود شكل توروسي (Taurus) أو حلقي من الليبيدات يربطها بحاجز التفلون. اترك الغشاء ليصبح رقيقاً، ويمكن تسهيل ذلك عن طريق تطبيق جهد كهربائي يتراوح من 100 إلى 200 millivolt عبر الغشاء.

ضع طرف الماصة الزجاجية الدقيقة في جهاز Taurus واتركه لبضع دقائق لضمان إحكام الغلق بين الماصة والطبقة الثنائية. في هذه المرحلة، تكون مستعداً لعزل رقعة غشائية باستخدام الماصة الزجاجية الدقيقة. الآن، قم بتطعيم الغشاء بمادة gramin.

تَم تحضير محلول الجرامين هذا من محلول مخزون بتركيز 1 µM، والذي تم تخفيفه إلى تركيز يتراوح بين 1 إلى 10 nM. في مادة dimethyl sulf oxide، يُضاف عادةً من 1 إلى 10 µL من التخفيف إلى كل جانب من الغشاء، بحيث يكون التركيز النهائي في نطاق picaMolar. استخدم قضبان التحريك المغناطيسية لتقليب المحلول لمدة دقيقتين تقريباً، وانتظر 10 دقائق أخرى قبل تشكيل غشاء صغير جديد لتسجيل نشاط القناة الواحدة.

يسمح هذا الوزن بدمج الجرامين في الغشاء. تحقق من نشاط القناة عن طريق تطبيق الجهد الكهربائي. بشكل عام، نسعى للحصول على حدث قناة واحد تقريباً في الثانية.

تظهر القنوات على هيئة تغيرات منفصلة صعوداً وهبوطاً في تيار الغشاء. أنت الآن مستعد لبدء التجربة الفعلية. أولاً، قم بتسجيل آثار تيار التحكم.

قم بموازنة القطب الكهربائي كما تم توضيحه سابقاً، ثم شكّل غشاءً صغيراً أو رقعة كما هو موصوف في الفيديو المرفق. قم بتطبيق جهد موجب قدره 200 millivolts وسجل نشاط القناة الواحدة. يجب عليك جمع ما بين 100 إلى 200 انتقال لتيار القناة الواحدة.

كرر هذه الخطوة بقيمة -200 millivolts. قم بكسر الرقعة عن طريق دفع الإلكتروليت عبر طرف الماصة. وباستخدام المسمار النايلوني، أعد موازنة الأقطاب الكهربائية، ثم اسحب الماصة إلى الغرفة الخلفية، واطرد فائض الليبيدات، وكون رقعة جديدة.

يمكنك أيضاً تكرار هذه الخطوات لطلب تسجيلات عند جهود كهربائية أخرى. والآن، أنت مستعد لتسجيل آثار التيار التجريبي عند مُعدِّل الطبقة المزدوجة، وفي هذه الحالة، يكون مضاد الاكتئاب fluoxetine على كلا جانبي الغشاء.

يجب تخفيف المحلول المخزون من الفلوكسيتين (fluoxetine) ليصل إلى تركيز 25 millimolar في DMSO. أضف خمسة µL من هذا المحلول لتحقيق تركيز 50 micromolar في الغرفة. قد يؤثر DMSO على خصائص الطبقة المزدوجة؛ لذا، من المهم الحد من كمية DMSO في المحلول لتكون 25 µL أو 1% أو 150 millimolar.

يُقلب المزيج لمدة خمس دقائق، ثم يُنتظر لمدة 10 دقائق للسماح للمعدل بالوصول إلى حالة الاتزان بين المحلول المائي والغشاء. والآن، يتم تسجيل نشاط القناة كما وُصف سابقاً في وجود المعدل. تُكرر هذه الخطوات لتسجيل نشاط القناة عند تركيزات متزايدة من المعدل.

نتعلم الكثير عن التغيرات في الطبقة الثنائية من خلال قياس فترات بقاء القنوات ومعدلات ظهورها. ولإجراء مثل هذا التحليل، نحتاج إلى الكشف عن تكوين القنوات واختفائها. نستخدم هنا خوارزمية تعتمد على الانتقال حيث يحسب الكمبيوتر المشتق الأول لتحديد التغيرات السريعة في التيار وتصنيفها كأحداث خاصة بالقنوات.

يتم تخزين الأحداث كسلسلة زمنية لمساعدتنا في تحديد أعمار القنوات قبل الانتقال وبعده. كما يتم تخزين مستويات التيار للمساعدة في تحديد سعات القنوات أثناء سير التجربة. ويقوم الكمبيوتر بإنشاء مدرج تكراري لسعة انتقال التيار، مما يتيح لك متابعة عملية اكتساب انتقالات التيار.

كما يتيح لك ذلك تقييم جودة التجربة؛ فإذا تشتتت سعات الانتقال الحالية بشكل واسع، فهذا يشير إلى وجود مشكلات، أما إذا كان المدرج التكراري متراصاً، فهذا يعني أن أداءك جيد.

عندما تجمع أكثر من 200 حدث انتقال، احسب متوسط التيار والانحراف المعياري للانتقالات في الذروة الرئيسية. يمكنك تقدير معدل ظهور القناة ببساطة عن طريق قسمة عدد الانتقالات في مدرج التكرار لسعة الانتقال الحالي على وقت الملاحظة. تذكر أيضاً القسمة على اثنين لأن القناة تُحتسب مرتين في مدرج التكرار، مرة عند ظهورها ومرة عند اختفائها.

قم بتحليل السلسلة الزمنية لأحداث الانتقال للحصول على توزيعات عمر القناة. إن تحديد فترات العمر أمر مباشر في الآثار الحالية حيث لا يتوفر لديك أكثر من قناة موصلة واحدة في أي وقت. في هذه الحالة، يكتشف الكمبيوتر ما إذا كان كل انتقال يمثل ظهور قناة أو اختفاءها، ولا يمكن أن ينتمي حدث الاختفاء إلا إلى حدث الظهور السابق له.

يمثل الوقت المنقضي بين الانتقالين عمر القناة. وفي الحالات التي تحدث فيها انتقالات القناة متقاربة جداً بحيث يصعب تمييزها، يجب تعيين حالات الظهور والاختفاء يدوياً. ويكون هذا التعيين أكثر تعقيداً في حال وجود قناتين أو أكثر تعمل في آن واحد، لأنك حينئذٍ لن تتمكن من معرفة أي اختفاء للقناة ينتمي إلى أي ظهور للقناة.

لهذا السبب، يُفضل أن يكون نشاط القناة منخفضاً. يمكنك حل مشكلة التعيين باستخدام مولد أرقام عشوائية لربط حالات الظهور بحالات الاختفاء؛ وبذلك، سينتج لديك سلسلة من أعمار القنوات.

يتم تحويل هذا إلى مدرج تكراري للعمر الزمني، والذي يتم تحويله بدوره إلى مخطط بقاء؛ ثم يُحدد متوسط العمر الزمني عن طريق مطابقة توزيع أسي مفرد مع مخطط البقاء باستخدام ملاءمة المنحنى بطريقة المربعات الصغرى غير الخطية وفي التجارب التي لا يتم فيها كسر الغشاء الكبير. وعند إضافة مُعدِّل الطبقة الثنائية، يمكن مقارنة التأثير على معدلات ظهور القنوات. ولا تكون هذه المقارنة مبررة إذا انكسر الغشاء الكبير، حيث يتم تنظيم وظيفة بروتين الغشاء من خلال تركيب الدهون في الغشاء الخلوي.

يعود هذا التنظيم إلى مزيج من تفاعلات بروتينية دهنية محددة وتفاعلات أكثر عمومية بين الطبقة الدهنية المزدوجة وبروتينات الغشاء. وتكتسب هذه التفاعلات أهمية خاصة في الأبحاث الدوائية؛ نظرًا لأن العديد من الأدوية الحالية المتوفرة في الأسواق هي مركبات أمفيباتية يمكنها تغيير خصائص الطبقة الدهنية المزدوجة، مما قد يؤدي بدوره إلى تغيير وظيفة بروتينات الغشاء.

يمكن استخدام قنوات الجرامين كمحولات قوة جزيئية للإبلاغ عما إذا كانت المواد الأمفيفيلية قادرة على تغيير خصائص الطبقة الدهنية المزدوجة. ويمنح رسم التغيرات في العمر الزمني ومعدل الظهور كدالة لتركيز المادة المعدلة رؤية متعمقة في التغيرات التي تطرأ على خصائص الطبقة المزدوجة.

تعني زيادة التكرار أن الطبقة الثنائية تكون أكثر قابلية للتشوه لاستيعاب موقع Gram والدمج الثنائي. وتعني زيادة مدة البقاء أن تشوه الطبقة الثنائية المرتبط بتكوين القناة ليس مكلفاً من الناحية الطاقية. وقد يؤدي المُعدِّل إلى زيادة التكرار ومدة البقاء من خلال زيادة مرونة الغشاء أو التأثير على الانحناء.

لقد أوضحنا الآن كيفية استخدام القنوات اللونية للتحقق مما إذا كانت الجزيئات الصغيرة تغير خصائص الطبقة الثنائية المرنة. وهذا كل شيء. شكراً للمشاهدة.

بالتوفيق في تجاربكم.