قياس التدفق الخلوي وفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS): عزل الخلايا الليمفاوية البائية الطحالية

p class = "jove_title" >1. التحضير

1. قبل البدء ، ارتد قفازات المختبر والملابس الواقية المناسبة.
2. عقم جميع أدوات التشريح ، أولا بمنظف ثم بنسبة 70٪ من الإيثانول ثم جففها جيدا.
3. تحضير 50 مل من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) الذي يحتوي على 2٪ مصل عجل الجنين (FCS).

2. تشريح

1. باستخدام نظام توصيل ثاني أكسيد الكربون ، قم بالقتل الرحيم للفأر عن طريق نقص الأكسجة. قم بتأمين الفأر القتل الرحيم على لوحة تشريح في وضع الاستلقاء وقم بإجراء بضع البطن الطولي باستخدام المقص والملقط.
2. باستخدام الملقط ، حرك الأمعاء والمعدة على الجانب الأيمن من البطن لكشف المعدة والطحال. يرتبط الطحال بالمعدة.
3. باستخدام الملقط ، افصل الطحال بعناية عن المعدة وضعه في طبق بتري الذي يحتوي على 5 مل من HBSS 2٪ FCS.

< p class = "jove_title" >3. عزل الخلايا المناعية

1. ضع الطحال في مصفاة خلوية 40 ميكرومتر فوق نفس طبق بتري. سحق الطحال بمكبس لفصله في نفس الطبق.
2. انقل الطحال المنفصل والسائل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
قم
3. بالطرد المركزي للأنبوب عند 370 × جم لمدة 7 دقائق عند 10 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية ، وتجنب الحبيبات.
4. أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من أسيتات البوتاسيوم لتحلل كريات الدم الحمراء. انتظر لمدة دقيقتين ثم قم بتعويض الحجم حتى 15 مل باستخدام HBSS 2٪ FCS.
5. قم بالطرد المركزي للأنبوب مرة أخرى عند 370 × جم لمدة 7 دقائق عند 10 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 5 مل من HBSS 2٪ FCS.
6. عد الخلايا باستخدام مقايسة تلطيخ التريبان الأزرق واضبط التركيز النهائي للخلية على 10⁷ خلايا / مل باستخدام الحجم المناسب من HBSS 2٪ FCS.

< ص الفئة = "jove_title" >4. تلطيخ الخلية

1. انقل 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى ستة أنابيب FACS ، تحمل علامة 1 إلى 6.
2. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 370 × جم لمدة 7 دقائق عند 10 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية لتجنب الحبيبات.
3. بعد ذلك ، قم بإعداد ستة خلطات جديدة من الأجسام المضادة عن طريق إضافة كمية مناسبة من الجسم المضاد إلى 200 ميكرولتر HBSS 2٪ FCS وفقا للجدول 1.
4. بعد ذلك ، انقل مزيج الأجسام المضادة هذه إلى أنابيب FACS المرقمة المقابلة.
5. احتضان معلقات الخلية الممزوجة بالأجسام المضادة لمدة 20 دقيقة على الجليد في الظلام.
6. أضف 1 مل من HBSS 2٪ FCS إلى كل أنبوب ثم جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 370 × جم لمدة 3 دقائق عند 10 درجات مئوية.
7. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من HBSS 2٪ FCS.
8. انقل الكريات المعلقة إلى أنابيب FACS جديدة.

< p class = "jove_content" >
الجدول 1: تكوين مزيج الأجسام المضادة. تم إعداد ستة خلطات من 200 ميكرولتر من HBSS + الجسم المضاد للتجربة. المزيج 1 مخصص لإعداد PMT ، والخلطات من 2 إلى 5 مخصصة لإعدادات التعويض ، والمزيج 6 مخصص لفرز الخلايا.

5. معايرة FACS

1. أولا ، قم بتشغيل فارز وقم بإجراء "Fluidics Startup".
2. قم بتشغيل البث ثم انتظر لمدة 15 دقيقة حتى يستقر الدفق.
3. اضبط سعة التيار للحصول على تشكيل قطرة منفصل. ثم انقر فوق "Sweet Spot" لإكمال ضبط السعة.
4. ضع مرشح الكثافة المحايدة (N.D.) - 1.0 وافتح واجهة "CST" التي تعني إعداد مقياس الخلوي وتتبعه.
5. لإجراء مراقبة الجودة اليومية ، قم أولا بتخفيف حبات CST بوسيط FACS باتباع تعليمات الشركة المصنعة ثم قم بإجراء عنصر تحكم CST.
6. بمجرد اكتمال التحكم في CST ، استبدل مرشح N.D. 1.0 بمرشح N.D. 2.0 على مقياس الخلوي.
7. بعد ذلك ، قم بتخفيف حبات تأخير السقوط في وسيط FACS باتباع تعليمات الشركة المصنعة ثم قم بتحميلها في FACS.
8. لضمان الفرز الصحيح ، قم بإجراء تأخير الإسقاط-
   1. انقر أولا فوق "الجهد" ثم "المرشح البصري". يجب أن يكون الربع الأيمن مساويا ل 100٪. إذا لزم الأمر ، اضبط برغي الليزر الأحمر على مقياس الخلوي إلى اليسار أو اليمين للحصول على 100٪ في الربع الأيمن.
   2. بعد ذلك ، قم بإجراء فرز تجريبي للتأكد من سقوط التيار في أنبوب التجميع. للقيام بذلك ، انقر فوق "درج النفايات" وابدأ "اختبار الفرز". تأكد من أن الجداول الجانبية تقع في أنابيب التجميع. إذا لم يفعلوا ذلك ، فاضبط الجهد حتى يفعلوا ذلك.
   3. انتقل إلى القالب التجريبي. ثم افتح تجربة "Accudrop Drop Delay" وانقر فوق "تخطيط الفرز".
   4. قم بتغيير معدل التدفق للحصول على 1000 إلى 3000 حدث في الثانية.
   5. انقر فوق "الجهد" ثم "المرشح البصري". يجب أن يكون الربع الأيسر يساوي 0 والربع الأيمن 100.
   6. في نافذة "تخطيط الفرز" ، انقر فوق "فرز" ثم انقر فوق "إلغاء". يجب أن يكون الربع الأيسر مساويا ل 100 والربع الأيمن هو 0. إذا كان الربع الأيسر أقل من 95 ، فانقر فوق "تأخير تلقائي" لضبطه تلقائيا.

< p class = "jove_title" >6. قياس التدفق الخلوي والتحكم في النقاء

1. ابدأ قياس التدفق الخلوي بالبدء بالأنبوب 1 (الخلايا غير الملطخة) لتحديد مورفولوجيا الخلية والقمم السلبية للفلوروكروم. قم بإعداد المبعثر الأمامي والجانبي وحدد الفولتية لكل معلمة فلورية. ضع السكان السالبين في العقد الأول باستخدام الشبكات الموجودة على كل مخطط نقطي.
2. بعد ذلك ، قم بتحميل الأنبوب 2 (التحكم في اللون الواحد) في مقياس الخلويات. اضبط التداخل الطيفي حتى تتم محاذاة متوسطات السكان السالب والموجب أو استخدم برنامج الحساب التلقائي. من المهم الحفاظ على الإشارة على نطاق واسع. يجب أن تتطابق عناصر التحكم في التعويض مع إعدادات الفلوروكروم وأجهزة الكشف التجريبية. سجل 10,000 حدث.
3. كرر هذه الخطوات مع الأنبوب 3 و4 و5 (عناصر تحكم أحادية اللون الأخرى).
4. بعد ذلك ، قم بتحميل الأنبوب 6 (الخلايا متعددة الألوان) وحدد مجموعات الخلايا ذات الأهمية باستخدام استراتيجية بوابة محددة.
5. في نافذة تخطيط الفرز، حدد محتوى الخلايا محل الاهتمام. حدد عتبة الخلية في "الأحداث المستهدفة" ومستوى الدقة في "الدقة". هنا يتم فرز مجموعة سكانية واحدة فقط ، ومع ذلك ، يمكن فرز أربعة مجموعات سكانية مختلفة في نفس الوقت.
6. بمجرد أن تصبح جاهزا ، انقر فوق "فرز" و "موافق" ، ثم انتظر فرز الخلايا.
7. بمجرد اكتمال فرز الخلايا ، قم بإجراء التحكم في النقاء عن طريق سحب 10 ميكرولتر من الخلايا المصنفة أولا في أنبوب FACS جديد مع 90 ميكرولتر من HBSS 2٪ FCS.
8. ثم قم بتحميل الأنبوب في مقياس الخلوي. سجل وتحليل الأنماط الظاهرية للخلايا للتحقق من أن استراتيجية البوابات عملت على النحو المنشود.

< p class = "jove_title" >7. تحليل البيانات

1. افتح برنامج "FlowJo" واسحب الملفات لكل أنبوب في نافذة "كل العينة".
2. انقر نقرا مزدوجا فوق ملف لفتحه في نافذة جديدة.
3. انقر فوق "المضلع" وأعد إنشاء استراتيجية البوابات المستخدمة سابقا.
4. كرر الخطوات مع جميع الملفات الأخرى.
5. لتصور المخططات النقطية ، انقر فوق "محرر التخطيط" واسحب المجموعات السكانية ذات الأهمية من الأنبوب 6 والتحكم في النقاء في علامة تبويب محرر التخطيط. يجب أن تظهر الخلايا فقط في المجموعة المهتمة بالتحكم في النقاء (انظر <الفئة القوية = "xfig">الشكل 2).
6. للتحقق من نقاء الخلايا الليمفاوية البائية في الخلايا التي تم فرزها ، انقر فوق "محرر الجدول". اسحب مجموعة الخلايا الليمفاوية B من الأنبوب 6 والتحكم في النقاء في الجدول.
7. في قائمة "الإحصائيات" ، حدد تكرار خلايا CD45 ⁺ لاختبار نقاء مجموعة الخلايا هذه ، ثم انقر فوق "إنشاء جدول".
8. تظهر قيم المعلمات في جدول جديد. في نافذة التحكم في النقاء ، تحقق من تواتر الخلايا الليمفاوية البائية داخل خلايا CD45 ⁺ ، والتي يجب أن تكون أعلى من 98٪ (انظر الشكل 2 ، اللوحة السفلية).