قياس التدفق الخلوي وفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS): عزل الخلايا الليمفاوية البائية الطحالية

يحمي الجهاز المناعي الجسم من مسببات الأمراض الغازية عن طريق توليد الكريات البيض ، وتسمى أيضا خلايا الدم البيضاء. عندما يصيب العامل الممرض كائنا كائنا بنجاح ، يتم تنشيط مجموعة متنوعة من الكريات البيض ويسمى هذا التفاعل المنسق بالاستجابة المناعية.

في كثير من الأحيان ، من المفيد للباحثين أن يكونوا قادرين على تحديد النوع والعدد المحدد للخلايا المناعية التي تم تنشيطها استجابة لمسببات الأمراض. قياس التدفق الخلوي هو تقنية تسمح للباحثين بفصل الخلايا بناء على حواتم معينة يتم التعبير عنها على أسطحها. يتم تحقيق ذلك باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي تحمل علامة الفلوروكروم والتي ترتبط بحلقات محددة للخلايا المناعية المعروفة ، وعند الإثارة ، تنبعث هذه الفلوروكرومات المرتبطة بطول موجي من الضوء يمكن اكتشافه وتسجيله بواسطة مقياس التدفق الخلوي.

تتكون مقاييس التدفق الخلوي من ثلاثة أنظمة. ينقل النظام السائل الخلايا في تيار بحيث تمر أمام الليزر واحدة تلو الأخرى. يتكون النظام البصري من أشعة الليزر وأجهزة الكشف التي تتعرف على وجود أو عدم وجود الفلوروفورات. أخيرا ، يقوم النظام الإلكتروني بتحويل البيانات البصرية التي تم جمعها إلى ملفات إلكترونية لتحليلها.

امتداد قياس التدفق الخلوي هو فارز الخلايا المنشط بالفلورة ، أو FACS ، والذي يسمح بإثراء مجموعات خلايا معينة حتى يمكن دراستها بشكل مستقل. يتم فرز الخلايا باستخدام فوهة اهتزازية داخل تيار السوائل التي تشكل قطرات صغيرة ، تحتوي كل منها على خلية واحدة. بعد ذلك ، يحدد الكاشف ما إذا كان ضوء الفلورسنت ينبعث من كل قطرة أم لا ، وبناء على هذه المعلومات ، يعطي المغناطيس الكهربائي كل خلية شحنة سالبة أو موجبة. بعد ذلك ، يقوم مجال كهربائي قوي بفرز القطرات المشحونة بشكل مختلف في حاويات منفصلة. في النهاية ، ستحتوي إحدى الحاويات على مجموعة متجانسة من الخلايا بناء على التعبير عن جزيء سطح خلية معين.

في هذا الفيديو ، ستتعلم كيفية استخدام قياس التدفق الخلوي لعزل الكريات البيض من أنسجة طحال الفأر و FACS لاختيار الخلايا الليمفاوية البائية.

للبدء ، ارتد قفازات المختبر والملابس الواقية المناسبة. بعد ذلك ، اغسل زوجا من مقصات التشريح والملقط أولا بمنظف ثم باستخدام 70٪ من الإيثانول ثم جففهما بمنشفة ورقية نظيفة.

ثم أضف 49 مل من محلول الملح المتوازن من هانك ، أو HBSS ، إلى أنبوب سعة 50 مل. أضف ملليلترا واحدا من مصل عجل الجنين، أو FCS، لإنشاء محلول HBSS 2٪ FCS واخلطه عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل 10 مرات تقريبا.

بعد ذلك ، ضع فأرة مرحمة في وضع ضعيف على لوحة تشريح. باستخدام المقص والملقط ، قم بإجراء شق البطن الطولي للوصول إلى تجويف البطن. استخدم الملقط لتحريك الأمعاء على الجانب الأيمن من البطن إلى جانب واحد لكشف المعدة والطحال. يرتبط الطحال بالمعدة. ثم باستخدام ماصة ، ضع خمسة ملليلتر من HBSS 2٪ FCS في طبق بتري. باستخدام الملقط ، افصل الطحال بعناية عن المعدة وضع الطحال في طبق بتري.

لعزل الخلايا المناعية ، ضع الطحال أولا على مصفاة خلية 40 ميكرون في طبق بتري. سحق الطحال بمكبس لفصله في الطبق. بعد ذلك ، قم بتقطيع الطحال والسائل المنفصل من طبق بتري إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلترا. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 370 مرة جم لمدة سبع دقائق عند 10 درجات مئوية ثم استرجع الأنبوب بعناية حتى لا تزعج الحبيبات.

الآن ، قم بإزالة المادة الطافية ، وتجنب الحبيبات ، وتخلص من السائل في حاوية نفايات مناسبة. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من محلول التحلل ACK في أنبوب الطرد المركزي لإعادة تعليق كريات الدم الحمراء وتحللها. انتظر دقيقتين ثم أضف HBSS 2٪ FCS للحصول على حجم إجمالي قدره 15 ملليلترا. كرر الطرد المركزي. استرجع الأنبوب بعناية وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات مرة أخرى في خمسة ملليلتر من HBSS 2٪ FCS.

لحساب الخلايا المعلقة ، قم بتخفيف خمسة ميكرولترات من تعليق الخلية بخمسة ميكرولترات من Trypan Blue. بعد ذلك ، قم بإيداع قطرة خمسة ميكرولتر برفق من تعليق الخلية المخفف هذا بين الغطاء الزجاجي وشريحة Malassez. الآن ، تحت المجهر بتكبير 40X ، احسب عدد الخلايا الموجودة. بعد ذلك ، اضبط تركيز الخلية إلى 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر عن طريق إضافة الحجم المناسب ل HBSS 2٪ FCS.

لتلطيخ الخلايا المناعية ، ابدأ بوضع العلامات على ستة أنابيب FACS من واحد إلى ستة. ثم انقل 200 ميكرولتر من محلول الخلية إلى كل من الأنابيب الستة. قم بالطرد المركزي لهذه الأنابيب عند 370 مرة جم لمدة سبع دقائق عند 10 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية.

بعد ذلك ، قم بتسمية ستة أنابيب FACS جديدة على أنها واحدة إلى ستة وماصة 200 ميكرولتر من HBSS 2٪ FCS في كل منها. قم بإعداد خلطات الأجسام المضادة الستة الجديدة عن طريق إضافة الكمية المناسبة من الجسم المضاد إلى كل أنبوب وفقا للجدول الأول. المزيج الأول للخلايا غير الملوثة بدون إضافة جسم مضاد. يحتوي كل من مزيج من اثنين إلى خمسة على جسم مضاد واحد مختلف لإعدادات التعويض. يحتوي المزيج السادس على جميع الأجسام المضادة الأربعة للخلايا متعددة البقع لاستخدامها في الفرز.

بعد ذلك ، انقل خلطات الأجسام المضادة هذه إلى أنابيب FACS المرقمة المقابلة. احتضن هذه المحاليل لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية أو على الجليد في الظلام. بعد ذلك ، أضف مليلتر واحد من HBSS 2٪ FCS إلى كل أنبوب ثم جهاز الطرد المركزي مرة أخرى. تخلص من المادة الطافية ثم أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من HBSS 2٪ FCS. أخيرا ، انقل الكريات المعلقة إلى أنابيب FACS جديدة تحمل علامة تجارية.

لإجراء FACS، قم أولا بتشغيل آلة الفرز. ثم حدد قائمة مقياس الخلايا وانقر فوق بدء تشغيل السوائل. اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة.

في علامة تبويب البث، انقر فوق الصليب الأحمر لتشغيل البث ثم انتظر 15 دقيقة حتى يستقر الدفق. اضبط سعة الدفق حتى ترى قطرة واضحة منفصلة تظهر في علامة تبويب البث. ثم انقر فوق Sweet spot لإكمال ضبط السعة. أدخل مرشح الكثافة المحايدة ، أو ND ، 1.0 أمام الليزر.

افتح قائمة مقياس الخلايا في الجزء العلوي من الشاشة وحدد CST ، والتي تعني إعداد مقياس الخلوي وتتبعه. لإجراء مراقبة الجودة اليومية ، قم أولا بتخفيف حبات CST بوسيط FACS في أنبوب FACS باتباع تعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك، قم بتحميل الأنبوب في الجهاز وقم بإجراء عنصر تحكم CST بالنقر فوق تشغيل في علامة التبويب CST.

عند اكتمال عنصر تحكم CST، استبدل مرشح ND 1.0 بمرشح ND 2.0 على مقياس الخلوي. بعد ذلك ، قم بتخفيف حبات تأخير السقوط في وسط FACS باتباع تعليمات الشركة المصنعة ثم قم بتحميل الأنبوب في FACS. لضمان الفرز المناسب ، قم بإجراء تأخير السقوط عن طريق النقر أولا على الجهد ثم المرشح البصري. يجب أن يكون الربع الأيمن من المرشح البصري مساويا ل 100٪ ، مما يشير إلى أن 100٪ من القطرات مسجلة بواسطة الجهاز. إذا لزم الأمر ، اضبط برغي الليزر الأحمر على مقياس الخلوي إلى اليسار أو اليمين للحصول على 100٪ في الربع الأيمن. من المهم التأكد من أن التيار يقع في أنبوب التجميع. للقيام بذلك ، قم بإجراء فرز تجريبي بالنقر فوق درج النفايات ثم اختبار الفرز. تأكد من سقوط التيارات الجانبية في أنابيب التجميع. إذا لم يفعلوا ذلك، فاضبط الجهد الكهربائي أسفل علامة تبويب الفرز حتى يفعلوا ذلك.

انتقل إلى القالب التجريبي عن طريق تحديد علامة تبويب المتصفح والنقر فوق طريقة العرض المشتركة. ثم افتح تجربة Accudrop_DROP DELAY وانقر فوق زر تخطيط الفرز. الآن ، قم بتغيير معدل العتبة في لوحة معلومات الاستحواذ عن طريق معالجة معدل التدفق حتى يصل إلى 3,000 حدث في الثانية. انقر فوق الجهد ثم انقر فوق المرشح البصري. يجب أن يكون الربع الأيسر مساويا للصفر والربع الأيمن يساوي 100.

أخيرا ، في نافذة تخطيط الفرز ، انقر فوق فرز ثم انقر فوق إلغاء. يجب أن يكون الربع الأيسر مساويا ل 100 والربع الأيمن يساوي صفرا. إذا كان الربع الأيسر أقل من 95، فانقر فوق تأخير تلقائي لتوجيه البرنامج لزيادة الجهد تلقائيا للحصول على 100٪ من القطرات في الربع الأيسر.

لبدء قياس التدفق الخلوي ، سنستخدم أولا الخلايا غير الملوثة لتحديد مورفولوجيا الخلية والقمم السلبية للفلوروكروم. للقيام بذلك ، ضع الأنبوب الأول الذي يحتوي على خلايا غير ملوثة في الجهاز وتحت علامة تبويب لوحة معلومات الاستحواذ انقر فوق التحميل. في علامة التبويب مقياس الخلويات، اضبط الفولتية المشتتة الأمامية والجانبية حتى ترى عدد الخلايا كتركيز كثيف من النقاط على الشاشة. الخلايا الليمفاوية هي خلايا صغيرة ، لذلك سيكون لها تشتت أمامي منخفض وتشتت جانبي منخفض.

بعد ذلك ، قم بإزالة تألق الخلفية عن طريق ضبط الجهد للفلوروكرومات في علامة تبويب مقياس الخلايا حتى تصبح مجموعات الخلايا عند المستوى السلبي في العقد الأول في علامة تبويب ورقة العمل العالمية. في قائمة مقياس الخلايا، انقر فوق عرض التكوين وتحقق من وجود جميع الفلوروكرومات. بعد ذلك ، ضع الأنبوب الثاني في مقياس الخلوي وانقر فوق الحمل. اضبط التداخل الطيفي في علامة تبويب مقياس الخلايا حتى تتم محاذاة متوسطات السكان السالبة والإيجابية في علامة تبويب ورقة العمل العامة. في علامة تبويب الاكتساب، قم بتعيين الأحداث لتسجيل المعلمة إلى 10,000 وانقر فوق تسجيل. كرر هذه الخطوات باستخدام الأنابيب الثالثة والرابعة والخامسة.

بعد ذلك ، قم بتحميل الأنبوب السادس الذي يحتوي على الخلايا متعددة الألوان. لعزل الخلايا الليمفاوية البائية ، قم أولا بإعداد المعلمات لفرز الخلايا بناء على مورفولوجيتها. في النافذة الأولى، ارسم منطقة الانتثار الأمامي FSC-A على المحور y ومنطقة الانتثار الجانبي SSC-A على المحور x. في مخطط التبعثر ، تمثل كل نقطة خلية. انقر فوق بوابة المضلع في ورقة العمل العمومية ثم حدد السكان الذين لديهم مبعثر أمامي منخفض ومبعثر جانبي وسيط. في نافذة مخطط نقطي جديد ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق النافذة وحدد إظهار السكان من القائمة وانقر فوق P1.

بعد ذلك ، في النافذة الجديدة ، قم ببوابة الخلايا الموجبة CD45 القابلة للحياة عن طريق رسم قابلية البقاء على المحور y و CD45 على المحور السيني. استخدم بوابة المضلع لوضع دائرة حول الخلايا ذات الجدوى المنخفضة وإشارة CD45 العالية وحدد P2 لعرض الخلايا المحددة في نافذة جديدة. في النافذة التالية ، بوابة الكريات البيض الإيجابية CD45 ، باستثناء الخلايا الليمفاوية التائية. مع CD45 على المحور x و CD3 على المحور y ، ضع دائرة حول السكان بإشارة CD45 عالية وإشارة CD3 سالبة منخفضة وحدد P3. أخيرا ، بوابة للخلايا الإيجابية CD19 التي تحدد الخلايا الليمفاوية البائية. مع CD19 على المحور y و CD3 على المحور x ، ضع دائرة حول السكان بإشارة CD19 عالية وإشارة CD3 سالبة منخفضة وحدد P4.

تم الآن تعيين جميع معلمات الفرز. بعد ذلك ، في نافذة تخطيط الفرز ، حدد مجموعة الخلايا التي تهمك - P4 ، وهي المجموعة الرابعة التي تم تجميعها ، وتخبر الجهاز بفرز الخلايا الليمفاوية B فقط. اضبط الأحداث المستهدفة على 10,000 خلية واضبط الدقة على النقاء. نحن نقوم بفرز مجموعة سكانية واحدة فقط. ومع ذلك ، يمكن فرز ما يصل إلى أربعة مجموعات سكانية مختلفة في نفس الوقت. بمجرد أن تصبح جاهزا ، انقر فوق فرز وموافق. ثم انتظر فرز الخلايا.

بمجرد اكتمال فرز الخلايا ، قم بإجراء التحكم في النقاء عن طريق سحب 10 ميكرولتر من الخلايا التي تم فرزها في أنبوب FACS جديد مع 90 ميكرولتر من HBSS 2٪ FCS. ضع الأنبوب في مقياس الخلوي ، وانقر فوق الحمل ثم انقر فوق سجل لتحليل الأنماط الظاهرية للخلايا للتحقق من أن استراتيجية البوابات تعمل على النحو المنشود.

الآن ، سنقوم بتحليل الخلايا التي تم فرزها لتحديد النسبة المئوية للخلايا الليمفاوية البائية بين الكريات البيض التي تم عزلها من طحال الفأر. للبدء ، انقر نقرا مزدوجا فوق أيقونة FlowJo واسحب الملفات الخاصة بكل أنبوب إلى نافذة كل العينة.

انقر فوق المضلع وأعد إنشاء استراتيجيات البوابات التي تم استخدامها في القسم السابق. بعد ذلك ، انقر فوق محرر التخطيط واسحب مجموعات الخلايا الليمفاوية البائية ذات الأهمية من الأنبوب السادس والتحكم في النقاء إلى علامة تبويب محرر التخطيط. ستظهر مخططات نقطية تمثل الخلايا الليمفاوية البائية. في هذا المثال ، تمثل المخطط الموجود أعلى اليمين الخلايا الليمفاوية البائية التي تم فرزها من تعليق خلايا الطحال الكلي والمؤامرة الموجودة في أسفل اليمين هي التحكم في النقاء. يجب أن تظهر الخلايا فقط في السكان المهتمين بالتحكم في النقاء.

للتحقق من نقاء الخلايا الليمفاوية البائية في الخلايا التي تم فرزها ، انقر فوق محرر الجدول. اسحب مجموعة الخلايا الليمفاوية B من الأنبوب السادس والتحكم في النقاء في الجدول. في قائمة الإحصائيات ، حدد تردد الخلايا الموجبة CD45 لاختبار نقاء مجموعة الخلايا هذه. ثم انقر فوق إنشاء جدول. تظهر قيم المعلمات في جدول جديد. في نافذة التحكم في النقاء ، تحقق من تواتر الخلايا الليمفاوية البائية داخل الخلايا الإيجابية CD45 ، والتي يجب أن تكون أعلى من 98٪.