فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية (MACS): عزل الخلايا الليمفاوية التائية الصعترية

فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا ، أو MACS ، هو تقنية تسمح للباحثين بفصل الخلايا بناء على حواتم معينة يتم التعبير عنها على أسطحها.

تبدأ العملية عادة باستخراج عضو أو نسيجة، مثل الغدة الصعترية. بعد ذلك ، يتم فصل الخلايا ميكانيكيا ، عادة عن طريق التكسير ، حتى يتم فصل الأنسجة إلى خلايا مفردة. يمكن إزالة الخلايا غير المرغوب فيها في هذه المرحلة عن طريق إضافة المواد الكيميائية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام محلول كلوريد الأمونيوم والبوتاسيوم ، أو المخزن المؤقت ACK ، لتحلل كريات الدم الحمراء غير المرغوب فيها.

بعد ذلك ، يضاف جسم مضاد مترافق مع جزيء يسمى البيوتين إلى المعلق ، وترتبط هذه المجمعات بحواتم سطح الخلايا المستهدفة. البيوتين له تقارب كبير مع جزيء آخر يسمى ستربتافيدين. في الخطوة التالية ، تضاف جزيئات الستربتافيدين المدمجة في الخرز المغناطيسي إلى الخلايا المسماة بالجسم المضاد. عندما يتلامس البيوتين والستربتافيدين ، فإنهما يرتبطان بإحكام. والنتيجة هي أن الخلايا ذات الأهمية مغطاة بالخرز المغناطيسي. يشار إلى هذا المجمع أحيانا باسم شطيرة. في هذه الحالة ، CD3 على غشاء الخلية في الأسفل ، ثم مضاد CD3 مترافق مع البيوتين ، وأخيرا ، الستربتافيدين مترافق مع حبات مغناطيسية.

يمكن الآن وضع هذه الخلايا المسماة في عمود يحتوي على مصفوفة تسمح للخلايا بالمرور ببطء بواسطة مغناطيس. أثناء قيامهم بذلك ، ستلتصق الخلايا المسماة بالخرز المغناطيسي بحافة الأنبوب الأقرب إلى المغناطيس ، بينما ستستمر الخلايا غير المسماة في أنبوب تجميع أدناه. بعد ذلك ، يمكن إزالة الخلايا المسماة من العمود ببساطة عن طريق إزالة المغناطيس ، وإضافة محلول مزيع ، وتطبيق ضغط لطيف باستخدام مكبس لإخراجها من العمود إلى أنبوب تجميع جديد. في النهاية ، تسمح هذه العملية باسترداد 60 إلى 98٪ من الخلايا ذات الأهمية.

في هذا الإجراء ، سنقوم بعزل كريات البيض الصعترية عن الفأر واستخدام MACS لفرز الخلايا التائية الإيجابية CD3 قبل تأكيد كفاءة الفرز باستخدام FACS.

للبدء ، ارتد أي معدات واقية مناسبة بما في ذلك معطف المختبر والقفازات. بعد ذلك ، اغسل زوجا من المقصات والملقط مع 70٪ من الإيثانول وجففهما بمنشفة ورقية نظيفة. ثم قم بإعداد 200 مل من مصل عجل الجنين HBSS 2٪ ، أو FCS ، عن طريق خلط أربعة ملليلتر من FCS مع 196 مل من HBSS.

قم بتثبيت فأر قتل رحيم في وضع ضعيف على لوحة تشريح. باستخدام المقص والملقط ، قم بإجراء شق البطن الطولي للوصول إلى تجويف الصدر. أولا ، قم بإزالة القلب للوصول إلى الغدة الصعترية الموجودة فوق القلب. ثم حدد الغدة الصعترية ، التي تتكون من فصين أبيضين. باستخدام الملقط ، افصل الغدة الصعترية بعناية وضعها على طبق بتري مع خمسة ملليلتر من HBSS 2٪ FCS.

لعزل الخلايا المناعية ، ضع الغدة الصعترية أولا على مصفاة خلية 40 ميكرومتر في طبق بتري. سحق الأنسجة بمكبس لفصلها في الطبق. بعد ذلك ، اشطف المكبس والمصفاة باستخدام HBSS 2٪ FCS لاستعادة أي خلايا ملتصقة. بعد ذلك، قم بإخراج خلايا الغدة الصعترية المنفصلة والسوائل من طبق بتري إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. اغسل طبق بتري بخمسة ملليلتر من HBSS 2٪ FCS وانقل محلول الغسيل هذا إلى أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مليلتر أيضا.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 370 مرة جم لمدة سبع دقائق عند 20 درجة مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلترين من محلول التحلل ACK لتحلل كريات الدم الحمراء. احتضن لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة على سطح المقعد. ثم ارفع الحجم إلى 14 مل مع HBSS 2٪ FCS. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 370 مرة جم لمدة سبع دقائق عند 20 درجة مئوية. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من HBSS 2٪ FCS.

قم بتقدير تركيز الخلية باستخدام شريحة Malassez كما هو موضح في بروتوكول عزل FACS للخلايا الليمفاوية البائية وضبط تركيز الخلية إلى 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر مع HBSS 2٪ FCS.

انقل 500 ميكرولتر من محلول الخلية إلى أنبوبين FACS. قم بتسمية أنبوب واحد من الخلايا التائية غير المخصبة والخلايا التائية المخصبة بالأنبوب الآخر ، والتي سيتم فصلها باستخدام الملصقات المغناطيسية.

جهاز الطرد المركزي أنبوب الخلايا التائية المخصب بمعدل 370 مرة جم لمدة ثلاث دقائق عند 20 درجة مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من البيوتين المقترن بالجسم المضاد المضاد ل CD3 المخفف واحد من كل 400 في HBSS 2٪ FCS. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة على الجليد وفي الظلام. أضف ثلاثة ملليلتر من HBSS 2٪ FCS إلى الأنابيب وقم بطردها مرة أخرى عند 370 مرة جم لمدة ثلاث دقائق عند 20 درجة مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من الخرز المقترن بالستربتافيدين المخفف واحد من كل خمسة في HBSS 2٪ FCS. احتضان خليط الخلايا والخرز لمدة 20 دقيقة على الجليد. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ملليلتر من HBSS 2٪ FCS إلى الأنبوب ، والماصة لأعلى ولأسفل للخلط ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 370 مرة جم لمدة ثلاث دقائق عند 20 درجة مئوية. أعد تعليق الحبيبات في ملليلترين من HBSS 2٪ FCS.

ضع العمود على المغناطيس وأضف ثلاثة ملليلتر من HBSS 2٪ FCS لترطيب النظام. ثم قم بإدخال الخلايا الملطخة في العمود. بعد مرور تعليق الخلية عبر العمود ، اغسل العمود ثلاث مرات بثلاثة ملليلتر من HBSS 2٪ FCS. بعد ذلك ، قم بإزالة العمود من المغناطيس وضعه في أنبوب سعة 15 مل. لمسح الخلايا المستهدفة ، أضف خمسة ملليلتر من HBSS 2٪ FCS إلى العمود واغسل العمود بمكبس. كرر هذه الخطوة مع خمسة ملليلتر أخرى من HBSS 2٪ FCS.

لتقييم فعالية عزل الخلية المستهدفة ، قم أولا بنقل 500 ميكرولتر من معلق الخلية المغطى إلى أنبوب FACS وقم بتسميته بالخلايا التائية المخصبة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لكل من الأنابيب المخصبة وغير المخصبة عند 370 مرة جم لمدة سبع دقائق عند 20 درجة مئوية. تخلص من المادة الطافية ، ثم أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الفلورية المخففة واحدا في 200 في HBSS 2٪ FCS إلى كلا الأنبوبين. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة على الجليد وفي الظلام. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ملليلتر من HBSS 2٪ FCS إلى الأنابيب وقم بطردها عند 370 مرة جم لمدة ثلاث دقائق عند 20 درجة مئوية. تخلص من المادة الطافية ، ثم أعد تعليق الكريات في 250 ميكرولتر من HBSS 2٪ FCS. الآن ، قم بتقييم معدل تخصيب الخلايا الإيجابي CD3 باستخدام قياس التدفق الخلوي كما هو موضح في بروتوكول FACS.

الآن ، سنحدد تواتر الخلايا الليمفاوية الإيجابية CD3 بين جميع الخلايا الغدة الصعترية التي تم عزلها من الغدة الصعترية للفأر. للبدء ، انقر نقرا مزدوجا فوق أيقونة FlowJo واسحب الملفات الخاصة بكل أنبوب في نافذة كل العينة. بعد ذلك ، انقر نقرا مزدوجا فوق ملف الخلايا التائية المخصب لعرض الخلايا المسجلة من تلك العينة على مخطط نقطي يعرض التشتت الأمامي ، FSCA ، على المحور x ، والمبعثر الجانبي ، SSCA ، على المحور y.

انقر فوق المضلع لوضع دائرة حول مجموعات الخلايا الليمفاوية. بعد ذلك ، انقر نقرا مزدوجا فوق السكان المحاطين بدائرة لإنشاء نافذة جديدة. حدد FSC-W على المحور y ، و FSC-A على المحور x وقم بدائرة حول الخلايا السالبة FSA-W. في نافذة تعريف السكان الفرعيين، قم بتسمية مجموعة الخلايا الخلوية الخاصة بك خلايا مفردة. بعد ذلك ، انقر فوق "موافق" في نافذة تحديد السكان الفرعية ، ثم انقر نقرا مزدوجا فوق السكان المحاطين بدائرة لإنشاء نافذة جديدة. حدد CD3 على المحور y ، ووضع دائرة حول الخلايا الموجبة ل CD3. في نافذة تحديد السكان الفرعيين، قم بتسمية الخلايا التائية لمجموعة الخلايا. كرر مع ملف الخلايا التائية غير المخصبة. لتصور عدد الخلايا ، انقر فوق محرر التخطيط واسحب مجموعة الخلايا التائية من الخلايا التائية المخصبة وملفات الخلايا التائية غير المخصبة إلى علامة التبويب.

ستظهر مخططات نقطية تمثل الخلايا الليمفاوية الإيجابية ل CD3. يجب أن تظهر الخلايا الإيجابية ل CD3 فقط في السكان المهتمين في الأنبوب المخصب الإيجابي ل CD3. لتقييم إثراء الخلايا الليمفاوية الإيجابية ل CD3 في الخلايا التي تم فرزها ، انقر فوق محرر الجدول ثم اسحب مجموعة الخلايا التائية من الخلايا التائية المخصبة وملفات الخلايا التائية غير المخصبة إلى الجدول. في قائمة الإحصائيات ، حدد تكرار خلايا الخلايا الليمفاوية للتحقق من النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ل CD3 في جميع الخلايا الليمفاوية. ثم انقر فوق إنشاء جدول. ستظهر قيم المعلمات في جدول جديد. بالنسبة للخلايا التائية المخصبة ، يجب أن يكون تواتر الخلايا الإيجابية CD3 حوالي 80٪ أو أعلى.