فحوصات ELISA: غير مباشرة وساندويتش وتنافسية

مقايسة الممتز المناعي المرتبطة بالإنزيم ، أو ELISA هي اختبار كمي شديد الحساسية يستخدم بشكل شائع لقياس تركيز مادة تحليلية مثل السيتوكينات والأجسام المضادة في عينة بيولوجية. يتضمن المبدأ العام لهذا الاختبار ثلاث خطوات: بدءا من التقاط أو تثبيت المادة التحليلية المستهدفة على صفيحة دقيقة ، متبوعا بالكشف عن المادة التحليلية بواسطة بروتينات الكشف الخاصة بالهدف ، وأخيرا ، تفاعل الإنزيم ، حيث يحول الإنزيم المترافق ركيزته إلى منتج ملون. استنادا إلى طرق مختلفة للالتقاط والكشف ، يمكن أن تكون ELISA من أربعة أنواع: مباشرة وغير مباشرة وشطيرة وتنافسية.

بالنسبة إلى ELISA المباشر ، يرتبط المستضد المستهدف أولا باللوحة ، ثم يتم اكتشافه بواسطة جسم مضاد محدد للكشف. تستخدم هذه الطريقة بشكل شائع لفحص الأجسام المضادة لمستضد معين. يستخدم ELISA غير المباشر للكشف عن الأجسام المضادة في العينة من أجل تحديد الاستجابات المناعية. يتم طلاء اللوحة أولا بمستضد التقاط محدد ، مما يشل حركة الجسم المضاد المستهدف ، ثم يتم الكشف عن مركب الجسم المضاد للمستضد هذا باستخدام جسم مضاد ثان.

في حالة شطيرة ELISA ، فإن المادة التحليلية المستهدفة عبارة عن مستضد يتم التقاطه على اللوحة باستخدام جسم مضاد ملتقط ثم يتم اكتشافه بواسطة الجسم المضاد للكشف ، وبالتالي تشكيل شطيرة الجسم المضاد والمستضد والأجسام المضادة. هذه الطريقة مفيدة لقياس تركيز المستضد في عينة مختلطة.

يتم استخدام ELISA التنافسي عندما يتوفر جسم مضاد واحد فقط لمستضد مستهدف محل أهمية. يتم طلاء اللوحة أولا بالمستضد المنقى. وفي الوقت نفسه ، يتم تحضين العينة التي تحتوي على المستضد مسبقا بالجسم المضاد ثم تضاف إلى اللوحة ، للسماح لأي جزيئات أجسام مضادة حرة بالارتباط بالمستضد الثابت. كلما زادت الإشارة من اللوحة ، انخفض تركيز المستضد في العينة. في جميع الأنواع الأربعة من ELISA ، المباشرة وغير المباشرة والساندويتش والتنافسية ، يكون الجسم المضاد للكشف إما مترافقا مباشرة مع الإنزيم أو يمكن ربطه بشكل غير مباشر من خلال جسم مضاد أو بروتين آخر.

الإنزيمات المستخدمة بشكل شائع في التفاعل هي بيروكسيداز الفجل الحار أو الفوسفاتيز القلوي مع ركائزها الخاصة ، وكلاهما ينتج منتجا ملونا قابلا للذوبان يمكن قياسه وقياسه كميا باستخدام قارئ الألواح. في هذا الفيديو ، ستلاحظ كيفية أداء ELISA غير المباشر ، وشطيرة ELISA ، و ELISA التنافسية ، متبوعة بأمثلة على القياس الكمي للتحليل المستهدف من طرق ELISA غير المباشرة والساندويتش.

ستوضح التجربة الأولى كيفية استخدام ELISA غير المباشر لتحديد وجود الأجسام المضادة لفيروس الأنفلونزا في المصل الذي تم الحصول عليه من الفئران المصابة بالأنفلونزا.

للبدء ، أضف 50 ميكرولترا من المستضد المنقى - في هذه الحالة ، 2 ملليغرام لكل ملليلتر من فيروس الإنفلونزا A المنقى A / PR / 8 - إلى كل بئر من لوحة ELISA المكونة من 96 بئرا. بعد ذلك ، قم بتغطية اللوحة بغطاء لاصق واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية للسماح للمستضد بالالتصاق باللوحة. في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الطلاء عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض. بعد ذلك ، قم بسد مواقع ربط البروتين المتبقية في الآبار المطلية بإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع - هنا ، مصل الحمير 5٪ في 1X PBS - لكل بئر. اترك الطبق ليحتضن لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحجب ثم اغسل اللوحة بإضافة 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1٪ Tween-20. قم بتمرير اللوحة فوق الحوض مرة أخرى لإزالة الغسيل.

بعد ذلك ، قم بإعداد عينات الاختبار عن طريق إضافة 460 ميكرولتر من PBS إلى أنبوب جديد ، ثم إضافة 40 ميكرولترا من المصل لعمل تخفيف من 1 إلى 12.5. ثم أضف 300 ميكرولتر من PBS إلى أنبوب ثان ، ثم أضف 100 ميكرولتر من التخفيف الأول. استمر في نطاق التخفيف التسلسلي هذا حتى الحصول على عينة نهائية بتخفيف من 1 إلى 204,800. أضف عينات المصل المخففة بشكل متسلسل في ثلاث نسخ إلى الآبار. غطي اللوحة بغطاء لاصق واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. بعد ذلك ، قم بإزالة العينات عن طريق تحريك اللوحة في الحوض ثم اغسل اللوحة بإضافة 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1٪ Tween-20. مرة أخرى ، انقر فوق اللوحة لإزالة الغسيل.

الآن ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المترافق بالإنزيم ، والذي في هذه التجربة هو بيروكسيداز الفجل الحار ، أو HRP ، الحمار المترافق الثانوي المضاد للفأر ، إلى كل بئر. احتضن الطبق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، وقم بنفض الغبار على اللوحة لإزالة أي سائل زائد. اغسل اللوحة باستخدام 1X PBS تحتوي على 1٪ Tween-20 ثم ضع 100 ميكرولتر من ركيزة المؤشر بتركيز ملليغرام واحد لكل مليلتر على كل بئر. احتضن اللوحة بالركيزة لمدة 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. في هذا المثال ، تتحول الركيزة عديمة اللون 3،3 '، 5،5 ' - رباعي ميثيل بنزيدين ، أو TMB ، إلى اللون الأزرق عند وجود HRP. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعل الأنزيمي بإضافة 100 ميكرولتر من حمض الكبريتيك 2N. ستتحول العينات إلى اللون الأصفر.

في غضون 30 دقيقة من إضافة محلول التوقف ، أدخل اللوحة في قارئ صفيحة دقيقة واقرأ اللوحة بالطول الموجي المناسب للركيزة لتحديد امتصاص الآبار.

لبدء شطيرة ELISA ، يجب أن تكون اللوحة مغلفة بجسم مضاد منقى الالتقاط. للقيام بذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الملتقط بتركيز في نطاق 1-10 ميكروغرام لكل مليلتر ، إلى كل بئر من لوحة ELISA المكونة من 96 بئرا. بعد ذلك ، قم بتغطية اللوحة بغطاء لوح لاصق ثم احتضن اللوحة طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الطلاء عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.

الآن ، قم بسد مواقع ربط البروتين المتبقية في الآبار المطلية بإضافة 200 ميكرولتر من الحليب الجاف الخالي من الدسم بنسبة 5٪ إلى الآبار. احتضان الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة على الأقل. بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحجب ، ثم اغسل الآبار باستخدام 1X PBS يحتوي على 1٪ Tween-20. قم بإزالة الغسيل عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض. الآن ، أضف 100 ميكرولتر من عينة الاختبار إلى الآبار ، وأغلق اللوحة بغطاء لاصق ، ثم احتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، قم بإزالة العينات عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض ثم اغسل الآبار ب 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1٪ Tween-20. قم بتمرير اللوحة فوق الحوض لإزالة الغسيل ثم أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد للكشف المترافق بالإنزيم إلى الآبار.

ختم اللوحة بغطاء لاصق. اترك الطبق ليحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، قم بإزالة الجسم المضاد للكشف غير المرتبط عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض وغسل الآبار ب 200 ميكرولتر من 1X PBS يحتوي على 1٪ Tween-20. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من ركيزة المؤشر بتركيز 1 ملليغرام لكل مليلتر ، واحتضن اللوحة لمدة 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعل الأنزيمي عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من حمض الكبريتيك 2N إلى الآبار ثم اقرأ اللوحة في غضون 30 دقيقة من إضافة محلول التوقف في قارئ الصفيحة الدقيقة.

لإجراء ELISA تنافسي ، قم أولا بتغطية آبار لوحة ELISA المكونة من 96 بئرا ب 100 ميكرولتر من المستضد المنقى بتركيز 1-10 ميكروغرام لكل ملليلتر. غطي الطبق بغطاء لوح لاصق ثم احتضنه طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول المستضد غير المرتبط من الآبار عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.

بعد ذلك ، قم بسد مواقع ربط البروتين المتبقية في الآبار المطلية بإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب إلى كل بئر - هنا ، 5٪ حليب جاف خالي الدسم في PBS. احتضن اللوحة لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة. أثناء سد الآبار ، قم بإعداد خليط المستضد والأجسام المضادة في 1. أنبوب 5 مليلتر عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من مستضد العينة إلى 150 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي لكل بئر في الفحص. احتضان هذا الخليط لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. الآن ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحجب من الآبار عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض. بعد ذلك ، اغسل الآبار باستخدام 1X PBS الذي يحتوي على Tween 20 ثم أضف 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الأولية للمستضد.

اترك الطبق ليحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بإزالة خليط العينة عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض ثم اغسل الآبار باستخدام 1X PBS يحتوي على 1٪ Tween-20 لإزالة أي جسم مضاد غير مرتبط. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المترافق مع الإنزيم إلى كل بئر واحتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، اغسل اللوحة باستخدام 1X PBS تحتوي على 1٪ Tween-20 ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر. انتظر لمدة 5-10 دقائق. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعل الأنزيمي عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من حمض الكبريتيك 2N ثم قم بقياس الامتصاص في قارئ الصفيحة الدقيقة في غضون 30 دقيقة من إضافة محلول التوقف.

بالنسبة لمقايسة ELISA غير المباشرة شبه الكمية ، تم تحديد وجود الأجسام المضادة لفيروس الأنفلونزا A في عينات مصل مصل الدم المخففة بشكل متسلسل من الفئران المصابة بالإنفلونزا A من خلال قراءة امتصاص كل بئر عند 405 نانومتر في قارئ لوحة. يتم تصدير هذه البيانات الأولية إلى جدول بيانات لأغراض الحساب. في هذه التجربة ، تكررت عينات المصل المخففة بشكل متسلسل ، والتي تتراوح من 1 - 12.5 ، إلى 1 - 204،800 ، في ثلاث نسخ.

لتحليل البيانات ، يتم حساب متوسط قيمة الامتصاص لكل مجموعة من النسخ الثلاثية عن طريق إضافة جميع القيم لكل تخفيف وقسمة المجموع على 3. بمجرد تحديد متوسط كل مجموعة من النسخ الثلاثية ، يتم رسم متوسط قراءات OD450 مقابل التخفيفات التسلسلية. تنخفض قراءات OD مع تخفيف المصل ، مما يشير إلى وجود أجسام مضادة أقل في العينات المخففة. في الشطيرة الكمية ELISA ، تمت إضافة التخفيفات ذات المعيار المعروف ، في هذه الحالة إعادة تجميع TNFalpha البشري ، إلى صفيحة مكونة من 96 بئرا وقراءتها مع العينات غير المعروفة.

لإنشاء المنحنى القياسي ، تم حساب متوسط قيمة الامتصاص لكل مجموعة من قراءات التركيزات المعروفة. بعد ذلك ، تم رسم متوسط قيمة الامتصاص على المحور y ، مقابل تركيزات البروتين المعروفة على المحور السيني. تتم إضافة منحنى ملاءمة أفضل من خلال النقاط الموجودة في الرسم البياني.

بمجرد إنشاء المنحنى القياسي ، يمكن تحديد كمية بروتين TNFalpha في عينة الاختبار عن طريق حساب متوسط قيمة الامتصاص لعينة الاختبار أولا. في هذا المثال، أعطت عينات الاختبار قراءات OD450 للعددين 0.636 و0. 681- بجمع هذه القيم وقسمة المجموع على 2 يعطى متوسط 0.659. من المحور y على الرسم البياني للمنحنى القياسي ، قم بتمديد خط أفقي من قيمة الامتصاص هذه إلى المنحنى القياسي. عند نقطة التقاطع ، قم بتمديد خط عمودي إلى المحور x واقرأ التركيز المقابل الذي يتوافق في عينة الاختبار هذه مع تركيز TNFalpha البالغ 38.72 بيكوغرام لكل مليلتر.