الكيمياء المناعية والكيمياء المناعية: تصوير الأنسجة عن طريق المجهر الضوئي

الكيمياء الخلوية المناعية والكيمياء المناعية هي طرق تلطيخ لبروتين ذي أهمية في الخلايا والأنسجة المستنبتة ، على التوالي. يتضمن المبدأ الأساسي لكلتا التقنيتين المرتبطتين استخدام أجسام مضادة محددة موسومة بنظام كشف لتحديد البروتين وتصوره وتحديد موقعه داخل الخلايا والأنسجة ، بالإضافة إلى المستويات النسبية. تبدأ العملية في أي من التجربتين بإعداد العينة.

بالنسبة لكيمياء الخلايا المناعية ، التي تصور على وجه التحديد مواقع البروتين أو المستضد في الخلايا ، يتضمن ذلك ثلاث خطوات. الخطوة الأولى هي الطلاء ، والذي يستلزم زراعة الخلايا في وسط النمو على زلة غطاء أو شريحة ، عادة في آبار صفيحة الاستزراع. يتبع ذلك التثبيت ، حيث يضاف عامل ترسيب أو تشابك مثل بارافورمالدهيد إلى الخلايا للحفاظ على السلامة الهيكلية للبروتينات ومنع نشاط الإنزيم من تدهورها. الخطوة الأخيرة هي النفاذية ، والتي تتضمن إضافة منظف لجعل أغشية الخلايا قابلة للاختراق للتلطيخ.

في الطريقة المقابلة ، يتم تصور الكيمياء المناعية أو البروتينات أو المستضدات في الأنسجة ويتكون تحضير العينة من خمس خطوات. أولا ، يخضع النسيج بأكمله للتثبيت ، عادة باستخدام بارافورمالدهايد. يتبع ذلك تضمين الأنسجة في كتلة من البارافين ، ثم تقسيم هذه الكتلة باستخدام آلة تسمى microtome لتقطيع الأنسجة إلى شرائح رفيعة يمكن وضعها على الشرائح. بعد ذلك ، تخضع الشرائح لإزالة البارافينات ، أو إزالة البارافين من حول شريحة الأنسجة. بعد ذلك ، يمكن إجراء خطوة اختيارية لاسترجاع المستضد. يمكن القيام بذلك إما باستخدام الحرارة أو الإنزيمات لكشف القناع عن الحلقات التي تم ربطها أثناء التثبيت مما يجعلها متاحة لربط الأجسام المضادة. بعد تحضير العينة المناسبة ، يضاف جسم مضاد أولي محدد إلى عينة الخلية أو الأنسجة. يجب أن يرتبط هذا الجسم المضاد الأساسي بالبروتين محل الاهتمام. بعد ذلك ، يتم إضافة جسم مضاد ثانوي ، والذي يكتشف الجسم المضاد الأساسي ويرتبط به. يترافق هذا الجسم المضاد الثانوي مع إنزيم يسمى HRP أو يمكن أن يرتبط به. عند إضافة الركيزة المحددة ، DAB ، يقوم HRP بتحويل هذا إلى راسب بني غير قابل للذوبان. تشير هذه البقعة البنية إلى موقع البروتين المستهدف. الشرائح ملطخة أيضا بالهيماتوكسيلين ، الذي يصنف النوى باللون الأزرق ويوفر نقطة مرجعية مكانية لتحديد التوطين تحت الخلوي. بعد ذلك ، تتم إضافة وسائط التثبيت إلى الشريحة ، متبوعة بزلة غطاء من أجل إغلاق العينة الملطخة والحفاظ عليها. أخيرا ، يمكن تصوير الشرائح على مجهر ضوئي.

في هذا الفيديو ، ستلاحظ تقنية تحضير العينة للخلايا المطلية وأقسام الأنسجة ، متبوعة بالتلوين المناعي لأقسام الأنسجة.

أولا ، يجب أن تجلس الخلايا ذات الأهمية على أغطية. للقيام بذلك ، من خلال العمل في غطاء لزراعة الأنسجة ، ضع أغطية فردية في آبار صفيحة 24 بئرا. بعد ذلك ، أغلق الوشاح وقم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتعقيم الغطاء لمدة 15 دقيقة على الأقل. بعد ذلك ، أطفئ ضوء الأشعة فوق البنفسجية. لرفع الخلايا ذات الأهمية من طبق ملتقى يبلغ طوله 10 سم ، قم بشفط الوسائط ، واغسلها لفترة وجيزة باستخدام PBS ، وأضف التربسين إلى الخلايا لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، اضغط على جانب اللوحة للتأكد من انفصال الخلايا وتحييد التربسين بالوسائط. بعد ذلك ، أضف 0. 5 مل من تعليق الخلية في كل بئر ، مع التأكد من تغطية الغطاء. ضع اللوحة في حاضنة CO2 رطبة واترك الخلايا تنمو عند 37 درجة مئوية حتى تتماسك بنسبة 50-70٪.

بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء مثالي ، قم بشفط وسط الثقافة من كل بئر ، ثم قم بإصلاح الخلايا عن طريق احتضانها في. 5 مل من 4٪ بارافورمالدهيد مخفف في 1X PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة المثبت ، اشطف الخلايا بإضافة 1 مل من 1X PBS فوق كل غطاء غطاء. قم بشفط PBS على الفور ، ثم كرر الشطف مرتين أخريين ليصبح المجموع 3 غسلات.

الآن ، قم باختراق الخلايا عن طريق إضافة 0.5 مل من 0.1٪ Triton X-100 في 1X PBS إلى كل بئر. اترك الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. استنشق المخزن المؤقت للنفاذية ثم اشطف الخلايا بإضافة 1 مل من 1X PBS في كل بئر. قم على الفور بسحب PBS وكرر الشطف مرتين أخريين ليصبح المجموع 3 غسلات. الآن بعد أن تم إصلاح الخلايا الموجودة على الغطاء ونفاذها ، انتقل إلى إجراء التلوين الموضح لمثال الكيمياء المناعية التالي باستثناء أنه يجب إجراء الحضانات داخل آبار الصفيحة المكونة من 24 بئرا بدلا من وضعها مباشرة على شريحة قسم الأنسجة.

للبدء ، احصل على أقسام أنسجة معدة ومثبتة بالفورمالين ومدمجة في البارافين. قم بإزالة الشرائح عن طريق وضعها في رف منزلق ثم غمرها تماما في 250 مل من الزيلين بنسبة 100٪. اترك الشرائح تحتضن لمدة 5 دقائق في الزيلين. بعد ذلك ، قم بإزالة الشرائح من الحاوية ، وامسحها بمنشفة ورقية ، وضعها في حمام زيلين جديد في وعاء جديد لمدة 5 دقائق أخرى.

بعد ذلك ، أعد ترطيب الأقسام في سلسلة من محاليل الإيثانول المتدرجة بدءا من الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 3 دقائق. امسح رف الشرائح بمنشفة ورقية وانقل الشرائح إلى حاوية جديدة تحتوي على الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 3 دقائق أخرى. استمر في دورة الغسيل والتجفيف بمنشفة ورقية ونقل الشرائح إلى حمام جديد باتباع التركيزات المحددة من الإيثانول للوقت المحدد. بعد غسل الإيثانول النهائي ، امسح الرف بمنشفة ورقية واحتضن الشرائح في 100 مل من بيروكسيد الهيدروجين .3٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة من أجل منع أي نشاط بيروكسيداز داخلي. اغسل الشرائح في 250 مل من 1X PBS لمدة 5 دقائق. كرر هذا الغسيل في وعاء به 1X PBS طازج لمدة 5 دقائق إضافية.

بعد ذلك ، قم بإجراء استرجاع المستضد عن طريق غمر الشرائح في 250 مل من مخزن سترات IHC عند درجة الحموضة 6.0 وغليها لمدة 20 دقيقة. ثم انتقل إلى بروتوكول التلوين.

لبدء عملية تلطيخ IHC ، ضع دائرة حول الأقسام بقلم كاره للماء لتحديد الحد الأدنى من المساحة التي يحتاج المخزن المؤقت إلى تغطيتها. بعد ذلك ، استخدم ماصة لوضع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للانسداد ، والذي في هذه التجربة عبارة عن مصل حصان مخفف في 1X PBS ، فوق القسم. احتضن الشرائح لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحجب باستخدام ماصة.

بعد ذلك ، قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي ومنع المخزن المؤقت عند تخفيف 1: 100 عن طريق إضافة 990 ميكرولتر من مصل الحصان المخفف في 1X PBS إلى 1. 5 مل أنبوب Eppendorf ، متبوعا ب 10 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي المخفف إلى كل قسم ، واحتضن الشرائح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. عندما يصدر صوت المؤقت ، قم بتصريف الجسم المضاد الأساسي من كل شريحة ، ثم اغسله في 250 مل من 1X PBS لمدة 5 دقائق. كرر هذا الغسيل مرة أخرى باستخدام 1X PBS الطازج.

أثناء غسل الشرائح في 1X PBS ، قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي إلى تخفيف 1: 200 عن طريق إضافة 995 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع إلى أنبوب 1.5 مل متبوعا ب 5 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي ، والذي في هذه الحالة هو IGG مضاد للفأر للحصان. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف إلى كل قسم ، ثم احتضن الشرائح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة الجسم المضاد الثانوي عن طريق تصريفه من الأقسام ، ثم اغسل الشرائح في 250 مل من 1X PBS لمدة 5 دقائق. كرر هذا الغسيل باستخدام 1X PBS الطازج.

الآن ، أضف 100 ميكرولتر من كاشف مركب أفيدين بيوتين ، واحتضن الأقسام في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل الشرائح عن طريق غمرها في 250 مل من 1X PBS لمدة 5 دقائق. على غرار خطوات الغسيل السابقة ، كرر هذا الغسيل مرة أخرى باستخدام 1X PBS الطازج. بعد ذلك ، قم بتطوير الشرائح عن طريق احتضان الأقسام في 100 ميكرولتر من DAB لمدة تصل إلى 5 دقائق. أوقف التطوير عن طريق غمر الأقسام في 250 مل من الماء المقطر لمدة 5 دقائق.

الآن ، يمكن تلطيخ الشرائح ، إذا رغبت في ذلك. للقيام بذلك ، اغمس الشرائح لفترة وجيزة في 250 مل من محلول Harris Hematoxylin. اشطف البقعة المضادة عن طريق غسل الشرائح في 250 مل من الماء المقطر لمدة 5 دقائق. كرر هذا الغسيل مرة أخرى باستخدام الماء المقطر العذب. بعد ذلك ، قم بتجفيف الأقسام. للقيام بذلك ، قم أولا باحتضان الشرائح في 95٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق. امسح الشرائح على منشفة ورقية ، وانقلها إلى وعاء جديد من الإيثانول الطازج بنسبة 95٪ لمدة 5 دقائق أخرى. استمر في دورة الغسيل ، والنشاف بمنشفة ورقية ، ونقل الشرائح إلى حمام جديد ، باتباع المحاليل المشار إليها لمدة 5 دقائق لكل منها.

بعد الحضانة النهائية ، امسح الشرائح بمنشفة ورقية ، ثم أضف قطرة من وسائط التثبيت ، مثل Organo-Limonene Mount ، إلى الشرائح. الآن ، ضع غطاء فوق الأقسام ، مع الحرص على عدم حبس فقاعات الهواء. الشرائح جاهزة الآن للمراقبة تحت المجهر لتحليلها.

لمراقبة الأقسام الملطخة ، استخدم مجهر ضوئي قياسي لتصور البقعة ، وكاميرا رقمية لالتقاط الصورة. في هذا المثال بالذات من IHC ، تتم مقارنة أنسجة الطحال من النوع البري والفئران العفوية أو المعدلة وراثيا المزدوجة أو DTG لدراسة تعبير Dyclin D1 في سرطان الغدد الليمفاوية. كانت الأنسجة مضمنة في البارافين ، ومقسمة ، وملطخة بجسم مضاد مضاد للسيكلين D1 ، وتم تصويرها بتكبير 20 مرة. يشار إلى الخلايا التي تعبر عن Cyclin D1 باللون البني المحمر مقابل خلفية الأنسجة الزرقاء. بمقارنة شدة التلوين بين الصور من الفئران المختلفة ، فإن الطحال غير المتضخم يحتوي على كميات منخفضة نسبيا من تعبير Cyclin D1 بغض النظر عن النمط الجيني للفأر. في المقابل ، يظهر الطحال المتضخم من فأر DTG زيادة في تلطيخ البني المحمر مما يشير إلى وجود علاقة بين تطور السرطان وتعبير Cyclin D1 في نموذج الفأر هذا.