توليد الأجسام المضادة: إنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة باستخدام الأورام الهجينة

الأجسام المضادة هي أداة قوية للبحث والتشخيص ، مما يعني أن إنتاجها بكميات كبيرة غالبا ما يكون ضروريا.

تتمثل الخطوة الأولى لتوليد الأجسام المضادة في حقن المستضد المعني في المضيف. ينشط المستضد الخلايا البائية للمضيف والتي تنتج بعد ذلك وتطلق أجساما مضادة خاصة بهذا المستضد. بعد ذلك ، يتم إجراء فحص منتظم لأمصال المضيف لوجود الجسم المضاد المستهدف ، باستخدام ELISA أو طريقة كشف أخرى. بمجرد اكتشافه ، تتم إزالة طحال المضيف ، الذي يحتوي على الخلايا البائية. إذا تم عزل جميع الخلايا البائية من الطحال الآن ، فيجب أن يشمل ذلك مجموعة من السكان الذين يفرزون الأجسام المضادة للمستضد المعني. نشير إلى هذه المجموعة على أنها متعددة النسيلة ، لأن كل خلية من المحتمل أن ترتبط بحتمة مختلفة من المستضد ، وبالتالي ، تولد جسمها المضاد الفردي والفريد.

لتوليد أجسام مضادة وحيدة النسيلة ، يجب أولا عزل وزراعة الخلية البائية الفردية التي تنتج الجسم المضاد المطلوب. لسوء الحظ ، لا تعيش الخلايا البائية بشكل جيد في الثقافة. لذلك للتغلب على هذه العقبة ، يقوم العلماء بدمج الخلايا البائية مع خلايا الورم النقوي الخالدة ، مما يؤدي إلى الأورام الهجينة. ثم تزرع هذه الخلايا في وسط انتقائي يسمح فقط للأورام الهجينة بالنمو وإطلاق الأجسام المضادة. مرة أخرى ، يتم فحص الوسيط باستخدام طريقة مثل ELISA للجسم المضاد المطلوب. بمجرد اكتشافها ، يتم استنساخ الأورام الهجينة عبر عملية تسمى الحد من التخفيف ، وهو تخفيف تسلسلي للثقافة الأم ، والذي يجب أن يؤدي إلى زرع خلايا مفردة في آبار لوحة الغربلة. يسمح هذا بنمو الأورام الهجينة من خلية أم واحدة ، مما ينتج عنه خط خلية وحيد النسيلة يطلق الجسم المضاد المطلوب فقط. يمكن توسيع هذه الخطوط أحادية النسيلة في قوارير زراعة الأنسجة لإنتاج كميات كبيرة من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. بعد ذلك ، عندما تبدأ الخلايا في الموت ، يمكن ترسيب الأجسام المضادة من الوسط بكبريتات الأمونيوم. عادة ، في المحلول ، تتفاعل الأجسام المضادة مع الماء من خلال التفاعلات المحبة للماء. ومع ذلك ، فإن الأمونيوم والكبريتات عبارة عن أيونات عالية الشحنة تفصل جزيئات الماء عن الأجسام المضادة ، مما يقلل من قابلية ذوبان الأجسام المضادة ويؤدي إلى ترسبها.

للبدء ، تحقق أولا من قائمة المواد وقم بإعداد جميع الوسائط والإمدادات وأسطح العمل للبروتوكول.

ثم قم بتشغيل حمام مائي واضبطه على 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 10 مل من RPMI الكامل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر و 15 مل من RPMI الكامل إلى قارورة ثقافة خلية T75 وضعها جانبا. توخي الحذر وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة ، قم بإزالة القارورة المجمدة التي تحتوي على خلايا الورم الهجين من تخزين النيتروجين السائل. لتحرير الضغط داخل القارورة ، قم بفك الغطاء قليلا. الآن ، احتضان القارورة بعناية في الحمام المائي ، مع التأكد من بقاء الغطاء فوق سطح الماء لتقليل فرص التلوث. عندما تذوب الخلايا تقريبا ، والتي تستغرق عادة حوالي دقيقتين ، انقل القارورة إلى غطاء زراعة الأنسجة.

ثم امسح الجزء الخارجي من القارورة بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل إزالة الغطاء. باستخدام ماصة معقمة ، انقل الخلايا إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على 10 ملليلتر من وسط RPMI الكامل. ثم ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة خمس دقائق عند 1200 دورة في الدقيقة. بعد الطرد المركزي ، حرك الأنبوب مرة أخرى إلى غطاء الأنسجة وامسح الجزء الخارجي من الأنبوب بالإيثانول. دون إزعاج الحبيبات ، تخلص من المادة الطافية ثم أضف خمسة ملليلتر من وسط RPMI الكامل الطازج وقم بالماصة برفق لأعلى ولأسفل لإعادة التعليق. بعد ذلك ، انقل الخلايا إلى قارورة ثقافة الخلايا T75 وضع القارورة داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. اسمح للخلايا بالوصول إلى ما يقرب من 80٪ من التقاء ، والذي يستغرق عادة حوالي ثلاثة أيام. لاحظ أن خلايا الورم الهجين غير ملتصقة وستنمو معلقة في الوسط. قد يختلف وقت الوصول إلى التقاء كاف بناء على العدد المبدئي للخلايا الحية ونوع خلية الورم الهجين المستخدمة.

بمجرد أن تتماسك الخلايا بدرجة كافية، استخدم ماصة معقمة سعة 25 مليلتر لنقلها من قارورة الاستزراع إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل. حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. أثناء وجود الخلايا في جهاز الطرد المركزي ، أضف 18 مل من RPMI الكامل إلى كل من قوارير ثقافة الخلايا T75 الثلاثة الجديدة وضعها جانبا. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق في ستة ملليلتر من RPMI الكامل. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من معلق الخلية في كل من قوارير زراعة الخلايا الثلاثة الجديدة. أخيرا ، ضع القوارير في حاضنة مضبوطة على 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية واحتضانها حتى تصبح القوارير حوالي 80٪ ملتقية ، حوالي ثلاثة أيام.

في هذه المرحلة ، تكون الخلايا جاهزة لمواصلة نموها في الوسط الخالي من المصل المصمم لخطوط خلايا الورم الهجين ، مثل الوسط السائل القاعدي HB المتاح تجاريا والذي يحتوي على مكمل HB101. انقل الخلايا من كل قارورة لزراعة الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي مخروطية الشكل ثم قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 1200 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. الآن ، أضف 230 مل من الوسط الخالي من المصل HB101 المكملة في كل من ستة قوارير لزراعة الخلايا بحجم 225 سم مربع وضعها جانبا. عند اكتمال الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق كل حبيبات في 10 ملليلتر من وسط HB101 المكمل. ثم ، في كل قارورة لزراعة الخلية ، أضف خمسة ملليلتر من تعليق الخلية. ضع القوارير في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية واستمر في نمو الخلايا لمدة ثلاثة أسابيع تقريبا. خلال هذا الوقت ، ستنتج الخلايا وتطلق الجسم المضاد أحادي النسيلة ذي الأهمية في وسط المزرعة وسيكون الجسم المضاد جاهزا للتنقية عندما تبدأ الخلايا في الموت.

لإزالة الحطام الخلوي من وسط الثقافة المحتوية على الأجسام المضادة ، اسكب محتويات قوارير المزرعة في أنابيب للحصول على دوار بزاوية ثابتة. ضع الأنابيب في الدوار وتأكد من توازنها بشكل صحيح قبل الطرد المركزي. قم بتدوير الأنابيب بسرعة 10,000 دورة في الدقيقة لمدة ثماني دقائق. أثناء الطرد المركزي للعينات ، ضع دورق بلاستيكي سعة لترين مع قضيب تقليب في دلو ثلج ثم ضع دلو الثلج على طبق التقليب.

بعد ذلك ، قم بتوصيل سطح مرشح سعة 500 مل بزجاجة سعة لتر واحد. قم بتوصيل وحدة الفلتر العلوية للزجاجة بمكنسة كهربائية منزلية باستخدام الأنبوب المناسب. ثم اسكب المادة الطافية التي تحتوي على الجسم المضاد في الجزء العلوي من المرشح. الطرد المركزي للوسائط المتبقية لفصل بقايا الخلية عن المادة الطافية المحتوية على الجسم المضاد. عندما يكون الجزء العلوي من المرشح مليئا بالمواد الطافية ، ابدأ الفراغ. بعد ذلك ، عندما تقترب زجاجة التجميع سعة لتر واحد من الامتلاء ، قم بإزالة الجزء العلوي من الفلتر واسكب المادة الطافية المفلترة في الدورق سعة لترين على الثلج. كرر خطوات الترشيح حتى تتم معالجة كل المادة الطافية.

عندما تتم معالجة كل العينة ، تزن 295 جراما من كبريتات الأمونيوم لكل لتر واحد من المادة المطفية المفلترة. ابدأ في طبق التقليب وأضف كبريتات الأمونيوم ببطء إلى المادة الطافية خلال الساعتين المقبلتين. هذا يمنع تركيزا عاليا موضعيا من ملح كبريتات الأمونيوم الذي قد يتسبب في ترسيب البروتينات غير المرغوب فيها. بمجرد إضافة كل كبريتات الأمونيوم ، قم بتغطية الدورق بورق الألمنيوم وانقله ، جنبا إلى جنب مع لوح التحريك ، إلى غرفة باردة عند أربع درجات مئوية واضبطه على تحريك محلول الجسم المضاد طوال الليل.

في صباح اليوم التالي ، اسكب محلول الأجسام المضادة المحتوية على كبريتات الأمونيوم من الدورق سعة لترين في أنابيب نظيفة للدوار ذو الزاوية الثابتة. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 6500 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة دون انقطاع لتكسير الجسم المضاد في الجزء السفلي من الأنابيب. بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية بالمكنسة الكهربائية ، مع توخي الحذر حتى لا تمتص الحبيبات الناعمة. استمر في استخدام نفس مجموعة الأنابيب لجمع الجسم المضاد المحبب من باقي المادة الطافية المحتوية على كبريتات الأمونيوم. بعد الشفط الأخير ، أعد تعليق كل بيليه للجسم المضاد في ما يقرب من مليلتر واحد من PBS.

لإزالة كبريتات الأمونيوم من محلول الأجسام المضادة ، قم أولا بقطع ما يقرب من بوصة واحدة من أنابيب غسيل الكلى لكل مليلتر من محلول الأجسام المضادة. بعد ذلك ، امسح الأنبوب بالماء المقطر واربط عقدة على أحد طرفي الأنبوب. املأ الأنبوب بالماء المقطر للتحقق من التسرب من العقدة. إذا لم يكن هناك تسرب بعد بضع دقائق ، فقم بإفراغ الماء من الأنبوب.

بعد ذلك ، قم بإدخال محلول الجسم المضاد في الأنبوب. لاستعادة أكبر قدر ممكن من الأجسام المضادة ، اشطف الأنابيب ب 0.25 مل إضافية من PBS وانقلها إلى الأنبوب أيضا. قم بتأمين الجزء العلوي من الأنبوب بالقرب من المحلول قدر الإمكان باستخدام مشبك غسيل الكلى. بعد ذلك ، قم بلصق الجزء العلوي من الأنبوب على الجزء العلوي الخارجي من دورق سعة أربعة لترات مع الجزء المملوء من الأنبوب المعلق في الدرق. الآن ، خذ الدورق إلى الغرفة الباردة التي تبلغ درجة حرارتها أربع درجات مئوية وضعه على طبق تحريك. املأ الدورق إلى الأعلى ب PBS وأضف شريط التقليب. اترك الأنبوب والمحلول يقلبان طوال الليل لمدة ثماني ساعات تقريبا. في صباح اليوم التالي ، استبدل PBS في الدورق ب PBS طازج ثم اترك الدورق ليقلب مرة أخرى لمدة ثماني ساعات تقريبا. في وقت لاحق من ذلك المساء ، كرر العملية مرة أخيرة. في الصباح ، افتح أنبوب غسيل الكلى ثم انقل محلول الجسم المضاد من الأنبوب إلى أنابيب مخروطية سعة 15 ملليلترا. لإزالة أي مرسب قد يكون قد تشكل أثناء غسيل الكلى ، قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة خمس دقائق عند 1200 دورة في الدقيقة. أخيرا ، انقل المادة الطافية إلى أنابيب جديدة.

لتحديد تركيز الجسم المضاد ، قم أولا بعمل تخفيف بمقدار 20 ضعفا عن طريق إضافة خمسة ميكرولترات من حصة الجسم المضاد إلى 95 ميكرولترا من PBS. بعد ذلك، قم بتقطيع الجسم المضاد المخفف إلى كوفيت واستخدم مقياس الطيف الضوئي لتسجيل التركيز عند 280 نانومتر. بعد ذلك ، احسب تركيز الجسم المضاد باستخدام الصيغة الموضحة. أخيرا ، قم بتسمية قوارير الغطاء اللولبي باسم الجسم المضاد وتركيزه وتاريخ التحضير ، وإذا أمكن ، رقم الدفعة واسم المجرب ، ثم قم بنقل الجسم المضاد في قوارير الغطاء اللولبي المسمى. يمكن تخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لحين الحاجة.

على سبيل المثال ، تراوحت الغلة باستخدام خط الورم الهجين CD317 المضاد للفأر 120G8 أو PDCA-1 بين 44 و 99.6 ملليغرام ، والذي ينتج عادة ، في المتوسط ، 67.3 ملليغرام. من المهم ملاحظة أن كل إنتاج يتم تشغيله بنفس خط خلايا الورم الهجين يمكن أن يكون مختلفا قليلا في كمية الجسم المضاد أحادي النسيلة المتاح في النهاية.