Why can't B-cells be cultured directly to produce monoclonal antibodies?

B-cells do not survive well in long-term culture, making it impossible to maintain them indefinitely for antibody production. To overcome this limitation, scientists fuse B-cells with immortal myeloma cells to create hybridomas, which combine the antibody-producing properties of B-cells with the indefinite growth capacity of myeloma cells.

What is the difference between polyclonal and monoclonal antibodies?

Polyclonal antibodies are a mixture of antibodies, each recognizing different epitopes on an antigen, produced by multiple B-cell clones. Monoclonal antibodies are identical antibodies produced by a single hybridoma cell line, recognizing only one specific epitope. This makes monoclonal antibodies more specific and useful for distinguishing between similar antigens.

How does limiting dilution ensure monoclonal antibody production?

Limiting dilution is a serial dilution process that statistically ensures single cells are seeded into screening plate wells. Wells containing one cell grow into monoclonal populations producing identical antibodies. This cloning method guarantees that the resulting hybridoma line releases only the desired antibody of known specificity.

What role does ammonium sulfate play in antibody purification?

Ammonium sulfate precipitation removes antibodies from culture medium by competing with proteins for water molecules through hydrophilic interactions. The highly charged ammonium and sulfate ions decrease antibody solubility, causing them to precipitate out of solution. This salting-out method is a standard technique for protein purification from culture supernatants.

Why is dialysis tubing used after ammonium sulfate precipitation?

Dialysis tubing removes residual ammonium sulfate from the antibody solution through osmotic exchange. The antibody solution is placed in dialysis tubing and immersed in PBS buffer overnight. Water and small salt ions pass through the tubing membrane while antibodies remain inside, resulting in purified antibody free of ammonium sulfate.

How is antibody concentration determined after purification?

Antibody concentration is measured using a spectrophotometer at 280 nanometers, which detects protein absorbance. A 20-fold dilution of the antibody sample is prepared in PBS, then analyzed using the spectrophotometer. The concentration is calculated using a standard formula and recorded for documentation and storage of the purified monoclonal antibody.

What screening method is used to identify hybridomas producing the desired antibody?

ELISA assays indirect sandwich and competitive methods are used to screen hybridoma culture media for the presence of the target antibody. After hybridoma fusion and limiting dilution cloning, ELISA detects which wells contain cells producing the desired monoclonal antibody. This screening step ensures only hybridomas with the correct antibody specificity are selected for expansion and antibody production.

توليد الأجسام المضادة: إنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة باستخدام الأورام الهجينة

0 مشاهدة13:21 دقيقة

ملاحظة: يجب الحفاظ على تقنية زراعة الخلايا المعقمة عند التعامل مع خلايا الورم الهجين والوسائط بطريقة معقمة (على سبيل المثال ، في خزانة السلامة الحيوية) حتى خطوات تنقية الأجسام المضادة.

< p class = "jove_title" >1. إذابة خلايا الورم الهجين المجمد

احتضان القارورة التي تحتوي على خلايا الورم الهجين المجمدة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى تذوب تماما (حوالي دقيقتين).
أضف الخلايا المذابة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 10 مل من RPMI الكامل (RPMI مكمل بنسبة 10٪ مصل بقري جنيني ، 100 وحدة / مل بنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، 1 ملي بيروفات الصوديوم ، 1x أحماض أمينية غير أساسية ، 50 ميكرومتر 2-ميركابتو إيثانول ، 10 ملي هيبس).
جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 1200 دورة في الدقيقة لغسل أي وسائط تجميد ملوثة.
بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية السائلة ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل RPMI كامل طازج. بعد ذلك ، أضف الخلايا إلى قارورة ثقافة الأنسجة T75 التي تحتوي على 15 مل RPMI كامل (الحجم النهائي ل RPMI هو 20 مل).
قم بزراعة الخلايا في حاضنة قياسية عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. الخلايا غير ملتصقة أثناء الاستزراع.

< p class = "jove_title" >2. توسع الورم الهجين

اسمح للخلايا بالتمدد لمدة 3 أيام تقريبا حتى تصبح القارورة ~ 80٪ ملتقية.
ملاحظه: يمكن أن يختلف هذا المقدار من الوقت بناء على العدد المبدئي للخلايا ، بالإضافة إلى الاختلافات المتأصلة في معدلات نمو الخلايا المختلفة. من المهم أن تكون الخلايا في مرحلة النمو
بمجرد أن تصل القارورة الأولية إلى ~ 80٪ من التقاء ، قم بإزالة الخلايا من قارورة T75 الأولية هذه ، وضعها في أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل وقم بالدوران (1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق) لحبيبات الخلايا.
أعد تعليق الخلايا في 6 مل من RPMI الكامل ، ثم وزع تعليق الخلية في ثلاث قوارير T75 جديدة (2 مل / قارورة تحتوي على 18 مل RPMI). احتضان قوارير T75 الثلاثة هذه عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ حتى تصبح ~ 80٪ ملتقية (يجب أن يستغرق ذلك حوالي 3 أيام).

فئة

3. إنتاج الأجسام المضادة في وسط خال من المصل

ملاحظة: في هذه المرحلة ، تكون الخلايا جاهزة لمواصلة نموها في وسط خال من المصل مصمم لنمو خطوط خلايا الورم الهجين. في هذا البروتوكول ، نستخدم وسيط HB Basal Liquid الجاهز للاستخدام والمتوفر تجاريا والذي يحتوي على منتج HB101 الغذائي.

جمع الخلايا من كل من قوارير T75 الثلاثة (عند التقاء ~ 80٪) وطردها بالطرد المركزي (1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق).
يتم إعادة تعليق حبيبات الخلية من كل قارورة T75 في 10 مل مكمل HB101 الوسط الخالي من المصل ثم تضاف إلى قارورتين T225 مكملتين لوسط HB101 الخالي من المصل (أي تعليق خلية 5 مل في كل من 6 قوارير تحتوي على ~ 220-240 مل HB101 في كل قارورة).
استمر في زراعة الخلايا في قوارير T225 ووسائط HB101 عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة ثلاثة أسابيع ، أو حتى تبدأ الخلايا في الموت. تنتج الخلايا mAb خلال هذه الأسابيع الثلاثة وتفرزها في وسط الاستزراع. بمجرد أن تبدأ الخلايا في الموت ، فإنها لم تعد تنتج أي mAb.

< ص الفئة = "jove_title" >4. تنقية الأجسام المضادة - اليوم 1

ملاحظة: في هذه المرحلة ، لا يلزم الحفاظ على العقم ، لذا لا يلزم التعامل مع الوسائط بطريقة معقمة (على سبيل المثال ، في خزانة السلامة البيولوجية). علاوة على ذلك ، لا تعتبر الأورام الهجينة عامل "مستوى BSL2".

صب الوسائط من القوارير في أنابيب للحصول على دوار بزاوية ثابتة. قم بتدوير الأنابيب في جهاز طرد مركزي بدوار بزاوية ثابتة عند 10,000 دورة في الدقيقة لمدة 8 دقائق. تم تصميم هذه الخطوة لإزالة الحطام الخلوي من المادة الطافية للثقافة.
ملاحظه: يمكن أن تختلف أحجام الأنابيب حسب الدوار المستخدم. الشيء المهم الذي يجب تذكره هو أن يكون لديك نفس الحجم في الأنابيب لضمان توازن الدوار بشكل صحيح قبل الطرد المركزي. من المحتمل ألا يتناسب الحجم الكامل للوسائط مع جهاز الطرد المركزي في وقت واحد. سيتم طرد الوسائط المتبقية لاحقا (الخطوة 4.5) باستخدام نفس الأنابيب.
قم بإعداد دورق بلاستيكي سعة 2 لتر مع قضيب تقليب في دلو محاط بالثلج. ضعها على طبق تحريك.
قم بتوصيل سطح فلتر سعة 500 مل على زجاجة سعة 1 لتر. قم بتوصيل وحدة الفلتر العلوي للزجاجة بالمكنسة الكهربائية المنزلية عبر الأنابيب المناسبة.
صب المادة الطافية من الخطوة 4.1 (التي لا تزال تحتوي على mAb الذي تنتجه خلايا الورم الهجين) في الجزء العلوي من المرشح.
استمر في استخدام نفس مجموعة الأنابيب لإزالة حطام الخلايا من الوسائط (ستستمر الحبيبات في البناء). انتظر لتشغيل المكنسة الكهربائية حتى يمتلئ الجزء العلوي من المرشح وتكون دفعة أخرى من المادة الطافية جاهزة للصب. لا تدع الفلتر يجف وإلا ستصبح الترشيح بطيئة جدا.
عندما تقترب الزجاجة سعة 1 لتر من الامتلاء ، قم بإزالة الجزء العلوي من الفلتر واسكب المادة الطافية في دورق سعة 2 لتر تم إعداده في الخطوة 4.2. أعد تركيب الجزء العلوي من الفلتر. تتبع مستوى الصوت.
كرر خطوات الطرد المركزي والترشيح حتى تتم معالجة جميع الوسائط.
قم بقياس 295 جراما من كبريتات الأمونيوم لكل 1 لتر من المادة الطافية المفلترة التي تم جمعها. أثناء التقليب ، أضف كبريتات الأمونيوم ببطء إلى المادة الطافية خلال الساعتين المقبلتين (~ 25 جم كل 15 دقيقة) لمنع تركيز عال موضعي من ملح كبريتات الأمونيوم الذي قد يتسبب في ترسيب البروتينات غير المرغوب فيها.
بمجرد إضافة كل كبريتات الأمونيوم ، قم بتغطية الدورق بورق الألمنيوم وتحرك مع لوحة التقليب إلى 4 درجات مئوية (على سبيل المثال ، الثلاجة أو غرفة التبريد). يقلب طوال الليل. مطلوب التقليب المستمر للمحلول لإذابة الملح ، لكن التحريك المطول يمكن أن يؤدي إلى تمسخ البروتينات في المحلول عند واجهة السطح / الهواء.
اغسل الأنابيب باستخدام الدوار ذو الزاوية الثابتة.

< p class = "jove_title" >5. تنقية الأجسام المضادة - اليوم 2

صب كبريتات الأمونيوم المحتوية على مادة طافية من دورق 2 لتر في أنابيب للحصول على دوار بزاوية ثابتة. تدور في جهاز الطرد المركزي مع دوار بزاوية ثابتة عند 6500 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة بدون فرامل.
بشفط المادة الطافية بالمكنسة الكهربائية ، مع الحرص على عدم امتصاص الحبيبات لأنها ستكون طرية. استمر في استخدام نفس مجموعة الأنابيب لجمع الحبيبات من كبريتات الأمونيوم المحتوية على المادة الطافية.
بعد الشفط الأخير ، أعد تعليق كل حبيبات (تحتوي على أجسام مضادة) في ~ 1 مل PBS.
قم بإزالة كبريتات الأمونيوم من محلول mAb المترسب عن طريق غسيل الكلى ضد كميات كبيرة من PBS. للقيام بذلك ، قم أولا بقطع ما يقرب من 1 بوصة من أنابيب غسيل الكلى (على سبيل المثال ، Membra-Cel MD25-14 MWCO 12,000-14,000 Dalton قطع أنابيب غسيل الكلى السليلوز) لكل مل من محلول mAb. بلل الأنبوب ب dH₂O. اربط عقدة في أحد طرفي الأنبوب واملأه ب dH₂O للتحقق من عدم تسرب العقدة. إفراغ dH₂O من الأنبوب.
الماصة PBS / محلول الأجسام المضادة في الأنبوب. اشطف الأنابيب ب 0.25 مل إضافي من PBS ، وانقلها إلى الأنبوب.
قم بتأمين الجزء العلوي من الأنبوب بالقرب من المحلول قدر الإمكان بمشبك غسيل الكلى البرتقالي.
قم بلصق الجزء العلوي من الأنبوب على الجزء العلوي الخارجي من دورق سعة 4 لتر. اترك الجزء المملوء من الأنبوب يتدلى في الدورق املأ الدورق ب PBS وأضف شريط التقليب.
يقلب طوال الليل لمدة ~ 8 ساعات عند 4 درجات مئوية.
استبدل PBS في الدورق ب PBS الطازج وحرك لمدة ~ 8 ساعات مرتين أخريين.
انقل الجسم المضاد من الأنبوب إلى أنابيب مخروطية سعة 15 أو 50 مل. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 1200 دورة في الدقيقة لإزالة أي راسب قد يكون قد تشكل. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.
تمييع كمية من الجسم المضاد 1:20 مع PBS (5 ميكرولتر جسم مضاد + 95 ميكرولتر PBS). قم بقياس تركيز الجسم المضاد باستخدام مقياس الطيف الضوئي (فارغ مع PBS) عند 280 نانومتر. استخدم معامل الانقراض (ε) 1.43. يتم حساب التركيز على النحو التالي
< / >
بتقسيم الجسم المضاد في قوارير الغطاء اللولبي وتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

المصدر: فرانسيس ف. سجاستاد ^1,2 ، ويتني سوانسون ^2,3 ، وتوماس س. جريفيث ^1,2,3,4
¹ برنامج الدراسات العليا في علم الأحياء الدقيقة والمناعة وبيولوجيا السرط…

Browse More Videos

ELISA PBS