What is a fluorophore and how does it work in immunofluorescence microscopy?

A fluorophore is a molecule that absorbs light energy at a specific wavelength through excitation, then immediately releases the energy at a different wavelength through emission. Fluorophores are conjugated to antibodies and introduced into tissue samples through immunostaining. When the antibody binds to the target protein, the fluorophore labels it, allowing visualization under a fluorescence microscope.

How does a fluorescence microscope separate excitation and emission light?

A fluorescence microscope uses specialized optical components to separate wavelengths. Excitation light passes through an excitation filter, then reflects off a dichroic mirror toward the objective lens, which focuses it on the sample. Emitted light from excited fluorophores returns through the objective and dichroic mirror, which allows only emission wavelengths to pass. An emission filter removes unwanted wavelengths before the image reaches the eyepiece or camera.

Why is rehydration necessary before immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue?

Tissue sections are dehydrated during the paraffin embedding process. Before staining, sections must be rehydrated through graded ethanol incubations and PBS washes to restore tissue hydration and prepare it for antibody binding. This step ensures proper antibody penetration and reduces non-specific binding during the immunostaining procedure.

What is the purpose of a blocking buffer in immunofluorescence staining?

Blocking buffer reduces non-specific binding of antibodies to the tissue section. The tissue is incubated with blocking buffer for one hour at room temperature before primary antibody application. This step prevents the antibody from binding to sites other than the target protein, improving staining specificity and reducing background fluorescence in the final image.

Why is a control slide included in immunofluorescence staining procedures?

A control slide is treated identically to experimental slides but receives only blocking buffer instead of primary antibody. This control helps identify any non-specific binding of the secondary antibody to the tissue. By comparing the control to experimental slides, researchers can distinguish true target protein localization from background fluorescence caused by non-specific antibody interactions.

How can multiple proteins be visualized simultaneously in a single tissue sample?

Multiple different fluorophores with distinct excitation and emission wavelengths can be used to label different proteins within the same sample. DNA binding fluorescent dyes like DAPI label nuclei as a reference point. By using multiple fluorophores, researchers can compare the localization of different proteins and analyze their spatial relationships within the tissue section.

What information can immunofluorescence imaging provide about tissue samples?

Immunofluorescence imaging provides data on protein intensity and localization within tissue sections, revealing cell type heterogeneity, activation of signaling pathways, and biomarker expression. Researchers can quantify the frequency of specific cell populations by counting positively stained cells and comparing them to the total cell population, calculated using a simple ratio equation.

الفحص المجهري المناعي: تلطيخ التألق المناعي لأقسام الأنسجة المضمنة في البارافين

0 مشاهدات09:56 د

1. الإعداد

يتضمن بروتوكول التلوين النموذجي الخطوات التالية:
1. إعادة ترطيب أقسام الأنسجة على الشرائح باستخدام سلسلة من الإيثانول المتدرج.
2. احتضان أقسام الأنسجة بمخزن مؤقت مانع ، مما سيساعد على منع الارتباط غير المحدد للجسم المضاد بالأنسجة وتقليل تألق الخلفية.
3. إزالة المخزن المؤقت المانع واحتضان القسم في الجسم المضاد الأولي ، وفي ذلك الوقت سيربط الجسم المضاد هدف الببتيد.
4. إزالة الجسم المضاد الأساسي وغسل الأقسام على نطاق واسع في محلول الغسيل.
5. احتضان الأقسام بجسم مضاد ثانوي للسماح بالارتباط بالجسم المضاد الأولي ، إذا لم يتم تصنيف الجسم المضاد الأساسي مباشرة بالفلوروفور وكان هناك حاجة إلى جسم مضاد ثانوي.
6. غسل الجسم المضاد الثانوي من الشرائح.
7. تركيب الشرائح في وسائط التركيب والسماح لها بالجفاف قبل التصور على مجهر الفلورسنت.
العناصر التالية مطلوبة: حاملات الشرائح (الزجاج أو البلاستيك) ، والبرطمانات ، والماصات ، وقلم عنق الرحم ، والغرفة الرطبة ، وزلات الغطاء ، ووسائط التثبيت باستخدام DAPI.
يستخدم الزيلين لترطيب الشرائح. الزيلين خطير ويجب استخدامه في غطاء الدخان جنبا إلى جنب مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك القفازات ومعطف المختبر.
وصفات للمخازن المؤقتة والحلول والكواشف
1. الإيثانول المتدرج
  الإيثانول - 160 مل 200 دليل على EtOH و 40 مل ddH₂O
  الإيثانول - 140 مل 200 دليل على EtOH و 60 مل ddH₂O
2. حل استرجاع المستضد
  10 ملي مولار سترات الصوديوم ، درجة الحموضة 6.0
3. المخزن المؤقت للحظر
  100 ميكرولتر مصل من المضيف الذي صنع منه الجسم المضاد الثانوي
  900 ميكرولتر 1X PBS
  ملاحظه: هذا هو حجم 10 أقسام. اضبط مستوى الصوت لحوالي 100 ميكرولتر مخزن مؤقت لكل قسم ، حسب الحاجة.
4. عازلة الغسيل (1X PBS)

2. بروتوكول

الإماهة بالزيلين والإيثانول
1. ضع الشرائح في حامل الشرائح ، ثم اغمر الشرائح في محلول أيزومرات الزيلين بنسبة 100٪ ، مما يضمن تغطية الشرائح بالكامل بالمحلول.
2. احتضان الشرائح في أيزومرات الزيلين 100٪ لمدة 3 دقائق. كرر مرتين ليصبح المجموع 3 حضانات منفصلة. تأكد من مسح رف الشرائح بمنشفة ورقية قبل نقله إلى محلول جديد لتقليل التلوث.
  ملاحظه: يوصى بإجراء هذه الحضانات في ثلاث حاويات منفصلة.
3. احتضان الشرائح في 100٪ EtOH لمدة دقيقتين ، كرر مرتين ليصبح المجموع 3 حضانات منفصلة.
  ملاحظه: يوصى بإجراء هذه الحضانات في ثلاث حاويات منفصلة.
4. احتضان الشرائح في 95٪ EtOH لمدة 2 دقيقة.
5. احتضان الشرائح في 80٪ EtOH لمدة دقيقتين.
6. احتضان الشرائح في 70٪ EtOH لمدة دقيقتين.
7. احتضان الشرائح في 1X PBS لمدة 5 دقائق.
(اختياري) استرجاع المستضد لكشف القناع عن الحلقات المعترف بها بواسطة الجسم المضاد الأساسي
ملاحظة 1: يعتمد هذا الإجراء بشكل كبير على الجسم المضاد المستخدم ويوصى بإجراء إجراءات التحسين الأولية لتحديد متطلبات استرجاع المستضد.
الملاحظة 2: لم يتم تنفيذ هذا الإجراء باستخدام تلطيخ F4 / 80 الموضح أدناه. يجب تحسين متطلبات استرجاع المستضد مع كل جسم مضاد جديد.
1. ضع الشرائح في حامل منزلق بلاستيكي أو زجاجي مقاوم للحرارة ، وتأكد من ملء الحامل بالشرائح لضمان توزيع الحرارة بشكل متساو. يمكن استخدام الشرائح الفارغة إذا كان هناك عينات أقل من الفتحات الموجودة في الحامل.
2. ضع الرف في 1000 مل من محلول كشف القناع المستضد في دورق سعة 2 لتر - 10 مل من مخزون كشف المستضد إلى 990 مل من الماء.
3. الميكروويف على حرارة عالية لمدة 20 دقيقة إجمالا ، تأكد من بقاء الشرائح مغطاة بالماء.
4. تبرد الشرائح لمدة 20 دقيقة في الدورق
5. اغسل رف الشرائح في حاملات الشرائح التي تحتوي على ddH₂O لمدة 5 دقائق لكل منها. كرر مرتين ليصبح المجموع 3 حضانات منفصلة باستخدام ddH₂O الطازج في كل مرة. يمكن غسل الشرائح في نفس حامل الشريحة أثناء كل غسلة.
6. احتضان الشرائح في 1X PBS لمدة 5 دقائق.
ضع دائرة حول الأقسام بقلم عنق الرحم. سيسمح ذلك باستخدام الحد الأدنى من المخازن المؤقتة اللازمة لتغطية أقسام الأنسجة. لا تدع أقسام الأنسجة تجف.
أضف مخزن مؤقت للحظر إلى كل قسم. ستختلف كمية المخزن المؤقت اللازمة لتغطية القسم اعتمادا على حجم القسم ولكنها يمكن أن تتراوح من 25-500 ميكرولتر. يجب استخدام ما يكفي من المخزن المؤقت لتشكيل حبة تغطي سطح القسم بالكامل بما في ذلك الحواف.
ملاحظه: قد يختلف اختيار المخزن المؤقت المانع اعتمادا على الجسم المضاد المستخدم. على سبيل المثال ، يمكن استخدام مصل 10٪ من المضيف الذي تم فيه رفع الجسم المضاد الثانوي لتقليل الارتباط غير المحدد للجسم المضاد الثانوي (على سبيل المثال ، يمكن استخدام مصل الماعز الطبيعي إذا تم رفع الجسم المضاد الثانوي في الماعز). يجب إجراء تحسين المخزن المؤقت للحجب لكل جسم مضاد أولي. لتلطيخ أقسام الورم الثديي ب F4 / 80 ، تم استخدام 0.1 مل من مصل الماعز الطبيعي بنسبة 10٪ في PBS.
احتضان الأقسام في المخزن المؤقت في غرفة مرطبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية حتى 24 ساعة. تضمن الغرفة المرطبة عدم جفاف الأقسام.
قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر عن طريق تصريفه من الشريحة. بدلا من ذلك، يمكن إزالة المخزن المؤقت للحجب باستخدام ماصة، على الرغم من الحرص على عدم لمس القسم الذي يحتوي على طرف الماصة.
تمييع الجسم المضاد الأساسي في المخزن المؤقت المنع.
ملاحظه: يجب تحديد التخفيف الصحيح لكل جسم مضاد ونوع عينة. سيشمل التحسين إجراء سلسلة من التخفيفات لتحديد التلوين الأمثل. لتلطيخ أقسام الورم الثديي ب F4 / 80 ، تم تحضين أقسام الأنسجة بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في 0.1 مل من الجسم المضاد للفئران المضاد F4 / 80 المخفف 1: 100 في مصل الماعز الطبيعي بنسبة 1٪ في PBS.
أضف الجسم المضاد الأساسي إلى كل قسم واحتضنه في غرفة رطبة لمدة تصل إلى 16 ساعة (بين عشية وضحاها) عند 4 درجات مئوية. اترك قسما واحدا على الأقل في المخزن المؤقت بدون جسم مضاد أولي ليكون بمثابة عنصر تحكم ، مما سيساعد في تحديد الارتباط غير المحدد بواسطة الجسم المضاد الثانوي.
قم بتصريف الجسم المضاد الأساسي أو المخزن المؤقت المغلق من القسم ، واغسل الأقسام باستخدام PBS عن طريق وضع الشرائح في رف الشرائح ووضعها في حامل الشريحة مع 1x PBS. اغسل 3 مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة.
تمييع الجسم المضاد الثانوي 1: 200 في المخزن المؤقت المانع. يمكن تحسين التخفيف اعتمادا على الجسم المضاد الثانوي.
أضف الجسم المضاد الثانوي إلى جميع الأقسام ، بما في ذلك التحكم ، واحتضن لمدة ساعة واحدة في غرفة رطبة محمية من الضوء.
صفي الجسم المضاد الثانوي من الأقسام ، واغسليه 3 مرات في PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة.
أضف 2-3 قطرات من وسائط التثبيت التي تحتوي على DAPI إلى الشرائح وضع غطاء على العينات. إذا لم تكن وسائط التثبيت من نوع الوسائط سريعة الجفاف ، فقد يكون من الضروري إغلاق حواف الشريحة بشمع البارافين المذاب أو طلاء الأظافر لمنع التسرب والحفاظ على العينات على المدى الطويل.
اترك الشرائح تجف طوال الليل في الظلام ، وقم بتصوير الأقسام باستخدام مجهر الفلورسنت.

< p class = "jove_title" >3. تحليل البيانات والنتائج

يتم تحليل المقاطع الملطخة باستخدام مجهر الفلورسنت. ستعتمد التفاصيل المحددة لالتقاط الصور وتحليلها على مواصفات المجهر والبرامج المستخدمة لإجراء التحليل. عادة ، يمكن التقاط الصور كصور أحادية اللون وتداخلها لإنشاء صور متعددة الألوان. يمكن قياس النسبة المئوية للخلايا الموجبة عن طريق حساب عدد الخلايا الملطخة إيجابيا والقسمة على العدد الإجمالي للخلايا الملطخة ب DAPI داخل القسم. بالنسبة لتلوين أقسام الأورام الثديية F4 / 80 ، باستخدام برنامج Leica Application Suite ، الإصدار 3.8 ، ضمن علامة التبويب Acquisition وفي وضع الحصول على Image Overlay ، تم تمكين كل من DAPI و RFP. تم تعديل التعرض والكسب وجاما (20.0 مللي ثانية و 1.0x و 1.53 على التوالي ل DAPI و 944.2 مللي ثانية و 1.0x و 1.08 على التوالي لطلب تقديم العروض) ، على الرغم من أن هذا يختلف بين التجارب. تم استخدام زر Acquire Overlay لإنشاء صور تراكب لتعريضات DAPI و RFP.
تظهر الصورة أدناه (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1) مثالا على صورة التألق المناعي لقسم ورم ملطخ ب F4 / 80 ، والذي يكتشف مستضد على الضامة والخلايا النخاعية الأخرى. تم تركيب القسم باستخدام وسائط التثبيت المحتوية على DAPI وتظهر النوى باللون الأزرق.

تعتمد

وظيفة البروتين في الخلية إلى حد كبير على توطينه الصحيح داخل الخلية. الفحص المجهري المناعي هو طريقة يمكن من خلالها تصور البروتين داخل الخلايا باستخدام الأصباغ الفلورية. صبغة الفلورسنت هي فلوروفور ، أي جزيء يمتص الطاقة الضوئية بطول موجي معين من خلال عملية تسمى الإثارة ، ثم يطلق الطاقة على الفور بطول موجي مختلف ، يعرف باسم الانبعاث.

يتم اقتران الأصباغ الفلورية مع جسم مضاد محدد للهدف ويتم إدخالها في الخلايا أو الأنسجة المستنبتة عن طريق التلوين المناعي. عندما يرتبط هذا الجسم المضاد الأساسي بالبروتين محل الاهتمام ، يتم تمييز البروتين بصبغة الفلورسنت. بدلا من ذلك ، يمكن اقتران الصبغة الفلورية بجسم مضاد ثانوي ، بدلا من الجسم المضاد الأساسي ، ويرتبط الجسم المضاد الثانوي بمركب الجسم المضاد الأساسي للبروتين لتسمية الهدف. بعد ذلك ، يتم إغلاق العينة في وسط تركيب مضاد للبهتان للحفاظ على الملصقات المضان ثم تكون جاهزة للتصوير على المجهر الفلوري.

تم تجهيز المجهر الفلوري بمصدر ضوء قوي. يمر شعاع الضوء أولا عبر مرشح الإثارة ، والذي يسمح فقط للضوء عند الطول الموجي للإثارة بالمرور من خلاله. يصل ضوء الإثارة بعد ذلك إلى مرآة متخصصة ، تسمى مرآة ثنائية اللون أو فاصل الشعاع ، والتي تم تصميمها لتعكس بشكل انتقائي الطول الموجي للإثارة نحو عدسة موضوعية. ثم تركز العدسة الضوء على منطقة صغيرة في العينة. عند الوصول إلى العينة ، يثير الضوء الفلوروفورات ، والتي تنبعث منها بعد ذلك الطاقة الضوئية بطول موجي مختلف. ينتقل هذا الضوء مرة أخرى من خلال العدسة الموضوعية إلى المرآة ثنائية اللون. نظرا لأن الطول الموجي للانبعاث يختلف عن الطول الموجي للإثارة ، فإن المرآة ثنائية اللون تسمح لضوء الانبعاث بالمرور. بعد ذلك ، يمر عبر مرشح ثان ، يسمى مرشح الانبعاث ، والذي يزيل الضوء من أي أطوال موجية أخرى قد تكون موجودة. بعد ذلك ، تصل أشعة الضوء الآن إلى العدسة أو الكاميرا ، حيث تقدم صورة مكبرة تم إنشاؤها من الضوء المنبعث من الفلوروفورات المحددة. تمثل هذه الصورة موقع البروتين محل الاهتمام داخل الخلية.

غالبا ما تستخدم الأصباغ الفلورية المرتبطة بالحمض النووي جنبا إلى جنب مع التلوين المناعي لتسمية النوى كنقطة مرجعية داخل الخلايا. يمكن استخدام العديد من الفلوروفورات المختلفة ، ذات الأطوال الموجية المختلفة لانبعاثات الإثارة ، لبروتينات مختلفة داخل نفس العينة لمقارنة توطين البروتينات.

يوضح هذا الفيديو إجراء تلطيخ الفلورسنت المناعي لبروتين ذي أهمية في عينة من الأنسجة متبوعا بتصوير العينة على مجهر فلوري.

قبل البدء في عملية التلوين ، تحتاج الأقسام التي تم تجفيفها أثناء عملية التضمين إلى إعادة الترطيب. للقيام بذلك ، أولا ، ضع الشرائح في حامل الشرائح ثم اغمر الشرائح بالكامل في أيزومرات Xlene بنسبة 100٪. اسمح للشرائح بالتحتضن لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة الشرائح من الحاوية ، وامسح أي زيلين زائد بمنشفة ورقية ، وضعه في حمام زيلين جديد في وعاء جديد ، لمدة ثلاث دقائق أخرى. كرر هذه الحضانة في كل مرة في وعاء جديد مع زيلين طازج وامسح الشرائح بالمناشف الورقية قبل نقلها إلى الحاوية الجديدة ، ليصبح المجموع ثلاث حضانات. بعد ذلك ، احتضان الأقسام في سلسلة من محاليل الإيثانول المتدرجة ، بدءا من الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة دقيقتين. امسح رف الشرائح بمنشفة ورقية ، وانقل الشرائح إلى حاوية جديدة تحتوي على 100٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين أخريين. استمر في دورة الغسيل ، ومسح الإيثانول الزائد بمنشفة ورقية ، ونقل الشرائح إلى حمام جديد ، باتباع تركيزات الإيثانول المشار إليها للوقت المحدد. بعد غسل الإيثانول النهائي ، تخلص من المحلول الزائد واحتضن الشرائح في 1X PBS لمدة خمس دقائق.

لبدء عملية التلوين ، أولا ، ضع دائرة حول الأقسام بقلم PAP لتحديد الحد الأدنى من المساحة التي تحتاج المخازن المؤقتة إلى تغطيتها. بمجرد وضع علامة واضحة على الأقسام على الشريحة ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب إلى كل شريحة ، مع التأكد من تغطية سطح القسم بالكامل. بعد تغطية الأنسجة بمخزن مؤقت مانع ، ضع الشرائح في غرفة رطبة. اترك الشرائح لتحتضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد وقت الحضانة المطلوب ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر عن طريق تصريفه من الشريحة. بعد ذلك ، قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي في المخزن المؤقت المنع. للتخفيف بنسبة 1:100 ، أضف 990 ميكرولترا من المخزن المؤقت المانع إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مليلتر ، متبوعا ب 10 ميكرولترات من الجسم المضاد الأساسي إلى نفس الأنبوب. قم بتسمية شريحة واحدة كعنصر تحكم ثم أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر. سيساعد هذا التحكم في تحديد أي ارتباط غير محدد للجسم المضاد الثانوي. الآن ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للأجسام المضادة الأولية إلى الشرائح المتبقية. احتضان الأقسام طوال الليل في غرفة رطبة عند أربع درجات مئوية ، في الظلام.

بعد الحضانة الليلية ، قم بإزالة الأقسام من الغرفة واستنزاف الجسم المضاد الأساسي من كل شريحة والمخزن المؤقت للحجب من عنصر التحكم. ضع الشرائح في رف الشرائح ثم اغسلها ثلاث مرات في 1X PBS لمدة عشر دقائق لكل منها. أثناء غسل الشرائح في 1X PBS ، قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي في المخزن المؤقت المنع. للتخفيف بنسبة 1: 200 ، أضف 995 ميكرولترا من المخزن المؤقت للحجب إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر ، متبوعا بخمسة ميكرولترات من الجسم المضاد الثانوي إلى نفس الأنبوب. أضف الجسم المضاد الثانوي إلى جميع الأقسام ، بما في ذلك التحكم ، واحتضنها لمدة ساعة واحدة في غرفة رطبة محمية من الضوء. عندما يصدر صوت المؤقت ، قم بإزالة الشرائح من الحاضنة. استنزاف الجسم المضاد الثانوي من الأقسام. بمجرد إزالة الجسم المضاد الثانوي ، ضع الشرائح في رف شرائح ثم اغمر الشرائح تماما في 1X PBS لمدة 10 دقائق ، محمية من الضوء. كرر هذا الغسيل ثلاث مرات ، باستخدام 1X PBS الطازج لكل غسلة. بعد الغسل، أضف قطرتين إلى ثلاث قطرات من وسائط التثبيت التي تحتوي على DAPI إلى كل شريحة وضع غطاء زجاجي على العينات. اترك الشرائح تجف طوال الليل في مكان مظلم قبل تصوير الأقسام باستخدام منظار الفلورسنت.

أثناء التصوير ، ستعتمد تفاصيل التقاط الصورة على المجهر والبرامج المحددة المتاحة. ومع ذلك ، في هذا المثال بالذات ، برنامج Leica Application Suite ، الإصدار 3. 8 ، يستخدم لإجراء التحليل. باستخدام هذا البرنامج ، انقر فوق علامة التبويب Acquisition وفي وضع Image Overlay Acquisition ، قم بتمكين كل من DAPI و RFP. بعد ذلك ، اضبط التعرض والكسب وجاما لكل من DAPI و RFP ، عن طريق أخذ حرف أولي باستخدام الإعدادات الافتراضية المحددة بواسطة البرنامج ، ثم تحسين السطوع عن طريق تعديل وقت التعرض والكسب ، مع الأخذ في الاعتبار أن الحد الأدنى من الإعدادات المثلى مرغوب فيه لتجنب تشبع الصورة وتبييض العينات. يمكن تعديل جاما لتحسين المناطق الداكنة من الصورة.

بمجرد ضبط الإعدادات، اضغط على الزر Acquire Overlay لإنشاء صور تراكب لتعريضات DAPI و RFP. تظهر هذه الصورة المثالية، التي تم التقاطها باستخدام التقنية الموضحة، قسما من ورم الثدي في الفأر، ملطخا بالجسم المضاد F4/80، الذي يكتشف مستضد موضح باللون الأحمر على البلاعم والخلايا النخاعية الأخرى. منذ استخدام وسائط التثبيت المحتوية على DAPI ، تظهر النوى باللون الأزرق. ستوفر البيانات من التصوير معلومات تتعلق بكثافة البروتين وتوطينه داخل قسم الأنسجة.

على سبيل المثال ، في صورة الورم الملطخ ب F4 / 80 ، لوحظ تلطيخ سطح الخلية لهذا المستضد. يمكن أن توفر هذه البيانات أيضا معلومات تتعلق بتكرار مجموعات خلايا معينة داخل قسم الأنسجة. يمكن قياس ذلك عن طريق حساب عدد الخلايا الملطخة إيجابيا ، الموضحة هنا باللون الأحمر ، ومقارنة ذلك بإجمالي عدد الخلايا ، الموضح باللون الأزرق ، وحساب التردد باستخدام المعادلة التالية.

المصدر: Thomas Chaffee¹, Thomas S. Griffith^2,3,4, and Kathryn L. Schwertfeger^1,3,4
¹ قسم الطب المخبري وعلم الأمراض ، جامعة مينيسوتا ، مينيابوليس ، مين…

Browse More Videos

DAPI